JP2009256271A - AQUAPORIN 3 mRNA EXPRESSION PROMOTOR AND SKIN MOISTURE RETENTION FUNCTION-IMPROVING AGENT - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、植物からの抽出物を有効成分とするアクアポリン（ＡＱＰ）３ｍＲＮＡ発現促進剤及び皮膚水分保持機能改善剤に関する。 The present invention relates to an aquaporin (AQP) 3 mRNA expression promoter and a skin water retention function improving agent, which contain an extract from a plant as an active ingredient.
皮膚細胞では、水チャンネルとして知られるアクアポリンが、細胞膜上に発現して、細胞間隙の水をはじめとする低分子物質を細胞内へ取り込む役割を担っていることが知られている。ヒトでは、１３種類のアクアポリン（ＡＱＰ０〜ＡＱＰ１２）の存在が知られている。表皮細胞においては、主としてアクアポリン３が存在しており、水に加えて、水分保持作用に関与するグリセロールや尿素等の低分子化合物をも取り込む役割を担っていると考えられている。しかしながら、アクアポリン３は加齢とともに減少し、このことが水分保持機能の低下の一因であることが示唆されていることから、アクアポリン３の発現を促進することにより、加齢による水分保持能やバリア機能等を制御することが可能であると考えられる（非特許文献１参照）。このような考えに基づき、アクアポリン３発現促進作用を有するものとして、例えば、ノウゼンハレン科植物より得られる抽出物（特許文献１参照）、トコフェリルレチノエート（特許文献２参照）等が知られている。 In skin cells, it is known that aquaporins, known as water channels, are expressed on the cell membrane and play a role of taking in low-molecular substances such as interstitial water into cells. In humans, the presence of 13 types of aquaporins (AQP0 to AQP12) is known. In epidermal cells, aquaporin 3 is mainly present, and it is considered to play a role of taking in low-molecular compounds such as glycerol and urea involved in water retention action in addition to water. However, aquaporin 3 decreases with aging, and this is suggested to contribute to a decrease in the water retention function. Therefore, by promoting the expression of aquaporin 3, It is considered that the barrier function and the like can be controlled (see Non-Patent Document 1). Based on such an idea, for example, an extract obtained from a Nozenhalen plant (see Patent Document 1), tocopheryl retinoate (see Patent Document 2) and the like are known as having an action of promoting aquaporin 3 expression. .
本発明においては、天然物の中から、表皮においてアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を有する成分を見出し、これらを有効成分として含有するアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤並びに皮膚水分保持機能改善剤を提供することを目的とした。 In the present invention, an object of the present invention is to find a component having an action for promoting aquaporin 3 mRNA expression in the epidermis from natural products, and to provide an aquaporin 3 mRNA expression promoter and a skin water retention function improving agent containing these as active ingredients. did.
前記課題を解決するために、種々検討を行ったところアスパラサスリネアリス、コガネバナ、カンゾウ、ドクダミ、チョウジ、マロニエ、マチルスオドラチシマ及びヘチマの各植物抽出物にアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of various studies to solve the above problems, the present inventors have found that aquaporin 3 mRNA expression promoting action is found in each plant extract of Asparasas cinereas, Koganebana, Licorice, Dokudami, Chouji, Maronnier, Matylus odoratishima, and Loofah. It came to complete.
本発明によると、アスパラサスリネアリス、コガネバナ、カンゾウ、ドクダミ、チョウジ、マロニエ、マチルスオドラチシマ及びヘチマの各抽出物から選択される少なくとも１種を含有してなるアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤が、優れたアクアポリン−３ｍＲＮＡ発現促進作用を有し、表皮水分保持機能の正常化による乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎や各種感染症などの皮膚症状の予防・改善を効果的に行うことができる。 According to the present invention, there is provided an aquaporin 3 mRNA expression promoter comprising at least one selected from the extracts of Asparasaslinearias, Coganebana, Daylily, Dokudami, Clove, Maroni, Mathillus dorachishima and Loofima. It has aquaporin-3 mRNA expression promoting action, and can effectively prevent and improve skin symptoms such as dry skin, rough skin, atopic dermatitis and various infectious diseases by normalizing the water retention function of the epidermis.
本発明のアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤は、アスパラサスリネアリス、コガネバナ、カンゾウ、ドクダミ、チョウジ、マロニエ、マチルスオドラチシマ及びヘチマの各抽出物から選択される少なくとも１種を含有してなり、さらに必要に応じてその他の成分を含有してなる。 The aquaporin 3 mRNA expression promoter of the present invention contains at least one selected from the extracts of asparasaslinearias, koganebana, licorice, dokudami, clove, maronnier, matylus odoratishima and loofah, and further necessary. Accordingly, it contains other components.
アスパラサスリネアリス（学名：Ａｓｐａｌａｔｈｕｓ ｌｉｎｅａｒｉｓ）は、マメ科の植物であり、南アフリカ等で栽培されておりこれらの地域から容易に入手可能である。抽出原料として使用し得る部位としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、好ましくは全草である。 Asparathus linealis (scientific name: Aspalathus linearis) is a leguminous plant that is cultivated in South Africa and the like and is easily available from these regions. There is no restriction | limiting in particular as a site | part which can be used as an extraction raw material, Although it can select suitably according to the objective, Preferably it is a whole plant.
コガネバナ（学名：Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ）は、中国北部から東北部、モンゴル等に分布しているシソ科タツナミソウ属に属する多年草であり、これらの地域から容易に入手することができる。抽出原料として使用し得る部位としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば、葉、花、根、樹皮、枝又はこれらの混合物が挙げられ、これらの中でも、根が好ましい。コガネバナの根を生薬名でオウゴンといい、従来、健胃薬、抗アレルギー剤等として使用されている。 Scutellaria baicalalensis is a perennial belonging to the genus Lamiaceae that is distributed from northern China to the northeastern region, Mongolia, etc., and can be easily obtained from these regions. The site that can be used as an extraction raw material is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include leaves, flowers, roots, bark, branches, and mixtures thereof. Among these, roots Is preferred. The root of Koganebana is called “Ougon” under the name of herbal medicine, and it has been used as a stomachic medicine, an antiallergic agent and the like.
カンゾウは、マメ科カンゾウ属に属し、古代より薬用又は甘味料の原料として利用されている有用植物である。抽出原料として使用するカンゾウの種類は特に限定されるものではなく、例えば、グリチリーザ グラブラ（Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｇｌａｂｒａ）、グリチリーザ インフラータ（Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｉｎｆｌａｔａ）、グリチリーザ ウラレンシス（Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、グリチリーザ アスペラ（Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ａｓｐｅｒａ）、グリチリーザ パリディフロラ（Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｐａｌｌｉｄｉｆｌｏｒａ）等を抽出原料として使用することが出来るが、好ましくはグリチリーザ グラブラ（Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｇｌａｂｒａ）、グリチリーザ インフラータ（Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｉｎｆｌａｔａ）、グリチリーザ ウラレンシス（Ｇｌｙｃｈｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）である。また、抽出原料として使用し得るカンゾウの構成部位としては、例えば、葉部、枝部、樹皮部、幹部、茎部、果実部、種子部、花部等の地上部、根部、根茎部又はこれらの混合物等が挙げられるが、好ましくは葉部及び枝部である。 Licorice belongs to the genus Lizoaceae and is a useful plant that has been used as a raw material for medicinal or sweeteners since ancient times. The kind of licorice used as a raw material for extraction is not particularly limited. Glychyrrhiza pallidiflora and the like can be used as an extraction raw material, but preferably Glychyrhiza glabra, Glychryrhiza inflata, Glychryza urarensis It is a uralensis). Examples of the constituent parts of licorice that can be used as an extraction raw material include, for example, leaf parts, branch parts, bark parts, trunk parts, stem parts, fruit parts, seed parts, flower parts, etc., root parts, rhizome parts, or these The leaf part and the branch part are preferable.
ドクダミ（学名：Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａ ｃｏｒｄａｔａ）は、ドクダミ科の植物であり、日本各地に分布しており、これらの地域から容易に入手可能である。抽出原料として使用し得る部位としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば葉、枝、茎、花、蕾、果実、根茎、地上部またはこれらの混合物が挙げられ、これらの中でも地上部が好ましく、生薬名でジュウヤクと呼ばれる。 Dokudami (scientific name: Houttunia cordadata) is a plant belonging to the family Dokudami, which is distributed in various parts of Japan and is easily available from these areas. The site that can be used as an extraction raw material is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include leaves, branches, stems, flowers, persimmons, fruits, rhizomes, aerial parts, and mixtures thereof. Of these, the above-ground part is preferable, and it is called juyaku by the name of herbal medicine.
チョウジ（学名：Ｓｙｚｙｇｉｕｍ ａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）は、フトモモ科の植物であり、インドネシア、タンザニア、マダガスカル、マレーシア等で栽培されており、これらの地域から容易に入手可能である。抽出原料として使用し得る部位としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば葉、茎、根、花、蕾、種子、果実、果皮、果核、地上部、全草またはこれらの混合物が挙げられ、これらの中でも前記蕾が好ましい。 Clove (scientific name: Syzygium aromaticum) is a plant of the Myrtaceae family and is cultivated in Indonesia, Tanzania, Madagascar, Malaysia, etc., and is easily available from these regions. The site that can be used as an extraction raw material is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. For example, leaves, stems, roots, flowers, persimmons, seeds, fruits, pericarps, fruit nuclei, above-ground parts, all parts Examples thereof include grass or a mixture thereof, and among these, the cocoon is preferable.
マロニエ（学名：Ａｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）は、トチノキ科の植物であり、ヨーロッパ、北アメリカ等で栽培されておりこれらの地域から容易に入手可能である。抽出原料として使用し得る部位としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば葉、枝、茎、花、蕾、種子、樹皮、根、塊根、地上部またはこれらの混合物が挙げられ、これらの中でも種子が好ましい。 Maronnier (scientific name: Aesculus hippocastanum) is a plant belonging to the family Aceculaceae and is cultivated in Europe, North America, etc., and is easily available from these regions. The site that can be used as an extraction raw material is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. For example, leaves, branches, stems, flowers, buds, seeds, bark, roots, tuberous roots, above-ground parts, or these parts A mixture is mentioned, Among these, a seed is preferable.
マチルスオドラチシマ（学名：Ｍａｃｈｉｌｕｓ ｏｄｏｒａｔｉｓｓｉｍａ）は、クスノキ科の植物であり、亜熱帯に分布しており、これらの地域から容易に入手可能である。抽出原料として使用し得る部位としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば葉、茎、花、根、樹皮、枝またはこれらの混合物が挙げられ、これらの中でも樹皮が好ましい。 Machilus odoratishima (scientific name: Machilus odoratisima) is a plant belonging to the family Aceraceae and is distributed in the subtropics and is easily available from these regions. The site that can be used as an extraction raw material is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include leaves, stems, flowers, roots, bark, branches, and mixtures thereof, and among these, bark Is preferred.
ヘチマ（学名：Ｌｕｆｆａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）は、ウリ科の植物であり、日本各地で栽培されており、これらの地域から容易に入手可能である。抽出原料として使用し得る部位としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選定することができるが、例えば葉、茎、花、蕾、果実、果皮、果核、地上部またはこれらの混合物が挙げられ、これらの中でも地上部が好ましい。 Loofah (scientific name: Luffa cylindrica) is a plant of the Cucurbitaceae family and is cultivated in various parts of Japan and is easily available from these areas. The site that can be used as the extraction raw material is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include leaves, stems, flowers, persimmons, fruits, pericarps, fruit nuclei, aerial parts, and mixtures thereof. Among these, the above-ground part is preferable.
なお、前記アスパラサスリネアリス、コガネバナ、カンゾウ、ドクダミ、チョウジ、マロニエ、マチルスオドラチシマ及びヘチマの各抽出物が含有する有効成分であるアクアポリン−３ｍＲＮＡ発現促進作用物質の詳細については不明であるが、これらの有効成分は植物の抽出に一般に用いられている方法により抽出したものを使用してもよいし、市販品を使用してもよい。前記抽出物には、抽出処理によって抽出原料から得られる抽出液、該抽出液の希釈液もしくは濃縮液、該抽出液を乾燥して得られる乾燥物、又はこれらの粗精製物もしくは精製物のいずれもが含まれる。 The details of the aquaporin-3 mRNA expression promoting agent, which is an active ingredient contained in each extract of Asparasaslinearias, Koganebana, Licorice, Dokudami, Choji, Maroni, Mathilus odoratishima and Loofima, are unknown. As these active ingredients, those extracted by a method generally used for plant extraction may be used, or commercially available products may be used. The extract includes any one of an extract obtained from an extraction raw material by an extraction process, a diluted or concentrated solution of the extract, a dried product obtained by drying the extract, or a roughly purified product or a purified product thereof. Is also included.
前記抽出原料は、採取後ただちに乾燥し粉砕したものが適当である。乾燥は天日で行ってもよいし、通常使用される乾燥機を用いて行ってもよい。また、ヘキサン、ベンゼン等の非極性溶媒によって脱脂等の前処理を施してから抽出原料として使用してもよい。 The extraction raw material is suitably dried and pulverized immediately after collection. Drying may be performed in the sun or using a commonly used dryer. Moreover, after performing pre-processing, such as degreasing, with nonpolar solvents, such as hexane and benzene, you may use as an extraction raw material.
前記抽出に用いる溶媒としては、水若しくは親水性有機溶媒又はこれらの混合液を室温又は溶媒の沸点以下の温度で用いることが好ましい。各植物に含まれるアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用を示す成分は、極性溶媒を抽出溶媒とする抽出処理によって容易に抽出することができる。 As the solvent used for the extraction, it is preferable to use water, a hydrophilic organic solvent, or a mixture thereof at room temperature or a temperature not higher than the boiling point of the solvent. The component showing the aquaporin 3 mRNA expression promoting action contained in each plant can be easily extracted by an extraction treatment using a polar solvent as an extraction solvent.
前記抽出溶媒として使用し得る水としては、例えば、純水、水道水、井戸水、鉱泉水、鉱水、温泉水、湧水、淡水等の他、これらに各種処理を施したものが含まれる。水に施す処理としては、例えば、精製、加熱、殺菌、ろ過、イオン交換、浸透圧の調整、緩衝化等が含まれる。従って、本発明において抽出溶媒として使用し得る水には、精製水、熱水、イオン交換水、生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等も含まれる。 Examples of water that can be used as the extraction solvent include pure water, tap water, well water, mineral spring water, mineral water, hot spring water, spring water, fresh water, and the like, as well as water that has been subjected to various treatments. Examples of the treatment applied to water include purification, heating, sterilization, filtration, ion exchange, adjustment of osmotic pressure, buffering, and the like. Therefore, the water that can be used as the extraction solvent in the present invention includes purified water, hot water, ion-exchanged water, physiological saline, phosphate buffer, phosphate buffered saline, and the like.
前記親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等の炭素数１〜５の低級アルコール；アセトン、メチルエチルケトン等の低級脂肪族ケトン；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等の炭素数２〜５の多価アルコールなどが挙げられ、該親水性有機溶媒と水との混合溶媒などを用いることができる。 Examples of the hydrophilic organic solvent include lower alcohols having 1 to 5 carbon atoms such as methanol, ethanol, propyl alcohol, and isopropyl alcohol; lower aliphatic ketones such as acetone and methyl ethyl ketone; 1,3-butylene glycol, propylene glycol, Examples thereof include polyhydric alcohols having 2 to 5 carbon atoms such as glycerin, and a mixed solvent of the hydrophilic organic solvent and water can be used.
なお、前記水と親水性有機溶媒との抽出溶媒を使用する場合には、低級アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部、低級脂肪族ケトンの場合は水１０質量部に対して１〜４０質量部添加することが好ましい。多価アルコールの場合は水１０質量部に対して１〜９０質量部添加することが好ましい。 In addition, when using the extraction solvent of the said water and a hydrophilic organic solvent, in the case of a lower alcohol, it is 1-90 mass parts with respect to 10 mass parts of water, and in the case of a lower aliphatic ketone, it is 10 mass parts of water. It is preferable to add 1-40 mass parts with respect to it. In the case of a polyhydric alcohol, it is preferable to add 1 to 90 parts by mass with respect to 10 parts by mass of water.
本発明において、前記各抽出原料からアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進物質を抽出するにあたって特殊な抽出方法を採用する必要はなく、室温又は還流加熱下で、任意の装置を用いて抽出することができる。 In the present invention, it is not necessary to employ a special extraction method for extracting the aquaporin 3 mRNA expression promoting substance from each extraction raw material, and the extraction can be performed using an arbitrary apparatus at room temperature or under reflux heating.
具体的には、抽出溶媒を満たした処理槽に各抽出原料を投入し、更に必要に応じて時々攪拌しながら、３０分〜４時間静置して可溶性成分を溶出した後、ろ過して固形物を除去し、得られた抽出液から抽出溶媒を留去し、乾燥することにより抽出物が得られる。抽出溶媒量は通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）である。抽出条件は、抽出溶媒として水を用いた場合には、通常５０〜９５℃で１〜４時間程度である。また、抽出溶媒として水とエタノールとの混合溶媒を用いた場合には、通常４０〜８０℃で３０分〜４時間程度である。なお、溶媒で抽出することにより得られる抽出液は、抽出溶媒が安全性の高いものであればそのまま配合して本発明のアクアポリン−３ｍＲＮＡ発現促進剤及び／又は皮膚水分保持機能改善剤の有効成分として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。 Specifically, each extraction raw material is put into a treatment tank filled with an extraction solvent, and further, while stirring occasionally as necessary, the mixture is allowed to stand for 30 minutes to 4 hours to elute soluble components, and then filtered and solidified. An extract is obtained by removing a thing, distilling an extraction solvent off from the obtained extract, and drying. The amount of the extraction solvent is usually 5 to 15 times (mass ratio) of the extraction raw material. The extraction condition is usually about 1 to 4 hours at 50 to 95 ° C. when water is used as the extraction solvent. Moreover, when using the mixed solvent of water and ethanol as an extraction solvent, it is about 30 minutes-4 hours at 40-80 degreeC normally. It should be noted that the extract obtained by extraction with a solvent is an active ingredient of the aquaporin-3 mRNA expression promoter and / or skin moisture retention function improving agent of the present invention, as long as the extraction solvent is highly safe. However, a concentrated solution or a dried product thereof is easier to use.
得られた抽出液は、該抽出液の希釈液若しくは濃縮液、該抽出液の乾燥物、又はこれらの粗精製物若しくは精製物を得るために、常法に従って希釈、濃縮、乾燥、精製等の処理を施してもよい。 The obtained extract is diluted, concentrated, dried, purified, etc. according to a conventional method in order to obtain a diluted or concentrated solution of the extract, a dried product of the extract, or a crude purified product or a purified product thereof. Processing may be performed.
なお、得られた抽出液はそのままでもアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤及び／又は皮膚水分保持機能改善剤として使用することができるが、濃縮液又はその乾燥物としたものの方が利用しやすい。乾燥物を得るにあたっては、吸湿性を改善するためにデキストリン、シクロデキストリン等のキャリアーを添加してもよい。 The obtained extract can be used as it is as an aquaporin 3 mRNA expression promoter and / or skin moisture retention function improver, but a concentrated solution or a dried product thereof is easier to use. In obtaining a dried product, a carrier such as dextrin or cyclodextrin may be added to improve hygroscopicity.
また、各抽出原料は特有の匂いと味を有しているため、その生理活性の低下を招かない範囲で脱色、脱臭等を目的とする精製を行うことも可能であるが、化粧料に添加する場合には大量に使用するものではないから、未精製のままでも実用上支障はない。精製は、具体的には活性炭処理、吸着樹脂処理、イオン交換樹脂処理等によって行うことができる。 In addition, since each extraction raw material has a unique odor and taste, it is possible to carry out purification for the purpose of decolorization, deodorization, etc. within a range that does not cause a decrease in its physiological activity, but it is added to cosmetics. In this case, since it is not used in large quantities, there is no practical problem even if it is not purified. Specifically, purification can be performed by activated carbon treatment, adsorption resin treatment, ion exchange resin treatment, or the like.
本発明のアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤及び／又は皮膚水分保持機能改善剤は、製剤化により粉末状、顆粒状、錠剤状等、任意の剤形とすることができる。 The aquaporin 3 mRNA expression promoter and / or skin moisture retention function improving agent of the present invention can be made into any dosage form such as powder, granule, tablet, etc. by formulation.
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、本試験例においては、試料として表１に示す製品（全て丸善製薬社製）の凍結乾燥品を使用した（試料１〜８）。 Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples. In this test example, freeze-dried products (samples 1 to 8) shown in Table 1 (all manufactured by Maruzen Pharmaceutical Co., Ltd.) were used as samples.
〔表１〕
試料 抽出原料 製品名
１ アスパラサスリネアリス全草 アスパラサスリネアリス抽出液
２ コガネバナ根 オウゴン抽出液
３ カンゾウ葉 甘草葉抽出液
４ ドクダミ地上部 ジュウヤク抽出液
５ チョウジ蕾 チョウジ抽出液
６ マロニエ種子 マロニエ抽出液
７ マチルスオドラチシマ樹皮 マチルス樹皮抽出液
８ ヘチマ地上部 ヘチマ抽出液
[Table 1]
Sample Extraction raw material Product name
1 Asparagus Linearis Whole Asparagus Linearis Extract 2 Koganabana Root Ogon Extract 3 Licorice Leaves Licorice Leaf Extract 4 Dokudami Aboveground Juyaku Extract 5 Clove Mushroom Clove Extract 6 Maronier Seed Maronier Extract 7 Matilus Odrachima Tree Bark extract
8 Loofah above ground loofah extract
〔試験例１〕アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用試験
上記の各抽出物について、下記の方法によりアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用の試験をした。
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞（ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｋｅｔｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ；ＮＨＥＫ）を８０ｃｍ２フラスコで正常ヒト表皮角化細胞長期培養用増殖培地（Ｅｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２）において、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて前培養し、トリプシン処理により細胞を回収した。
回収した細胞を３５ｍｍシャーレ（ＦＡＬＣＯＮ社製）に４０×１０４ｃｅｌｌｓ／２ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下で、Ｅｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２を用いて一晩培養した。２４時間後に培養液を捨て、Ｅｐｉｌｉｆｅ−ＫＧ２で溶解した試料溶液を各シャーレに２ｍＬずつ添加し、３７℃、５％ＣＯ２−９５％ａｉｒの条件下にて２４時間培養した。培養後、培養液を捨て、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製，Ｃａｔ． Ｎｏ． ３１１−０２５０１）にて総ＲＮＡを抽出し、それぞれのＲＮＡ量を分光光度計にて測定し、２００μｇ／ｍＬになるように総ＲＮＡを調製した。
この総ＲＮＡを鋳型とし、アクアポリン３及び内部標準であるＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を測定した。検出はリアルタイムＰＣＲ装置Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を用いて、ＴａＫａＲａ ＳＹＢＥＲ Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ，ｃｏｄｅ Ｎｏ． ＲＲ０６３Ａ）によるリアルタイム２Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ反応により行った。アクアポリン３の発現量は、「試料無添加」で及び「試料添加」でそれぞれ培養した細胞から調製した総ＲＮＡ標品を基にして、ＧＡＰＤＨの値で補正値を求め、さらに「試料無添加」の補正値を１００としたときの「試料添加」の補正値を算出した。得られた結果から、下記式により、アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進率（％）を算出した。
アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進率（％）＝Ａ／Ｂ×１００
式中、Ａは「試料添加時の補正値」を表し、Ｂは「試料無添加時の補正値」を表す。
上記試験の結果を表２に示す。なお、上記計算式において、試料無添加のアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進率は１００％となる。
[Test Example 1] Aquaporin 3 mRNA expression promoting action test Each of the above extracts was tested for aquaporin 3 mRNA expression promoting action by the following method.
Normal human epidermis keratinocytes (NHEK) in 80 cm 2 flasks in normal human epidermal keratinocyte long-term growth medium (Epilife-KG2) at 37 ° C., 5% CO 2 -95% air The cells were precultured under the above conditions and cells were collected by trypsin treatment.
The collected cells were inoculated in a 35 mm petri dish (manufactured by FALCON) at 40 × 10 4 cells / 2 mL, and cultured overnight at 37 ° C. under 5% CO 2 -95% air using Epilife-KG2. After 24 hours, the culture solution was discarded, and 2 mL of the sample solution dissolved with Epilife-KG2 was added to each petri dish, and cultured for 24 hours under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 -95% air. After culturing, the culture solution is discarded, total RNA is extracted with ISOGEN (Nippon Gene, Cat. No. 311-02501), and the amount of each RNA is measured with a spectrophotometer so that it becomes 200 μg / mL. Total RNA was prepared.
Using this total RNA as a template, the expression levels of aquaporin 3 and GAPDH mRNA as an internal standard were measured. The detection was performed by real-time 2 Step RT-PCR reaction using TaKaRa SYBER Prime Script RT-PCR kit (Perfect Real Time, code No. RR063A) using a real-time PCR apparatus Smart Cycler (manufactured by Cepheid). The expression level of aquaporin 3 was determined based on the total RNA preparation prepared from the cells cultured with “no sample added” and “added sample”, respectively, and a correction value was obtained from the GAPDH value. The correction value of “sample addition” was calculated with the correction value of 100 being 100. From the obtained results, the aquaporin 3 mRNA expression promotion rate (%) was calculated by the following formula.
Aquaporin 3 mRNA expression promotion rate (%) = A / B × 100
In the formula, A represents “correction value when sample is added”, and B represents “correction value when sample is not added”.
The results of the above test are shown in Table 2. In the above calculation formula, the aquaporin 3 mRNA expression promotion rate without addition of the sample is 100%.
〔表２〕
試料 試料濃度（μｇ／ｍＬ） アクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進率（％）
１ １２．５ １３２．８
２ １．０ １１０．６
３ １０．０ １１４．９
４ １．０ １１６．６
５ １．０ １２５．１
１０．０ １３４．１
６ １．０ １１５．２
７ １．０ １６８．０
８ １２．５ １０２．８
５０．０ １３０．６
[Table 2]
Sample Sample concentration (μg / mL) Aquaporin 3 mRNA expression promotion rate (%)
1 12.5 132.8
2 1.0 110.6
3 10.0 114.9
4 1.0 116.6
5 1.0 125.1
10.0 134.1
6 1.0 115.2
7 1.0 168.0
8 12.5 102.8
50.0 130.6
表２に示すように、アスパラサスリネアリス、コガネバナ、カンゾウ、ドクダミ、チョウジ、マロニエ、マチルスオドラチシマ及びヘチマの各抽出物は、いずれも高いアクアポリン−３ｍＲＮＡ発現促進率を示した。この結果から、これらの抽出物は、優れたアクアポリン−３ｍＲＮＡ発現促進作用を有することが確認された。 As shown in Table 2, each extract of Asparasaslinearias, Koganebana, Licorice, Dokudami, Chou, Maroni, Matils odoratishima and Loofima showed a high aquaporin-3 mRNA expression promotion rate. From these results, it was confirmed that these extracts have an excellent aquaporin-3 mRNA expression promoting action.
本発明のアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進剤及び皮膚水分保持機能改善剤は、表皮におけるアクアポリン３ｍＲＮＡ発現促進作用によって皮膚の水分保持機能を改善させることにより、乾燥肌、荒れ肌、アトピー性皮膚炎などの各種皮膚症状の予防・改善に大きく貢献できる。 The aquaporin 3 mRNA expression promoter and skin water retention function improving agent of the present invention improves various skin symptoms such as dry skin, rough skin, and atopic dermatitis by improving the skin water retention function by promoting aquaporin 3 mRNA expression in the epidermis. Can greatly contribute to prevention and improvement.
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