JP2009204452A - マッサージ方法の評価方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、人にマッサージを施すことなく、マッサージ方法の有効性を評価することが可能なマッサージ方法の評価方法を提供することを目的とする。
【解決手段】マッサージ方法の評価方法は、皮膚に圧力を印加する工程と、圧力が印加された皮膚の細胞増殖能を評価する工程、及び／又は、圧力が印加された皮膚のＮＯの産生量を測定する工程を有する。
【選択図】なし

Description

本発明は、マッサージ方法の評価方法に関する。

従来、マッサージの評価方法として、マッサージ前後の唾液を採取して、唾液中の免疫グロブリンや副腎皮質ホルモンの濃度を測定する方法が知られている（特許文献１、２参照）。

また、マッサージの施術の効果を評価する際に、施術前後における目の周囲の体液循環の状態の変化を指標とすることが知られている（特許文献３参照）。また、顔面のシワを予防及び／又は改善させるために体幹部に施術されるマッサージ方法を評価する際に、体幹及び／又は顔面の筋緊張度を施術の前後に計測し、筋緊張度の緩和の度合いを指標とすることが知られている（特許文献４参照）。

しかしながら、これらの評価方法は、人にマッサージを施した前後に測定を行う必要があるという問題がある。
特開平８−１５２５７号公報 特開平１１−２３５７９号公報 特開２００４−１２９７０５号公報 特開２００６−３３４１８６号公報

本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑み、人にマッサージを施すことなく、マッサージ方法の有効性を評価することが可能なマッサージ方法の評価方法を提供することを目的とする。

請求項１に記載の発明は、マッサージ方法の評価方法において、皮膚に圧力を印加する工程と、該圧力が印加された皮膚の細胞増殖能を評価する工程、及び／又は、該圧力が印加された皮膚のＮＯの産生量を測定する工程を有することを特徴とする。

請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のマッサージ方法の評価方法において、前記ＮＯは、前記皮膚に含まれるｎＮＯＳにより合成されたものであることを特徴とする。

請求項３に記載の発明は、請求項１又は２に記載のマッサージ方法の評価方法において、前記皮膚に押圧刺激する際に、マッサージ料を用いることを特徴とする。

請求項４に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のマッサージ方法の評価方法において、前記皮膚は、人工皮膚であることを特徴とする。

請求項５に記載の発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のマッサージ方法の評価方法において、前記皮膚は、動物由来の皮膚であることを特徴とする。

請求項６に記載の発明は、請求項５に記載のマッサージ方法の評価方法において、前記皮膚内のリンパ管の拡張を評価することを特徴とする。

本発明によれば、人にマッサージを施すことなく、マッサージ方法の有効性を評価することが可能なマッサージ方法の評価方法を提供することができる。

次に、本発明を実施するための最良の形態を図面と共に説明する。

本発明のマッサージ方法の評価方法は、皮膚に圧力を印加する工程と、圧力が印加された皮膚の細胞増殖能を評価する工程、及び／又は、圧力が印加された皮膚の一酸化窒素（ＮＯ）の産生量を測定する工程を有する。これにより、人にマッサージを施すことなく、マッサージ方法の有効性を評価することができる。

なお、皮膚としては、人工皮膚、動物由来の皮膚を用いることができる。

皮膚に圧力を印加する方法としては、特に限定されないが、一定の圧力を継続的に印加する方法、一定の圧力を断続的に印加する方法、変動する圧力を継続的に印加する方法、変動する圧力を断続的に印加する方法等が挙げられる。また、圧力を印加する際には、圧力の大きさ、圧力を印加する頻度、圧力を印加する部材の形状及び硬さ、環境の温度、湿度等を、必要に応じて、適宜調整することができる。

なお、マッサージ料を評価する際には、圧力を印加する前に、皮膚にマッサージ料を塗布してもよい。これにより、マッサージ料をスクリーニングすることができる。マッサージ料としては、特に限定されないが、化粧水、乳液、クリーム、ジェル等が挙げられ、二種以上併用してもよい。

圧力が印加された皮膚の細胞増殖能を評価する際には、例えば、［^３Ｈ］−チミジン、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）等の標識試薬を添加した培地を用いて、圧力が印加された皮膚を培養した後に標識試薬が取り込まれた細胞数を計測する。これにより、皮膚に圧力を印加する方法、即ち、マッサージ方法が、皮膚の細胞増殖能に及ぼす影響を評価することができる。

圧力が印加された皮膚のＮＯの産生量を測定する際には、例えば、圧力が印加された皮膚に、ジアミノフルオレセイン−２（ＤＡＦ−２）等のＮＯ蛍光指示薬を添加し、ＮＯ蛍光指示薬とＮＯの反応生成物が発光する蛍光を測定する。なお、ＤＡＦ−２のアミノ基がＮＯと反応した生成物を、波長が４９５ｎｍの光で励起すると、波長が５１５ｎｍの蛍光を発光する。これにより、皮膚に圧力を印加する方法、即ち、マッサージ方法が、皮膚のＮＯの産生に及ぼす影響を評価することができる。

ＮＯは、血管拡張物質として知られているが、Ｌ−アルギニンを基質として、ＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）により合成される。ＮＯＳは、構成型ＮＯＳ（ｃＮＯＳ）と誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）に分類され、ｃＮＯＳには、神経型ＮＯＳ（ｎＮＯＳ）、内皮型ＮＯＳ（ｅＮＯＳ）があるが、本発明においては、皮膚中のｎＮＯＳによりＮＯが合成される。このため、本発明によれば、皮膚に圧力を印加する方法、即ち、マッサージ方法が、皮膚中のｎＮＯＳの活性化に及ぼす影響を評価することができる。

さらに、皮膚として、動物由来の皮膚を用いる場合は、皮膚に圧力を印加する方法、即ち、マッサージ方法が、ＮＯの産生による皮膚内の血管又はリンパ管の拡張に及ぼす影響を評価することができる。

なお、皮膚をマッサージすることにより、皮膚内の末梢血管が拡張されると、末梢血流が促進されるため、末梢血管障害を伴う疾患の予防・改善に役立つ。具体的には、糖尿病患者は、末梢血流が悪化し、細胞が壊死することがあるが、この場合に、皮膚をマッサージすることにより、このような疾患の予防・改善ができる。また、褥瘡（床ずれ）は、同じ部位に長期間圧力が印加されることによる末梢血流の悪化に起因する皮膚の壊死であるが、皮膚をマッサージすることにより、このような疾患を予防できる。

［皮膚の細胞増殖能の評価］
１０〜１３週齢のへアレスマウスの腹腔内に２５％Ｃａｒｂｏｍｉｃ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ溶液を４ｍｌ／ｋｇ投与して麻酔した状態で、背部の皮膚を採取し、安楽死させた後、筋層、血管をメスで整形して、１．５ｃｍ×１５ｃｍの皮膚組織片を得た。

皮膚組織片をテフロン（登録商標）メッシュ上に載せた後、培地ＭＣＤＢ１５３（シグマ社製）が２ｍＬ入った培養皿に浮かせて、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２、湿度９５％）で３時間培養した。次に、皮膚組織片の角層の上に、ウレタンゴムシートを敷き、その上から、円柱形状のおもり（直径２ｃｍ、高さ２ｃｍ、５３ｇ）を用いて押圧刺激した。なお、押圧刺激としては、おもりを載せるＰ刺激又は転がすＲ刺激（１分間に２３．５往復）を、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２、湿度９５％）内で１０分間実施した。このとき、比較のため、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２、湿度９５％）内で１０分間押圧刺激しない場合（無刺激）も実施した。

次に、ＢｒｄＵを５０μＭ含有するＭＣＤＢ１５３に培地を置換し、３７℃で２時間培養した後、４℃の４％パラホルムアルデヒド液中に一晩浸漬した。さらに、７０％エタノールに置換した後、パラフィンブロックを作製し、５μｍの厚さに薄切し、パラフィン標本を作製した。

次に、パラフィン標本を脱パラフィンした後、一次抗体に抗ＢｒｄＵ抗体（Ａｂｃａｍ社製）、二次抗体にウサギ抗ラットＩｇＧビオチン化抗体（ＤＡＫＯ社製）を用いて、ＢｒｄＵを染色した。さらに、ＤＡＢ（ＤＡＫＯ社製）を用いて、核を染色した後、封入した。光学顕微鏡を用いて、幅１ｃｍの間に存在するＢｒｄＵが取り込まれた細胞数をカウントし、細胞増殖能を評価した。

図１に、ＢｒｄＵ及び核が染色された皮膚組織片を示す。なお、図１（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、それぞれ無刺激、Ｐ刺激及びＲ刺激の場合を示す。また、図２及び図３に、ＢｒｄＵが取り込まれた表皮・基底細胞及び真皮・繊維芽細胞の数を示す。図１及び図２より、押圧刺激により、ＢｒｄＵが取り込まれた表皮・基底細胞の数が増加していることがわかり、表皮・基底細胞の細胞増殖能、即ち、皮膚のターンオーバーが増大していることがわかる。さらに、Ｐ刺激に比べて、Ｒ刺激の方が表皮・基底細胞の細胞増殖能を増大させる効果が大きいことがわかる。一方、図３より、押圧刺激が、真皮・繊維芽細胞の細胞増殖能に及ぼす影響は見られなかった。

［皮膚のＮＯ産生量の測定１］
１０〜１３週齢のへアレスマウスの腹腔内に２５％Ｃａｒｂｏｍｉｃ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ溶液を４ｍｌ／ｋｇ投与して麻酔した状態で、背部の皮膚を採取し、安楽死させた後、筋層、血管をメスで整形して、１．５ｃｍ×１５ｃｍの皮膚組織片を得た。

皮膚組織片をテフロンメッシュ上に載せた後、培地ＭＣＤＢ１５３（シグマ社製）が２ｍＬ入った培養皿に浮かせて、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２、湿度９５％）で２時間培養した。次に、１０μＭのＤＡＦ−２（第一化学薬品社製）を添加したＢａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＢＳＳ）に培地を交換し、さらに１時間培養した。なお、ＢＳＳは、ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）、ＫＣｌ（５ｍＭ）、ＣａＣｌ_２（１．８ｍＭ）、ＭｇＣｌ_２（１．２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）、ＮａＨ_２ＰＯ_４（１．２ｍＭ）及びＤ−グルコース（１０ｍＭ）からなり、ｐＨは７．４である。

このとき、得られた培養液４００μＬを回収して遠心分離した後、上清を回収し、刺激前の試料とした。

さらに、培養した皮膚組織片の角層の上に、ウレタンゴムシートを敷き、その上から、円柱形状のおもり（直径２ｃｍ、高さ２ｃｍ、５３ｇ）を用いて、押圧刺激した。なお、押圧刺激としては、おもりを載せるＰ刺激又は転がすＲ刺激（１分間に２３．５往復）を、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２、湿度９５％）内で１０分間実施した。このとき、比較のため、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２、湿度９５％）内で１０分間押圧刺激しない場合（無刺激）も実施した。得られた培養液４００μＬを回収して遠心分離した後、上清を回収し、刺激後の試料とした。

得られた刺激前後の試料を室温（２３℃）で１時間インキュベートした後、蛍光測定専用９６穴プレートに移し、マイクロプレートリーダーを用いて蛍光測定した。

次に、刺激前後の試料の蛍光強度を元に、式
（刺激後の試料の蛍光強度−刺激前の試料の蛍光強度）／刺激前の試料の蛍光強度
で表されるＮＯ産生量の増加率を算出した。

図４に、へアレスマウスのＮＯ産生量の増加率を示す。図４より、押圧刺激により、へアレスマウスのＮＯ産生量の増加率が増大していることがわかる。さらに、Ｐ刺激に比べて、Ｒ刺激の方がＮＯ産生量の増加率を増大させる効果が大きいことがわかる。

［皮膚のＮＯ産生量の測定２］
へアレスマウスの代わりに、１０〜１３週齢のｗｉｌｄ ｔｙｐｅのマウス、ｎＮＯＳ ＫＯマウス、ｅＮＯＳ ＫＯマウス及びｉＮＯＳ ＫＯマウスを用いた以外は、皮膚のＮＯの産生量の測定１と同様にして、ＮＯ産生量の増加率を算出した。なお、これらのマウスは、背部の皮膚を剃毛して２４時間以上経過したものである。

図５に、各種のマウスのＮＯ産生量の増加率を示す。なお、図５（ａ）及び（ｂ）は、それぞれＰ刺激及びＲ刺激の場合を示す。図５より、Ｐ刺激及びＲ刺激のいずれにおいても、ｎＮＯＳ ＫＯマウスのＮＯ産生量の増加率が低下していることから、ＮＯは、ｎＮＯＳ由来であることがわかる。

［皮膚のＮＯ産生量の測定３］
皮膚組織片の代わりに、１．５ｃｍ×１５ｃｍに切り出した三次元培養皮膚モデルのテストスキン（東洋紡社製）を用いた以外は、皮膚のＮＯの産生量の測定１と同様にして、ＮＯ産生量の増加率を算出した。

図６に、テストスキンのＮＯ産生量の増加率を示す。図６より、押圧刺激により、テストスキンのＮＯ産生量の増加率が増大していることがわかる。さらに、Ｐ刺激に比べて、Ｒ刺激の方がＮＯ産生量の増加率を増大させる効果が大きいことがわかる。以上のように、血管や神経が存在しないテストスキンにおいても、へアレスマウスと同様の傾向が見られる。

［皮膚のＮＯ産生量の測定４］
Ｐ刺激及びＲ刺激時のおもりの重さを５３ｇから１７ｇに変更した以外は、皮膚のＮＯの産生量の測定１と同様にして、ＮＯ産生量の増加率を算出した。

図７に、へアレスマウスのＮＯ産生量の増加率を示す。なお、図７（ａ）及び（ｂ）は、それぞれＰ刺激及びＲ刺激の場合を示し、図７には、無刺激の場合と、おもりの重さが１７ｇ及び５３ｇである場合を示す。図７より、Ｐ刺激及びＲ刺激のいずれにおいても、おもりの重さが１７ｇである場合に比べて、５３ｇである場合の方がＮＯ産生量の増加率が増大していることがわかる。

［皮膚のＮＯ産生量の測定５］
Ｐ刺激及びＲ刺激時の温度を３７℃から室温（２３℃）又は３３℃に変更した以外は、皮膚のＮＯの産生量の測定１と同様にして、ＮＯ産生量の増加率を算出した。

図８に、へアレスマウスのＮＯ産生量の増加率を示す。なお、図８（ａ）及び（ｂ）は、それぞれＰ刺激及びＲ刺激の場合を示し、図８には、温度が２３℃、３３℃及び３７℃である場合を示す。図８より、Ｐ刺激及びＲ刺激のいずれにおいても、室温である場合に比べて、３３℃又は３７℃である場合の方がＮＯ産生量の増加率が増大していることがわかる。

［皮膚のＮＯ産生量の測定６］
Ｒ刺激時のおもりを転がす速度を１分間に２３．５往復から８．５往復又は３８．５往復に変更した以外は、皮膚のＮＯの産生量の測定１と同様にして、ＮＯ産生量の増加率を算出した。

図９に、へアレスマウスのＮＯ産生量の増加率を示す。なお、図９には、おもりを転がす速度が１分間に８．５往復、２３．５往復及び３８．５往復である場合を示す。図９より、おもりを転がす速度が８．５往復又は２３．５往復である場合に比べて、３８．５往復である場合の方がＮＯ産生量の増加率が増大していることがわかる。

［皮膚のＮＯ産生量の測定７］
Ｒ刺激時に圧点を有するおもりを用いた以外は、皮膚のＮＯの産生量の測定１と同様にして、ＮＯ産生量の増加率を算出した。なお、圧点数が４．５、１２．５、３０又は８１ｃｍ^−２であるおもりを用いた。

図１０に、へアレスマウスのＮＯ産生量の増加率を示す。なお、図１０には、無刺激と、Ｐ刺激と、圧点数が０、４．５、１２．５、３０及び８１ｃｍ^−２であるおもりを用いたＲ刺激を示す。図１０より、圧点数が多い程、ＮＯ産生量の増加率が増大していることがわかる。

［リンパ管の拡張の評価］
１０〜１３週齢のｗｉｌｄ ｔｙｐｅのマウス又はｎＮＯＳ ＫＯマウスの腹腔内に２５％Ｃａｒｂｏｍｉｃ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ溶液を４ｍｌ／ｋｇ投与して麻酔した状態で、背部の皮膚を採取し、安楽死させた後、筋層、血管をメスで整形して、１．５ｃｍ×１５ｃｍの皮膚組織片を得た。なお、これらのマウスは、背部の皮膚を剃毛して２４時間以上経過したものである。

皮膚組織片をテフロンメッシュ上に載せた後、培地ＭＣＤＢ１５３（シグマ社製）が２ｍＬ入った培養皿に浮かせて、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２、湿度９５％）で３時間培養した。次に、培養した皮膚組織片の角層の上に、ウレタンゴムシートを敷き、その上から、円柱形状のおもり（直径２ｃｍ、高さ２ｃｍ、５３ｇ）を用いて、押圧刺激した。なお、押圧刺激としては、おもりを転がすＲ刺激（１分間に２３．５往復）を、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２、湿度９５％）内で１０分間実施した。

次に、押圧刺激された皮膚組織片を、４℃のアセトン中に２４時間浸漬した。さらに、７０％エタノールに置換した後、パラフィンブロックを作製し、５μｍの厚さに薄切し、パラフィン標本を作製した。

次に、パラフィン標本を脱パラフィンした後、一次抗体に抗ＬＹＶＥ−１抗体（ｕｐｓｔａｔｅ社製）、二次抗体にＨＲＰ Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ（ＤＡＫＯ社製）を用いて、リンパ管を染色した。リンパ管を染色したパラフィン標本の画像を取り込み、画像解析ソフトＷｉｎＲｏｏｆ（三谷商事社製）を用いて、リンパ管の断面積を計測し、式
リンパ管の断面積／皮膚の断面積×１００
で表されるリンパ管の面積率を算出した。なお、皮膚の断面積は、表皮から深さが３００μｍまでの間で計測した。

図１１に、リンパ管が染色されたＲ刺激後の皮膚組織片を示す。なお、図１１（ａ）及び（ｂ）は、それぞれｗｉｌｄ ｔｙｐｅのマウス及びｎＮＯＳ ＫＯマウスの皮膚組織片を示す。また、図１２に、皮膚組織片のリンパ管の面積率を示す。なお、図１２（ａ）及び（ｂ）は、それぞれＲ刺激後及びＲ刺激前の皮膚組織片のリンパ管の面積率である。

図１１及び図１２より、Ｒ刺激によりリンパ管が拡張されるが、ｎＮＯＳ ＫＯマウスは、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅのマウスに比べて、リンパ管の拡張が抑制されていることがわかる。このことから、Ｒ刺激によるリンパ管の拡張は、ｎＮＯＳ由来のＮＯに起因しているものと考えられる。

［皮膚の血流速度の測定］
１０〜１３週齢のｗｉｌｄ ｔｙｐｅのマウス又はｎＮＯＳ ＫＯマウスの腹腔内に２５％Ｃａｒｂｏｍｉｃ ａｃｉｄ ｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ溶液を４ｍｌ／ｋｇ投与して麻酔した後、血流速度と皮膚温を安定させるために、ヒートパッド上で３０分間左測臥位の状態で安静にさせた。なお、これらのマウスは、背部の皮膚を剃毛して２４時間以上経過したものである。この状態で、レーザードップラーフローメトリー（ニューロサイエンス社製）を用いて、背部の血流速度を測定した。

次に、左測臥位の状態で、円柱形状のおもり（直径２ｃｍ、高さ２ｃｍ、５３ｇ）を用いて、左側の背部の中央部分（２．５ｃｍ）を押圧刺激した。なお、押圧刺激としては、おもりを転がすＲ刺激（１分間に２０往復）を３０分間実施した。この直後に、背部の血流速度を測定した。

さらに、式
（刺激後の血流速度−刺激前の血流速度）／刺激前の血流速度×１００
で表される血流量増加率［％］を算出した。図１３に、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅのマウス及びｎＮＯＳ ＫＯマウスのＲ刺激による血流量の増加率を示す。図１３より、Ｒ刺激により血流量が増加するが、ｎＮＯＳ ＫＯマウスは、ｗｉｌｄ ｔｙｐｅのマウスに比べて、血流量の増加が抑制されていることがわかる。このことから、Ｒ刺激による血流量の増加は、ｎＮＯＳ由来のＮＯによる血管の拡張に起因しているものと考えられる。

ＢｒｄＵ及び核が染色された皮膚組織片を示す光学顕微鏡写真である。 ＢｒｄＵが取り込まれた表皮・基底細胞の数を示す図である。 ＢｒｄＵが取り込まれた真皮・繊維芽細胞の数を示す図である。 へアレスマウスのＮＯ産生量の増加率を示す図である。 各種のマウスのＮＯ産生量の増加率を示す図である。 テストスキンのＮＯ産生量の増加率を示す図である。 へアレスマウスのＮＯ産生量の増加率に対するおもりの重さの影響を示す図である。 へアレスマウスのＮＯ産生量の増加率に対する温度の影響を示す図である。 Ｒ刺激時のへアレスマウスのＮＯ産生量の増加率に対するおもりを転がす速度の影響を示す図である。 Ｒ刺激時のへアレスマウスのＮＯ産生量の増加率に対するおもりの圧点数の影響を示す図である。 リンパ管が染色されたＲ刺激後の皮膚組織片を示す光学顕微鏡写真である。 皮膚組織片のリンパ管の面積率を示す図である。 Ｒ刺激による血流量の増加率を示す図である。

Claims (6)

1. 皮膚に圧力を印加する工程と、
   該圧力が印加された皮膚の細胞増殖能を評価する工程、及び／又は、該圧力が印加された皮膚のＮＯの産生量を測定する工程を有することを特徴とするマッサージ方法の評価方法。
2. 前記ＮＯは、前記皮膚に含まれるｎＮＯＳにより合成されたものであることを特徴とする請求項１に記載のマッサージ方法の評価方法。
3. 前記皮膚に圧力を印加する際に、マッサージ料を用いることを特徴とする請求項１又は２に記載のマッサージ方法の評価方法。
4. 前記皮膚は、人工皮膚であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のマッサージ方法の評価方法。
5. 前記皮膚は、動物由来の皮膚であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のマッサージ方法の評価方法。
6. 前記皮膚内の血管又はリンパ管の拡張を評価することを特徴とする請求項５に記載のマッサージ方法の評価方法。