JP2009216944A - 顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】レンズの高精度な直線駆動機構や高精度な移動制御を行うことを不要とし、簡易に、かつ、安価に構成する。
【解決手段】試料からの検出光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された検出光をピンホール１４ａに集光する集光光学系１３と、該集光光学系１３と対物光学系との間に配置され、集光光学系１３に対して固定され、該集光光学系１３に入射する検出光の光束径を拡大または縮小させる光束径変更光学系２０と、該光束径変更光学系２０を通過する光路と該光束径変更光学系２０を通過しない光路とを切り替える光路切替機構２１とを備え、該光路切替機構２１が、検出光を偶数回反射する複数の反射部材２１ａ〜２１ｄと、該反射部材２１ａ〜２１ｄを一体的に移動させる反射部材移動機構とを備える顕微鏡を提供する。
【選択図】図２

Description

本発明は、顕微鏡に関するものである。

従来、レンズを光軸方向に移動させることにより試料からの検出光の光束径を可変させる光束径変換光学系を備えた顕微鏡が知られている。この顕微鏡によれば、光束径変換光学系により試料からの検出光の光束径を大きくして高分解能の蛍光画像を得ることができ、光束径を小さくすることで分解能が下がる代わりに被写界深度を深くし、明るい画像を得ることができる。

特許第２９１８９９５号明細書

しかしながら、特許文献１の光束径変換光学系は、レンズを光軸方向に移動させるものであるため、レンズの位置決めを精度よく行う必要がある。また、レンズの光軸に交差する方向への偏心も極力小さくする必要があり、レンズを駆動する直線駆動機構を高精度に構成しかつ高精度に制御しなければならないという不都合がある。

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、レンズの高精度な直線駆動機構や高精度な移動制御を行うことを不要とし、簡易に、かつ、安価に構成することができる顕微鏡を提供すること目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、試料からの検出光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された検出光をピンホールに集光する集光光学系と、該集光光学系と前記対物光学系との間に配置され、前記集光光学系に対して固定され、該集光光学系に入射する検出光の光束径を拡大または縮小させる光束径変更光学系と、該光束径変更光学系を通過する光路と該光束径変更光学系を通過しない光路とを切り替える光路切替機構とを備え、該光路切替機構が、検出光を偶数回反射する複数の反射部材と、該反射部材を一体的に移動させる反射部材移動機構とを備える顕微鏡を提供する。

本発明によれば、対物光学系により集光された試料からの検出光を集光光学系により集光してピンホールを通過させることにより、対物光学系の焦点位置からの検出光を選択的にピンホールに通過させ、高い空間分解能で試料の観察を行うことができる。光路切替機構を作動させて、光路径変更光学系を通過する光路に検出光を入射させることにより、検出光の光束径を拡大または縮小する。

集光光学系に入射させる光束径を拡大することにより、ピンホールに入射する際の検出光のスポット径が小さくなるので、焦点位置が光軸方向にずれた試料からの検出光もピンホールを通過可能となり、空間分解能は低下するが、被写界深度を向上し、明るい観察を行うことができる。一方、集光光学系に入射させる光束径を縮小することにより、ピンホールに入射する際の検出光のスポット径を増大させて、対物光学系の焦点位置から発せられた検出光のみをピンホールに通過させることができ、空間分解能を向上することができる。

この場合において、反射部材移動機構の作動により検出光を偶数回反射する複数の反射部材を一体的に移動させることで、光束径変更光学系を通過する光路と通過しない光路とを切り替えるので、切替の前後において、検出光の角度を変化させないようにすることができる。すなわち、反射部材を一体的に移動させる際の精度が低くても、最初の反射部材に入射する検出光の角度と最後の反射部材から出射される検出光の角度とを精度よく一致させることができる。したがって、光路切替機構によって光路を光路径変更光学系を通過する光路と通過しない光路とを切り替えてもいずれの場合も集光光学系によりピンホールに検出光を入射させることができ、高精度な直線駆動機構や高精度な移動制御を行うことを不要とし、簡易に、かつ、安価に構成することができる。

上記発明においては、前記光路切替機構が、前記光束径変更光学系の光軸上に前記反射部材を挿脱させることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記光束径変更光学系が、前記集光光学系の光軸に対して偏心して配置され、前記反射部材移動機構が、前記集光光学系の光軸回りに回転させられることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記光束径変更光学系が、前記集光光学系の光軸回りに複数配置されていてもよい。
また、上記発明においては、前記光束径変更光学系が、互いに焦点距離の絶対値が異なる少なくとも２群のレンズ群で構成されたアフォーカル光学系であってもよい。このようにすることで、入射してくる平行光束を入射してきたときとは別の光束径の平行光束として射出することができる。

本発明によれば、レンズの高精度な直線駆動機構や高精度な移動制御を行うことを不要とし、簡易に、かつ、安価に構成することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡１について、図１〜図３を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１は、レーザ走査型顕微鏡であって、レーザ光を出射するレーザ光源２と、該レーザ光源２からのレーザ光を集光するカップリング光学系３と、該カップリング光学系３により集光されたレーザ光を導光する光ファイバ４と、該光ファイバ４によってレーザ光源２と接続された顕微鏡本体５とを備えている。

顕微鏡本体５は、光ファイバ４から出射されたレーザ光を略平行光に変換するコリメート光学系６と、該コリメート光学系６により略平行光にされたレーザ光を偏向するダイクロイックミラー７と、該ダイクロイックミラー７により偏向されたレーザ光を２次元的に走査する近接ガルバノミラー８と、該近接ガルバノミラー８により走査されたレーザ光を集光する瞳投影光学系９、結像光学系１０および対物光学系１１とを備えている。

また、顕微鏡本体５は、対物光学系１１により集光され、結像光学系１０、瞳投影光学系９および近接ガルバノミラー８を介して戻り、ダイクロイックミラー７を透過した試料Ａからの蛍光または反射光を通過させる光束径調整光学系１２と、該光束径調整光学系１２を通過した蛍光または反射光を集光するカップリング光学系（集光光学系）１３と、該カップリング光学系１３により集光された試料Ａからの蛍光または反射光を導光する光ファイバ１４と、該光ファイバ１４により導光された蛍光または反射光を検出する検出光学系１５とを備えている。顕微鏡本体５は、相互に直交する３軸（ＸＹＺ）方向に移動可能に設けられるとともに、各軸回りに回転可能に設けられており、対物光学系１１の先端の位置および角度を任意に調節することができるようになっている。

近接ガルバノミラー８は、観察位置を対物光学系１１の光軸に対して略垂直方向で走査するようになっている。また、対物光学系１１は、その先端を試料Ａに密着させることにより、試料Ａの呼吸や拍動による観察像のブレを抑えるようになっている。

検出光学系１５は、光ファイバ１４により導光されてきた蛍光または反射光を略平行光にするコリメート光学系１６と、バリアフィルタ１７と、集光レンズ１８と、光検出器１９とを備えている。

光束径調整光学系１２は、カップリング光学系１３とダイクロイックミラー７との間に配置され、図２および図３に示されるように、カップリング光学系１３に対して固定された光束径変更光学系２０と、該光束径変更光学系２０を通過する光路と該光束径変更光学系２０を通過しない光路とを切り替える光路切替機構２１とを備えている。
光束径変更光学系２０は、例えば、ダイクロイックミラー７側から光軸に沿って並んで配置された負パワーレンズ（両凹レンズ）２０ａおよび焦点距離の絶対値が負パワーレンズ２０ａより大きな正パワーレンズ（両凸レンズ）２０ｂからなるアフォーカル光学系からなり、図３に示されるように、ダイクロイックミラー７から入射される平行光束からなる蛍光または反射光の光束径を拡大した平行光束として射出するようになっている。

光路切替機構２１は、相対的に固定された４つの直角プリズム（反射部材）２１ａ〜２１ｄと図示しない反射部材移動機構とを備えている。
４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄは、１つの光軸に沿って入射された光を４回、９０°偏向させることにより、光路をクランク状に迂回させて最初の光軸の延長線に沿って光を射出することができるようになっている。４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄは、反射部材移動機構により光束径変更光学系２０の光軸に対して直交する方向に一体的に移動させられて、その内の２つの直角プリズム２１ａ，２１ｄを光束径変更光学系２０の前後の光路に挿脱させることにより、光束径変更光学系２０を通過する光路と該光束径変更光学系２０を迂回して通過しない光路とに切り替えるようになっている。

さらに具体的には、図２に示されるように、光路切替機構２１が、４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄを一体的に移動させて光束径変更光学系２０の前後の光路に挿入された場合について説明する。この場合には、ダイクロイックミラー７側から入射されてきた蛍光または反射光が第１の直角プリズム２１ａによって光軸に略直交する方向に９０°偏向された後、第２の直角プリズム２１ｂによって光軸に略平行な方向に９０°偏向され、その後、第３の直角プリズム２１ｃによって光軸に略直交する方向に９０°偏向され、最後に、第４の直角プリズム２１ｄによって光軸に沿う方向に９０°偏向されるようになっている。これにより、蛍光または反射光は光束径変更光学系２０を通過せずにその光束径を保ったままカップリング光学系１３に入射させられるようになっている。

一方、図３に示されるように、光路切替機構２１が、４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄを一体的に移動させて光束径変更光学系２０の前後の光路から抜き去った場合には、ダイクロイックミラー７側から入射されてきた蛍光または反射光は、そのまま光束径変更光学系２０を通過させられるようになっている。上述したように光束径変更光学系２０は、入射された光の光束径を増大させる。これにより、光路切替機構２１の作動によって、２種類の光束径の蛍光または反射光の光束をカップリング光学系１３に入射させることができるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡１を用いて試料Ａの観察を行うには、対物光学系１１の先端を試料Ａに密着させた状態で、レーザ光源２からレーザ光を出射させ、光ファイバ４を介して顕微鏡本体５に導かれたレーザ光をダイクロイックミラー７により偏向し、近接ガルバノミラー８によって２次元的に走査し、瞳投影光学系９、結像光学系１０、および対物光学系１１を介して試料Ａに照射する。

レーザ光が照射された試料Ａにおいては、蛍光物質が励起されることにより蛍光（以下、反射光については説明を省略する。）が発生し、発生した蛍光は、対物光学系１１によって集光され、結像光学系１０、瞳投影光学系９および近接ガルバノミラー８を介して戻り、ダイクロイックミラー７を透過する。ダイクロイックミラー７を透過した蛍光は、光束径調整光学系１２に入射され、そこで、光束径が調整される。

被写界深度が深く明るい観察を行いたい場合には、光路切替機構２１を作動させて、図３に示されるように４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄを光束径変更光学系２０の前後の光路から抜き去った状態にする。これにより、ダイクロイックミラー７を透過してきた蛍光は直進して光束径変更光学系２０に入射され、その光束径が拡大された平行光となってカップリング光学系１３に入射される。カップリング光学系１３は入射された蛍光を光ファイバ１４の端面１４ａ（ピンホール）に集光させる。

この場合に、拡大された光束径の蛍光が光ファイバ１４の端面１４ａに入射されることで、入射される蛍光の開口数が増加する。これにより、光ファイバ１４の端面１４ａに集光する蛍光のスポット径は小さくなり、対物光学系１１の焦点位置のみならず、光軸方向にずれた位置から発せられた蛍光も光ファイバ１４の端面１４ａに入射できるようになる。その結果、空間分解能は低下するが、被写界深度が深く、明るい画像を取得することが可能となる。

一方、空間分解能が高い精密な観察を行いたい場合には、光路切替機構２１を作動させて、４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄを一体的に移動させ、図２に示されるように、その内の２つの直角プリズム２１ａ，２１ｄを光束径変更光学系２０の前後の光路に挿入した状態にする。これにより、ダイクロイックミラー７を透過してきた蛍光は、４つの直角プリズムに２１ａ〜２１ｄよって光束径変更光学系２０をクランク状に迂回し、そのダイクロイックミラー７を透過してきたままの光束径の平行光（すなわち、上記と比較して光束径の小さい平行光）としてカップリング光学系１３に入射される。

この場合に、小さい光束径の蛍光がカップリング光学系１３によって集光されて光ファイバ１４の端面１４ａに入射されるので、入射する蛍光の開口数は上記と比較して小さくなる。これにより、光ファイバ１４の端面１４ａに集光する蛍光のスポット径は大きくなり、対物光学系１１の焦点位置から発せられた蛍光のみが光ファイバ１４の端面１４ａに入射できるようになる。その結果、被写界深度は浅く、暗くなるが、空間分解能の高い精密な観察を行うことができる。

そして、本実施形態に係る顕微鏡１においては、このような切り替えを精度よく行うことができる。すなわち、本実施形態においては、従来のようにレンズを光軸に沿って移動させるのではなく、光軸上に固定したままで、４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄを一体的に光路に挿脱するので、移動機構の精度に基づくレンズの芯ズレや傾斜が発生しない。

また、４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄの相対位置を固定したままで一体的に移動させることにより、高い精度で位置決めしなくても、確実に光束径を切り替えることができるという利点がある。すなわち、相対的に固定された偶数個の反射面を持つ直角プリズム２１ａ〜２１ｄの組への入射光の光軸に対する出射光の光軸の角度は、４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄ組全体の位置や傾斜角度によらず常に一定である。したがって、４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄ組の移動精度や位置決め精度が低くても、常に、光ファイバ１４の端面１４ａに蛍光を集光させることができる。

なお、本実施形態においては、光束径変更光学系２０として、ダイクロイックミラー７側から光軸に沿って並んで配置された負パワーレンズ（両凹レンズ）２０ａおよび焦点距離の絶対値が負パワーレンズ２０ａより大きな正パワーレンズ（両凸レンズ）２０ｂからなるアフォーカル光学系を例示したが、これに限定されるものではなく、図４および図５に示されるように負パワーレンズ（両凹レンズ）２０ａおよび焦点距離の絶対値が負パワーレンズ２０ａより大きな正パワーレンズ（両凸レンズ）２０ｂの順序を逆に配置したアフォーカル光学系を採用してもよい。この場合には、上記とは逆に、図４に示されるように４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄ組を光路に挿入して光束径変更光学系２０を迂回させた場合が高被写界深度で明るい観察となり、図５に示されるように光路から抜き去って光束径変更光学系２０に蛍光を入射させた場合が高分解能の観察となる。

また、本実施形態においては、単一の光束径変更光学系を有する場合について説明したが、これに代えて、図６〜図８に示されるように、並列に配置された２つ以上の光束径変更光学系２０，２０′を備え、４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄ，２１ａ′〜２１ｄ′からなる２組の光路切替機構２１，２１′を備えることにしてもよい。
図に示す例では、第１の光束径変更光学系２０および１組の光路切替機構２１は、上述した図４および図５のものと同じである。一方、第２の光束径変更光学系２０′は、第１の光束径変更光学系２０とは逆に、図２および図３と同様にして光束径を拡大させるようになっている。

第１の光路切替機構２１を作動させて、図６に示されるように、第１の直角プリズム２１ａ〜２１ｄ組を第１の光束径変更光学系２０の前後に挿入したときには、第１の光束径変更光学系２０を迂回する光路によりダイクロイックミラー７を透過してきたままの（中程度の）光束径の平行光としてカップリング光学系１３に入射され、中程度の分解能での中程度の明るさの観察を行うことができる。また、図７に示されるように、第１の直角プリズム２１ａ〜２１ｄ組を第１の光束径変更光学系２０の前後から抜き去ったときには、第１の光束径変更光学系２０を通過する光路により、光束径が最も縮小された平行光となってカップリング光学系１３に入射される。これにより、被写界深度が深く明るい観察を行うことができる。

さらに、第２の光路切替機構２１′を作動させて、第２の直角プリズム２１ａ′〜２１ｄ′組を第１の光束径変更光学系２０の前後に挿入したときには、図８に示されるように、ダイクロイックミラー７を透過してきた蛍光が、４つの直角プリズム２１ａ′〜２１ｄ′によって第１の光束径変更光学系２０をクランク状に迂回し、第２の光束径変更光学系２０′に通過させられる。これにより、光束径が最も拡大された平行光となってカップリング光学系１３に入射され、分解能の最も高い高精度の観察を行うことができる。

２組の光束径変更光学系２０，２０′および光路切替機構２１，２１′を有することとしたが、これに代えて、周方向に３以上の光束径変更光学系２０および光路切替機構２１を配置してもよい。これにより、空間分解能と被写界深度をより細かく調節することができる。

また、図９および図１０に示されるように、周方向に間隔をあけて複数（図１０では３組）の光束径変更光学系２０Ａ，２０Ｂ，２０Ｃを配置し、４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄを備える光路切替機構２１が、直角プリズム２１ａ〜２１ｄを中心軸回りに回転させるようになっていてもよい。図９に示す例では、光路切替機構２１はモータ２１ｅにより４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄを一体的に回転させるようになっている。

このようにすることで、直角プリズム２１ａ〜２１ｄ組を各光束径変更光学系２０Ａ，２０Ｂ，２０Ｃの位相に配置したときには、当該光束径変更光学系２０Ａ，２０Ｂ，２０Ｃに蛍光が通過させられて、光束径変更光学系２０Ａ，２０Ｂ，２０Ｃ毎に設定されている光束径に変更されるようになっている。また、光束径変更光学系２０Ａ，２０Ｂ，２０Ｃが配置されていない位相Ｘに光路切替機構２１の直角プリズム２１ａ〜２１ｄが配置されたときには、ダイクロイックミラー７を透過してきたままの光束径の蛍光がカップリング光学系１３に入射されるようになっている。これにより複数種類（図では４種類）の空間分解能と被写界深度を調節することができる。

なお、本実施形態においては、光路切替機構２１，２１′として４つの直角プリズム２１ａ〜２１ｄ，２１ａ′〜２１ｄ′を有するものを例示したが、これに限定されるものではなく、ミラーを用いてもよいし、その数も偶数個であれば、いくつでもよい。
また、光束径変更光学系２０，２０′，２０Ａ，２０Ｂ，２０Ｃとしては負パワーレンズ２０ａ，２０ａ′を両凹レンズ、正パワーレンズ２０ｂ，２０ｂ′を両凸レンズの組合せで示したが、これに限定されるものではない。例えば、負パワーレンズまたは正パワーレンズのうち少なくとも一方を単レンズではなく、複数のレンズからなる群構成として、球面収差、色収差等が良好に補正された光学系とすれば、より高精細な画像を得ることができる。
また、光束径変更光学系を用いたアフォーカル光学系は、上記実施の形態で示したように負パワーレンズと正パワーレンズとを組み合わせたガリレオタイプ以外に、互いにパワーが異なる正パワーレンズを２組以上組み合わせたケプラータイプとしてもよい。

本発明の一実施形態に係る顕微鏡を示す全体構成図である。 図１の顕微鏡に備えられる光束径変更光学系と光路切替機構を示す図である。 図２の光路切替機構により、図２の状態から光路が切り替えられた状態を示す図である。 図２の光束径変更光学系の第１の変形例を示す図２と同様の図である。 図４の状態から光路が切り替えられた状態を示す図である。 図２の光束径変更光学系の第２の変形例であって、複数の光束径変更光学系および光路切替機構を有する場合を示す図である。 図６の状態から光路が切り替えられた状態を示す図である。 図６の状態から他の光路に切り替えられた状態を示す図である。 図２の光路切替機構の変形例を示す図である。 図９の光路切替機構を光軸方向から見た図である。

符号の説明

Ａ 試料
１１ 対物光学系
１３ カップリング光学系（集光光学系）
１４ａ 端面（ピンホール）
２０，２０′，２０Ａ，２０Ｂ，２０Ｃ 光束径変更光学系
２１，２１′ 光路切替機構
２１ａ〜２１ｄ，２１ａ′〜２１ｄ′ 直角プリズム（反射部材）

Claims (5)

1. 試料からの検出光を集光する対物光学系と、
   該対物光学系により集光された検出光をピンホールに集光する集光光学系と、
   該集光光学系と前記対物光学系との間に配置され、前記集光光学系に対して固定され、該集光光学系に入射する検出光の光束径を拡大または縮小させる光束径変更光学系と、
   該光束径変更光学系を通過する光路と該光束径変更光学系を通過しない光路とを切り替える光路切替機構とを備え、
   該光路切替機構が、検出光を偶数回反射する複数の反射部材と、該反射部材を一体的に移動させる反射部材移動機構とを備える顕微鏡。
2. 前記光路切替機構が、前記光束径変更光学系の光軸上に前記反射部材を挿脱させる請求項１に記載の顕微鏡。
3. 前記光束径変更光学系が、前記集光光学系の光軸に対して偏心して配置され、
   前記反射部材移動機構が、前記集光光学系の光軸回りに回転させられる請求項２に記載の顕微鏡。
4. 前記光束径変更光学系が、前記集光光学系の光軸回りに複数配置されている請求項３に記載の顕微鏡。
5. 前記光束径変更光学系が、互いに焦点距離の絶対値が異なる少なくとも２群のレンズ群で構成されたアフォーカル光学系である請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡。

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