JP2009242255A - プラスミノーゲン活性化剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】乳酸菌の菌体を有効成分とするプラスミノーゲン活性化剤であり、前記乳酸菌は、Lactococcuslactis ssp. lactis、Lactococcus lactis ssp. lactisbv. diacetylactis、及びLactobacillusbulgaricusのいずれか一種以上が好ましく、更には前記乳酸菌の菌体を、80℃〜150℃の温度で、5分〜40分加熱処理することが好ましい。また本発明のプラスミノーゲン活性化剤は、前記乳酸菌の菌体からpH7〜pH14の抽出液により抽出したものを利用することができる。
【選択図】なし
Description
<1> 本発明は、乳酸菌の菌体を有効成分とするプラスミノーゲン活性化剤であり、前記乳酸菌は、Lactococcus lactis ssp. lactis、Lactococcus lactis ssp. lactisbv. diacetylactis、及びLactobacillusbulgaricusのいずれか一種以上が好ましい。
<2> 更に本発明は、前記乳酸菌の菌体を、80℃〜150℃の温度で、5分〜40分加熱処理したプラスミノーゲン活性化剤である 。
<3> 更に本発明は、前記乳酸菌の菌体から、pH7〜pH14の抽出液により抽出されたプラスミノーゲン活性化剤である 。
<4> 更に本発明は、前記のプラスミノーゲン活性化剤を用いた食品、及び飼料又はペットフードである。
(供試株及び培養)
実施例1に供試した菌株は、Lactococcus lactis ssp. lactisに属する菌株3種、Lactococcus lactis ssp. lactis bv. diacetylactisに属する菌株3種、Lactococcus lactisssp. cremorisに属する菌株1種、Lactobacillus bulgaricusに属する菌株2種、Lactobacillus coryniformisに属する菌株1種、Lactobacillus paraplantarumに属する菌株1種、Lactobacillus plantarumに属する菌株1種、Leuconostoc mesenteroidesに属する菌株1種、Pediococcus acidilacticiに属する菌株1種、及びStreptococcus thermophilusに属する菌株1種の合計15株を用いた。試験に供試した乳酸菌株、及びその入手先を表1に示したが、表1の寄託機関欄の、1)はAmerican Type Culture Collection.(ATCC)を、2)は 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(FERM)を、3)は農業生物資源ジーンバンク (MAFF)を、4)は独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター(NITE )をそれぞれ示す。
前記により前培養を行った各供試菌株について、培養液50ulを滅菌した新鮮な前記各培地5mlに接種し、30℃で14時間静置培養した。該培養液を日立CR20型高速冷却遠心機(ローター形式 RPRS3−3)を用いて遠心分離(3000rpm、20分、4℃)した。遠心上清(培養上清)を吸引して取り除き、沈殿している菌体を0.85%塩化ナトリウム溶液1mlに懸濁後、同様に遠心分離(3000rpm、20分、4℃)した。遠心上清(菌体洗浄液)を吸引して取り除き、沈殿している各供試菌株の菌体を回収した。
N-Tosylglycyl-L-prolyl-L-lysine 4-nitroanilide acetate salt))100ulを加え、30℃で18時間静置した後、トミーMRX−152型微量冷却遠心機(ローター形式 TMS−4)を用いて遠心分離(12000rpm、10分、4℃)し、上清の405nmの吸光度を、ベックマンDU640型分光光度計を用いて測定した。
N-Tosylglycyl-L-prolyl-L-lysine 4-nitroanilide acetate salt))100ulを加え、前記と同様に静置した後、トミーMRX−152型微量冷却遠心機(ローター形式 TMS−4)を用いて遠心分離(12000rpm、10分、4℃)し、上清の405nmの吸光度を測定した。
前記により求めた各供試菌株の菌体懸濁液(OD600=0.25)1ml当たりのプラスミノーゲン活性化能を表3に示す。
(方法)
実施例1においてプラスミノーゲン活性化能が強かったATCC 19435株及びC 59株について、ウシ型プラスミノーゲンに対する活性化能を観察した。菌体懸濁液の調製と活性化能測定は、実施例1に記載の方法と同様とし、ウシプラスミノーゲンに対する活性化能測定は、実施例1の酵素基質液のヒトプラスミノーゲンを、ウシプラスミノーゲン(Sigma社製、plasminogen from bovine plasma)に代えることによって行った。
前記各菌体のdA405値と数2に示す算式から、ウシ型プラスミノーゲン活性化能を算出した。該各菌株の菌体懸濁液(OD600=0.25)1ml当たりのヒト型及びウシ型プラスミノーゲンに対するプラスミノーゲン活性化能を表4に示す。
(方法)
C59株について、実施例1の方法と同様にして得た菌体懸濁液(pH7.4、OD600=0.25)を、次の5条件で処理した。(1)4℃で4時間静置、(2)室温で4時間静置、(3)−30℃凍結後、室温融解を3回繰り返し、(4)沸騰水浴上で10分間加熱、(5)オートクレーブ(121℃、1気圧加圧)で15分間加熱。
前記各処理した菌体懸濁液について、前記実施例1の方法と同様にして、プラスミノーゲン活性化能を測定、算出した。各処理について、菌体懸濁液(OD600=0.25)1ml当たりの残存するプラスミノーゲン活性化能、及び(1)の活性量を100とした相対値を残存活性として表5に示す。
(方法)
C59菌体について、前記実施例1と同様の方法により得た菌体について、緩衝液0.1M Tris-Cl pH7.4に替えて、pH3.0, pH 4.0, pH 5.0, pH 6.0, pH 7.0, pH8.0, pH 9.0の各緩衝液を用いて、600nmの吸光度が5.0(OD600=5.0)になるように、各緩衝液中に懸濁した。前記緩衝液は、pH3.0ないしpH7.0については、McIlvaine緩衝液(リン酸−クエン酸緩衝液)を、pH7.0ないしpH 9.0については、0.1M Tris-Cl緩衝液を、それぞれ用いた。前記菌体懸濁液を、30℃で3時間加温処理後、0.1MTris-Cl pH7.4で20倍に希釈し、その50ulを用いて残存するプラスミノーゲン活性化能を測定した。
各pHで処理後菌体懸濁液(OD600=0.25)1ml当たりの残存するプラスミノーゲン活性化能、及びプラスミノーゲン活性化能が最も高い値を示したpH4.0の値を100とした相対値を括弧書きとして表6に示す。
(方法)
C59菌株について、前記実施例1と同様の方法により前培養をした前培養液50ulを、滅菌した新鮮なGM17培地5mlに接種し、30℃で培養した。接種後3時間から27時間後まで3時間ごとに培養液を採取し、該採取した培養液について、実施例1の方法で菌体懸濁液(OD600=0.25)を作製し、菌体のプラスミノーゲン活性化能を測定した。また、培養上清、及び菌体洗浄液のプラスミノーゲン活性化能についても測定した。培養上清、及び菌体洗浄液は0.1M Tris-Cl pH7.4にて30倍に希釈し、その希釈液50ulに前記酵素基質液100ulを加え、菌体懸濁液と同様の方法でプラスミノーゲン活性化能を測定した。
表7及び図2から、菌の生育は、接種後6時間でプラトーに達した。菌体量あたりのプラスミノーゲン活性化能は、15時間後から増加し、21時間後にプラトーに達した。培養上清及び菌体洗浄液には活性はほとんど認められず、本活性は菌体に結合している成分によると示唆された。
(方法)
前記実施例5のC59菌体について、21時間培養液から実施例1に記載の方法で菌体を調製した。前記菌体について、抽出液としてMcIlvaine緩衝液(リン酸−クエン酸緩衝液)pH3.0, pH 4.0, pH 5.0, pH 6.0、及び0.1MTris-Cl緩衝液pH7.0, pH 8.0、並びに0.1M 重炭酸ナトリウム緩衝液pH9.0, pH 10.0, pH 11.0を、OD600=5.0となるようにそれぞれ加え、菌体懸濁液を調製した。
表8の結果から、pH3−pH8の緩衝液で抽出した際にはプラスミノーゲン活性化能の緩衝液への移行は見られなかったのに対して、pH10以上の緩衝液を用いた際には緩衝液へ活性が移行した。pH10以上の緩衝液を用いることにより、無細胞抽出液のプラスミノーゲン活性化剤を作成することができる。
Claims (6)
- 乳酸菌の菌体を有効成分とするプラスミノーゲン活性化剤。
- 前記乳酸菌が、Lactococcus lactis ssp. lactis、Lactococcus lactis ssp. lactis bv. diacetylactis、及びLactobacillus bulgaricusのいずれか一種以上である請求項1に記載のプラスミノーゲン活性化剤。
- 前記請求項1または請求項2に記載の菌体を、80℃〜150℃の温度で、5分〜40分加熱処理したプラスミノーゲン活性化剤。
- 前記請求項1または請求項2に記載の菌体から、pH7〜pH14の抽出液により抽出されたプラスミノーゲン活性化剤。
- 前記請求項1ないし請求項4のいずれかに記載のプラスミノーゲン活性化剤を用いた食品。
- 前記請求項1ないし請求項4のいずれかに記載のプラスミノーゲン活性化剤を用いた飼料又はペットフード。
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