KR102039217B1 - 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기는 켈로이드성 섬유아세포에서 콜라겐 침착을 억제하고 세포 이동성을 저해시키는 효과가 있으므로, 켈로이드의 예방 및 치료에 크게 이용될 것으로 기대된다.

Description

비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기 및 이의 용도{Apparatus for keloids using non-thermal atmospheric pressure plasma and uses thereof}

본 발명은 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기 및 이의 용도에 관한 것이다.

켈로이드란 피부 손상 후 발생하는 상처 치유과정에서 비정상적으로 섬유조직이 밀집되게 성장하는 질환으로 본래 상처나 염증 발생부위의 크기를 넘어서 주변으로 자라는 성질을 갖고 있다. 임상적으로, 표피는 정상이나 진피는 증식되어 두껍고 혈관이 풍부하며, 일반적인 흉터조직과 비교해서 염증세포의 침윤이 증가한 경우에 켈로이드라고 진단한다. 정상 진피의 콜라겐 다발은 이완되어 있고 배열이 흐트러져 있는데 비해서, 켈로이드의 진피는 콜라겐 다발이 두껍고 풍부한 특징이 있다. 조직학적인 특징으로, 켈로이드는 수많은 원섬유(fibril)로 이루어진 크고 넓고 밀접하게 배열된 콜라겐 섬유가 나타나는데, 소용돌이 모양으로 불규칙하게 배열된 두꺼운 유리질화(hyalinized) 콜라겐을 켈로이드 콜라겐이라고 정의한다. 이러한 켈로이드는 침범 범위가 넓어 미용적인 문제를 일으킬 뿐만 아니라 관절에 발생할 경우에는 관절의 운동을 방해할 수 있으므로, 켈로이드 성향이 있는 사람은 가능한 한 불필요한 상처를 입지 않도록 주의하는 것이 무엇보다 중요하다. 그러나 부득이하게 발생한 상처에 대하여 켈로이드로 진행되지 않도록 선처방하는 방법이 부재한 실정이므로, 이에 대한 기술 개발이 시급하다 할 것이다.

한편, 플라즈마란 물리학이나 화학 분야에서 디바이 차폐(Debye sheath)를 만족하는 이온화된 기체로, 전기전도도를 가지는 전하를 띤 입자들의 집합체이다. 최근 플라즈마를 바이오 메디칼 분야에 적용하기 위한 노력으로, “플라즈마를 이용한 피부 치료 장치(KR 10-1568380 B1)”, “플라즈마 피부 치료 방법(US 9226790 B2)”, 및 “피부 표면 개질을 위한 플라즈마 장치(US 6518538 B2)” 등의 기술이 개발되고 있으나, 플라즈마를 켈로이드 치료에 이용하고자 하는 기술 개발은 전무한 실정이다.

따라서 본 발명은, 켈로이드의 예방 및 치료 효과가 있는 플라즈마 발생 장치에 관한 것이다. 본 발명의 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기는 켈로이드성 섬유아세포에서 콜라겐 침착을 억제하고 세포 이동성을 저해시키는 효과가 있으므로, 켈로이드의 예방 및 치료에 크게 이용될 것으로 기대된다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기 및 이의 용도에 관한 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 명세서에 있어서 “켈로이드(keloids)”란, 피부 손상 후 발생하는 상처 치유과정에서 비정상적으로 섬유조직이 밀집되게 성장하는 질환으로, '진피섬유양성종양(benign dermal fibrous tumor)'이라고도 명명된다. 상처치유 과정을 적절하게 조절하고 억제하는 기능의 장애에 의해서 발생하는 것으로, 콜라겐의 과도한 분비와 같은 세포외기질(ECM: Extracellular matrix)의 비정상적인 축적이 원인인 것으로 지적되고 있으며, 악성화 되지는 않는다. 켈로이드는 일반 흉터와 달리 더 단단하고, 피부면 위로 튀어올라와 있으며, 표면이 붉고, 불규칙한 특징을 가지고 있다. 침범 범위가 넓어 안면 등에 발생할 경우 미용적인 문제를 일으킬 수 있고, 관절과 같이 중요한 부위에 발생할 경우에는 운동 장애를 유발할 수 있다.

켈로이드는 비대 흉터(hypertrophic scar)와는 달리 원래의 상처 부위를 넘어서 주변의 정상피부로 침윤해 들어갈 수 있으므로, 비대 흉터와 구분하는 것이 필요하다. 보다 구체적으로, 켈로이드는 외상 후 수개월 후에 발생하고, 시간이 지나도 호전되지 않으며, 원래 병변 부위를 넘어서 주변으로 번지며, 유전적 요인이 있는 사람에게서만 발생하며, 피부색이 짙은 사람에게서 호발하는 특징이 있는데 비하여, 비대 흉터는 외상 후 빠른 시간 내에 발생하고, 시간이 지나면서 호전되며, 상처 부위에 국한되며, 발생 빈도가 흔하며, 피부색과 무관하다.

본 발명의 일 구체예에서 “표피 성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor, EGFR)”이란, 표피성장인자 패밀리의 세포외 단백리간드에 대한 수용체로서, 세포표면에 존재한다. 서로 비슷한 작용을 하는 4종류의 키나아제들(EGFR, HER2/c-neu, Her 3 및 Her 4)의 아과(subfamily)이다. EGFR은 리간드인 표피성장인자(EGF) 및 전환성장인자 α(transforming growth factor α) 등과 결합하면서 활성화 되며, EGFR의 활성화는 표피세포의 내재면역반응에 매우 중요하다.

변이를 통한 EGFR의 과다 발현이나 과다반응(overactivity)은 폐암, 항문암, 다형성 아교모세포종(glioblastoma multiforme) 등의 암 발생과 관련이 있고, 켈로이드와도 연관된다. 켈로이드성 피부의 섬유아세포에서 EGFR의 활성이 증가되는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 구체예에서 “신호전도 및 전사활성화 인자(Signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)”란, 세포 내 신호전달자로서, 전사요인이다. STAT3의 인산화 형태인 pSTAT3(phosphorylated STAT3)가 세포핵으로 전달되어 유전자를 전달하는 것이 잘 알려져 있으며, 대부분의 단백질 표현이 pSTAT3에 의해 조절된다.

본 발명의 일 구체예에서 “비열 대기압 플라즈마(non-thermal atmospheric pressure plasma)”란, 저온(cold) 또는 비평형(non-equlibrium) 플라즈마라고도 명명되며 열 플라즈마(thermal plasma)에 반대되는 개념이다. 비교적 낮은 압력 하에서 낮은 에너지를 가지고 쉽게 만들어질 수 있으며, 반응 가스의 온도가 대기의 온도와 비슷하지만 전자의 온도만 그보다 약 10 내지 100 배 높은 상태에 있는 특징이 있다. 상압이나 고압에서의 비열 대기압 플라즈마는 화학적으로 반응성이 매우 큰 반응물을 생성하여, 일반적인 방법으로는 실현되기 어렵거나 불가능한 화학반응을 촉진시킬 수 있는 특성을 가지고 있다.

본 명세서에 있어서 “약학조성물”이란, 특정한 목적을 위해 투여되는 조성물을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 약학조성물은 본 발명의 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기로 전처리한 피처리물에 대해서 EGFR, 또는 STAT3 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물이며, 이에 관여하는 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기의 "약학적 허용될 가능한" 담체 또는 부형제는 정부의 규제부에 의해 승인된 것이나, 또는 척추 동물, 그리고 보다 특별하게는 인간에게 사용을 위한 정부 또는 기타 일반적으로 승인된 약전에서 리스트된 것을 의미한다.

비경구적인 투여를 위해 본 발명의 약학조성물은 유성 또는 수성 담체에 있는 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태로 될 수 있고, 고체 또는 반고체의 형태로 제조될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학조성물은 현탁제, 안정화제, 용해제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있고, 멸균될 수 있다. 상기 약학조성물은 제조 및 저장의 조건 하에서 안정할 수 있고, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약학조성물은 사용 전에 적절한 담체와 재구성을 위해 멸균 분말 형태일 수 있다. 약학조성물은 단위-복용량 형태로, 마이크로니들 패치에, 앰플에, 또는 기타 단위-복용량 용기에, 또는 다-복용량 용기에 존재할 수 있다. 대안적으로, 약학적 조성물은 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 사용 바로 전에 주사용 물의 부가함을 요하는 동결-건조된(냉동건조) 상태로 보관될 수 있다. 즉시 주사용액 및 현탁액은 멸균 분말, 그래뉼 또는 타블렛으로 제조될 수 있다.

몇몇 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 제형화되어 질 수 있고, 또는 액체 속에 미립구의 형태로 포함될 수 있다. 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 이들의 약학적으로 허용될 수 있는 화합물 및/또는 혼합물을 0.001 내지 100,000 U/kg 사이의 농도로 포함할 수 있다. 또한 어떤 비 제한적인 실시형태에 있어서, 본 발명의 약학조성물은 적절한 부형제는 보존제, 현탁제, 추가적인 안정화제, 염료, 완충제, 항균제, 항진균제, 및 등장화제, 예를 들어, 설탕 또는 염화나트륨을 포함할 수 있다. 여기서 사용된 것으로, 용어 "안정화제"는 보존 수명을 증가하기 위해 본 발명의 약학조성물에 선택적으로 사용된 화합물을 언급한다. 비-제한적인 실시에 있어서, 안정화제는 당, 아미노산, 또는 폴리머일 수 있다. 또한 본 발명의 약학조성물은 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있고, 상기 담체는 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 약학적으로 허용될 수 있는 담체의 비-제한적인 예는 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 오일, 및 이들의 적절한 혼합물을 포함한다. 본 발명의 약학조성물에 적용되는 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 터미날 멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 멸균 가스 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.

본 명세서에 있어서 “투여”란, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 본 발명의 약학조성물은 피부 위에 도포하거나 피하 또는 피내에 주사하는 형태로 제공되는 것이 가장 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 치료 방법은 상기 약학조성물을 약제학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에서 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 전원 공급부, 플라즈마 생성부, 가스 공급로 및 하우징을 구비하고, 상기 전원 공급부는 고압 변압기를 구비하며, 상기 플라즈마 생성부는 전극, 메탈 전극, 유전체 및 반응부를 구비하며, 상기 플라즈마 생성부는 다중 노즐의 비열 대기압 플라즈마 소스를 구비하며, 상기 유전체는 석영 또는 세라믹 관으로 구성되는 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기를 제공하고, 상기 치료기는 아르곤 및 질소 가스를 사용하는 것을 특징으로 하는 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기를 제공하며, 상기 치료기의 주파수는 10 내지 50 kHz이고, 전력 피크는 0.1 내지 10 kV인 것을 특징으로 하는 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기의 치료기로 플라즈마 전처리한 피처리물에 대해서 EGFR, 또는 STAT3 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하고, 상기 EGFR, 또는 STAT3 유전자의 발현 억제제는 EGFR, 또는 STAT3 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 치료기로 플라즈마 전처리한 피처리물에 대해서 EGFR, 또는 STAT3 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 켈로이드 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제공하고, 상기 EGFR, 또는 STAT3 유전자의 발현 억제제는 EGFR, 또는 STAT3 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 켈로이드 예방 또는 개선용 화장료조성물을 제고한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기의 치료기로 인간을 제외한 개체의 피부에 플라즈마 처리하는 단계를 포함하는 켈로이드 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, (a) 인간을 제외한 개체의 피부에 상기의 치료기로 플라즈마 처리하는 단계; 및 (b) EGFR, 또는 STAT3 유전자의 발현 억제제를 처리하는 단계;를 포함하는 켈로이드 예방 또는 치료 방법을 제공하고, 상기 (b)단계에서의 EGFR, 또는 STAT3 유전자의 발현 억제제는 EGFR, 또는 STAT3 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 켈로이드 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.

본 발명은 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기는 켈로이드성 섬유아세포에서 콜라겐 침착을 억제하고 세포 이동성을 저해시키는 효과가 있으므로, 켈로이드의 예방 및 치료에 크게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, NF와 KF에서 플라즈마 처리에 따른 세포 이동성을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, NF와 KF에서 플라즈마 처리에 따른 세포 생존성 변화를 FITC 아넥신V/PI 세포사 염색으로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, NF와 KF에서 플라즈마 처리에 따른 세포 생존성 변화를 MTT 염색으로 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, NF와 KF에서 플라즈마 처리에 따른 단백질 발현 변화를 웨스턴 블럿팅으로 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, NF와 KF에서 플라즈마 처리에 따른 단백질 발현 변화를 면역형광염색으로 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, NF와 KF에서 EGFR 특이적 siRNA를 처리한 후의 세포 이동성 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, NF와 KF에서 STAT3 특이적 siRNA를 처리한 후의 세포 이동성 변화를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, NF와 KF에서 EGFR 또는 STAT3 특이적 siRNA를 처리한 후의 단백질 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, NF와 KF에서 플라즈마 처리에 따른 Collagen Type 1, Collagen Type 3 및 TGF-β의 발현 변화를 RT-PCR로 확인한 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, NF와 KF에서 플라즈마 처리에 따른 콜라겐 침착 수준의 변화를 Sircol 콜라겐 분석법으로 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, NF와 KF에서 플라즈마 처리에 따른 콜라겐 침착 수준의 변화를 면역형광염색으로 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, NF와 KF에서 플라즈마와 STAT3 특이적 siRNA를 병용 처리한 후 콜라겐 침착 수준의 변화를 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기 제조

전원 공급부, 플라즈마 생성부, 가스 공급로 및 하우징을 구비하고, 상기 플라즈마 생성부는 전극, 메탈 전극, 유전체 및 반응부를 구비하는 플라즈마 발생 장치로서, 상기 전원 공급부는 고압 변압기를 구비하고, 상기 플라즈마 생성부는 다중 노즐의 비열 대기압 플라즈마 소스를 구비하며, 상기 유전체는 석영 또는 세라믹 관으로 구성되는, 켈로이드 치료용 플라즈마 발생기를 제조하였다. 비제한적인 실시예에 있어서, 본 발명의 플라즈마 발생기는 대기압에서 플라즈마를 생산하기 위해서 펄스 폭 변조 컨트롤러 IC를 갖춘 고전압 LF 전력 모듈을 구비할 수 있다.

상기 본 발명의 켈로이드 치료용 플라즈마 발생기가 켈로이드 치료 목적으로 사용될 때에는 주파수는 10 내지 50 kHz인 것이 바람직하고, 20 내지 30 kHz인 것이 더욱 바람직하며, 25 kHz인 것이 더욱 바람직하다. 상기 고압 변압기에 의한 전력 피크는 0.1 내지 10 kV 피크인 것이 바람직하고, 1 내지 5 kV 피크인 것이 더욱 바람직하며, 3kV 피크인 것이 더욱 바람직하고, 상기 플라즈마 발생 장치에 사용되는 가스는 아르곤 및 질소이나, 이에 한정하는 것은 아니다.

실시예 2. 비열 대기압 플라즈마 켈로이드 치료기의 효과 확인

실시예 2-1. 정상 섬유아세포 또는 켈로이드 섬유아세포의 배양

상처 발생된 피부 조직에서 상처 회복 후 1년 이상 지속적으로, 원래의 상처 경계를 넘어선 상태로서, 켈로이드로 진단된 피부 조직으로부터 분리된 섬유아세포를 “켈로이드 섬유아세포(Keloid Fibroblast, KF)”로 명명하고, 이의 대조군으로 정상 피부 조직으로부터 분리된 섬유아세포를 “정상 섬유아세포(Normal Fibroblast, NF)”로 명명하였다.

KF와 NF는 10 부피% FBS, 및 1 부피% 항생제/항균제가 포함된 RPMI-1640 배지로 5 부피% CO₂ 및 37℃ 습윤 환경에서 배양하였다. 세포가 배양 접시의 80 내지 90 밀도로 증식한 시점에서 계대 배양을 수행하였고, 계대 시에는 트립신을 이용하였다. 본 발명을 위한 실시예에서는 F2 내지 F7 세대의 세포만을 사용하였다.

실시예 2-2. NF와 KF에서 플라즈마 처리에 따른 세포 이동성 확인

NF의 상처 치유 및 KF 매개 켈로이드 형성에서 중요한 세포 기전인 세포 이동에 대한 플라즈마의 효과를 조사하기 위해 상처 치유 분석을 수행 하였다. 이를 위해, NF 또는 KF를 12-웰 배양접시에 5 x 10⁵/웰의 밀도로 배양하였고, 단층의 시트(sheet)를 형성한 세포의 중심부를 팁으로 긁는 방법으로 도말하였다. 이후, 세척하여 도말에 의한 세포 잔해를 제거하고, 질소 및 아르곤 가스를 사용하여 플라즈마를 10초 또는 30초간 처리하고, 24시간 추가로 배양한 후, 세포 이동을 측정하였다.

실험 결과, 플라즈마 10초 처리는 NF와 KF 모두 대조군(비처리군 또는 가스만 처리한 군)에 비하여 현저한 차이가 발생하지 않았다. 플라즈마 30초 처리한 경우에는 NF의 세포 이동은 대조군에 비하여 28% 증가하였으나, KF의 세포 이동은 오히려 36% 감소하는 것으로 나타났다. 상기 결과를 도 1에 나타내었다.

실시예 2-3. NF와 KF에서 플라즈마 처리에 따른 세포 생존성 확인

NF와 KF에서 플라즈마 처리에 따라 세포 생존과 관련된 분자 기전이 달라지는지 확인하였다.

상시 실시예 2-2의 방법과 동일하게 NF와 KF를 배양 및 플라즈마 처리하고, 추가로 24 또는 48 시간 배양하였다. 이를 제조사의 프로토콜에 따라 FITC 아넥신V/PI 세포사 염색(Annexin-V and propidium iodide staining, BD Biosciences)하여, 유세포분석기로 측정하였다. 상기 결과를 도 2에 나타내었다.

또한, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide, Sigma-Aldrich) 염색하여, 세포 증식율을 양적 측정하였다. 염색 후, 광학적 측정은 540 nm에서 마이크로 플레이트 판독기 (Bio-Tek, Winooski, VT, USA)를 사용하였고, 플라즈마 미처리한 대조군 세포를 기준으로 백분율 환산하였다. 상기 결과를 도 3에 나타내었다.

도 2와 도 3의 결과로부터, 플라즈마 처리가 NF 또는 KF 세포의 양적 증가를 유도하지 않으며, 세포 생존에도 유의미한 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다.

실시예 2-4. NF와 KF에서 플라즈마 처리에 따른 단백질 발현 변화 확인

상시 실시예 2-2의 방법과 동일하게 배양 및 플라즈마 처리(10초, 30초, 또는 60초)한 NF와 KF에 대해서 세포 내 단백질 발현 변화를 측정하였다. 웨스턴 블랏팅을 위한 항체는 EGFR, E-cadherin, p-STAT-3 (Y705), STAT-3, p-ERK, ERK, Collagen Type 1, 및 α-tubulin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, 1:1000)을 사용하였고, p-STAT3의 세포 내 위치 측정을 항-p-STAT3 항체를 이용하여 면역형광염색법으로 확인하였다.

상기 웨스턴 블럿팅 결과를 도 4에, 면역형광염색 결과를 도 5에 나타내었다.

실험 결과, 플라즈마 처리된 NF에서는 EGFR 발현은 비교적 일정하게 유지되었으나, 플라즈마 처리된 KF에서는 EGFR의 현저한 발현 감소가 관찰되었다. E-cadherin 발현의 경우 NF에서는 감소 하였으나, KF에서는 증가하였고, p-ERK의 발현 수준은 NF에서는 변화가 없었으나, KF에서는 감소하였다. 특이적으로 플라즈마 처리 후에 p-STAT3 및 Collagen Type 1의 발현 수준은 NF에서 더 높았지만, 각각의 대조군에서의 발현에 비해서는 KF에서 더 감소하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 플라즈마 처리가 KF에서 EGFR, STAT3 및 p-ERK 경로를 억제함으로써 켈로이드 세포의 이동을 방해한다는 것을 의미한다.

면역형광염색 결과에서는 플라즈마 처리가 KF에서는 p-STAT3 발현을 감소 시켰지만, NF에서는 반대로 증가시키는 것으로 나타났다. 그러나, 핵으로의 STAT3 전좌는 어느 유형의 세포에서도 관찰되지 않았다.

실시예 2-5. 플라즈마 처리에 따른 KF 세포 이동성 억제의 메커니즘 확인

실시예 2-5-1. EGFR siRNA 및 STAT3 siRNA를 이용한 세포 이동 메커니즘 확인.

세포 이동에서 EGFR과 STAT3의 역할을 평가하기 위해, NF와 KF를 EGFR 또는 STAT3 특이적 siRNA로 처리한 후, 세포 이동성 분석 및 단백질 발현 변화를 확인하였다. siRNA 형질 주입 실험은 리포펙타민(Lipofectamine 2000, Gibco / Invitrogen) 시약을 사용하였고, 세포를 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고, PBS로 세척하고, siRNA로 24, 또는 48 시간 동안 처리하였다. EGFR-, STAT3- 특이적 및 대조군 siRNA는 Genolution Pharmaceuticals (Seoul, Korea)로부터 획득 하였다. 세포 이동성 분석은 상기 실시예 2-2와, 단백질 발현 변화 분석은 EGFR, p-EGFR, p-AKT (Ser473), AKT, p-ERK, ERK, p-STAT-3 (Y705), STAT-3, Collagen Type 1, Vimentin, E-cadherin, 및 α-tubulin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, 1:1000)을 사용하여 상기 실시예 2-4와 동일한 방법으로 수행하였다. 상기 EGFR 특이적 siRNA를 처리한 결과를 도 6에, STAT3 특이적 siRNA를 처리한 결과를 도 7에, 단백질 발현 변화 분석 수행한 결과를 도 8에 나타내었다.

실험 결과, EGFR- 특이적 siRNA에 의한 세포 이동 억제는 NF 및 KF 모두에서 효과적으로 나타났고, STAT3- 특이적 siRNA에 의한 세포 이동 또한 NF 및 KF 모두에서 비슷하게 억제되었다. 단백질 발현 변화 분석 결과에서는, EGFR- 특이적 siRNA 처리에 의해 NF와 KF에서 EGFR, p-AKT, p-STAT3 및 Collagen Type 1의 발현이 감소하는 것을 확인하였다. 동시에, STAT3- 특이적 siRNA로 처리하면 Collagen Type 1의 발현은 감소되었지만 EGFR 및 p-AKT의 발현 수준에는 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 EGFR 및 STAT3 억제가 플라즈마 처리에 의한 세포 이동의 억제에서 중심적인 역학적 역할을 할 수 있음을 시사한다.

실시예 2-5- 2.플라즈마 처리된 NF와 KF에서 세포 이동 메커니즘 확인.

상기 실시예 2-5-1의 결과에 의거하여, 플라즈마 처리가 KF에서 콜라겐 생성을 억제하는 가를 확인하였다.

먼저, 상기 실시예 2-2와 동일한 방법으로 10초, 30초, 또는 60초 플라즈마 처리된 NF와 KF에서 RT-PCR에 의한 Collagen Type 1, Collagen Type 3 및 TGF-β의 발현 수준을 평가하였다. TGF-β 신호 전달의 활성화를 통해 증가하는 콜라겐 침착은 켈로이드 형성의 주요 메커니즘을 나타낸다. RT-PCR을 위한 플라이머 서열은 하기 표 1에 기재하였다. 구체적인 조건으로, 시료를 94 ℃에서 3 분 동안 변성시킨 후, 94 ℃, 62 ℃ 및 72 ℃에서 30 초 동안 증폭시키고, 72 ℃에서 5 분간 연장시켰다. 최종 생성물을 1.5 % 아가로스 겔에서 전기 영동으로 분리하고, 자외선 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 밴드를 검출 하였다. 상기 결과를 도 9에 나타내었다.

타겟 유전자	방향	서열
Collagen Type 1	F(순방향)	5'-GGG CAA GAC AGT GAT TGA ATA-3 '
	R(역방향)	5'-ACG TCF AAG CCG AAT TCC T-3 '
Collagen Type 3	F(순방향)	5'-AGG TCC TGC GGG TAA CAC T-3 '
	R(역방향)	5'-ACT TTC ACC CTT GAC ACC CTG-3 '
TGF-β	F(순방향)	5'-CCG ACT ACT ACG CCA AGG-3 '
	R(역방향)	5'-AGT GAA CCC GTT GAT CA-3 '
GAPDH	F(순방향)	5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'
	R(역방향)	5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3 '

실험결과, NF에서 플라즈마 처리 후 Collagen Type 1, Collagen Type 3 및 TGF-β mRNA의 발현량에는 유의미한 변화가 나타나지 않았다. 그러나 KF에서는 상기 세 가지 mRNA 모두의 발현이 유의하게 감소되었다.

다음으로, 플라즈마 처리에 의하여 세포 수준에서 가용성 콜라겐의 침착이 감소하는가를 세포 배양 상층액의 총 가용성 콜라겐을 정량화하는 방법으로 측정하였다. 이를 위한 Sircol 콜라겐 분석(Biocolor, Belfast, UK)은 세포를 60mm² 배양 접시에서 24 시간 배양하고, 염기성 콜라겐 측쇄 그룹과 특이적으로 반응하는 음이온성 염료인 Sirius red stain을 상층액에 400 ㎕ 첨가하고, 실온에서 30 분간 완만하게 회전시키면서 추가로 배양하고, 12,000g에서 10 분간 원심 분리 한 후, 0.5M NaOH 1㎖을 첨가한 후 콜라겐 결합 염료를 다시 용해시키고, 효소 결합 면역 흡착 분석법 (Bio-Tek, Winooski, VT, USA)으로 540nm에서의 흡광도를 측정하는 방법으로 수행하였다. 흡광도는 세포 배양 상층액에서 새로 형성된 콜라겐의 양에 직접 비례한다.

실험 결과, 플라즈마 처리는 KF에서 가용성 콜라겐 함량을 감소시키는 반면, NF에서는 오히려 약간 증가시키는 것을 확인하였다. 상기 결과를 도 10에 나타내었다.

또한 상기 플라즈마 처리에 의한 Collagen Type 1의 발현량 변화가 면역 형광 염색 결과에서도 동일하게 나타나는 것을 확인하였다. 이를 도 11에 나타내었다.

실시예 2-6. 플라즈마와 siRNA 병용 처리된 NF와 KF에서 콜라겐 생성 변화 확인.

NF와 KF에 플라즈마와 STAT3- 특이적 siRNA를 병용으로 처리하였다. 그 결과, 플라즈마만 처리하거나, STAT3- 특이적 siRNA만 처리한 경우에 비하여, 플라즈마와 STAT3- 특이적 siRNA를 병용으로 처리한 경우에 콜라겐의 생성이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 도 12에 나타내었다.

상기 실시예 1과 2의 결과로부터, 플라즈마 처리에 의하여 KF에서의 세포 이동성이 현저하게 감소되며, 이는 세포 내 콜라겐 합성 저하에 의한 것이며, 플라즈마와 STAT3- 특이적 siRNA를 병용으로 처리하는 경우에는 더욱 현저하게 켈로이드 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다.

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4. 플라즈마 발생장치에 0.1 내지 10 kV의 전력 피크 및 10 내지 50 kHz의 주파수를 공급하여 발생시킨 플라즈마와, STAT3 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
5. 제 4항에 있어서,
   상기 STAT3 유전자의 발현 억제제는 STAT3 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 켈로이드 예방 또는 치료용 약학조성물.
   
6. 플라즈마 발생장치에 0.1 내지 10 kV의 전력 피크 및 10 내지 50 kHz의 주파수를 공급하여 발생시킨 플라즈마와, STAT3 유전자의 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는, 켈로이드 예방 또는 개선용 화장료조성물.
   
7. 제 6항에 있어서,
   상기 STAT3 유전자의 발현 억제제는 STAT3 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 켈로이드 예방 또는 개선용 화장료조성물.
   
8. 삭제
9. (a) 인간을 제외한 개체의 피부에, 플라즈마 발생장치에 0.1 내지 10 kV의 전력 피크 및 10 내지 50 kHz의 주파수를 공급하여 발생시킨 플라즈마를 처리하는 단계; 및
   (b) STAT3 유전자의 발현 억제제를 처리하는 단계;를 포함하는, 켈로이드 예방 또는 치료 방법.
   
10. 제 9항에 있어서,
    상기 (b)단계에서의 STAT3 유전자의 발현 억제제는 STAT3 유전자에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 켈로이드 예방 또는 치료 방법.
    

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