JP2009281876A - 血液中成分の定量分光分析法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】血清、血漿、血球又は血餅のいずれかの試料血液に含まれる標的物質の濃度を定量する方法であって、前記試料血液を、該試料血液がそのままもしくは希釈され、かつ無機塩が添加された状態で凍結させて凍結試料を得た後、前記凍結試料に、前記試料血液中に予め含まれている無機塩成分、前記無機塩もしくは前記無機塩から生じるイオンと前記標的物質との間、又は前記イオンと前記標的物質とそれらの周囲の水分子との間に形成される弱い相互作用のエネルギーに共鳴する周波数を含む電磁波を照射し、前記凍結試料を透過した電磁波を測定することにより得られる吸収特性スペクトルから前記標的物質の濃度を定量する血液中成分の定量分光分析法。
【選択図】図3
Description
テラヘルツ時間領域分光法は、標的物質固有のエネルギーに由来する吸収特性スペクトルを得ることで直接的に定性定量分析を行う方法である。
Y.Ueno,R.Rungsawang,I.Tomita,and K.Ajito,Anal.Chem.2006,78,5424−5428.
そこで本発明では、弱い相互作用のエネルギーに共鳴する電磁波を用いて、試料血液中の標的物質の濃度を高感度に定量することができる血液中成分の定量分光分析法を目的とする。
また、前記相互作用を形成する前記標的物質が、糖、有機酸、有機酸の塩、アミノ酸、アミノ酸の塩、ポリペプチド、蛋白質のいずれかを主成分とする物質であることが好ましい。
図1は、本発明の定量分光分析法に用いることのできる分析装置の一例を示した模式図である。本実施形態の分光分析装置10は、図1に示すように、周波数0.1〜10THzの周波数領域の電磁波を励起する励起光40を発生する光源12と、励起光40により電磁波42を発生させて凍結試料30に照射するパルス発生器22および凍結試料30を透過した電磁波を検出する検出器24を有する分光器14と、無機塩が添加された試料血液を凍結させて凍結試料30を得る低温チャンバ16と、凍結試料の厚さを測定する厚さ測定手段18と、分光器14、低温チャンバ16および厚さ測定手段18を制御し、かつスペクトル計算を行って吸収特性スペクトルを得る制御・計算手段20とを備えている。
凍結試料30は、前記試料血液を、該試料血液がそのままもしくは希釈され、かつ無機塩が添加された状態で凍結させた試料である。
パルス発生器22は、光源12からの励起光40を受け、電磁波42(テラヘルツ波)を発生することができるものであれば特に限定されず、例えば、非線形光学結晶、光伝導アンテナ、半導体、量子井戸、高温伝導薄膜等が挙げられる。
検出器24は、凍結試料30を透過した電磁波を検出できるものであれば特に限定されず、例えば、光伝導アンテナ等が挙げられる。
制御・計算手段20における制御としては、例えば、低温チャンバ16を制御して凍結試料30の調製および測定時の温度を制御し、分光器14および厚さ測定手段18の制御により測定を制御するもの等が挙げられる。また、制御・計算手段20における計算としては、検出器24における検出値からスペクトル計算を行い、吸収特性スペクトルを得るものが挙げられる。スペクトル計算としては、検出値からフーリエ変換により連続スペクトルを得て、その連続スペクトルを厚さ測定手段18から送られる凍結試料30の厚さ情報を基に単位厚さあたりに正規化するもの等が挙げられる。
制御・計算手段20としては、このような制御および計算が行えるものであれば特に限定されない。
以下、本発明の定量分光分析法の実施形態の一例として前述の分光分析装置10を用いた標的物質の濃度の定量方法について説明する。
本発明の定量分光分析法における試料血液は、血清、血漿、血球または血餅のいずれかの血液検査の対象となる試料である。
また、本発明における標的物質は、試料血液中に含まれ、該試料血液中で弱い相互作用を形成する物質であり、例えば、糖(グルコース等)、有機酸(コハク酸、リンゴ酸、クエン酸等)、有機酸の塩、アミノ酸(メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、システイン)、アミノ酸の塩、ポリペプチド、蛋白質のいずれかを主成分とする物質である。ここで、弱い相互作用とは、水素結合、ファンデルワールス結合、π電子相互作用、静電相互作用等の相互作用のことである。
また、試料血液中には、ナトリウム、亜鉛、マグネシウム、鉄、カリウム、カルシウム等の無機塩成分が予め含まれている。
また、無機塩は、例えば攪拌器等を用いて溶解させることができる。
無機塩としては、標的物質の濃度の定量に優れる点から、前記試料血液中で、亜鉛、カリウム、カルシウム、クロム、セレン、鉄、銅、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、リン、バナジウム、ストロンチウムもしくはアンモニウムのいずれかの陽イオン、またはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、水酸、亜硫酸、炭酸、硝酸、リン酸もしくはホウ酸のいずれかの陰イオンを生じる塩であることが好ましい。
無機塩は1種のみを単独で使用してもよく、2種以上を併用してもよい。
前記試料血液を凍結する速度は、該試料血液を急速に凍結できる速度であればよく、10℃/分以上であることが好ましく、30℃/分以上であることがより好ましい。前記試料血液を凍結する速度が10℃/分以上であれば、凍結の際に無機塩が析出することを抑制しやすいため、標的物質の濃度の定量が容易になる。
凍結試料30に照射する電磁波は、前記試料血液中に予め含まれている無機塩成分、前記添加された無機塩もしくは前記添加された無機塩から生じるイオンと前記標的物質との間、または前記イオンと前記標的物質とそれらの周囲の水分子との間に形成される弱い相互作用のエネルギーに共鳴する周波数を含む電磁波である。すなわち、前記試料血液中に予め含まれている無機塩成分と前記標的物質との間、または前記添加された無機塩と前記標的物質との間、または前記添加された無機塩から生じるイオンと前記標的物質との間、または前記イオンと前記標的物質とそれらの周囲の水分子との間に形成される弱い相互作用のエネルギーに共鳴する周波数を含む電磁波である。
弱い相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス結合、π電子相互作用、静電相互作用等の相互作用が挙げられる。これら弱い相互作用のエネルギーに共鳴する周波数を含む電磁波42の具体例としては、例えば、0.1〜10THzの周波数領域の電磁波(テラヘルツ波)が挙げられる。
そして、検出器24から、標的物質を透過した電磁波を検出した検出値と前記サンプリング検出の検出値とがデータとして制御・計算手段20に送られ、フーリエ変換により電磁波42の周波数成分の連続スペクトルに変換される。併せて、低温チャンバ16内の温度および厚さ測定手段18から制御・計算手段20に送られた凍結試料30の厚さの値を基に、得られた連続スペクトルを分析実施温度における単位厚さあたりに正規化して吸収特性スペクトルを得る。前記正規化は、凍結試料30の厚さと吸収特性スペクトルの吸収強度との比例関係を利用する。具体的には、厚さ測定手段18で測定された凍結試料30の厚さで、その吸収特性スペクトルを除算したものである。
また、純水を凍結させた氷を調製して参照試料とし、該参照試料に対して前述の検知工程と同様の測定を行って吸収特性スペクトルを得て、前記正規化した吸収特性スペクトルから参照試料の吸収特性スペクトルを減算することで、凍結試料30の吸収特性スペクトルを得る。
分析中の低温チャンバ16内の温度は、4〜300Kであることが好ましい。
方法(1)の検量線を用いる場合は、吸収特性スペクトル中における前記相互作用のエネルギーとの共鳴によるピークが生じた周波数において、その周波数における標準試料の濃度(既知)と吸収強度から検量線を作成する。これにより、対象となる試料血液の吸収特性スペクトルの同一の周波数の吸収強度から標的物質の濃度の定量を行うことができる。
また、方法(1)では、各温度において得られた標的物質の濃度の平均値と標準偏差を算出することが好ましい。また、方法(2)では、各温度において得られた前記係数の平均値と標準偏差を算出することが好ましい。
すなわち、方法(1)においては、対象の試料血液の吸収特性スペクトルの各ピークについて、同一ピークを有する標準試料の吸収特性スペクトルから得られた検量線を用いることで、試料血液中の各標的物質の濃度を定量することができる。
方法(2)においても、対象の試料血液の吸収特性スペクトルの各ピークについて、同一ピークを有する標準吸収スペクトルを抽出し、それらのピーク同士の誤差を最小にする係数を算出していくことにより、試料血液中の各標的物質の濃度を定量することができる。
したがって、本発明の定量分光分析法に不適当な周波数領域のスペクトルデータを除去して測定を行ってもよい。ここで、分析に不適当な周波数領域とは、例えば方法(2)の場合、該周波数領域が除かれた結果、標的物質の各々の濃度条件における標準吸収スペクトルの誤差が10%未満になる領域である。具体的には、0.5〜2.0THzの周波数領域の電磁波を用いて測定を行う方法が挙げられる。
これは、本発明の定量分光分析法では、無機塩を用い、該無機塩もしくは該無機塩から生じるイオンと標的物質との間、または前記イオンと標的物質とそれらの周囲の水分子との間に形成される弱い相互作用のエネルギーを利用しているため、標的物質が有する固有のエネルギーを直接測定する既存の技術に比べて吸収特性スペクトルの吸収強度が強くなるためである。
図1に例示した分光分析装置10を用いて、試料血液中の標的物質の濃度の定量を行った。分光分析装置10は、光源12としてチタンサファイアレーザであるvitesse(100フェムト秒型、コヒレント社製)を用い、パルス発生器22(光伝導アンテナ、浜松ホトニクス社製)、検出器24(光伝導性アンテナ、浜松ホトニクス社製)を備えた分光器14に低温チャンバ16(瞬間冷却器付き低温チャンバ、日本サーマル社製)および厚さ測定手段18を取り付けたものを用いた。
標的物質は血清中のグルコースとした。血清を試料血液として、これを純水で2倍に希釈して50%血清水溶液とし、希釈した試料血液に無機塩である塩化ナトリウムを濃度が20質量%となるように添加した。また、標的物質であるグルコースを濃度が0.2質量%となるように添加して試料血液Aとした。また、グルコースを添加していない以外は試料血液Aと同様に調製したものを試料血液Bとした。さらに、20質量%の塩化ナトリウム水溶液(試料C)を調製した。
また、同量の純水を用いて氷を作製し、吸収特性スペクトル測定時の参照試料とした。
前述の試料調製により得た凍結試料Aを厚さ測定手段18に設置し、0.1〜10.0THzの周波数領域の電磁波により測定を行い、測定により得られた連続スペクトルを単位試料厚さあたりに正規化した後、同様の測定により得た前記参照試料の吸収強度を差し引き、凍結試料Aの吸収特性スペクトルを得た。また、凍結試料BおよびCについても、凍結試料Aと同様の方法でそれぞれの凍結試料の吸収特性スペクトルを得た。
凍結試料A〜Cの吸収特性スペクトルを図3に示す。
[実施例1]
血清を試料血液として、これを純水で2倍に希釈して50%血清水溶液とし、これに濃度がそれぞれ0.05質量%、0.1質量%、0.2質量%となるようにグルコースを添加し、さらに無機塩である塩化ナトリウムを濃度が20質量%となるように添加した3種類の試料血液D〜Fを調製した。
ついで、試料血液D〜Fについて、実験例1と同様の方法で凍結試料D〜Fを調製し、それぞれの凍結試料について吸収特性スペクトルを測定した。
凍結試料D〜Fの吸収特性スペクトルを図4に示す。
また、1.8THzのピークの吸収強度とグルコースの濃度との関係をプロットした結果を図5に示す。図5に示すように、1.8THzのピークの吸収強度とグルコースの濃度との間には良好な直線関係が得られた。これにより、このピークの吸収強度を用いることでグルコースの定量が行えることが示された。
また、本実施例により0.05質量%のグルコースを定量できることが示されたことから、標的物質固有の吸収強度から定量を行う従来の直接的な定性定量分析法に比べて、検出限界は少なくとも100倍以上高くできることが期待でき、非常に高感度な定量分析が行えることがわかった。
Claims (3)
- 血清、血漿、血球または血餅のいずれかの試料血液に含まれる標的物質の濃度を定量する方法であって、
前記試料血液を、該試料血液がそのままもしくは希釈され、かつ無機塩が添加された状態で凍結させて凍結試料を得た後、
前記凍結試料に、前記試料血液中に予め含まれている無機塩成分、前記添加された無機塩、もしくは前記添加された無機塩から生じるイオンと前記標的物質との間、または前記イオンと前記標的物質とそれらの周囲の水分子との間に形成される弱い相互作用のエネルギーに共鳴する周波数を含む電磁波を照射し、前記凍結試料を透過した電磁波を測定することにより得られる吸収特性スペクトルから前記標的物質の濃度を定量する血液中成分の定量分光分析法。 - 前記添加された無機塩が、前記試料血液中で、亜鉛、カリウム、カルシウム、クロム、セレン、鉄、銅、ナトリウム、マグネシウム、マンガン、リン、バナジウム、ストロンチウムもしくはアンモニウムのいずれかの陽イオン、またはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、水酸、亜硫酸、炭酸、硝酸、リン酸もしくはホウ酸のいずれかの陰イオンを生じる塩である、請求項1に記載の血液中成分の定量分光分析法。
- 前記相互作用を形成する前記標的物質が、糖、有機酸、有機酸の塩、アミノ酸、アミノ酸の塩、ポリペプチド、蛋白質のいずれかを主成分とする物質である、請求項1または2に記載の血液中成分の定量分光分析法。
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