JP2009255019A - リポソーム及びその作製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 水性溶液相1上に油性溶液相2を配するとともに、油水界面に外層脂質膜となる脂質単分子膜3を形成しておき、油性液体相2中に内層脂質膜6が形成されたW/O液滴5を導入する。液滴7を構成する水性溶液と水性溶液相1を構成する水性溶液に比重差を付与することで、重力によりW/O液滴5を水性溶液相1中に移行させ、内層脂質膜6の外側に外層脂質膜(脂質単分子膜3)を形成する。作製されるリポソーム9は、内層脂質膜6と外層脂質膜(脂質単分子膜3)の組成が異なる非対称性脂質2分子膜を備え、当該非対称性脂質2分子膜の膜面内に特定の脂質が偏在したミクロドメイン構造が形成されている。
【選択図】 図1
Description
・DOPC(不飽和リン脂質):dioleoyl L-α phosphatidylcholine(Avanti Polar Lipids社製)
・DPPC(飽和リン脂質):dipalmitoyl L-α phosphatidylcoline(Avanti Polar Lipids社製)
・コレステロール(Avanti Polar Lipids社製)
・ミネラルオイル(Nacalai Tesque社製)
・Rhodamine red-X DHPE(蛍光色素):N-(rhodamine red-X)-1,2-dihexadecanoyl -sn-glycero-3-pjosphoethanolamine triethylammonium salt(λex=560nm、λen=580nm)(Invitroge社製)
・NBD−PE(蛍光色素):1-oleoyl-2-[12-[(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazo-4-yl) amino]dodecanoyl]-sn-glycero-3-phosphoethanolamine(λex=460nm、λen=533nm)(Avanti Polar Lipids社製)
・eggPC:egg yolk phosphatidylcholine (卵黄フォスファチジルコリン)
DOPC、DPPC、コレステロール、eggPCを、濃度が7mg/mLとなるようにクロロホルム/メタノール混合溶媒(容積比2:1)に溶解した。このリン脂質溶液をガラスの試験管に注いだ。蛍光色素であるRhodamine red-X DHPEとNBD−PEは、それぞれ1/50のモル比率でリン脂質と混合した。窒素ガスによって有機溶媒を蒸発させ、3時間以上真空下で乾燥させることで、試験管の底に乾いたリン脂質のフィルムを作製した。ミネラルオイルを入れ、50℃、60分間超音波処理をした。オイル中の脂質の最終濃度は0.5mMまたは0.1mMにした。W/O液滴は、リン脂質を含むオイルに水溶液を5%加えて、タッピングすることで作製した。
観察チャンバの構成を図2に示す。本実験で使用した観察チャンバは、スライドガラス11上に円筒形状の孔部13を形成したシリコンゴムシート12を載置することにより構成されている。前記孔部13内でリポソーム形成が行われる。前記観察チャンバにおいては、スライドガラス11を通して孔部13内の様子を観察することが可能である。なお、液滴やリポソームの観察は、スライドガラス11下に顕微鏡の対物レンズ14を配置して行った。使用した顕微鏡は、60倍レンズと100倍オイルレンズを装備した倒立型顕微鏡(オリンパス社製)である。
リポソームを効率的に作製するために、液滴の比重を大きくすることを試みた。液滴の比重を大きくするために、本実験では、液滴の中にスクロース溶液、水相の中に同じ濃度のグルコース溶液を入れた。スクロース溶液とグルコース溶液は、浸透圧が加わるのを防ぐために同じ濃度に調製した。また、本実験では、スクロース及びグルコースについて、10mM、100mM、1M溶液を用いてリポソームを作製し、その大きさと個数を測定した。なお、液滴(内層脂質膜)の脂質はeggPC、単分子膜(外層脂質膜)の脂質は0.1mM・DOPCを用いた。
液滴から作製されたリポソームが二分子膜内外層非対称であるかを調べた。図5(a)は、単分子膜(外層脂質膜)にのみRhodamine red-X DHPEを入れ、液滴(内層脂質膜)には蛍光色素を入れずに作製したリポソームの蛍光顕微鏡写真であり、図5(b)は、写真のリポソームの赤道面の白い点線上の蛍光強度を示したものである。図6(a)は、液滴(内層脂質膜)にのみNBD−PEを入れ、単分子膜(外層脂質膜)には蛍光色素を入れずに作製したリポソームの蛍光顕微鏡写真であり、図6(b)は、写真のリポソームの赤道面の白い点線上の蛍光強度を示したものである。図7(a)は、単分子膜(外層脂質膜)にRhodamine red-X DHPEを入れ、液滴(内層脂質膜)にNBD−PEを入れて作製したリポソームの蛍光顕微鏡写真(Rhodamine red-X DHPE)、図7(b)は、図7(a)のリポソームの赤道面の白い点線上の蛍光強度を示したもの、図7(c)は、単分子膜(外層脂質膜)にRhodamine red-X DHPEを入れ、液滴(内層脂質膜)にNBD−PEを入れて作製したリポソームの蛍光顕微鏡写真(NBD−PE)、図7(d)は、図7(c)のリポソームの赤道面の白い点線上の蛍光強度を示したものである。
内層に3種類の脂質と蛍光色素、外層にDOPCのみ入ったリポソームにおいて、脂質組成によるドメインの形成の様子を観察した。先ず、図8(a)に示すように、内層脂質膜がDOPCのみでできた液滴から作製したリポソームでは、ドメイン構造が観察されなかった。内層脂質膜がDOPCとDPPCの比率が1対1の組成でコレステロールを10%含む液滴から作製したリポソームでは、図8(b)に示すように、蛍光色素で染まった無秩序相の膜面に、蛍光色素で染まっていない秩序相のドメインが点在する様子が観察された。内層脂質膜がDOPCとDPPCの比率が1対1の組成でコレステロールを60%含む液滴から作製したリポソームでも、図8(c)に示すように、蛍光色素で染まった無秩序相の膜面に、蛍光色素で染まっていない秩序相のドメインが点在する様子が観察された。
Claims (7)
- 内層脂質膜と外層脂質膜の組成が異なる非対称性脂質2分子膜を備え、当該非対称性脂質2分子膜の膜面内に特定の脂質が偏在したミクロドメイン構造が形成されていることを特徴とするリポソーム。
- 水性溶液相上に油性溶液相を配するとともに、油水界面に外層脂質膜となる脂質単分子膜を形成しておき、
油性液体相中に内層脂質膜が形成された液滴を導入し、前記液滴を構成する水性溶液と前記水性溶液相を構成する水性溶液に比重差を付与することで、重力により前記液滴を水性溶液相中に移行させ、前記内層脂質膜の外側に外層脂質膜を形成することを特徴とするリポソームの作製方法。 - 前記液滴と前記水性溶液相に異なる溶質を溶解することで比重差を付与することを特徴とする請求項2記載のリポソームの作製方法。
- 前記液滴と前記水性溶液相における溶質の濃度が略等しいことを特徴とする請求項3記載のリポソームの作製方法。
- 前記溶質が糖であることを特徴とする請求項3記載のリポソームの作製方法。
- 前記液滴にスクロースを溶解し、前記水性溶液相にグルコースを溶解することを特徴とする請求項5記載のリポソームの作製方法。
- 前記油水界面に形成される脂質単分子膜を構成する脂質と、前記内層脂質膜を構成する脂質とは、その組成が異なることを特徴とする請求項2から6のいずれか1項記載のリポソームの作製方法。
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