JP2009502913A - 調節因子 - Google Patents

Abstract

線維増殖性疾患を治療又は予防するための薬物の製造における、ＳＴＡＴを調節する組成物の使用。上記線維増殖性疾患はケロイド瘢痕化を含みうる。上記組成物は、ＳＴＡＴの活性、リン酸化、発現レベル又は細胞内局在のうちの１つ又は複数を調節するものであってもよい。上記ＳＴＡＴはＳＴＡＴ３であってもよい。
【選択図】なし

Description

発明の詳細な説明

本発明は、線維増殖性疾患を治療するための組成物及び医薬組成物に関する。

過度な線維芽細胞増殖及び過剰なコラーゲンの沈着が、とりわけ強皮症、肺線維症、ケロイド瘢痕化、手術癒着等の線維増殖性疾患の特徴である。線維増殖性疾患の潜在的治療の１つが硫酸グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の阻害剤である。いくつかの線維増殖性疾患モデルで、ＧＡＧの阻害剤が線維増殖性組織の阻害及びコラーゲン発現の減弱を示したことが知られている。しかし、現在のところ、線維増殖性疾患に適した使用中の治療は存在しないようである。

創傷治癒は、フィブリン塊の分解、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の分解、血管新生の促進、並びに細胞の移動及び増殖を含む、調節されているが複雑な事象である。皮膚損傷の場合には、ケラチノサイト及び線維芽細胞が、増殖及び移動することが見出されている細胞である。正常な創傷治癒を促進させるために、好中球、マクロファージ、ケラチノサイト及び線維芽細胞から、ケモカイン、サイトカイン及び成長因子のカクテルが時間的かつ空間的に分泌され、適切な反応を指示する。過度な皮膚創傷治癒の場合、肥厚性瘢痕からケロイド瘢痕までの多岐に渡る瘢痕形成が起こる。ケロイド瘢痕は、ヒトのみが患う皮膚瘢痕化の最も極端な例であり、その再帰的性質のため、治療戦略が大部分効き目のない、創傷治癒に対する病理反応である。「ケロイド」という用語は、カニの鉤爪のような上記瘢痕の外観を描写するために１８０６年に案出された。ケロイド瘢痕は、元の傷の境界を越えて広がり、自発的に縮退しない瘢痕と定義されている。対照的に、肥厚性瘢痕は、損傷の外縁を超えて発達せず、自発的な軟化及び平坦化を伴う。ケロイド瘢痕は、ヒトのみが患い、刺激となる皮膚外傷は、耳のピアス及び擦傷のような小さな損傷から、手術又は火傷のようなより重度な外傷まで多岐に渡る。

ケロイド瘢痕は、性質が攻撃的であり、アフリカ人及びアジア人でより一般的なようである。ケロイド瘢痕の治療及び管理は、それらの再発のため、これまで困難であり、無数の治療が利用可能ではあるが、どれも単独で満足なものではない。ケロイド瘢痕の既知の治療は、ケロイドが現れた直後に開始した場合に、最もよい結果を与える。利用可能な治療には以下のものが含まれる。

・従来の手術による除去は信頼性の低い手法である。除去後に再帰するケロイドは元のものより大きいものとなりうるので、これは重大な注意を必要とする。ケロイドは、手術によって除去した場合、４５パーセントを超える人々で再帰する（Ｃｏｓｍａｎら、１９６１年）。
・シリコーンゲルシート製の湿性傷カバー又は包帯は、ケロイドの突出を経時的に低減することが研究で示されている。この治療は安全かつ無痛である。
・トリアムシノロンアセトニド又は別のコルチコステロイド薬のようなコルチコステロイドの注射は、通常４〜６週間毎に繰り返す。この治療は、ケロイドのサイズ及び刺激作用を軽減しうるが、注射は不快である。
・６〜１２カ月の期間に渡って１日２４時間、持続的に圧力を加えるための包帯又はテープを用いた加圧。そのような加圧は、皮膚を薄くする作用を与えうる。
・冷凍外科療法、又は液体窒素を用いた冷凍治療を、２０〜３０日毎に繰り返す。これは、皮膚色を薄くする副作用を引き起こしうる。それによってこの治療の有用性が制限されている（Ａｌｓｔｅｒ及びＴａｎｚｉ、２００３年）。
・放射線照射は、癌の危険性を増大させる点で問題がある。放射線治療は、手術直後、手術創が治癒している間に使用された場合、瘢痕形成を軽減しうる（Ｒａｇｏｏｗａｎｓｉら、２００１年）。
・レーザ療法は、従来の手術に代わる、ケロイドを除去するための代替手段である。レーザ療法の後に、通常の手術の後より、ケロイドが再発する可能性が低いという確かな証拠はない（Ａｌｓｔｅｒ及びＴａｎｚｉ、２００３年）。
・様々なタイプのインターフェロン、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン等の薬を用いた実験的な治療も試験されている。

これらの治療は、大部分信頼性が低く、重大な注意を必要とする。ケロイド瘢痕は多くの場合再発し、元の瘢痕より大きくなることがある。

ケロイド瘢痕は、皮膚線維芽細胞による、フィブロネクチン等のコラーゲン及び他のＥＣＭ成分の過剰な沈着と、創傷の際の線維芽細胞増殖の増大と、を特徴とする。ケロイド瘢痕でのプロコラーゲンのｍＲＮＡ発現レベルに関しては、相互に矛盾した報告が存在する。ケロイド線維芽細胞において、ＩＩＩ型プロコラーゲンのｍＲＮＡレベルの変化を伴わない、Ｉ型プロコラーゲンｍＲＮＡの過剰産生が示され、ケロイド線維芽細胞におけるＩ／ＩＩＩ型プロコラーゲンｍＲＮＡの比率が、正常線維芽細胞培養物と比較して、逆転することが示されている（Ｕｉｔｔｏら、１９８５年、及びＡｂｅｒｇｅｌら、１９８５年）。しかし、それより後の出版物は、プロコラーゲンＩＩＩ ｍＲＮＡも、ケロイド組織で２０倍発現上昇していたと報告している（Ｎａｉｔｏｈら、２００１年）。ＩＬ−６（Ｘｕｅら、２０００年）及びＶＥＧＦ（Ｗｕら、２００４年）発現の増大もケロイド線維芽細胞で観測されている。

皮膚損傷によるケロイド発病の正確な機構はまだ明らかでない。ケロイド線維芽細胞における創傷後のサイトカイン及び成長因子又はそれらの受容体のレベルの増大、並びにこれらの分泌因子に対する有糸分裂反応の感作が示唆されている。ケロイド線維芽細胞では、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２が増大し、ＴＧＦ−β３は増大しなかった（Ｌｅｅら、１９９９年）。そして、ケロイド線維芽細胞における、ＴＧＦ−β１に対する感受性の増大は、フィブロネクチン（Ｂａｂｕら、１９９２年）及びコラーゲンの産生、並びに細胞増殖を増大させた。ＰＤＧＦα受容体の発現がケロイド線維芽細胞で増強されたが、これは、３種のＰＤＧＦアイソフォームすべてについて生じた、有糸反応の増大に対応していた（Ｈａｉｓａら、１９９４年）。ケロイド線維芽細胞で検出されたＩＧＦ−１受容体の過剰発現は、それらの侵襲性を強化したが、線維増殖は強化しなかった（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏら、１９９９年）。皮膚線維芽細胞に加えて、ケロイド組織上にある表皮も、サイトカイン（ＶＥＧＦ等）の過剰発現を示した（Ｇｉｒａら、２００４年）。加えて、異常な表皮−間充織間相互作用もケロイド発病に関係付けられており、これは、ケロイド由来のケラチノサイトと同時培養された場合に、正常ヒトケラチノサイトと同時培養された場合と比較して、正常線維芽細胞における増殖（Ｌｉｍら、２００１年）並びにコラーゲンＩ及びＩＩＩの分泌（Ｌｉｍら、２００２年）が増大していたことを証拠としている。ケロイドケラチノサイトと同時培養された線維芽細胞は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β受容体１、Ｓｍａｄ２、Ｉ型コラーゲン、結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）、及びＩＧＦ−ＩＩ受容体の発現増大も示したが、ケロイド線維芽細胞と同時培養されたケロイドケラチノサイトは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β３、及びＴＧＦ−β受容体１の発現増大を示した（Ｘｉａら、２００４年）。瘢痕線維症における、制御遺伝子（ｐ５３等）中の変異も提唱されている（Ｓａｅｄら、１９９８年）。

ＳＴＡＴタンパク質は、シグナル伝達及び転写の活性化という二重機能を有する。ＳＴＡＴタンパク質は、二次メッセンジャー及び転写因子として機能する細胞質タンパク質のファミリーである。それらは、サイトカイン及び成長因子に反応する正常な細胞シグナル伝達で根本的な役割を演じる。哺乳動物では、現在、７種の既知のＳＴＡＴタンパク質（ＳＴＡＴ１、２、３、４、５ａ、５ｂ及び６）があり、それぞれ異なった遺伝子にコードされているが、選択的ＲＮＡスプライシング又はタンパク質分解性の翻訳後プロセシングを受け、これによって、悪性細胞におけるＳＴＡＴの追加変種が説明される。最も注目すべきことは、悪性腫瘍の中でも、とりわけ乳房癌、頭頚部癌、黒色腫及び多発性骨髄腫で、ＳＴＡＴ３及び５が構成的に活性化されていることである。いくつかの上流経路を介した異常なシグナル伝達は、腫瘍細胞でＳＴＡＴの構成的な活性化をもたらすことができ、これによって、Ｂｃｌ遺伝子の発現上昇によるアポトーシスの防止、及びサイクリンＤＩ遺伝子の発現上昇による細胞周期進行の調節異常を含む、いくつかの共通した生物学機構を介した悪性進行がもたらされる。ＳＴＡＴ３の阻害が癌の阻止に有効であることが知られており、頭頚部癌（Ｌｅｏｎｇら、２００３年）及び皮膚癌（Ｃｈａｎら、２００４年、及びＰｅｄｒａｎｚｉｎｉら、２００４年）に対して効果的に作用することが示されている。

シグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）は、細胞増殖、移動、炎症、免疫応答及び細胞生存を含む様々な過程に関与している潜在性転写因子である。ＳＴＡＴ３は、不可避的なＴｙｒ７０５リン酸化（ｏｂｌｉｇａｔｏｒｙ Ｔｙｒ７０５ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）により、様々な成長因子及びサイトカインによって活性化される（Ｄａｒｎｅｌｌ、１９９７年）。このリン酸化によって、そのホスホチロシン残基と、その２量体パートナーの、対応するＳＨ２ドメインと、を介した２量体化が可能となる。ＳＴＡＴ３は、ホモ２量体を形成することも、Ｓｔａｔ１とヘテロ２量体を形成することもできる。その後、この２量体は核内に移動して、標的ＤＮＡ配列に結合し、標的遺伝子の転写に作用する（Ｄａｒｎｅｌｌら、１９９４年）。Ｔｙｒ７０５リン酸化がＳＴＡＴ３活性化に必須である一方、Ｓｅｒ７２７リン酸化は、最大限の遺伝子活性化に必要であることが示された（Ｗｅｎら、１９９５年）。内在的チロシンキナーゼ活性を欠失したサイトカイン受容体では、受容体に結合したＪａｎｕｓキナーゼ（Ｊａｋ）によってＴｙｒ７０５リン酸化が行われた（Ｄａｒｎｅｌｌ、１９９７年）。ＳＴＡＴ３ノックアウトは、胎生致死を引き起こし（Ｔａｋｅｄａら、１９９７年）、それにより、さらなる条件的な組織又は細胞特異的ノックアウト分析が促進された（Ｔａｋｅｄａら、２０００年）。ＳＴＡＴ３破壊ケラチノサイトが創傷治癒の遅延を示したことが以前に報告されている。詳細には、ケラチン５特異的プロモーターによって転写されるＣｒｅリコンビナーゼを用いて、ケラチノサイト内でＳＴＡＴ３発現を破壊したところ、表皮及び毛嚢の発生は正常に見え、増殖は影響されないままであったが、マウスのＳＴＡＴ３欠損上皮細胞の、創傷治癒及び成長因子依存性の移動には障害が見られた（Ｓａｎｏら、１９９９年）。最近、Ａ５４９カルシノーマ細胞内でＳｔａｔ３Ｃを過剰発現させた後のマイクロアレイ分析によって、Ｓｔａｔ３によって調節される遺伝子が、細胞侵入／移動、血管新生、及びＥＣＭの再構築を含めて、創傷治癒及び癌の双方に共通していることが判明した（Ｄａｕｅｒら、２００５年）。

多数の研究が、ＳＴＡＴ活性化、特にＳＴＡＴ３を癌進行に関連付けている。腫瘍細胞内でのＳＴＡＴタンパク質の作用を遮断するために、アンチセンス法（米国特許第６７２７０６４号明細書）、干渉ペプチド（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ）（例えば、低分子量組成物ＳＴＡ−２１（Ｓｏｎｇら、２００５年）、ホスホチロシンペプチド（Ｔｕｒｋｓｏｎら、２００１年））、ＳＴＡＴ３デコイオリゴヌクレオチド（Ｌｅｏｎｇら、２００３年）、及びククルビタシン組成物（例えば、ククルビタシンＩ（Ｂｌａｓｋｏｖｉｃｈら、２００３年）、ククルビタシンＱ（Ｂｌａｓｋｏｖｉｃｈら、２００５年））を含む様々な戦略が用いられている。

本発明者らは、正常患者及びケロイド患者から得た、皮膚組織、ケラチノサイト及び線維芽細胞を検査することによって、ケロイド瘢痕の発病機序を調査した。

まとめると、本発明者らは、線維増殖性疾患の発病機序におけるＳＴＡＴの新規な役割を初めて示した。

本発明の第１の態様は、線維増殖性疾患を治療又は予防するための薬物の製造における、ＳＴＡＴを調節する組成物の使用を提供する。

上記線維増殖性疾患は、ケロイド瘢痕化を含むことが好ましい。

調節という用語は、ＳＴＡＴの活性、ＳＴＡＴへのＲＮＡスプライシング若しくは翻訳後プロセシング、ＳＴＡＴのリン酸化、ＳＴＡＴ発現（ｍＲＮＡ発現及びタンパク質発現の両方を含む。）のレベル、又はＳＴＡＴの細胞内局在、のうちの１つ又は複数の活性化、阻害、遅延、抑制又は干渉を指すことが好ましい。調節という用語は、ＳＴＡＴ３に媒介されたシグナル伝達の低減を指すことがより好ましい。ＳＴＡＴの調節は、下記の実施例に記載の方法を用いて、又は前に参照した文献中の方法のような、当技術分野で一般的に使用されている方法によって評価することができる。

上記ＳＴＡＴは、ＳＴＡＴ３を含むことが好ましい。ＳＴＡＴ３は、生物学、特に癌の分野（Ｗｅｎら、１９９５年）で周知のタンパク質である。ＳＴＡＴ３の特性の一部は上述の通りである。ヒトＳＴＡＴ３のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号はＮＭ＿１３９２７６である。

一実施形態では、上記組成物は、ＳＴＡＴ、好ましくはＳＴＡＴ３、のＳｉＲＮＡであることが好ましい。短鎖干渉リボ核酸ＳｉＲＮＡ又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、転写後レベルで遺伝子発現を調節する新規な細胞機序として、そして遺伝子機能を制御する強力な手段として現れた。有効なｓｉＲＮＡ配列を選択する判定規準の改良、並びに哺乳類細胞、組織及び動物で遺伝子サイレンシングを行うためのｓｉＲＮＡを送達するベクターの作製が進展している。ｓｉＲＮＡを調製する方法には、化学合成、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、ｓｉＲＮＡ発現ベクター、及びＰＣＲ発現カセットのようないくつかの方法がある。どの方法を用いるかにかかわらず、ｓｉＲＮＡを設計するための最初のステップは、ｓｉＲＮＡの標的遺伝子部位を選択することである。最適なｓｉＲＮＡの選択は、ある遺伝子を特異的に標的とするように設計された数種のｓｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の結果として実現される。通常、そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、対象とする遺伝子を安定発現する細胞にいくつかのｓｉＲＮＡ２本鎖を形質移入するものである（Ｎｅｎｃｉｏｎｉら、２００４年）。特異的に設計されたＳｉＲＮＡは、ＳＴＡＴ発現のレベルを調節可能なものでありうる。

上記ＳＴＡＴ３のＳｉＲＮＡは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３（下記参照）を含むことが好ましい。これらは、ＳＴＡＴ３、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１３９２７６から、ＳＴＡＴ３に対して設計されたものである。ＳＴＡＴ３配列は長さ４９７８塩基対である。ＳｉＲＮＡ系でＳＴＡＴ３を阻害する、ＳＴＡＴ３配列に沿った３つの配列が同定された。上記３種の標的は次のように命名されている。
ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡ１（ｎｔ．４６１〜４８０）
配列番号１：ＡＧＴＣＧＡＡＴＧＴＴＣＴＣＴＡＴＣＡ；
ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡ２（ｎｔ．１２６４〜１２８３）
配列番号２：ＧＧＣＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＣＴＡＣＴＡ；及び
ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡ４（ｎｔ．１６６２〜１６８１）
配列番号３：ＧＣＧＴＣＣＡＴＣＣＴＧＴＧＧＴＡＣＡ

一実施形態では、上記ＳＴＡＴ３のＳｉＲＮＡは、配列番号４及び／又は配列番号５、或いは配列番号６及び／又は配列番号７、或いは配列番号８及び／又は配列番号９を含む。１つのヘアピンループが保存されており、その上流には、上述した３種の標的配列、すなわち配列番号１又は配列番号２又は配列番号３の１つがセンス方向（下線部）で隣接し、そしてその下流には、相補的なアンチセンス配列（イタリック体）が隣接する。次に、超過の塩基対、好ましくはＴリッチ配列を３’及び５’末端に追加する。対応するプライマーは、ＲＮＡｉによって断片化されるＳｉＲＮＡヘアピンループを生成する。上記ヘアピン配列に隣接する配列が１９塩基対のＳＴＡＴ３ ｍＲＮＡセクションに相補的である限り、ＳｉＲＮＡによって、ＳＴＡＴ３の翻訳が妨害されると予測されることは当業者ならば理解するであろう。この場合、ヘアピンループ（太字）を形成させるのに９ヌクレオチドの短い配列を用いたが、様々な研究グループが、３〜２３ヌクレオチドの範囲のループサイズを有するヘアピンｓｉＲＮＡを用いた遺伝子サイレンシングの成功結果を報告している。以下は、様々な研究グループによって用いられたループサイズ、及び特異的ループ配列の概要である。

ＳＴＡＴ３活性を調節するのにＳｉＲＮＡ変種が使用可能であることは、当業者ならば理解するであろう。ここで「変種」は、１又は複数の箇所で保存的又は非保存的なヌクレオチド挿入、欠失又は置換が生じたＳｉＲＮＡを指す。ただし、そのような変化は、基本的性質（例えば、活性を調節する性質）が顕著に変化していないＳｉＲＮＡをもたらすものであることを条件とする。この文脈における「顕著」とは、当業者であれば、この変種の性質は、元のＳｉＲＮＡの性質と比べてなお異なっている可能性があるが、それは非自明ではないであろう、と言うであろうことを意味する。

一実施形態では、上記ＳＴＡＴ３のＳｉＲＮＡは、配列番号４及び／又は配列番号５、或いは配列番号６及び／又は配列番号７、或いは配列番号８及び／又は配列番号９、からなる群より選択される。ベクターは、当技術分野で知られている手法を用いて調製することができる。下記の実施例に一例が記載されている。ＳｉＲＮＡのベクターは、ＳＴＡＴ３ ＳｉＲＮＡ標的を含有するように構築し、空のベクターで７〜９時間、２９３ＴベースのＰｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏパッケージング細胞系に形質移入し、４８時間後にアンホトロピックレトロウイルスを採取し、ペレットにして非付着細胞及び細胞片を除去し、０．４５μｍのセルロースアセテート膜に通して濾過した。分子生物学分野の当業者ならば、治療に使用可能なＳｉＲＮＡを送達するのに、多くのベクター及びパッケージング細胞系が利用可能であることを理解するであろう。

典型的な原核細胞ベクタープラスミドは、Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国カリフォルニア州リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）所在）から入手可能なｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（米国ニュージャージー州ピスキャタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）所在）から入手可能なｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０及びｐＲＩＴ５；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（米国ＣＡ９２０３７ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ）所在）から入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａである。

典型的な哺乳類細胞ベクタープラスミドは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（米国ニュージャージー州ピスキャタウェイ所在）から入手可能なｐＳＶＬである。このベクターは、クローニングされた遺伝子を発現させるのにＳＶ４０後期プロモーターを使用し、最も高いレベルの発現は、ＣＯＳ−１細胞等のＴ抗原産生細胞で見られる。誘導性哺乳類発現ベクターの一例がｐＭＳＧであり、これもＰｈａｒｍａｃｉａ社（米国ニュージャージー州ピスキャタウェイ所在）から入手可能である。このベクターは、クローニングされた遺伝子を発現させるのに、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復のグルココルチコイド誘導性プロモーターを使用する。

有用な酵母プラスミドベクターは、ｐＲＳ４０３〜４０６及びｐＲＳ４１３〜４１６であり、概ね、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社（米国ＣＡ９２０３７ラホーヤ所在）から入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５及びｐＲＳ４０６は、酵母組み込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母の選択マーカーであるＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２及びＵＲＡ３を取り込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ）である。

発現ベクターを構築するには、当業者に周知の方法を用いることができる。そのような方法の１つは、ホモポリマー末端を介した連結を行うものである。末端デオキシヌクレオチド転移酵素によってクローニングするべきＤＮＡ断片の露出３’ＯＨ基に、ｐｏｌｙｄＡ（又はｐｏｌｙｄＣ）ホモポリマーテールを付加する。その後、この断片は、線状化されたプラスミドベクターの末端に付加されたｐｏｌｙｄＴ（又はｐｏｌｙｄＧ）テールにアニールすることができる。

別の方法は、付着末端を介した連結を行うものである。適当な制限酵素の作用によって、核酸断片及びベクターに適合した付着末端を生成させることができる。これらの末端は、相補的な塩基対合を介して迅速にアニーリングするであろう。そして、残っているニックは、リガーゼの作用によって閉じることができる。

様々な制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーが、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（米国コネティカット州ニューヘブン（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）所在）を含む多くの供給源から購入可能である。

一実施形態では、上記組成物はククルビタシンであることが好ましい。ククルビタシン、Ｃ３２ Ｈ４６ Ｏ８は、主として、スカッシュ等のウリ科植物から単離される光化学物質である。ククルビタシンＱは、ＳＴＡＴ３の活性化を阻害するが、ＪＡＫ２の活性化は阻害せず、ククルビタシンＡは、ＪＡＫ２活性化を阻害するが、ＳＴＡＴ３活性化は阻害せず、ククルビタシンＢ、Ｅ及びＩは、両方の活性化を阻害する。ククルビタシンのＣ３カルボニルをヒドロキシルに変換すると、抗ＪＡＫ２活性が減失する結果となるが、ククルビタシンのＣ１１にヒドロキシル基を付加すると、抗ＳＴＡＴ３活性が減失する結果となる。ククルビタシンＱは、ＳＴＡＴ３の活性化を選択的に阻害し、ＪＡＫ２、Ｓｒｃ、Ａｋｔ、Ｅｒｋ又はＪＮＫ活性化を阻害せずにアポトーシスを誘導する。さらに、ククルビタシンＱは、構成的に活性化されたＳＴＡＴ３を含有するヒト腫瘍及びマウス腫瘍において、それを含有しないものと比較して、より強力にアポトーシスを誘導する（Ｂｌａｓｋｏｖｉｃｈら、２００５年）。ＳＴＡＴのリン酸化を阻害することによって、そのＳＴＡＴ２量体は核へ移行できなくなる可能性があり、それにより、そのＳＴＡＴがＤＮＡに結合するのが阻害され、そのような経路を介した遺伝子調節が阻害される。

上記ククルビタシンは、ククルビタシンＩ又はククルビタシンＱを含むことが好ましい。ククルビタシンＩは、米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）多様性セット（Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔ）から、ｖ−Ｓｒｃで形質転換されたＮＩＨ３Ｔ３細胞及びヒト癌細胞内のホスホチロシンＳＴＡＴ３のレベルを強力かつ迅速に１〜２時間以内に抑制するものとして同定された（ＪＳＩ−１２４）。ホスホチロシンＳＴＡＴ３レベルの抑制は、ＳＴＡＴ３ ＤＮＡの結合の阻害と、ＳＴＡＴ３媒介性ではあるが、血清応答エレメント媒介性ではない遺伝子転写と、をもたらした。ククルビタシンＩは、チロシンリン酸化されたＪａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）のレベルも低下させたが、Ｓｒｃではそのレベルを低下させなかった。ククルビタシンＩは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ３に関して高度に選択的であり、Ａｋｔ、細胞外シグナル制御キナーゼ１／２、又はｃ−Ｊｕｎ ＮＨ（２）末端キナーゼによって媒介された経路のような、他の発癌経路及び腫瘍生存経路は阻害しない。ククルビタシンＩは、構成的に活性化されたＳＴＡＴ３を高レベルで発現するモデルで強力に成長を阻害したが、それは、ＳＴＡＴ３非依存的な発癌性腫瘍の成長には影響を与えなかった（Ｂｌａｓｋｏｖｉｃｈら、２００３年）。線維増殖性細胞では、癌細胞内での阻害と比較して、より高いククルビタシンＩの感受性が存在する可能性がある。ククルビタシンＩによりＪａｋ２及びＳｔａｔ３の両方を阻害することによって、ＳＴＡＴ３発現のみを阻害するのと比較して、より強力な阻害作用を細胞増殖及び移動に及ぼしうる。

一実施形態では、上記組成物はＳＴＡＴ３デコイオリゴヌクレオチドを含むことが好ましい。ＳＴＡＴ３デコイは、１５ｍｅｒの２本鎖オリゴヌクレオチドを含み、それは、ｃ−ｆｏｓプロモーター内のＳｔａｔ３応答エレメントに密接に対応している。ＳＴＡＴ３デコイは、活性化されたＳｔａｔ３に特異的に結合し、Ｓｔａｔ３がＳＴＡＴ３結合エレメントに結合するのを阻止する。ＳＴＡＴ３デコイオリゴヌクレオチド配列は次の通りである。
配列番号５：
５’ＣＡＴＴＴＣＣＣＧＴＡＡＡＴＣ３’ ３’ＧＴＡＡＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＣ５’

一実施形態では、上記組成物はホスホチロシンペプチドであることが好ましく、より好ましくは、上記ホスホチロシンペプチドはＸＹ^＊Ｌ又はＡＹ^＊Ｌを含む。Ｓｔａｔ３の小分子ホスホチロシンペプチド阻害物質は、Ｓｔａｔ３ ＳＨ２ドメイン結合ペプチドであるＰＹ^＊ＬＫＴＫ（配列中、Ｙ^＊はホスホチロシンを表す。）の能力を破壊する。ＰＹＬＫＴＫ又はＰＦＬＫＴＫではなく、ＰＹ^＊ＬＫＴＫが核抽出物中に存在する場合に、ＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合活性レベルの有意な低下、そしてより少ない程度のＳＴＡＴ１の低下が起こり、ＳＴＡＴ５のそれには影響がない。アラニンスキャニング変異誘発及びＰＹ^＊ＬＫＴＫの欠失誘導体の分析は、Ｙ＋１位置のＬｅｕ残基及びＹ−１位置の置換基（ただし必ずしもＰｒｏではない。）が活性ＳＴＡＴ３の破壊に必須であることを明らかにし、それによって、最小活性配列をＸＹ^＊Ｌというトリペプチドにマッピングする。ビーズ結合のＰＹ^＊ＬＫＴＫペプチドを用いた研究は、このホスホペプチドがｉｎ ｖｉｔｒｏで直接的にＳＴＡＴ３単量体と複合体形成することを実証し、ＰＹ^＊ＬＫＴＫがＳＴＡＴ３：ＳＴＡＴ３ ２量体を破壊することを示唆する。ＳＴＡＴ３のペプチド誘導性阻害の機能的重要性に関する証拠として、ＰＹ^＊ＬＫＴＫ−ｍｔｓ（ｍｔｓは膜移行配列）は、構成的でリガンド誘導性のＳＴＡＴ３活性化をｉｎ ｖｉｖｏで選択的に阻害した。さらに、ＰＹ^＊ＬＫＴＫ−ｍｔｓは、Ｓｒｃ腫瘍性タンパク質による形質転換を抑制するが、これは、構成的なＳＴＡＴ３活性化を必要とすることが以前に示されている。ＸＹ^＊Ｌは、ＳＴＡＴ３シグナル伝達を阻害する最小ペプチドである。

ＳＴＡＴ３のＳＨ２ドメイン結合ホスホペプチドであるＰＹ^＊ＬＫＴＫ、並びにそのトリペプチド誘導体であるＰＹ^＊Ｌ及びＡＹ^＊Ｌ（配列中、Ｙ^＊はホスホチロシンを表す。）は、ＳＴＡＴ３の生化学的活性及び生物学的機能を阻害する。ベンジル、ピリジル又はピラジニルによるＹ−１残基の置換を有するＰＹ^＊Ｌ（又はＡＹ^＊Ｌ）の変異に基づいて、新規誘導体は、ＳＴＡＴ３活性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの破壊に関して、ＰＹ^＊Ｌ又はＡＹ^＊Ｌトリペプチドより５倍強力であった（Ｔｕｒｋｓｏｎら、２００１年）。

一実施形態では、上記組成物は、小さな低分子量組成物であるＳＴＡ−２１であることが好ましい。ＳＴＡ−２１は、Ｓｔａｔ３ＤＮＡ結合活性、Ｓｔａｔ３ ２量体化、及びＳｔａｔ３依存性ルシフェラーゼ活性を阻害する。さらに、ＳＴＡ−２１は、構成的なＳｔａｔ３シグナル伝達を有する乳癌細胞の生存を低減するが、構成的Ｓｔａｔ３シグナル伝達を有しない細胞には最小限の影響を有する（Ｓｏｎｇら、２００５年）。

一実施形態では、上記組成物は、上述の通りの、ＳＴＡＴ３を調節する組成物と、薬学的に許容される担体と、を含むことが好ましい。上記組成物は、活性成分の、１日量若しくは単位、１日サブ用量、又はその適切な一部を含有する単位用量であることが好ましい。

通常、ヒトでは、上記組成物の経口又は局所投与が好ましい経路であり、最も好都合である。受容者が嚥下障害又は経口投与後における薬物吸収障害を患っている状況では、上記薬物は、非経口投与、例えば舌下又は頬側投与することができる。本発明の組成物は、通常、局所的に、又は任意の非経口経路によって、活性成分を含む医薬組成物の形態で、（任意選択で非毒性の有機又は無機の酸又は塩基又は付加塩の形態で、）薬学的に許容される剤形で投与されるであろう。上記組成物は、治療するべき線維増殖性疾患及び患者、並びに投与経路に応じて、様々な用量で投与することができる。

ヒト治療では、上記組成物を単独で投与することもできるが、通常は、意図された投与経路及び標準的な調剤実務に考慮して選択された適切な医薬品添加剤、希釈剤又は担体と混合して投与される。

一実施形態では、上記組成物は、患者への局所投与に適していることが好ましい。皮膚への局所投与には、上記組成物は、例えば、ミネラルオイル、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン組成物、乳化ろう及び水のうちの１つ又は複数を有する混合物中に懸濁又は溶解された活性組成物を含有する適当な軟膏剤として処方することができる。或いは、例えば、ミネラルオイル、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水のうちの１つ又は複数を有する混合物中に懸濁又は溶解された適当なローション又はクリームとして、それらを処方することもできる。上記組成物は、ローション、溶液、クリーム、軟膏剤又は散布剤の形態で局所的に投与することもできる。

一実施形態では、上記医薬組成物はシリコーンゲルを含むことが好ましい。これは、医療用グレードのポリシロキサン組成物シーティングの形態であってもよい。それは再使用可能であってもよい。それは、液体ゲルの形態にある、実質的に水を含まない組成物であってもよい。上記シリコーンゲルは、上記組成物との混合物の形態であってもよく、或いは、上記組成物の投与後に上記シリコーンゲルを患者に貼付してもよい。

本発明の別の態様は、ＳＴＡＴを調節する組成物と、シリコーンゲルと、を含む部品キットである。上記組成物は、上述の通りＳＴＡＴ３を調節することが好ましい。

口内の局所投与に適した組成物には、風味付きベース、通常はショ糖及びアカシア又はトラガントの中に活性成分を含むトローチ剤；ゼラチン、グリセリン、又はショ糖及びアカシア、のような不活性ベース中に活性成分を含むパステル剤；並びに適当な液体担体中に活性成分を含む洗口剤、が含まれる。

本発明の組成物は、非経口的に、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋内又は皮下に投与することもでき、或いは注入法によってそれらを投与することもできる。それらは、他の物質、例えばその溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースを含有しうる無菌水溶液の形態で用いるのが最もよい。上記水溶液は、必要に応じて、（好ましくはｐＨ３〜９に）適切に緩衝されているのがよい。無菌状態での適当な非経口組成物の調製は、当業者に周知の標準的な調剤技術によって容易に行われる。

非経口投与に適した組成物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、及び上記組成物を、意図された受容者の血液と等張にする溶質を含有する水性及び非水性の無菌注入液、並びに懸濁薬剤及び増粘剤が含まれる水性及び非水性の無菌懸濁液が含まれる。上記組成物は、単位用量又は多用量容器（例えば、密封されたアンプル及びバイアル）に入れて提供することもでき、また、使用直前の無菌液体担体（例えば注射用水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することもできる。即時注射用溶液及び懸濁液は、上述の種類の無菌粉末、果粒及び錠剤から調製することができる。

一実施形態では、上記医薬組成物はさらにコルチコステロイドを含むことが好ましい。トリアムシノロンアセトニド又は別のコルチコステロイド薬のようなコルチコステロイドを含む非経口投与は、通常、４〜６週間の間隔で反復することができる。上記コルチコステロイドは、上記組成物との混合物の形態であってもよく、或いは上記組成物の投与後にコルチコステロイドを患者に非経口投与してもよい。

本発明の別の態様は、ＳＴＡＴを調節する組成物と、コルチコステロイドと、を含むキットである。上記組成物は、上述の通りＳＴＡＴ３を調節することが好ましい。

上記組成物は、例えば皮膚用パッチ剤の使用によって、経皮投与することもできる。一実施形態では、上記組成物を経皮投与することが好ましい。経皮投与は、患者の皮膚に貼付した膜、パッチ又はシートを介したものでよい。上記膜は、コルチコステロイド又は他の混合物を含む、上記組成物の徐放投与用に設計されたものでよい。上記膜は、実質的に水を含まない組成物の利点を有するように設計されたものでもよい。無菌状態での適当な膜組成物の調製は、当業者に周知の標準的な経皮的手法によって容易に行われる。

一実施形態では、上記組成物は、患者へのエアゾール送達に適した処方を含む。本発明の組成物は、鼻腔内投与することも、吸入によって投与することもでき、適当な高圧ガス（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン（１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ １３４Ａ３）、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルプロパン（ＨＦＡ ２２７ＥＡ３）等）、二酸化炭素、又は他の適当な気体）を使用した加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーからの、乾燥粉末吸入器又はエアゾールスプレーの形態での送達が好都合である。加圧エアゾールの場合には、計量された量を送達するバルブを提供することによって、用量単位を決定することができる。上記加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーは、例えば、エタノール及び高圧ガスの混合物を溶媒として用いた、活性組成物の溶液又は懸濁液を含有しうるものであり、上記混合物は、潤滑剤（例えば、トリオレイン酸ソルビタン）をさらに含有しうる。吸入器又は注入器で使用するための（例えばゼラチン製の）カプセル及びカートリッジは、本発明の組成物と、適当な粉末基剤（ラクトース、デンプン等）と、の粉末混合物を含有するように処方することができる。

エアゾール又は乾燥粉末組成物は、患者に送達するために、各計量用量又は「一服」が、本発明の組成物を少なくとも１ｍｇ含有するように調製することが好ましい。エアゾールを用いた総日用量は、患者によって異なること、そして、それを単回用量で投与しても、より一般的に、その日全体に渡った分割量で投与してもよいことが理解されよう。エアロゾル投与は、とりわけ肺線維症の患者に適したものでありうる。

例えば、本発明の組成物は、風味剤又は着色剤を含有しうる、即時放出、徐放又は制御放出投与用の、錠剤、カプセル剤、腟坐薬、エリキシール、溶液又は懸濁液の形態で、経口、頬側又は舌下投与することができる。無菌状態での適当な経口組成物の調製は、当業者に周知の標準的な調剤技術によって容易に行われる。本発明の組成物は、陰茎海綿体注射を介して投与することもできる。或いは、坐剤又は腟坐剤の形態で本発明の組成物を投与することもできる。

とりわけ眼の線維増殖性疾患の治療用には、経眼経路で組成物を投与することができる。眼科使用では、本発明の組成物は、等張のｐＨ調整無菌食塩水中の微粉状懸濁液として、又は好ましくは等張のｐＨ調整無菌食塩水溶液として、任意選択で塩化ベンジルアルコニウムのような保存剤と組み合わせて処方することができる。或いは、それらはペトロラタムのような軟膏剤中に処方することもできる。

本発明のさらに別の態様は、線維増殖性疾患を治療するのに有用と予測される組成物を同定する方法であって、線維増殖性細胞を試験混合物で処理するステップと、前記試験混合物の、ＳＴＡＴへの影響を評価するステップと、を含む方法である。

上記方法は、ＳＴＡＴを調節する組成物を選択するステップを含むことが好ましい。上記組成物は、ＳＴＡＴ活性、ＳＴＡＴのリン酸化、ＳＴＡＴのｍＲＮＡ又はタンパク質発現レベル、又はＳＴＡＴの細胞内局在、のうちの１つ又は複数を調節することがより好ましい。上記ＳＴＡＴの活性を調節する組成物は選択することができる。例えば、ＳＴＡＴの活性を低下させる組成物は、選択されたものであっても、また、さらなる研究又は化合物設計のための出発点であってもよい。選択された組成物は、より好ましくは、ＳＴＡＴ３媒介シグナル伝達の活性を低下させるものであるのがよい。ＳＴＡＴの調節は、下記実施例に記載する方法を用いて、或いは前に引用した文献中の方法のような、当技術分野で一般的に使用されている方法によって評価することができる。

一実施形態では、ＳＴＡＴはＳＴＡＴ３であることが好ましい。さらに別の実施形態では、上記線維増殖性細胞はヒトケロイド組織に由来することが好ましい。

本発明の方法は、コンピュータモデリングを用いて選択された組成物を、当業者に知られている通りに、準備、合成、精製及び／又は処方するステップと、上記組成物がＳＴＡＴの活性を調節するかどうかを評価するステップと、をさらに含みうる。上記組成物は、薬学的使用のために、例えば動物又はヒトでのｉｎ ｖｉｖｏ試験で使用するために処方することができる。

一実施形態では、上記試験混合物の影響を評価するステップは、ＳＴＡＴによって調節されるポリペプチドの量又は活性を評価することを含むことが好ましい。コラーゲン等のタンパク質、又はＳＴＡＴ３によって発現上昇する可能性のある遺伝子（サイクリンＤ１、Ｍｙｃ、Ｍｃｌ−１、ＳＯＣＳ３、Ｂｃｌ２、Ｂｏｌ−ｘＬ等）、の活性又はレベルを調節する組成物の能力を評価することができる。例えば、既知のアッセイを用いて、Ｍｙｃの活性又はレベルを評価することができる。そのような評価は、高スループットスクリーニングに適したマイクロタイタープレートフォーマット又は他のフォーマットで行ってもよい。上記評価は、当業者に周知の酵素アッセイ法を用いて行ってもよい。

上述の通り、選択又は設計された組成物は、合成（既に合成されていない場合）又は精製し、ＳＴＡＴへの影響について試験することができる。上記組成物は、コラーゲンＩ及び／又はコラーゲンＩＩＩのｍＲＮＡレベル及び／又はポリペプチドレベルを含むコラーゲン発現への影響、或いはコラーゲンが存在する細胞又は組織への影響に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングで試験することができる。上記細胞又は組織は、内因性コラーゲンを含有してもよく、或いは外因性コラーゲン（コラーゲンをコードする内因性核酸の操作の結果として発現されるコラーゲンも含む。）を含有してもよい。上記組成物は、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングで試験してもよく、この場合、トランスジェニック動物又は組織を使用しうる。適当な試験は当業者には明らかであろう。そして、それらの例には、生物学的により重要な評価又は経路評価（例えば、細胞増殖、線維性ポリペプチドの産生、レポーター遺伝子活性の測定）が含まれる。

当業者には周知の通り、組成物は、他の試験、例えば毒性試験又は代謝試験にも供することができる。

一実施形態では、上記試験混合物の影響は、細胞増殖の量及び／又は細胞移動の量を評価することをさらに含むことが好ましい。ＳＴＡＴ３の阻害剤は、ケロイド線維芽細胞のコラーゲン産生、細胞増殖及び移動を、正常線維芽細胞に匹敵するレベルにまで抑制することができた。

本発明のさらに別の態様は、線維増殖性疾患を発生する患者の危険性又は線維増殖性疾患の重度の評価を補助する方法を提供し、この方法は、試料中でのＳＴＡＴ発現又はＳＴＡＴ活性のレベルを測定するステップを含む。

好ましい実施形態は、上記レベルが、例えば手術又は傷害の後に患者が線維増殖性疾患を発症する危険性が低いこと、中程度であること、又は高いことを示しているかどうか、の判定を提供する。図２Ａは、ＳＴＡＴ発現及び活性のレベルから決定することができる、低危険度（ＮＳ３１、ＮＳ３２、ＮＳ３３、ＮＳ３４、ＮＳ３５）、中危険度（ＫＳ５３、ＫＳ５６）又は高危険度（ＫＳ５１、ＫＳ５２、ＫＳ５４、ＫＳ５５、ＫＳ５７、ＫＳ５８）、の患者の例である。

一実施形態では、上記試料は、手術後、短時間のうちに、そして瘢痕がケロイドを形成するかどうかを他の方法で判定可能となる前に患者から採取されたものである。

一実施形態では、上記試料は瘢痕から得られたものである。これは、特に、上記瘢痕が、上述の肥厚性のものであるかケロイドであるか、に関して不確実性が存在する場合である。

ＳＴＡＴはＳＴＡＴ３であることが好ましい。

以下、非限定的な図及び実施例を参照して本発明を説明する。

本明細書で言及されたすべての参考文献は、参照されることにより本明細書に組み込まれる。

本研究で提示された正常皮膚（ＮＳ）、ケロイド皮膚（ＫＳ）、正常線維芽細胞（ＮＦ）、ケロイド線維芽細胞（ＫＦ）、正常ケラチン細胞（ＮＫ）及びケロイド角化細胞（ＫＫ）

（実施例１）
本発明者らは、ケロイド組織内の表皮及び真皮細胞、並びにケロイド線維芽細胞におけるＳＴＡＴ３発現及びリン酸化の増大を観測した。ｓｉＲＮＡ又はククルビタシンＩによるＳＴＡＴ３発現及びリン酸化の阻害は、ケロイド線維芽細胞におけるコラーゲン産生の同時減失、細胞増殖障害、細胞移動の遅延を引き起こした。本発明者らは、初めて、ケロイド発病機序におけるＳＴＡＴ３の役割と、コラーゲン産生の新規な調節と、を示した。ＳＴＡＴ３の阻害剤は、ケロイド瘢痕、及びおそらく他の線維増殖性疾患の将来的治療に有用な治療となりうる。この実施例で、発明者らは、ＳＴＡＴ３がケロイド瘢痕の発病機序に関与しているかどうかの解明に取り組んだ。さらに、ＳＴＡＴ３は、創傷治癒の間に組織傷害に反応して、様々な細胞成分によって分泌されることが知られている様々なサイトカイン及び成長因子、リガンドで活性化される重要分子である。本発明者らの結果は、ケロイド組織、ケロイド由来線維芽細胞、及び増殖状態にあるケラチノサイトにおける、ＳＴＡＴ３発現及び／又はリン酸化の増強を示した。本発明者は、Ｊａｋ１ではなく、チロシンキナーゼＪａｋ２の活性化が、ケロイド線維芽細胞において、正常な皮膚線維芽細胞と比較して、同時的に増強されていることを検出した。加えて、本発明者らは、ケロイド線維芽細胞によるコラーゲン産生、並びにケロイド線維芽細胞の細胞増殖及び移動の増大を観測し、これらは、ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡ及びＪａｋ２／ＳＴＡＴ３の阻害剤であるククルビタシンＩを介したＳＴＡＴ３阻害によって抑制された。これらのデータは、ケロイド瘢痕の発病機序におけるＳＴＡＴ３の重要な役割を明らかにした。ケロイド瘢痕は、ＳＴＡＴ３の阻害によって改善が可能であり、ケロイド線維症の治療のための治療標的として有用でありうる。ケロイド瘢痕は、自然発生的に生じるものではなく、皮膚損傷後における過剰な創傷治癒の結果であり、細胞移動、増殖、炎症、コラーゲン及び他のＥＣＭ成分の合成及び分泌、並びに創傷部マトリックス（ｗｏｕｎｄ ｍａｔｒｉｘ）の再構築における異常を示す。本発明者らは、正常皮膚及びケロイド組織切片の両方、並びに線維芽細胞及びケラチノサイト細胞培養でのケロイド発病機序におけるＳＴＡＴ３の役割を調査した。本発明者らのデータは、ケロイド組織では、基底層でＳＴＡＴ３がリン酸化されているが、表皮のより表層にある分化した層ではその程度が低いことを示した（図１Ｃ）。これは、分化状態ではなく、むしろ増殖性の状態に維持されているケロイドケラチノサイトにおけるＴｙｒ７０５ ＳＴＡＴ３リン酸化が増強されていることによって実証される（図４）。真皮では、本発明者らは、ＳＴＡＴ３発現及びリン酸化の両方が、ケロイド組織切片、組織溶解物、及び線維芽細胞で増強されていることを示した（図１Ｂ、１Ｃ、及び２）。ケロイド瘢痕におけるコラーゲン産生、線維芽細胞増殖、及び移動の増大は以前に報告されている。したがって、本発明者らは、本発明者らが観測したＳＴＡＴ３発現及びリン酸化の増大が、ケロイド発病機序におけるこれらのいずれかの過程に役割を有しているかどうかを、ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡを使って、又はＪａｋ２／Ｓｔａｔ３活性化の阻害剤であるククルビタシンＩによってさらに調査した。実際、本発明者らは、いずれかの方法によるＳｔａｔ３リン酸化及び発現の阻害が、ケロイド線維芽細胞のコラーゲン産生、増殖、及び移動を、正常線維芽細胞のものに匹敵するレベルにまで減弱させることを見出した（図５〜８）。試験されたｓｉＲＮＡの中では、ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡ ４が最も有効であり、１μＭという低濃度のククルビタシンＩが、ケロイド線維芽細胞の増殖及び移動の速度を正常線維芽細胞の速度にまで低下させるのに有効であった。Ｔｙｒ７０５及びＳｅｒ７２７ ＳＴＡＴ３リン酸化、並びにコラーゲン産生を阻害するにはより高用量のククルビタシンＩが効果的であるが（図５Ｂ）、細胞形態の変化、並びに、より高用量で起こる一部の細胞死の始まりも本発明者らは観察した（図６Ｃ及び８Ｄ）。以前に報告されている通り、Ａ５４９ヒト肺癌細胞を１０μＭのククルビタシンＩで２４ｈ処理すると、３３％の腫瘍細胞死及び９．８％のアポトーシスを誘導し、さらにヌードマウスにおけるＡ５４９腫瘍増殖も５５．４％阻害した（Ｓｕｎら、２００５年）。しかし、本発明者らの初代細胞では、これらの癌細胞と比較して、ククルビタシンＩに対する感受性が高く、１μＭ、３０分間の曝露にさえ反応することを本発明者らは観測した。ククルビタシンＩは、ｐＳＴＡＴ３よりも、ｐＪａｋ２の、より強力な阻害剤であることが示されていた。また本発明者らは、ケロイド線維芽細胞では、正常線維芽細胞と比較して、ｐＪａｋ１でなくｐＪａｋ２の活性化が増強されていることを観測した（図３）。ククルビタシンＩによるＪａｋ２及びＳＴＡＴ３の両方の阻害は、ｓｉＲＮＡによってＳＴＡＴ３発現のみを阻害するのと比較して、細胞増殖及び移動に対して、より強力な阻害作用を引き起こしているようであった。

皮膚創傷治癒の過程は、炎症事象、組織形成事象（再上皮化、顆粒組織の形成、新生血管形成）、及び組織再構築事象の三相に、独断的に分割することができ、これらは、様々な細胞成分による、様々なケモカイン、サイトカイン、及び成長因子の時間的かつ空間的に調和した分泌によって支配されている。ＳＴＡＴ３は、これらのリガンドの大部分に反応して活性化される重要分子である。ここで本発明者らは、ケロイド組織、線維芽細胞、及びケラチノサイトにおけるＳＴＡＴ３発現及びリン酸化の増強を観測した。これは、停止シグナル若しくはその下方制御の欠失、及び／又はサイトカイン若しくは成長因子による間断のない刺激を示すものである。実際、ＳＴＡＴ３を活性化する一部のサイトカイン（ＩＬ−６等）がケロイド組織で増大していることが報告されている（Ｘｕｅら、２０００年）。その一方、ケロイド組織におけるＳＴＡＴ３に、ＳＴＡＴ３が過剰発現されやすくなるなんらかの変異が存在するかどうかはいまだに判定されないままである。Ｓｔａｔ３は様々な創傷治癒のすべての相に関与しているので、Ｓｔａｔ３の正常な調節はこれらの過程全体を通して必要であり、Ｓｔａｔ３シグナル伝達の調節異常は、創傷治癒障害及び線維症に向けて情勢を変化させるものであろうと本発明者らは推測する。炎症を欠失している胎児組織が無瘢痕の完全な創傷治癒を行い、急性炎症性浸潤の存在下では、瘢痕形成がそれに続いたので、炎症誘発性サイトカインによるＳｔａｔ３の活性化も、炎症相での瘢痕形成の進行におけるＳｔａｔ３の役割を示唆する（Ｙａｎｇら、２００３年）。

線維芽細胞は、ＥＣＭの合成、沈着、及び再構築の原因となっている。ここで本発明者らは、Ｓｔａｔ３の過剰発現及びリン酸化が線維芽細胞による過剰なコラーゲン沈着において新規な役割を演じており、それがケロイド等の線維性組織へと導くことを報告する。ｓｉＲＮＡ又はククルビタシンＩによるＳＴＡＴ３発現の阻害は、それに対応するコラーゲン産生の低減を示し（図５）、これは、コラーゲン産生がＳＴＡＴ３によって転写レベルで調節されていることを示唆する。コラーゲンＩα１型すなわちＣＯＬ１Ａ１及びコラーゲンＩＩＩα１型すなわちＣＯＬ３Ａ１両方のプロモーター領域の予備的なスキャニングによって、いくつかの推定上のＳＴＡＴ３結合部位が明らかになった。ケロイドで強い合成が見出されている２種のコラーゲンである、プロコラーゲンＩ型及びＩＩＩ型の転写にＳｔａｔ３が直接的影響を有するかどうかを調査するのは興味深いことであろう。

構成的に２量体化／活性化されたＳＴＡＴ３変異体（ＳＴＡＴ３Ｃ）の過剰発現が細胞の形質転換及び腫瘍形成を引き起こしたので、ＳＴＡＴ３は、潜在的発癌性を有することが示された。最近、腫瘍は「治癒しない創傷」であるという概念に基づき、Ａ５４９カルシノーマ細胞でＳＴＡＴ３Ｃを過剰発現させた後のマイクロアレイ分析によって、細胞侵入／移動、血管新生、及びＥＣＭの再構築を含む、ＳＴＡＴ３で調節されている遺伝子が、創傷治癒及び癌の両方に共通していることが判明した。これは、線維増殖性疾患、若しくはケロイドに見られるようなおかしくなった創傷治癒において、機能亢進性のＳＴＡＴ３が役割を演じているという本発明者らの観察を支持するものである。しかし、癌細胞は転移するのに、瘢痕組織は転移しないので、創傷治癒と皮膚癌との間には依然として明白な相違が存在する。創傷治癒と皮膚癌との間で、異なった役割をＳＴＡＴ３がどのようにして演じているかはいまだ明らかでない。ケラチノサイト特異的なＳＴＡＴ３欠失を有するマウスは、創傷治癒障害を示した。これは、ケラチノサイトにおけるＳｔａｔ３の発現及び／又は活性化のいずれかがこの過程で重要な役割を演じていることを示唆する。一方、活性なＳＴＡＴ３Ｃをケラチノサイト内に導入すると、２週間以内にマウスで自然発生的に乾癬を引き起こす（Ｓｏｎｏら、２００５年）。しかし、テープ剥離による創傷で発生する乾癬病巣は、ケラチノサイト内における活性化されたＳｔａｔ３と、活性化されたＴリンパ球の存在との両方が必要であり、ケラチノサイト内における活性Ｓｔａｔ３のみでは創傷治癒の障害を引き起こすのに不十分であることを実証している。本発明者らは、ケロイド線維芽細胞及び増殖中のケラチノサイトでＳＴＡＴ３が機能亢進性となっていることを示したが、Ｔ細胞もケロイド瘢痕化に必要であるかどうかはいまだに判定されていない。皮膚癌に関しては、２ステップモデルの化学物質誘発性皮膚発癌操作を受けた、ケラチノサイト特異的なＳｔａｔ３欠失マウスにおいて、ＳＴＡＴ３は皮膚腫瘍の発生に対して完全な抵抗性を有し、ケラチノサイト内でｖ−Ｈａ−ｒａｓを発現するトランスジェニックマウスにＳＴＡＴ３阻害剤を局所的に投与したところ、乳頭腫形成を阻害した（Ｃｈａｎら、２００４年、及びＰｅｄｒａｎｚｉｎｉら、２００４年）。癌進行におけるＴ細胞活性化の関与はこれらの報告では取り組まれておらず、この問題に答えるにはＴ細胞欠失ヌードマウスを用いたさらなる研究が必要であろう。

最近、腫瘍形成及び転写制御における非リン酸化ＳＴＡＴ３の関与が提唱されている。本発明者らは、正常組織及びケロイド組織におけるケラチノサイト及び線維芽細胞の両方でＳＴＡＴ３の強い発現を観測し、ＤＡＰＩによる核染色との重複画像は、ＳＴＡＴ３の強い核内分布を示した。しかし、ｐＳＴＡＴ３染色では、本発明者らは、いったいどれだけのＳＴＡＴ３がリン酸化されているのか決定することができなかった。ｐＴｙｒ７０５ ＳＴＡＴ３が核に移行し、標的ＤＮＡ配列に結合し、遺伝子の転写を調節することは確固として確立されているが、非リン酸化Ｓｔａｔ３の役割はそれほど明らかではない。本発明者らは、細胞質又は核の非リン酸化ＳＴＡＴ３がケロイド発病機序における役割を演じているかもしれないが、それは、ｐＴｙｒ７０５ ＳＴＡＴ３亜集団のものとは異なった方法である可能性が最も高いと考える。しかし、この機構はいまだ不明確であり、さらなる調査が必要である。

まとめると、本発明者らは、初めて、ケロイド瘢痕の発病機序におけるＳＴＡＴ３の新規な役割を示した。ＳＴＡＴ３発現又はリン酸化の阻害剤は、ケロイド線維芽細胞によるコラーゲン産生、細胞増殖、及び移動を、正常線維芽細胞に匹敵するレベルにまで抑制することができた。ｓｉＲＮＡ及びククルビタシンＩに加えて、ククルビタシンＱ（ククルビタシンＩの類似体であり、かつＳＴＡＴ３の選択的な阻害剤である。）（Ｓｕｎら、２００５年）、ＳＴＡ−２１（Ｓｏｎｇら、２００５年）、ＳＴＡＴ３デコイオリゴヌクレオチド（Ｌｅｏｎｇら、２００３年）、ホスホチロシンペプチド（Ｔｕｒｋｓｏｎら、２００１年）等の他の薬物を含む他のＳＴＡＴ３阻害剤も有用であると考えられる。ここに例示したものはすべて、抗腫瘍活性、アポトーシスの増強、増殖阻害、又は癌由来若しくはｖＳｒｃ形質転換細胞系の細胞形質転換の抑制のいずれかを示す。ＳＴＡＴ３の阻害を標的とするこれらの潜在的癌治療薬、又はＳＴＡＴ３を阻害するいかなる他の組成物も、ケロイド瘢痕を含む線維増殖性疾患の将来的臨床治療に有用であると考えられる。

（線維増殖性組織の特性分析）
正常組織及びケロイド組織：
皮膚及びケロイド組織の外科的切除の前に、シンガポール大学（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ）施設内審査委員会及びシンガポール国立医療グル−プ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｇｒｏｕｐ）領域別審査委員会（Ｄｏｍａｉｎ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）からの倫理的承認、並びに患者からのインフォームドコンセントを得た。すべての患者が、ケロイド病変のいかなる先行治療も受けていなかった。すべてのケロイド病変のカラースライドフォトドキュメンテーションに加えて、全病歴を聴取し、理学的検査を行った。本明細書で言及した正常皮膚及びケロイド瘢痕組織のリストを表１に示す。

細胞培養：
この研究で言及した正常及びケロイド由来線維芽細胞並びにケラチノサイトのリストを表１に示す。単離された線維芽細胞は、４５００ｍｇ／ｍｌグルコースを含有し、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、米国ニューヨーク州所在）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、及び１００ｎｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ社、米国ミズーリ州所在）を添加したＤＭＥＭ中で培養した。単離されたケラチノサイトは、ケラチノサイト増殖培地（ＫＧＭ；Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、米国ニューヨーク州所在）又はＥｐｉＬｉｆｅ培地（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社、米国オレゴン州所在）のいずれかの中で培養した。ケラチノサイトが重層化し、最終分化に到達するのを可能にするには、無血清ＫＧＭ中の細胞を単層培養で１００％集密状態まで維持し、それに続いて１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で４日間維持した後、細胞を気相液相界面に曝露した（Ｌｉｍら、２００１年）。

正常皮膚組織と対比したケロイド瘢痕組織におけるｉｎ ｖｉｖｏでのＳｔａｔ３発現及びリン酸化の増強：
正常皮膚では、非常に薄いケラチン層の下に表皮の薄層がある。対照的に、パラフィン切片のＨ＆Ｅ染色（図１Ａ）に示される通り、ケロイド組織のケラチン及び表皮層はそれより厚い。真皮もかなり肥厚しており、より一様に重層しており、規則的に見える正常皮膚と比較して、密集して不規則な結合組織を有する。

ヘマトキシリン及びエオシン染色：
組織切片は、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定し、パラフィンに包埋し、切片にした。組織切片をヘマトキシリンで５〜８分間染色し、流水で洗浄し、１％塩酸及び７０％エタノールを含有する酸性エタノールで迅速脱染し、流水で洗浄し、エオシンエタノールで３〜５分間、対比染色した。次に、７０％、８０％、９５％、及び１００％エタノール中での漸進的な浸漬によって、組織切片を再水和させ、キシレンで透徹し、最後にエンテランに封入した。写真は、Ｌｅｉｃａ ＤＭ４０００Ｂ顕微鏡を用いて撮影した。

免疫蛍光：
４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで、１５〜３０分間、室温で、組織試料の凍結切片を固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳで、それぞれ１０分間、３回洗浄し、ＰＢＳ中に５％正常なヤギ血清、２％ウシ胎児血清、２％ウシ血清アルブミン、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含有する緩衝液でブロッキングした。上記の通りに組織切片を洗浄し、ＦＤＢ中に１μｇ／ｍｌに１：２００希釈された、モノクローナルｐ−Ｓｔａｔ３（Ｂ７）、ポリクローナルＳｔａｔ３（Ｃ−２０）、抗マウスＩｇＧ、又は抗ウサギＩｇＧ抗体の１次抗体と共に、室温で１ｈインキュベートした。組織切片を記載されている通りに再び洗浄し、ＦＤＢ中に１：４００に希釈されたＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋ Ｃｙ３標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＰＡ４３００４；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、英国バッキンガムシャー所在）又は抗マウスＩｇＧ−Ｃｙ３（ＡＰ１２４Ｃ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、米国カリフォルニア州テメキュラ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ）所在）と共に室温で１ｈインキュベートした。切片を再び洗浄し、ＤＡＰＩを含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｈ−１２００；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国カリフォルニア州バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）所在）で封入した。写真は、Ｌｅｉｃａ ＤＭ４０００Ｂ顕微鏡を用いて撮影した。

（ＳＴＡＴ調節の評価）
ＳＴＡＴ発現の評価：
Ｓｔａｔ３の発現を検査するために、正常皮膚及びケロイド瘢痕の上にある皮膚の凍結切片に、ポリクローナルＳｔａｔ３（Ｃ−２０）抗体を用いた免疫蛍光法を施した。これは、対照として抗ウサギＩｇＧを用いたものと並行して行った。図１Ｂに示す通り、Ｓｔａｔ３は、正常皮膚及びケロイド組織の両方で検出することができたが、抗ウサギＩｇＧ抗体を用いた場合は、弱い蛍光が観測された。両方の皮膚型で、Ｓｔａｔ３発現は表皮層中に容易に検出された。これらの皮膚型は、主としてケラチノサイトによって占められている。皮層では、主として線維芽細胞で構成されている細胞性構成要素と共に結合組織が散在しており、これらの細胞性構成要素がコラーゲン線維及び他のＥＣＭ成分の沈着に関与している。正常皮膚３及び４の皮層における線維芽細胞の小集団もＳｔａｔ３発現を示したが、ケロイド試料２５、２６、３１、及び４８では、より多数の線維芽細胞がＳｔａｔ３発現を示した。Ｓｔａｔ３免疫蛍光は、正常皮膚と比較して、ケロイドの方がより強いように見えた。これは、ケロイド試料における表皮及び真皮の両細胞集団でＳｔａｔ３発現がより高いことを示す。

レトロウイルスＳｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ：
ＳＴＡＴ３に対して設計された４つの異なった標的を選択し、ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ社のｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ．ｐｕｒｏのＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩにクローニングし、配列決定を行った（ＳＴＡＴ３ Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿１３９２７６）。４つの標的を、ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡ １（ｎｔ．４６１〜４８０）配列番号１、ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡ ２（ｎｔ．１２６４〜１２８３）配列番号２、ＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡ ３（ｎｔ．３６４〜３８３）ＧＡＴＴＧＧＧＣＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＡ、及びＳＴＡＴ３ ｓｉＲＮＡ ４（ｎｔ．１６６２〜１６８１）配列番号３と命名した。９−ｎｔの短いヘアピンを中央（太字）に有する対応するプライマーは次の通りである。

Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ標的を含有するこれらのベクター及び空のベクターで、７〜９ｈ、２９３ＴベースのＰｈｏｅｎｉｘ−Ａｍｐｈｏパッケージング細胞系に形質移入し、４８ｈ後にアンホトロピックレトロウイルスを採取し、ペレットにして非付着細胞及び細胞片を除去し、０．４５μｍセルロースアセテート膜に通して濾過した。４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で終夜、ケロイド線維芽細胞を感染させ、翌日、新たな１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで置換した。感染の４８ｈ後に、細胞のウェスタンブロットアッセイ、ＸＴＴ細胞増殖、又は移動アッセイを行った。移動アッセイは、８μｍトランスウェル膜に細胞を再播種し、２４ｈ後に上記の通り固定することによって行った。

Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ用の、選択された４つの異なった標的のうち、３つ、すなわち、ｓｉＲＮＡ ３ではなく、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ １、２及び４が、２９３Ｔベースのアンホトロピックパッケージング細胞系でＳｔａｔ３発現に対する阻害作用を示した（図５Ａ、左側パネル）。

ＳＴＡＴのリン酸化、活性及び細胞内局在の評価：
Ｓｔａｔ３の活性化も、ホスホＳｔａｔ３（ｐＳｔａｔ３）モノクローナル抗体を用いて検査した。これは、対照として抗マウスＩｇＧを用いたものと並行して行った。正常皮膚４では、弱いｐＳｔａｔ３染色が観察された（図１Ｃ）。対照的にケロイド２６では、真皮及び表皮の両方で、Ｓｔａｔ３の活性化が有意に増強されていた。

細胞内局在の評価：
ケロイド３１における核ＤＡＰＩ染色とＳｔａｔ３染色とを重ね合わせたところ、細胞質局在を示す無定形な染色と共に、ドット様のＳｔａｔ３染色と核との共在を示した（図１Ｄ、上側パネル）。これによってより多くの活性化されたＳｔａｔ３がケロイド由来の細胞に存在したという示唆が強化された。抗ｐＳｔａｔ３抗体及びＤＡＰＩで同時染色されたケロイド２６でも同様な核内分布が観測された（図１Ｄ、下側パネル）。ケロイド２６をより詳細に検査したところ、Ｓｔａｔ３の核染色が主として基底層で検出され、有棘層及び顆粒層の両方で染色がより少ないことが明らかになった。これは、基底膜に隣接した基底層におけるＳｔａｔ３の活性化が、正常ケラチン細胞と比較して、ケロイドケラチノサイトでより強化されていることを示し、細胞分化よりむしろ細胞増殖における、ケロイドケラチノサイトでの活性化Ｓｔａｔ３の役割を示唆する。

ケロイド線維芽細胞及び組織溶解物における、正常皮膚線維芽細胞及び組織溶解物と比較して増強されたＳｔａｔ３活性化：
上記のデータをさらに確認するため、５人の個体からの正常皮膚及び８人の個体からのケロイド瘢痕の組織溶解物を、Ｓｔａｔ３のリン酸化及び発現に関して調査した。正常皮膚からの３つの試料は、低度のＴｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３リン酸化を示し、一方、２つは中程度のＴｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３リン酸化を示した（図２Ａ）。対照的に、１つを除いてすべてのケロイド組織溶解物が中程度から高度のＴｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３リン酸化を示した。Ｔｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３リン酸化の程度は、Ｓｔａｔ３発現のレベルとよく相関していた。加えて、８つのケロイド組織試料のうちの６つが、５つすべての正常皮膚試料と比較して、Ｓｅｒ７２７ Ｓｔａｔ３リン酸化の増大を示した。８つのケロイド組織試料のうちの同じ６つで、コラーゲン産生が増強されており、一方、残りの２つは、正常皮膚試料のものと同程度の発現を示した。

表皮は、９５％のケラチノサイトと、メラニン細胞、ランゲルハンス細胞、及びＭｅｒｋｅｌ細胞を含む５％の非ケラチノサイト細胞とによって占められており（３３）、一方、線維芽細胞は、一部の内皮細胞及びマスト細胞と共に、真皮において支配的な細胞である。Ｓｔａｔ３の活性化をさらに調査するため、正常皮膚組織及びケロイド組織から得られた初代線維芽細胞をさらに検査した。２株の正常線維芽細胞（ＮＦ）株及び３株のケロイド線維芽細胞（ＫＦ）株をＳｔａｔ３の活性化に関して検査した。ケロイド線維芽細胞では、Ｓｔａｔ３のＴｙｒ７０５リン酸化が、正常線維芽細胞と比較して、Ｓｔａｔ３発現に関して正規化した後で２．３〜４．３倍増強されていた（図２Ｂ）。Ｓｔａｔ１及びＳｔａｔ５のＴｙｒリン酸化は、これらの試料のいずれでも検出不可能であった。これらの試料のすべてで、Ｓｔａｔ１タンパク質の発現が存在し、他方、Ｓｔａｔ５の発現が弱かった。

Ｔｙｒ７０５及びＳｅｒ７２７ Ｓｔａｔ３リン酸化の動態をさらに検査するために、正常及びケロイド線維芽細胞を正常な増殖条件下で５日間培養した。正常線維芽細胞であるＮＦ７では、１日目にはＴｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３リン酸化がほとんど検出可能でなかったが、２日目には観測され、５日目まで維持されていた（図２Ｃ）。対照的に、ケロイド線維芽細胞であるＫＦ４８では、Ｔｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３リン酸化が１日目に観測され、それが増強されて、３日目にピークに達し、さらに、５日目には１日目のレベルにまで徐々に減弱された。Ｓｅｒ７２７ Ｓｔａｔ３リン酸化プロフィールは、正常及びケロイド線維芽細胞の両方で、Ｔｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３リン酸化に類似していた。加えて、ＫＦ４８では、ＮＦ７と比較して増強されたＳｔａｔ３発現が観測された。このデータは、組織切片及び組織溶解物で得られた観察とよく相関していた（図１Ｂ〜Ｄ及び図２Ａ）。

無血清条件下におけるＳｔａｔ３リン酸化も検査した。ＮＦ４及びＫＦ４８を９０％集密状態まで培養し、無血清ＤＭＥＭで広範に洗浄し、無血清ＤＭＥＭ中でさらに２日間インキュベートした。新たな無血清ＤＭＥＭを添加し、５日目まで細胞を２４ｈ毎に採取した。本発明者らは、ＮＦ４における非常に弱いリン酸化と共に、ＫＦ４８における強い構成的なＴｙｒ７０５及びＳｅｒ７２７ Ｓｔａｔ３リン酸化を５日間を通して観測した（図２Ｄ）。アクチン発現はすべての試料で同様であったが、ＫＦ４８では、ＮＦ４と比較して、Ｓｔａｔ３発現がわずかに増強されていた。全体的に、ケロイド線維芽細胞及び組織溶解物では、正常皮膚からの試料と比較して、Ｓｔａｔ３のリン酸化及び発現が増強されていた。ケロイド線維芽細胞におけるＴｙｒ７０５及びＳｅｒ７２７ Ｓｔａｔ３リン酸化も、構成的かつ血清非依存的に起こった。

Ｊａｋ１ではなくＪａｋ２の活性化がケロイド線維芽細胞で増強される：
ケロイド線維芽細胞でＴｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３リン酸化が増強されていたことは、本発明者らに、既知のＳｔａｔ３ Ｔｙｒキナーゼ、すなわちＪａｋ、Ｓｒｃ、及びＥＧＦ受容体の活性化について調査することを促した。ほぼ集密状態の正常及びケロイド線維芽細胞を無血清培地中で維持し、採取し、内因性Ｊａｋ１及びＪａｋ２の活性化を、抗ホスホＪａｋ１又は抗ホスホＪａｋ２抗体を用いたウェスタンブロットで分析した。図３に示す通り、ＮＦ１０３と比較して増強されたｐＪａｋ２がＫＦ４８で検出されたが、ｐＪａｋ１シグナルは、Ｊａｋ１発現が両方の細胞型で存在していたのに、正常又はケロイド線維芽細胞のいずれでもほとんど検出不可能であった。一方、ホスホＳｒｃ（Ｔｙｒ４１６）及びホスホＥＧＦＲ（Ｔｙｒ８４５）シグナルは、ＮＦ及びＫＦの両方でほとんど検出不可能であった（データは示されていない）。

様々な用量の、Ｊａｋ２／Ｓｔａｔ３活性化の阻害剤であるククルビタシンＩ（３２）と共に、又は対照としてＤＭＳＯのみと共にＫＦ４８を３０分間インキュベートし、それに続いて正常な増殖培地中で４８ｈさらにインキュベーションすることによってＳｔａｔ３の阻害も評価した。図５Ｂに示す通り、ククルビタシンＩによるｐＹ７０５ Ｓｔａｔ３、ｐＳ７２７ Ｓｔａｔ３、及びコラーゲン産生の用量依存的阻害が観測された。実効濃度は、１μＭという低いものであった。アクチン発現はすべての試料でかなり類似したものであったが、Ｓｔａｔ３発現の用量依存的低減も観測された。ククルビタシンＩはＧａｌｃｈｉｍｉａ社（スペイン国アコルフィア（Ａ Ｃｏｒｕｆｉａ）所在）から入手した。

ケロイドケラチノサイトにおけるＳｔａｔ３活性化：
正常及びケロイド組織から得られたケラチン細胞株でもＳｔａｔ３の活性化を検査した。ケラチノサイトを増殖培地で培養し、５日目まで毎日採取した。Ｔｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３リン酸化は、ＫＫ４８では検出可能であったが（図４Ａ、矢印によって示されている中央バンド）、ＮＫ１０３では検出可能でなかった。一方、Ｓｅｒ７２７ Ｓｔａｔ３リン酸化は、ＮＫ１０３において１日目から４日目まで通して、ＫＫ４８と比較して、より高かったが、５日目にはリン酸化レベルが逆転していた。Ｓｔａｔ３免疫ブロットは、ＮＫ１０３とＫＫ４８との間で等しい発現を示した。

増殖培地中で培養されたケラチノサイトは、増殖期にある基底層のケラチノサイトを表す。上の結果は、ケロイド２６の基底層におけるｐＳｔａｔ３染色と整合している（図１Ｃ）。表皮における他の重層化された層でＳｔａｔ３活性化がｉｎ ｖｉｖｏで起こるかどうかをさらに調査するために、ケラチノサイトを分化条件下で培養した。興味深いことに、Ｔｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３リン酸化は、６つの正常ケラチン細胞試料すべてで比較的高かったが、検査された６つのケロイドケラチノサイト試料すべてで有意に弱いものであった。（図４Ｂ）。加えて、Ｓｔａｔ３発現及びアクチン発現はすべての試料で類似していたが、正常ケラチン細胞の５０％は、ケロイドケラチノサイトと比較して、わずかに増強されたＳｅｒ７２７ Ｓｔａｔ３リン酸化を示した。分化中のケロイドケラチノサイトにおける低減されたＴｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３リン酸化も、ケロイド２６の有棘層及び果粒層における貧弱なｐＳｔａｔ３染色（図１Ｃ）と整合していた。

抗体及び試薬：
ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ６に対するリン酸化特異抗体のパネルを含む、７つのＳＴＡＴファミリーメンバーすべてに対する抗体が、Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＧｍｂＨ社（独国ヒッデンハウゼンイムヒンメルライヒ（Ｈｉｄｄｅｎｈａｕｓｅｎ Ｉｍ Ｈｉｍｍｅｌｒｅｉｃｈ）所在）から市販されている。これらのすべてがウェスタンブロッティングに使用でき、一部のものは免疫組織化学染色にも使用できる。加えて、多くの会社が、１つ又は複数のＳＴＡＴ抗体を販売している。

ポリクローナル抗ホスホＴｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３、モノクローナル抗ホスホＳｅｒ７２７ Ｓｔａｔ３、ポリクローナル抗ホスホＪａｋ１（Ｔｙｒ１０２２／１０２３）、及びポリクローナル抗ホスホＪａｋ２（Ｔｙｒ１００７／１００８）抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社（米国マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）所在）から購入し、モノクローナルｐＳｔａｔ３（Ｂ７）（ｓｃ−８０５９）、ポリクローナルＳｔａｔ３（Ｃ−２０）（ｓｃ−４８２）抗体、抗マウスＩｇＧ（ｓｃ−２０２５）、及び抗ウサギＩｇＧ（ｓｃ−２０２７）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（米国カリフォルニア州サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）所在）から入手した。モノクローナル抗Ｓｔａｔ３抗体は、ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国ケンタッキー州レキシントン（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ）所在）から購入し、ポリクローナル抗アクチン抗体は、Ｓｉｇｍａ社（米国ミズーリ州セントルイス（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ）所在）から購入した。

ウェスタンブロット：
プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）所在）を含有する放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．２、１％デオキシコール酸、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）又は１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．４、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５％ ＮＰ−４０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２ｍＭバナジウム酸ナトリウムを含有し、プロテアーゼ阻害剤錠剤を添加した溶解緩衝液中に細胞を採取した。４℃、１０分間の遠心分離の後に全細胞溶解物を収集し、７．５％又は１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）所在）に転写した。膜を抗ホスホＴｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３抗体（１：１０００希釈；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国マサチューセッツ州ビバリー所在）を用いて、１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ中、４℃で終夜ブロッティングし、０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで洗浄し、抗ウサギＩｇＧ ２次抗体（１：２０００希釈；Ｓｉｇｍａ社、米国ミズーリ州セントルイス所在）と共に室温で１ｈインキュベートし、０．２％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳで洗浄し、その後、強化化学発光法（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、英国バッキンガムシャー所在）、又はＬｕｍｉ−Ｌｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、米国インディアナポリス所在）と、オートラジオグラフィーと、を行った。Ｒｅｓｔｏｒｅウェスタンブロッティングストリッピング緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ社、米国イリノイ州ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）所在）を製造業者の指示に従って用いて、膜をストリッピングし、抗ホスホＳｅｒ７２７ Ｓｔａｔ３（１：１０００希釈；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社、米国マサチューセッツ州ビバリー所在）、及び抗マウスＩｇＧ ２次抗体（１：２０００希釈；Ｓｉｇｍａ社、米国ミズーリ州セントルイス所在）を用いて再ブロッティングした。ストリッピング及び再ブロッティング手順をモノクローナル抗Ｓｔａｔ３（１：１０００希釈；ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、ポリクローナル抗アクチン（１：１０００希釈；Ｓｉｇｍａ社）、及びモノクローナル抗コラーゲン抗体（１：１０００希釈；ＭＯＮＯＳＡＮ）を用いて繰り返した。

（ヒトケロイド組織由来の線維増殖性細胞）
線維芽細胞及びケラチノサイトの単離：
皮膚標本からの線維芽細胞及びケラチノサイトの単離及び培養の手順は以前に記載された通りである（Ｌｉｍら、２００２年）。

（ＳＴＡＴによって調節されているポリペプチドを評価する方法）
コラーゲンはＳＴＡＴ３活性化によって調節されているかもしれない：
モノクローナル抗ヒトコラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩは、ＭＯＮＯＳＡＮ（オランダ国ウーデン（Ｕｄｅｎ）所在）から購入した。フィブロネクチン及びマイトマイシンＣは、Ｓｉｇｍａ社（米国ミズーリ州セントルイス所在）から購入した。これらは、上述の通りのウェスタンブロットによって検出した。

８つのケロイド組織試料のうち６つで、コラーゲン産生が増強されていた（図２Ａ）。一方、残りの２つは、正常皮膚試料からのものと類似した発現を示した。

Ｓｔａｔ３の阻害はコラーゲン産生を下方制御する：
線維芽細胞によるコラーゲンの分泌は、創傷治癒における組織再構成の過程で起こり、コラーゲン産生の増強が線維症に関係付けられている。ＳＴＡＴ３がケロイドコラーゲン産生で何かの役割を演じているかどうかを調査するために、ＳＴＡＴ３ ＳｉＲＮＡを発現するレトロウイルスにケロイド線維芽細胞を感染させた。選択された４つの異なったＳｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ用の標的のうち、３つ、すなわちｓｉＲＮＡ ３ではなくＳｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ １、２、及び４が、２９３Ｔベースのアンホトロピックパッケージング細胞系でＳｔａｔ３発現に対する阻害作用を示した（図５Ａ、左側パネル）。これらの３つのＳｔａｔ３ ｓｉＲＮＡによるＳｔａｔ３発現の阻害は、ＫＦ４８のコラーゲン産生の阻害と相関していた（図５Ａ、右側パネル）。併せて、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡによるＳｔａｔ３発現の阻害、又はククルビタシンＩによるＳｔａｔ３活性化の阻害は、コラーゲン産生の同等な阻害をもたらした。

（細胞移動を評価する方法）
ケロイド線維芽細胞の細胞移動は、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ及びククルビタシンＩによって阻害される：
皮膚線維芽細胞の細胞移動におけるＳｔａｔ３の役割を検査するために、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡを発現するレトロウイルスでＫＦ４８細胞を感染させ、上記に記載の通り掻爬アッセイを行った。図８Ａにおいて、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ １、２、及び４はすべてがＳｔａｔ３発現を阻害するが、これらは、ＫＦ４８の細胞移動速度を遅らせることができ、一方、ベクターのみ、又はＳｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ ３は遅らせなかった。オーバーラップしてない３箇所の視野を取得し、図８Ｂに、平均±ＳＤとしてグラフ表示した。上記に記載の通りに、膜貫通細胞移動アッセイも三つ組で行い、平均±ＳＤとして定量化した（図８Ｃ）。掻爬アッセイと整合して、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ １、２、及び４は、ＫＦ４８の細胞移動を遅らせることができたが、ベクター及びＳｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ ３は遅らせなかった。図８Ｂ及び８Ｃの右側パネルは、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡによる阻害の効率を示すための、Ｓｔａｔ３及びアクチンの免疫ブロットを示す。

細胞移動におけるＳｔａｔ３の役割も、掻爬アッセイでククルビタシンＩを使用して検査した。最初に、ＫＦ４８細胞を１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣと共に２ｈインキュベートし、その後、ＤＭＳＯ又は１μＭククルビタシンＩで３０分間、処理した。掻爬創傷を行い、それに続いて、正常増殖培地中でさらにインキュベートした。創傷の０ｈ、２２ｈ、及び４８ｈ後に写真を撮影した。図８Ｄに示す通り、ククルビタシンＩによるＳｔａｔ３活性化の阻害は、ＤＭＳＯ対照と比較して、ＫＦ４８の移動を減速させた。オーバーラップしていない３箇所の視野における平均±ＳＤの定量化を図８Ｅに示す。それらは、ＤＭＳＯ対照と比較して、ククルビタシンＩによって、細胞移動が２２ｈに有意に減弱しており、４８ｈに移動が遅れていることを示した（^＊Ｐ＜０．００１）。

ケロイド線維芽細胞における細胞移動の増大：
創傷治癒は複雑な多段階過程である。これは、皮膚欠損の領域で表面を再生させるためのケラチノサイト及び線維芽細胞の移動及び増殖を必要とする。本発明者らは、掻爬アッセイを用いて、正常及びケロイド線維芽細胞の移動能力をさらに検査した。最初に細胞を完全な集密状態にまで培養し、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣで２ｈ処理した後、黄色のピペットチップで掻爬創傷した。０ｈ後及び１４ｈ後に写真を撮影した（図７Ａ）。オーバーラップしていない３箇所の視野を捕捉し、平均±ＳＤとして定量化した。結果を図７Ｂに示す。３株のケロイド線維芽細胞、すなわちＫＦ４３、ＫＦ４８、及びＫＦ１０７は、３株の正常線維芽細胞、すなわちＮＦ２、ＮＦ４、及びＮＦ１０３と比較して、掻爬損傷の正中線に向かった細胞移動速度の増大を示した。８．０μｍ孔径のポリビニルプロピレン非含有ポリカーボネートトランスウェル膜を用いて三つ組で行った膜貫通アッセイによっても、細胞移動を検査した。１複製あたり３箇所のオーバーラップしていない視野を捕捉し、三つ組における全移動細胞の平均として定量化した。再び、３つのＮＦ試料と比較して、３つのＫＦ試料が移動の増大を示した（図７Ｃ）。

移動アッセイ：
掻爬方法を用いた移動アッセイのために、細胞を集密状態にまで培養し、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣと共に２ｈインキュベートした後、黄色のピペットチップを用いてひっかき傷を導入した。正常増殖培地中で細胞をさらにインキュベートし、創傷の０ｈ、１４ｈ、１５ｈ、２２ｈ、又は４８ｈ後に写真を撮影した。オーバーラップしていない３箇所の視野を、Ｚｅｉｓｓ社製Ａｘｉｏｖｅｒｔ１３５顕微鏡によって捕捉し、損傷部位に移動した細胞を計数し、平均±ＳＤとして表した。

トランスウェル８．０μｍ孔径ポリカーボネート膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を用いた移動アッセイも行った。底部チャンバー内に０．５ｍｌの１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを走化性物質として有し、０．２ｍｌ無血清ＤＭＥＭ中にあるインサートの上層に１×１０^４細胞／ウェルを播種した。２４ｈ後に、冷ＰＢＳで１回細胞を洗浄し、その後、４％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ中で、１５分間、室温で固定した。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳを用いて、室温で３分間、細胞の透過処理を行い、室温で１０分間、ヘマトキシリンで染色し、その後、３回水で脱染色を行った。インサートの上層から、綿棒によって細胞を除去し、インサートを放置して乾燥させた。インサートをスライド上に封入し、Ｌｅｉｃａ ＤＭ４０００Ｂ顕微鏡を用いて、インサートの底部に移動した細胞の、３箇所のオーバーラップしていない視野を捕捉した。

（細胞増殖を評価する方法）
Ｓｔａｔ３の阻害は細胞増殖を減弱させる：
線維芽細胞増殖の増強は、ケロイド組織の特徴の１つである。これと整合して、ＮＦ２及びＮＦ４と比較して、ＫＦ４８及びＫＦ１０７で観察されたように（図６Ａ）、正常な培養条件で培養されたケロイド線維芽細胞は、正常線維芽細胞より速く増殖した。Ｓｔａｔ３がケロイド線維芽細胞増殖の増強に関与しているかどうかを調査するために、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡを発現するレトロウイルスにＫＦ４８を感染させ、細胞増殖を検査した。図６Ｂに示す通り、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ ４によるＳｔａｔ３の阻害は、非感染対照、ベクター対照、及びＳｔａｔ３を阻害しないＳｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ ３と比較して、ＫＦ４８の細胞増殖を減弱させた。

ＸＴＴ増殖アッセイ：
９６ウェルプレート中に３０００細胞／ウェルに播種され、正常増殖条件で培養された細胞、又はレトロウイルス性Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡに感染した細胞の増殖を、製造業者の指示に従ってＸＴＴ増殖キット（Ｒｏｃｈｅ社）を使用してアッセイした。ＸＴＴ試薬の添加の２ｈ後に、４５０ｎｍの測定値をとり、６９０ｎｍを対照とした。各試料について、２〜３回の独立した実験を４つ組で行った。データは、平均±ＳＤとして表した。

ＫＦ４８細胞を様々な用量のククルビタシンＩ又はＤＭＳＯ対照で処理し、その後、正常増殖培地中でインキュベートし、４日間超の期間、毎日検査することによっても、細胞増殖を調査した。１μＭという低濃度のククルビタシンＩによって、ＤＭＳＯ及び未処置対照（０μＭ）と比較して、ＫＦ４８の細胞増殖を阻害することができたが、５μＭ以上のククルビタシンＩへの曝露は細胞死を引き起こすようであった（図６Ｃ）。

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Ｙｏｕｎａｉ，Ｓ．，Ｎｉｃｈｔｅｒ，Ｌ．Ｓ．，Ｗｅｌｌｉｓｚ，Ｔ．，Ｒｅｉｎｉｓｃｈ，Ｊ．，Ｎｉｍｎｉ，Ｍ．Ｅ．，ａｎｄ Ｔｕａｎ，Ｔ．Ｌ． １９９４． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ ｉｎ ｋｅｌｏｉｄ ａｎｄ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ． Ａｎｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ． ３３：１４８−１５１．

ケロイド皮膚組織ではＳｔａｔ３の発現及び活性化が増大している。（Ａ）正常皮膚（ＮＳ１）及びケロイド瘢痕（ＫＳ２８）のパラフィン組織切片のＨ＆Ｅ染色。Ｄ、Ｅ及びＫは、それぞれ真皮、表皮及びケラチンを示す。 （Ｂ）正常皮膚及びケロイド瘢痕組織の凍結切片を、抗ウサギＩｇＧ（α−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ）又はポリクローナル抗Ｓｔａｔ３（Ｃ−２０）（α−Ｓｔａｔ３）で染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。 （Ｂ）正常皮膚及びケロイド瘢痕組織の凍結切片を、抗ウサギＩｇＧ（α−ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ）又はポリクローナル抗Ｓｔａｔ３（Ｃ−２０）（α−Ｓｔａｔ３）で染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。 （Ｃ）凍結切片を、抗マウスＩｇＧ（α−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）又はモノクローナル抗ｐＳｔａｔ３（α−ｐＳｔａｔ３）でプロービングし、ＤＡＰＩで対比染色した。 （Ｄ）抗Ｓｔａｔ３（Ｃ−２０）（α−Ｓｔａｔ３）又は抗ｐＳｔａｔ３（α−ｐＳｔａｔ３）と、ＤＡＰＩとの間の対比染色は、Ｓｔａｔ３及びｐＳｔａｔ３の核共存を示している。写真は、位相差と共に撮影されており、すべてのスケールバーは５０μｍを表す。 ケロイド組織溶解物及びケロイド線維芽細胞におけるＳｔａｔ３リン酸化及び発現の増強。（Ａ）正常皮膚（ＮＳ）及びケロイド試料（ＫＳ）からの組織溶解物を、抗ｐＹ７０５ Ｓｔａｔ３抗体を用いたウェスタンブロット分析にかけた。ブロットのストリッピングを行い、再プロービングを抗ｐＳ７２７ Ｓｔａｔ３で、その後、抗Ｓｔａｔ３、抗コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、及び抗アクチンで行った。 （Ｂ）示されている抗体を用いた、正常線維芽細胞（ＮＦ）及びケロイド線維芽細胞（ＫＦ）からの全細胞溶解物のウェスタンブロット分析。 （Ｃ）正常線維芽細胞であるＮＦ７、及びケロイド線維芽細胞であるＫＦ４８を、１０％ＦＢＳで刺激する前の２日間、無血清培地中で培養した。１〜５日目に全細胞溶解物を採取し、（Ａ）で記述した通りにウェスタンブロット分析を行った。 （Ｄ）Ｓｔａｔ３の血清非依存的リン酸化を調査するために、ＮＦ４及びＫＦ４８線維芽細胞を、５日間に渡って毎日採取する前の２日間、無血清ＤＭＥＭ中で培養した。全細胞溶解物を、示されている抗体を用いたウェスタンブロット分析にかけた。矢印はタンパク質バンドの位置を示す。 Ｊａｋ１ではなく、Ｊａｋ２によるＳｔａｔ３リン酸化。正常線維芽細胞であるＮＦ１０３、及びケロイド線維芽細胞であるＫＦ４８からの全細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ホスホＪａｋ１（ｐＪａｋ１）又はホスホＪａｋ２（ｐＪａｋ２）抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った。ブロットのストリッピングを行い、再プロービングをそれぞれＪａｋ１及びＪａｋ２抗体で行い、その後、正規化のための抗アクチンで行った。矢はタンパク質バンドの位置を示す。 分化中ではなく、増殖中のケロイドケラチノサイトにおけるＴｙｒ７０５ Ｓｔａｔ３リン酸化の増強。（Ａ）正常ケラチン細胞であるＮＫ１０３、及びケロイドケラチノサイトであるＫＫ４８を増殖培地中でほぼ集密状態にまで培養し、細胞を５日間に渡って毎日採取した。矢印はｐＹ７０５ Ｓｔａｔ３タンパク質の位置を示す。ＫＫ４８試料におけるその下のバンド、及びＮＫ１０３における強いバンドは非特異的なものである。 （Ｂ）６種類の正常ケラチノサイト（ＮＫ）及び６種類のケロイドケラチノサイト（ＫＫ）を、ケラチノサイトが重層化して最終分化を行う前に増殖培地中で培養した。ウェスタンブロット分析は、図２に記載の通りに行った。 Ｓｔａｔ３の阻害はコラーゲン産生を減少させる。（Ａ）Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡの４種の標的をｐＳｕｐｅｒ．ｒｅｔｒｏ．ｐｕｒｏベクターにクローニングし、ベクター単独も含めて、アンホトロピックな２９３Ｔベースのレトロウイルスパッケージング細胞系に形質移入した。形質移入の４８ｈ後に採取されたレトロウイルスを、ＫＦ４８の感染に使用した。アンホトロピックなパッケージング細胞系（左側パネル）及びＫＦ４８（右側パネル）の両方から、全細胞溶解物を採取し、Ｓｔａｔ３、アクチン及びコラーゲン発現に関してウェスタンブロットで分析した。 （Ｂ）ＫＦ４８は、未処理のままか、或いはＤＭＳＯ又は様々な用量のククルビタシンＩ（５μＭ、１０μＭ、２０μＭ又は３０μＭ）で３０分間処理し、その後、採取する前に、１０％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中で４８時間さらにインキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離された全細胞溶解物を、Ｓｔａｔ３のリン酸化及び発現、アクチンの発現、並びにコラーゲンの産生に関して、ウェスタンブロットで分析した。矢／矢印はタンパク質バンドの位置を示す。 Ｓｔａｔ３の阻害は細胞増殖を減弱させる。（Ａ）正常線維芽細胞と比較した、ケロイド線維芽細胞の細胞増殖の増強。正常線維芽細胞であるＮＦ２及びＮＦ４、並びにケロイド線維芽細胞であるＫＦ４８及びＫＦ１０７を、９６ウェルプレート内、正常成長培地中に、４つ組、３０００細胞／ウェルで播種し、ＸＴＴ細胞増殖キットを製造会社の指示に従って使用して、細胞増殖を毎日、最長６日間まで検査した。 （Ｂ）ＫＦ４８線維芽細胞を９６ウェルプレート内に播種し、翌日、１８時間、レトロウイルスＳｔａｔ３ ｓｉＲＮＡｓに感染させた後、１０％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭに培地交換した。感染の日から毎日、細胞増殖を検査した。 （Ｃ）ＫＦ４８線維芽細胞を９６ウェルプレート内に播種し、未処理のままにするか、或いはＤＭＳＯ又は様々な用量のククルビタシンＩで処理し、４日間に渡って毎日細胞増殖を検査した。 正常線維芽細胞と比較した、ケロイド線維芽細胞の細胞移動の増強。（Ａ）３株の正常線維芽細胞、すなわちＮＦ２、ＮＦ４及びＮＦ１０３、並びに３株のケロイド線維芽細胞、ＫＦ４３、ＫＦ４８及びＫＦ１０７を、６０ｍｍ培養皿で集密状態まで培養し、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣで２ｈ処理した後、黄色のピペットチップを用いてひっかき傷を導入した。細胞は正常成長培地中でさらに１４ｈインキュベートした。創傷の０ｈ後及び１４ｈ後に写真を撮影した。 （Ｂ）（Ａ）におけるオーバーラップしていない３箇所の視野の写真を撮り、創傷部位に移動した細胞を定量化して、データを平均±ＳＤで表した。^＊Ｐ＜＝０．０５、^＊＊Ｐ＜０．００５、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、それぞれ、スチューデントのｔ検定による、３株のＮＦ対ＫＦ４３、ＫＦ４８及びＫＦ１０７。 （Ｃ）細胞移動は、三つ組で行ったトランスウェルアッセイも用いて検査した。底部チャンバー内の走化性物質として１０％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭを有するインサート上層の無血清ＤＭＥＭ中にＫＦ４８細胞を播種した。各組の複製におけるオーバーラップしていない３箇所の視野において、４８ｈ後に、インサートの上部から底部に移動していた細胞を計数し、三つ組の平均±ＳＤをグラフ中に表した。^＊Ｐ＜０．００１及び^＊＊Ｐ＜０．００５は、それぞれ、スチューデントのｔ検定による、３株のＮＦ対ＫＦ４３、ＫＦ４８及びＫＦ１０７を示す。 Ｓｔａｔ３の阻害による細胞移動の減弱。（Ａ）ＫＦ４８細胞をＳｔａｔ３ ｓｉＲＮＡｓを発現するレトロウイルスに感染させ、ひっかき傷アッセイを行った。写真は、創傷の０ｈ後及び１５ｈ後に撮った。 （Ｂ）データは、（Ａ）におけるオーバーラップしていない３箇所の視野において、創傷部位に移動した細胞の平均±ＳＤを表す。^＊Ｐ＜０．００５は、スチューデントのｔ検定による、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ １、２及び４対ベクターを指し、ｎ．ｓ．は有意でないことを示す。ウェスタンブロットにおける、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡｓによるＳｔａｔ３の阻害を右側パネルに示す。 （Ｃ）Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡｓを有するレトロウイルスにＫＦ４８細胞を感染させ、トランスウェルインサートを用いた同様な細胞移動アッセイを行った。^＊Ｐ＜０．００１は、スチューデントのｔ検定による、ベクターとの比較であり、ｎ．ｓ．は有意でないことを示す。Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡｓによるＳｔａｔ３の阻害は、右側パネルのウェスタンブロットに示されている。 （Ｄ）ＫＦ４８細胞を１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣで２ｈ事前処理し、その後、黄色のピペットチップを用いて細胞を傷つける前に、ＤＭＳＯ又は１μＭククルビタシンＩのいずれかで３０分間処理した。１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ正常成長培地中で細胞をさらにインキュベートし、創傷の０ｈ、２２ｈ及び４８ｈ後に写真を撮影した。 （Ｅ）データは、（Ｄ）におけるオーバーラップしていない３箇所の視野において、創傷部位に移動した細胞の平均±ＳＤを表す。^＊Ｐ＜０．００１は、スチューデントのｔ検定による。 Ｓｔａｔ３の阻害による細胞移動の減弱。（Ａ）ＫＦ４８細胞をＳｔａｔ３ ｓｉＲＮＡｓを発現するレトロウイルスに感染させ、ひっかき傷アッセイを上記図７Ａに記載した通りに行った。写真は、創傷の０ｈ後及び１５ｈ後に撮った。 （Ｂ）データは、（Ａ）におけるオーバーラップしていない３箇所の視野において、創傷部位に移動した細胞の平均±ＳＤを表す。^＊Ｐ＜０．００５は、スチューデントのｔ検定による、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡ １、２及び４対ベクターを指し、ｎ．ｓ．は有意でないことを示す。ウェスタンブロットにおける、Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡｓによるＳｔａｔ３の阻害を右側パネルに示す。 （Ｃ）Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡｓを有するレトロウイルスにＫＦ４８細胞を感染させ、トランスウェルインサートを用いた同様な細胞移動アッセイを図７Ｃで記述した通りに行った。^＊Ｐ＜０．００１は、スチューデントのｔ検定による、ベクターとの比較であり、ｎ．ｓ．は有意でないことを示す。Ｓｔａｔ３ ｓｉＲＮＡｓによるＳｔａｔ３の阻害は、右側パネルのウェスタンブロットに示されている。 （Ｄ）ＫＦ４８細胞を１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣで２ｈ事前処理し、その後、黄色のピペットチップを用いて細胞を傷つける前に、ＤＭＳＯ又は１μＭククルビタシンＩのいずれかで３０分間処理した。１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ正常成長培地中で細胞をさらにインキュベートし、創傷の０ｈ、２２ｈ及び４８ｈ後に写真を撮影した。 （Ｅ）データは、（Ｄ）におけるオーバーラップしていない３箇所の視野において、創傷部位に移動した細胞の平均±ＳＤを表す。^＊Ｐ＜０．００１は、スチューデントのｔ検定による。

Claims (45)

1. 線維増殖性疾患を治療又は予防するための薬物の製造における、ＳＴＡＴを調節する組成物の使用。
2. 前記線維増殖性疾患がケロイド瘢痕化を含む、請求項１に記載の使用。
3. 前記組成物が、ＳＴＡＴの活性、リン酸化、発現レベル又は細胞内局在のうちの１つ又は複数を調節する、請求項１又は２に記載の使用。
4. 前記ＳＴＡＴがＳＴＡＴ３である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
5. 前記組成物がＳＴＡＴ３のＳｉＲＮＡを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
6. 前記ＳＴＡＴ３のＳｉＲＮＡが、配列番号１、配列番号２又は配列番号３を含む、請求項５に記載の使用。
7. 前記ＳＴＡＴ３のＳｉＲＮＡが、配列番号４及び／又は配列番号５、或いは配列番号６及び／又は配列番号７、或いは配列番号８及び／又は配列番号９を含む、請求項６に記載の使用。
8. 前記ＳＴＡＴ３のＳｉＲＮＡが、配列番号４及び／又は配列番号５、或いは配列番号６及び／又は配列番号７、或いは配列番号８及び／又は配列番号９、からなる群より選択される、請求項７に記載の使用。
9. 前記組成物がククルビタシンを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
10. 前記組成物がククルビタシンＩ又はククルビタシンＱを含む、請求項９に記載の使用。
11. 前記組成物がＳＴＡＴ３デコイオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
12. 前記組成物がホスホチロシンペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
13. 前記ホスホチロシンペプチドがＸＹ^＊Ｌ又はＡＹ^＊Ｌを含む、請求項１２に記載の使用。
14. 前記組成物が、医薬組成物と、薬学的に許容される担体と、を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
15. 前記組成物が患者への局所投与に適している、請求項１４に記載の使用。
16. 前記組成物が患者への経皮投与に適している、請求項１４に記載の使用。
17. 前記組成物が患者への非経口投与に適している、請求項１４に記載の使用。
18. 前記組成物が患者へのエアロゾル投与に適している、請求項１４に記載の使用。
19. 前記組成物がシリコーンゲルを含むか、或いは前記薬物が、シリコーンゲルも投与される患者への投与用である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の使用。
20. 前記組成物がコルチコステロイドを含むか、或いは前記薬物が、コルチコステロイドも投与される患者への投与用である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の使用。
21. 線維増殖性疾患を治療するのに有用と予測される組成物を同定する方法であって、線維増殖性細胞を試験混合物で処理するステップと、前記試験混合物の、ＳＴＡＴへの影響を評価するステップと、を含む方法。
22. 前記組成物がＳＴＡＴを調節する、請求項２１に記載の方法。
23. 前記組成物が、ＳＴＡＴの活性、リン酸化、発現レベル又は細胞内局在のうちの１つ又は複数を調節する、請求項２１に記載の方法。
24. 前記試験混合物の影響を評価するステップが、ＳＴＡＴによって調節されるポリペプチドの量又は活性を評価することを含む、請求項２１に記載の方法。
25. ＳＴＡＴがＳＴＡＴ３を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記試験混合物の影響を評価するステップが、細胞増殖の量及び／又は細胞移動の量を評価することを含む、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記線維増殖性細胞がヒトケロイド組織に由来する、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. ＳＴＡＴを調節する組成物と、シリコーンゲルと、を含むキット。
29. ＳＴＡＴを調節する組成物と、コルチコステロイドと、を含むキット。
30. 前記組成物が、前記ＳＴＡＴの活性、リン酸化、発現レベル又は細胞内局在のうちの１つ又は複数を調節する、請求項２８又は２９に記載のキット。
31. 前記ＳＴＡＴがＳＴＡＴ３である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のキット。
32. 前記組成物がＳＴＡＴ３のＳｉＲＮＡを含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のキット。
33. 前記ＳＴＡＴ３のＳｉＲＮＡが、配列番号１、配列番号２又は配列番号３を含む、請求項３２に記載のキット。
34. 前記ＳＴＡＴ３のＳｉＲＮＡが、配列番号４及び／又は配列番号５、或いは配列番号６及び／又は配列番号７、或いは配列番号８及び／又は配列番号９を含む、請求項３３に記載のキット。
35. 前記ＳＴＡＴ３のＳｉＲＮＡが、配列番号４及び／又は配列番号５、或いは配列番号６及び／又は配列番号７、或いは配列番号８及び／又は配列番号９、からなる群より選択される、請求項３４に記載のキット。
36. 前記組成物がククルビタシンを含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のキット。
37. 前記組成物がククルビタシンＩ又はククルビタシンＱを含む、請求項３６に記載のキット。
38. 前記組成物がＳＴＡＴ３デコイオリゴヌクレオチドを含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のキット。
39. 前記組成物がホスホチロシンペプチドを含む、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載のキット。
40. 前記ホスホチロシンペプチドがＸＹ^＊Ｌ又はＡＹ^＊Ｌを含む、請求項３９に記載のキット。
41. 患者の、線維増殖性疾患を発症する危険性の評価、又は線維増殖性疾患の重度の評価を補助する方法であって、試料中でのＳＴＡＴ発現又はＳＴＡＴ活性のレベルを測定するステップを含む方法。
42. 前記レベルが、例えば手術又は傷害の後に患者が線維増殖性疾患を発症する危険性が低いこと、中程度であること、又は高いことを示しているかどうか、を判定するステップを含む、請求項４１に記載の方法。
43. 前記試料が、手術後、短時間のうちに前記患者から採取されたものである、請求項４２に記載の方法。
44. 前記試料が瘢痕に由来する、請求項４１又は４２に記載の方法。
45. ＳＴＡＴがＳＴＡＴ３である、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。