JP2009109351A

JP2009109351A - 窒素酸化物含有化合物の検出方法およびそれに用いる検出装置

Info

Publication number: JP2009109351A
Application number: JP2007282237A
Authority: JP
Inventors: Jin Kodamaya; 仁児玉谷; Masaru Komatsu; 優小松; Yujiro Watanabe; 雄二郎渡辺; Kaoru Fujinaga; 薫藤永; Shigetoshi Seito; 惠逸齋籐; Shigeo Yamazaki; 重雄山崎
Original assignee: Kanazawa Institute of Technology (KIT)
Current assignee: Kanazawa Institute of Technology (KIT)
Priority date: 2007-10-30
Filing date: 2007-10-30
Publication date: 2009-05-21
Anticipated expiration: 2027-10-30
Also published as: JP4984292B2

Abstract

【解決すべき課題】
本発明はニトロソアミン類等の窒素酸化物含有化合物の高感度検出方法およびそのための検出装置を提供する。
【解決手段】
本発明の窒素酸化物含有化合物の検出方法は、ｐＨ１０．５〜１１．５の水性溶媒中に存在する窒素酸化物含有化合物に紫外線を照射し、紫外線照射した前記窒素酸化物含有化合物と発光性化合物を酸化剤の非存在下で反応させ、生成した発光を検出する。
【選択図】図２

Description

本発明は、窒素酸化物含有化合物の高感度検出方法およびそれに用いる検出装置に関する。

近年、多種多様な化学物質が製造、使用され、環境中に放出されている。これらの物質の中には、ヒトの健康や生態系に有害な影響を及ぼすものも数多く存在する。例えば、ニトロソ化合物、亜硝酸塩等の窒素酸化物含有化合物は環境中、食品中等に広く存在し、発がん性や変異原性を有することが確認されている。

窒素酸化物含有化合物のうち、Ｎ−ニトロソアミン（以下、単に「ニトロソアミン」とも記す）等のニトロソアミン類はアミン類と亜硝酸系化合物との反応、アミン類とクロラミンとの反応等の種々の反応により生成することが知られている。そして、ヒトはニトロソアミン類を食物（野菜等）、食品添加物、上水道の水等から摂取しており、ヒトの健康や生態系への悪影響を未然に防止する観点からニトロソアミン類に対する対策が求められている。

米国では、国際がん研究機関（ＩＡＲＣ）および全米毒性学計画（ＮＮＰ）が職業安全衛生局の危険有害性周知基準に従い、特定のニトロソアミン類を発がん性物質として認定し、規制対象としている。また、ドイツでは大気中ニトロソアミンへの職業性被爆の指針として、２．５μｇ／ｍ^３および１．０μｇ／ｍ^３（８時間加重平均値）の濃度基準を設定しており、カナダでは、特定のニトロソアミン類を高度な危険有害物質として指定している（非特許文献１）。さらに、米国のカリフォルニアでは、飲料水中の微量のＮ−ニトロソジメチルアミン（ＮＤＭＡ）による発がん性のリスクを回避するため、飲料水中のＮＤＭＡの目標濃度を３×１０^−６ｍｇ／Ｌ（０．００３ｐｐｂ）に設定している（非特許文献２）。

このような微量のニトロソアミン類を検出するためには、高感度検出方法が必要となる。日本では、環境庁水質保全局水質管理課によりニトロソアミン類の分析法が示されている（非特許文献３）。しかし、この方法は目標定量下限値が０．０３〜０．０６μｇ／Ｌ、目標検出下限値が０．０１〜０．０２μｇ／Ｌであり、ニトロソアミン類を上記の目標濃度レベルで検出するには感度が不十分であるだけでなく、複雑で煩雑な抽出、濃縮等の操作を必要とする。

本発明者らは、有機ニトロ化合物に紫外線を照射し、さらにイソルミノールおよび過酸化水素を反応させて発光させ、有機ニトロ化合物を検出する方法を報告している。しかし、この方法は発光反応に酸化剤を必要とするなど窒素酸化物含有化合物の検出方法として満足できるものではない。そのため、窒素酸化物含有化合物の高感度でより簡易な検出方法が求められている。
化学物質毒性ハンドブック第１巻、丸善株式会社、平成１１年１２月２０日発行、Ｉ−２８５〜Ｉ−３０７頁ＰＵＢＬＩＣＨＥＡＬＴＨＧＯＡＬＳＦＯＲＣＨＥＭＩＣＡＬＳＩＮＤＲＩＮＫＩＮＧＷＡＴＥＲ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２００６ＡｒｎｏｌｄＳｃｈｗａｒｚｅｎｅｇｇｅｒｅｔａｌ．要調査項目等調査マニュアル、平成１２年１２月、環境庁水質保全局水質管理課日本分析化学会第４９年会講演要旨集、2Ａ03

したがって、本発明の目的は、ニトロソアミン類等の窒素酸化物含有化合物の高感度検出方法およびそれに用いる検出装置を提供することにある。

上記目的に鑑み鋭意研究する中で、本発明者らは、所定のｐＨの水性溶媒中に存在する窒素酸化物含有化合物に紫外線を照射することにより、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物を直接発光反応させることができ、窒素酸化物含有化合物を高感度で、かつ簡易に検出できることを見出し、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ｐＨ１０．５〜１１．５の水性溶媒中に存在する窒素酸化物含有化合物に紫外線を照射し、紫外線照射した前記窒素酸化物含有化合物と発光性化合物を酸化剤の非存在下で反応させ、生成した発光を検出する、窒素酸化物含有化合物の検出方法に関する。

また、本発明は、窒素酸化物含有化合物が、ニトロソ化合物、ニトロ化合物、亜硝酸、亜硝酸エステル、亜硝酸塩、硝酸、硝酸エステルまたは硝酸塩である、前記検出方法に関する。
さらに、本発明はニトロソ化合物がニトロソアミン類である、前記検出方法に関する。

また、紫外線の波長が１７０〜４００ｎｍである、前記検出方法に関する。
さらに、本発明は、紫外線照射により生成したペルオキシナイトライトと発光性化合物とを反応させることを含む、前記検出方法に関する。

また、本発明は、発光性化合物がルミノール類、ルシゲニン類、アクリジニウム化合物、ルシフェリン類、シュウ酸エステル類またはルテニウム錯体類である、前記検出方法に関する。

さらに、本発明は、発光性化合物がルミノールである、前記検出方法に関する。
また、本発明は、ルミノールが炭酸緩衝液中で調製されたルミノールである、前記検出方法に関する。

さらに、本発明は、窒素酸化物含有化合物に紫外線を照射する前に、試料中の窒素酸化物含有化合物を分離する段階を含む、前記検出方法に関する。

また、本発明は、試料中の窒素酸化物含有化合物を分離する試料分離部と、窒素酸化物含有化合物に紫外線を照射する紫外線照射部と、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物を反応させ、反応により生成した発光を検出する発光検出部と、前記試料分離部と紫外線照射部の間にｐＨ調整溶媒を導入するｐＨ調整溶媒導入部とを有する、窒素酸化物含有化合物の検出装置に関する。
さらに、本発明は、紫外線照射部と発光検出部との間または発光検出部に発光性化合物導入部を有する、前記装置に関する。

本発明の検出方法によれば、抽出、濃縮等の煩雑な操作を必要とせず、微量の試料をそのまま測定することができ、また、検出反応に過酸化水素等の酸化剤を必要とせず、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物を直接発光反応させて、窒素酸化物含有化合物を検出できるため、簡易かつ高感度で検出することができる。特に、本発明は環境中のニトロソアミン類の検出に適しており、ニトロソアミン類の定量測定も可能である。

本発明の窒素酸化物含有化合物の検出装置は、試料中の窒素酸化物含有化合物を分離する試料分離部と、窒素酸化物含有化合物に紫外線を照射する紫外線照射部と、発光性化合物との発光反応を検出する発光検出部とを有し、試料を試料分離部において穏和な条件で分離するとともに、ｐＨ調整溶媒を試料分離部と紫外線照射部の間に設けられたｐＨ調整溶媒導入部から挿入するため、紫外線照射時のｐＨを反応に適したｐＨに的確に調整することができる。

［Ｉ］窒素酸化物含有化合物の検出方法
（１）窒素酸化物含有化合物
本明細書において窒素酸化物含有化合物とは、窒素酸化物（ＮＯ、ＮＯ_２またはＮＯ_３）を分子中に含有する化合物を意味する。窒素酸化物含有化合物は紫外線照射により活性酸素種を生成する。窒素酸化物含有化合物としてはニトロソ化合物（ニトロソアミン類、ニトロソアミド類等）、ニトロ化合物［少なくとも１つのニトロ基を有する脂肪族ニトロ化合物（ニトロメタン、ニトロエタン、１−ニトロプロパン、１−ニトロブタン、２−メチル−２−ニトロプロパン、１−ニトロペンタン、１−ニトロヘキサン等の飽和脂肪族ニトロ化合物、５−ニトロ−１−ペンテン、６−ニトロ−１−ヘキセン等の不飽和脂肪族ニトロ化合物等）、少なくとも１つのニトロ基を有する芳香族ニトロ化合物（ニトロベンゼン、ジニトロベンゼン、２−ニトロトルエン、３−ニトロトルエン、４−ニトロトルエン、２−クロロニトロベンゼン、３−クロロニトロベンゼン、４−クロロニトロベンゼン、２−フルオロニトロベンゼン、３−フルオロニトロベンゼン、４−フルオロニトロベンゼン、２，４−ジニトロフェノール、２，５−ジニトロフェニル、２，６−ジニトロフェニル、４，６−ジニトロ−２−メチルフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、２−アミノ−５−ニトロフェノール、２−アミノ−４−ニトロフェノール、ｐ−ニトロフェノール、２，４−ジニトロアニリン等）等］、亜硝酸、亜硝酸エステル（亜硝酸エチル、亜硝酸イソプロピル、亜硝酸イソブチル、亜硝酸イソアミル等）、亜硝酸塩［亜硝酸のアルカリ金属塩（Ｌｉ塩、Ｎａ塩、Ｋ塩等）、アルカリ土類金属塩（Ｍｇ塩、Ｃａ塩等）、アンモニウム塩等］、硝酸、硝酸エステル（ニトロセルロース、ニトログリセリン、ニトログリコール等）、硝酸塩［硝酸のアルカリ金属塩（Ｌｉ塩、Ｎａ塩、Ｋ塩等）、アルカリ土類金属塩（Ｍｇ塩、Ｃａ塩等）、アンモニウム塩等］等が挙げられる。

ニトロソアミン類は、ニトロソ基（−N＝O）と窒素原子との結合を有するアミン化合物であり、Ｎ−ニトロソアミン、その誘導体等が挙げられる。本発明の方法により検出するニトロソアミン類は特に限定されないが、例えば、Ｎ−ニトロソアミン、Ｎ−ニトロソジブチルアミン、Ｎ−ニトロソジエタノールアミン、Ｎ−ニトロソジエチルアミン、Ｎ−ニトロソジメチルアミン、Ｎ−ニトロソジフェニルアミン、Ｎ−ニトロソジプロピルアミン、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−エチルウレア、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレア、Ｎ−ニトロソメチルビニルアミン、Ｎ−ニトロソモルホリン、Ｎ−ニトロソノルニコチン、Ｎ−ニトロソピペリジン、Ｎ−ニトロソピロリジン、Ｎ−ニトロソサルコシン、Ｎ−ニトロソメチル−Ｎ’−ニトログアニジン、Ｎ−ニトロソメチルウレタン、Ｎ−ニトロソアナバシン、Ｎ−ニトロソテトラヒドロビピリジン、Ｎ−ニトロソジ−ｎ−ブチルアミン、Ｎ−ニトロソジ−ｎ−プロピルアミン、Ｎ−ニトロソシクロヘキシルアミン、Ｎ−ニトロソイソプロパノールアミン、ｐ−ニトロソジメチルアニリン、ｐ−ニトロソジフェニルアミン、４−（Ｎ−ニトロソメチルアミン）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン、Ｎ−ニトロソメチルエチルアミン、Ｎ−ニトロソノルニコチン、Ｎ−ニトロソプロリン等の米国やカナダで危険有害物質として認定されているニトロソアミン類である。検出試料として用いる窒素酸化物含有化合物は、１種であっても２種以上の混合物であってもよく、また、他の化合物との混合物であってもよい。

（２）試料の分離
本発明の検出方法は、予め試料中の窒素酸化物含有化合物を分離する段階を含んでいてもよい。例えば、水道水中のニトロソアミン類を検出する場合、ニトロソアミン類は通常２種以上の混合物として含まれており、その種類によって毒性の程度が異なるため、各ニトロソアミン類の含有量を同定する必要がある。したがって、検出操作前に、予めそれらのニトロソアミン類を分離しておくのが望ましい。分離方法は特に限定されず、キャピラリー電気泳動、カラムクロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等）、アフィニティークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー等の方法を目的に応じて、１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。

（３）紫外線照射
ｐＨ１０．５〜１１．５の水性溶媒中に存在する窒素酸化物含有化合物に紫外線を照射することにより、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物とを酸化剤の非存在下で直接反応させて発光させることができる。以下に本発明の検出方法において考えられる発光反応機構の一例として、N−ニトロソ化合物の発光反応機構を示すが、本発明はこの反応機構に限定されるものではない。

N−ニトロソ化合物に紫外線を照射することにより、Ｎ−ＮＯ結合が切断され、一酸化窒素（ＮＯ）が発生する。同時に共存する水または溶存酸素への紫外線照射から活性酸素種（Ｏ_２ ⁻・）が発生し、発生したＮＯとＯ_２ ⁻・の反応により、ペルオキシナイトライト（ＯＮＯＯ⁻）が生成する。このペルオキシナイトライトを発光性化合物（ルミノール）と混合すると発光反応が起きる。本発明の方法はかかる反応により生じた光を検出することによりN−ニトロソ化合物を検出する。なお、本発明者らは実際に反応によりペルオキシナイトライトが発生することを確認しているが、発光に関与する化学種はペルオキシナイトライトに限定されるものではない。

照射する紫外線の波長は、好ましくは１７０〜４００ｎｍ、より好ましくは１８０〜３００ｎｍ、特に好ましくは１８０〜１９０ｎｍまたは２５０〜２６０ｎｍである。紫外線の波長を上記範囲にすることにより、ペルオキシナイトライトの生成を促進し、検出感度を向上させることができる。また、紫外線の照射時間は好ましくは約１０〜６０秒であるが、照射時間は照射する物質により異なる。例えば、ニトロソアミン類では約１５〜３０秒、硝酸イオンまたは亜硝酸イオンでは約２０〜４０秒が好ましい。照射時間が短いと検出感度を低下させ、また、照射時間が長くても検出感度を低下させる。

紫外線を照射する段階は、試料を好ましくは溶媒中、より好ましくは水性溶媒（水または水と有機溶媒の混合溶媒）中に存在させて照射する。試料を予めカラム等で分離する場合は、試料をその溶離液中に存在させてもよいが、分離装置で分離した後、紫外線を照射する前に、ｐＨ調整溶媒等によりｐＨを１０．５〜１１．５に調整する。

（４）発光性化合物
本発明に用いる発光性化合物は、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と反応して発光するものであればよく、一般に発光反応に用いられている発光性化合物を用いることができる。発光性化合物の好ましい具体例としては、ルミノール類［ルミノール、イソルミノール、Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−（４−アミノブチル）−Ｎ−エチルイソルミノールヘミサクシミド、Ｎ−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール等］、ルシゲニン類［ルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート）またはその誘導体］、アクリジニウム化合物（アクリジニウム、アクリジニウムエステル、ベンズアクリジニウム等）、ルシフェリン類［ＣＬＡ（２−メチル−６−フェニル−３，７−ジヒドロイミダゾ−［１，２−ａ］ピラジン−３−オン）、ＭＣＬＡ（２−メチル−６−（ｐ−メトキシフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン塩酸塩）、ＦＣＬＡ（３，７−ジヒドロ−６−［４−［２−［Ｎ’−（５−フルオレセイニル）チオウレイド］エトキシ］フェニル］−２−メチルイミダゾ［１，２−ａ］ピラジン−３−オン）等］、シュウ酸エステル［ビス（２，４，６−トリクロロフェニル）オキサラート、ビス(２，４−ジニトロフェニル)
オキサラート、ビス(ペンタフルオロフェニル) オキサラート、シュウ酸ビス[３，４，６−トリクロロ−２−（ペンチルオキシカルボニル）フェニル]等］、ルテニウム錯体［トリス（２，２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩＩ）錯体等］等が挙げられる。中でもペルオキシナイトライトを高感度に検出する観点からルミノール類、特にルミノールが好ましい。

本発明の検出方法によれば、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物が酸化剤の非存在下で直接反応して発光するが、検出感度の増大、発光持続性効果等を目的として増感剤の存在下で反応させてもよい。増感剤としては、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロムフェノール、フェノールインドール、４−［４′−（２′−メチル）チアゾリル］フェノール、４−(４′−チアゾリル)フェノール、４−［４′−(２′−(３′−ピリジル))チアゾール］フェノール、４−(２′−チエニル)フェノール、４−［２′−(４′−メチル)チアゾリル］フェノール、フェノチアジン−Ｎ−プロピルスルフォネート、フェノールインドフェノール等のフェノール誘導体、６−ハイドロキシベンゾチアゾール、４−（４−ハイドロキシフェニル）チアゾール等のチアゾール誘導体、３−（１０−フェノチアジル）−プロピルスルホン酸塩、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸、ジエチルアニリン等が挙げられる。

発光性化合物は、好ましくは溶媒中、より好ましくは水性溶媒中において調製する。特に、発光性化合物を緩衝液中において調製することにより発光反応時のｐＨを望ましい範囲に調整することができる。例えば、発光性化合物としてルミノールを用いる場合、発光反応時の溶液のｐＨは、発光量の観点から９．５〜１１が好ましく、１０〜１０．５がより好ましい。発光量は緩衝液の種類によっても影響を受ける。発光性化合物としてルミノールを用いる場合、炭酸緩衝液中においてルミノールの発光量が最も大きくなる。したがって、ルミノール調製溶媒としては炭酸緩衝液を用いるのが好ましい。炭酸緩衝液の濃度は、好ましくは０．０５〜１Ｍ、より好ましくは０．１〜０．５Ｍである。

発光反応溶液中の発光性化合物の濃度は、特に限定されないが通常０．１〜１０ｍＭであり、好ましくは０．１〜１ｍＭ、より好ましくは０．１〜０．５ｍＭである。発光性化合物の濃度が低いと検出感度が低下し、また、発光性化合物の濃度が高すぎても過剰部分は反応に関与せず、コストの上昇を招く。

（５）発光量の検出
紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物との反応によって生じた発光は、発光検出器により発光量を検出する。発光量を検出することにより、試料中に存在する窒素酸化物含有化合物を検出することができる。本発明の検出方法は、窒素酸化物含有化合物を単に定性的に検出するだけでなく、定量的に測定することも可能である。発光反応による発光量は窒素酸化物含有化合物の種類によって異なるため、特定の窒素酸化物含有化合物を定量するには、例えば、対象とする窒素酸化物含有化合物の検量線と、試料中の窒素酸化物含有化合物の発光量とから試料中の濃度を測定する。具体的には、まず、濃度既知の窒素酸化物含有化合物の標準品を用い、窒素酸化物含有化合物の濃度と発光量との関係を検量線によって求め、次に、濃度未知の試料の発光量を測定し、試料中の窒素酸化物含有化合物の濃度を予め作成した検量線から読み取ることにより測定する。

試料の窒素酸化物含有化合物が混合物の場合は、上述のように予め分離手段により試料中の窒素酸化物含有化合物を分離し、分離した各窒素酸化物含有化合物と発光性化合物を反応させ、各窒素酸化物含有化合物により生成した発光量を測定する。そして、対応する窒素酸化物含有化合物の検量線から試料中のそれぞれの窒素酸化物含有化合物の濃度を読み取る。

（６）検出感度
本発明の検出方法は、抽出、濃縮等の複雑で煩雑な操作を必要とせず、試料（水道水等）をそのまま分析に供することができ、しかも高感度で測定することができる。従来の検出方法は、試料中のニトロソアミン類をジクロロメタンで抽出、濃縮した後、ガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）を用いて試料中のニトロソアミン類の濃度を測定する（非特許文献：要調査項目等調査マニュアル、平成１２年１２月、環境庁水質保全局水質管理課）。この方法による検出下限値は、Ｎ−ニトロソジメチルアミンにおいて０．０２μｇ／Ｌである。これに対し、本発明の検出方法では、Ｎ−ニトロソジメチルアミンにおいて９．８ｎｇ／Ｌ（０．００９８μｇ／Ｌ）であり、従来法に比べ、高感度で検出することができる。

（７）実施態様
本発明の検出方法の好ましい実施態様について説明する。試料として窒素酸化物含有化合物の混合物を用いる場合、まず、試料を高速液体クロマトグラフ装置等の分離手段を用いてそれぞれの窒素酸化物含有化合物に分離する。分離手段として高速液体クロマトグラフを用いる場合、溶離液は水と有機溶媒の混合溶媒であるのが好ましく、例えば、メタノール等のアルコール類と水の混合溶媒を用いる。次いで、分離した各窒素酸化物含有化合物に好ましくは波長１７０〜４００ｎｍの紫外線を１０〜６０秒間照射する。その際、紫外線照射時の溶液のｐＨを１０．５〜１１．５に調整する。

次に、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物とを反応させる。その際、反応溶液を発光反応に適した条件に調整するのが好ましい。発光性化合物としてはルミノールが好ましく、特に、０．１〜０．５Ｍの炭酸緩衝液中に調製したルミノールを用い、発光反応時の溶液のｐＨを９．５〜１１に調整するのが好ましい。発光性化合物との反応により生成した光は発光検出器を用いて検出する。

本発明の検出方法はより好ましくはフローシステムを用いて行う。すなわち、試料を溶媒（水、有機溶媒またはそれらの混合液であり、例えば、分離カラムの溶離液であってもよい。）とともに流路中に導入し、試料の分離、紫外線照射および発光性化合物との反応を１つの流路内で行い、反応により生成した発光を検出し、検出を終えた反応溶液を検出系外へ廃棄する。発光性化合物は紫外線照射後に上記流路内に導入し、発光反応に最適な条件で紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と反応させる。例えば、発光性化合物としてルミノールを用いる場合、好ましくはルミノールを緩衝液（例えば、０．１〜０．５Ｍの炭酸緩衝溶液）中に調製し、上記流路内に導入し、発光反応溶液のｐＨを好ましくは９．５〜１１とする。紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物との混合は、流体の流れ（乱流）を利用してもよいし、流路をコイル状にして混合を促進してもよい。

もちろん、本発明の検出方法は上記のフローシステムによる方法に限られない。例えば、試料の入った複数の試験管をサンプラー上にセットし、試験管内の試料を順次サンプリングし、サンプリングした試料を複数の反応キュベット内にそれぞれ注入し、さらに各キュベットに緩衝液を注入して溶液を所定のｐＨに調整した後、紫外線を照射し、次いで発光性化合物溶液を各キュベット内に注入し、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物との反応により生成した光を発光検出器により検出してもよい。

［ＩＩ］検出装置
本発明の窒素酸化物含有化合物の検出装置は、本発明の検出方法を実施するのに適する。本発明の検出装置は、試料中の窒素酸化物含有化合物を分離する試料分離部と、窒素酸化物含有化合物に紫外線を照射する紫外線照射部と、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物を反応させ、反応により生成した発光を検出する発光検出部と、前記試料分離部と紫外線照射部の間にｐＨ調整溶媒を導入するｐＨ調整溶媒導入部とを有する。紫外線照射部に備えられた光源は紫外線を照射できるものであればよく、一般に使用される低圧水銀ランプ、高圧水銀ランプ、メタルハライドランプ、水銀キセノンランプ等の紫外線ランプを用いることができる。紫外線照射部の試料に紫外線を照射する部分は、紫外線を透過する材質により構成され、例えば石英ガラス、プラスチック（フッ素樹脂、アクリル樹脂等）等により構成される。また、発光検出部は紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物とを反応させ、生成した光を検出する。発光反応はフローシステムの流路内で行ってもよいし、キュベット等の容器内で行ってもよい。発光検出部は一般のルミノメーター等を用いることができる。

検出反応をフローシステムで行う場合は、好ましくは紫外線照射部と発光検出部との間または発光検出部に発光性化合物の導入部を有する。導入部から発光性化合物を注入し、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と混合して反応させる。

試料分離部としては、例えばキャピラリー電気泳動装置、カラムクロマトグラフ装置（高速液体クロマトグラフ装置（ＨＰＬＣ）等）、アフィニティークロマトグラフ装置、薄層クロマトグラフ装置等が挙げられる。これらの分離装置を２種以上組み合わせて用いてもよい。試料分離部は好ましくは高速液体クロマトグラフ装置である。

以下、本発明に使用する検出装置を図１および図２を参照しながら説明する。図１に示す検出装置は、フローシステムによる窒素酸化物含有化合物の検出装置であり、インジェクター１、試料分離部２、紫外線照射部３、発光検出部４、ポンプ１０およびこれらの装置を互いに繋ぐ流路２１、ポンプ１１およびポンプ１１と発光性化合物導入部５を繋ぐ流路２２、ならびにデータ処理装置１２を有する。流路２１には溶離液を導入し、ポンプ１０によりインジェクター１、試料分離部２、紫外線照射部３および発光検出部４に送給し、発光検出部４から廃棄する。また、流路２２には発光性化合物溶液（ルミノール溶液等）を導入し、ポンプ１１により発光性化合物導入部５を介して流路２１に注入する。

この装置を用いて窒素酸化物含有化合物を含有する試料を測定する場合、まず、インジェクター１から試料を注入する。試料は溶離液とともに試料分離部（例えばＨＰＬＣ）２を通り、試料分離部２により各窒素酸化物含有化合物に分離する。分離した各窒素酸化物含有化合物を流路２１を通して紫外線照射部３に送給する。紫外線照射部３において窒素酸化物含有化合物に紫外線を照射し、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物を流路２１を通して発光検出部４に送給する。発光検出部４において、発光性化合物を発光性化合物導入部５を介して流路２１に導入し、溶離液中の窒素酸化物含有化合物と発光性化合物を混合する。このとき、発光反応に最適なｐＨ域になるように溶離液と発光性化合物溶液（例えば、発光性化合物を含有する炭酸緩衝液）によりｐＨを調整する。発光検出部４では、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物との発光反応により生じた発光を検出し、光電子増倍管４ａにより増幅し、増幅した信号をデータ処理装置１２に送る。データ処理装置１２では、例えば、各窒素酸化物含有化合物の検量線に基づき、発光信号を各窒素酸化物含有化合物の濃度に変換する。

図２に示す検出装置は、インジェクター１、試料分離部２、紫外線照射部３、発光検出部４、ポンプ１０およびこれらの装置を互いに繋ぐ流路２１、ポンプ１１およびポンプ１１と発光性化合物導入部５を繋ぐ流路２２、ポンプ１２およびポンプ１２とｐＨ調整溶媒導入部６を繋ぐ流路２３、ならびにデータ処理装置１２を有する。流路２１には溶離液を導入し、ポンプ１０によりインジェクター１、試料分離部２、紫外線照射部３および発光検出部４に送給し、発光検出部４から廃棄する。また、流路２２には発光性化合物溶液（ルミノール溶液等）を導入し、ポンプ１１により発光性化合物導入部５を介して発光検出部４の内部にある流路２１に注入する。さらに、流路２３にはｐＨ調整溶媒を導入し、ポンプ１２により試料分離部２と紫外線照射部３の間に設けたｐＨ調整溶媒導入部６を介して流路２１に注入する。ｐＨ調整溶媒は好ましくは緩衝液であり、ｐＨ調整溶媒を試料分離部２と紫外線照射部３の間で注入することにより、流路２１中で溶離液と混合し、紫外線照射部３における液性を反応に適したｐＨ（ｐＨ１０．５〜１１．５）に調整することができる。また、試料分離部２においては、溶離液を試料分離に適したｐHに調整できるとともに、アルカリ耐性カラムの使用等の特別な配慮を必要としないという利点を有する。図２に示す検出装置は、ｐＨ調整溶媒をｐＨ調整溶媒導入部６を介して流路２１に注入する以外は図１に示す検出装置と同様である。

図１および図２に示す例では、発光性化合物導入部５を発光検出部４の内部の流路２１に設けているが、発光性化合物導入部５を発光検出部４の外部に設置し、発光性化合物を試料が発光検出部４に入る直前で導入部５を介して流路２１に注入してもよい。なお、この検出装置は試料分離部２を有するが、試料中に１種類のみの窒素酸化物含有化合物を有する場合等、試料の分離を必要としない場合は、試料分離部２を取り外してもよい。また、単に発光を検出する場合のようにデータ処理を必要としない場合は、データ処理装置１２を省略してもよい。本発明の検出装置は、フローシステムを採用することにより、多数の試料を連続的に測定することが可能となる。

本発明の検出装置を用いて窒素酸化物含有化合物を検出するときの、検出条件（紫外線の波長、照射時間、紫外線照射時の溶液のｐＨ、発光性化合物の種類、発光反応時の溶液のｐＨ等）は上述の本発明の検出方法おける条件と同様である。

以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。

実施例１
紫外線照射時間と発光量との関係
窒素酸化物含有化合物試料として、Ｎ−ニトロソジエタノールアミン、Ｎ−ニトロソピロリジン、Ｎ−ニトロソモルホリンおよびＮ−ニトロソジメチルアミンをそれぞれ５０ｎＭ含有する水溶液を調製し、図１に示す検出装置（試料分離部を取り外したもの）を用い、下記の測定条件により、紫外線照射時間を変動させてニトロソアミン類の発光量を測定した。結果を図３に示す［各ニトロソアミン類の発光量（ｍＶ）はバックグラウンドのｍＶを差し引いた値を示す（以下同様）］。図３から明らかなように、いずれのニトロソアミン類においても約１５〜３０秒の紫外線照射時間で発光量が最大となった。
（測定条件）
溶離液：１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）：メタノール＝９８：２
溶離液の流量：１．０ｍｌ／分
ルミノール溶液：０．１ｍＭのルミノール溶液となるように、ルミノールを０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ１０．０）に溶解した。
ルミノール溶液の流量：０．２５ｍｌ／分
試料注入量：１００μＬ
紫外線照射時間：０〜４５秒
紫外線照射時間は市販の低圧水銀灯（殺菌灯、主波長２５４ｎｍ）にテフロン（登録商標）チューブを巻き付け、巻き付ける長さを調節することにより照射時間を調整した。

実施例２
紫外線照射時の試料溶液のｐＨと発光量との関係
溶離液として１０ｍＭホウ酸緩衝液、１０ｍＭリン酸緩衝液または１０ｍＭ炭酸緩衝液を用い、各緩衝液のｐＨを調整することにより紫外線照射時の試料溶液のｐＨを変動させた以外、実施例１と同様にしてニトロソアミン類の発光量を測定した。結果を図４に示す。図４から明らかなように、紫外線照射時の溶液のｐＨが約１０．５〜１１．５のときに発光量が最大となった。

実施例３
発光反応時の反応溶液のｐＨと発光量との関係
溶離液として１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）を用い、ルミノール溶液の緩衝液として０．５Ｍ炭酸緩衝液を用い、炭酸緩衝液のｐＨを調整することにより発光反応時の試料溶液のｐＨを変動させた以外、実施例１と同様にしてニトロソアミン類の発光量を測定した。結果を図５に示す。図５から明らかなように、発光反応時の反応溶液のｐＨが１０〜１０．５のときに発光量が最大となった。

実施例４
ルミノール溶液の緩衝液の種類と発光量との関係
ルミノール溶液の緩衝液として、（ａ）０．１Ｍ炭酸緩衝液、（ｂ）０．５Ｍ炭酸緩衝液、（ｃ）０．１Ｍホウ酸緩衝液、（ｄ）０．５Ｍホウ酸緩衝液、（ｅ）０．１Ｍリン酸緩衝液、（ｆ）０．５Ｍリン酸緩衝液（いずれもｐＨ１０に調整した）を用いた以外、実施例１と同様にしてニトロソアミン類の発光量を測定した。結果を図６に示す。図６から明らかなように、ルミノール溶液の緩衝液として炭酸緩衝液を用いたとき、他の緩衝液を用いたときに比べ、バックグラウンドの発光量が低く、ニトロソアミン類の発光量が高くなった。特に、炭酸緩衝液の濃度を０．５Ｍとしたときにニトロソアミン類の発光量が最も高くなった。

実施例５
窒素酸化物含有化合物の種類と発光量との関係
窒素酸化物含有化合物試料として、Ｎ−ニトロソジエチルアミン（０．１μＭ）、Ｎ−ニトロソジ−ｎ−プロピルアミン（０．１μＭ）、Ｎ−ニトロソジフェニルアミン（０．１μＭ）、およびＮ−ニトロソフェンフルラミン（Ｎ-nitrosofenfluramine）（０．１μＭ）、Ｓ−ニトロソグルタチオン（０．１μＭ）、１−ニトロプロパン（１μＭ）、コニフェロン（coniferron）（１０μＭ）、ニトロベンゼン（１０μＭ）、硝酸ナトリウム（１０μＭ）、および亜硝酸ナトリウム（１０μＭ）を用い、紫外線照射時間を１５秒とし、溶離液を１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）：メタノール＝９０：１０とした以外、実施例１と同様にして試料の発光量を測定した。結果を表１に示す。

表１から明らかなように、紫外線照射により活性酸素種を生成する化合物であればニトロソアミン類に限らず本発明の方法により検出できることが分る。特にニトロソアミン類は検出感度が高く、本発明の方法に適している。

実施例６
検出限界および検量範囲
図１に示す検出装置の試料分離装置として、アルカリ耐性のある逆相カラム（Ｇｅｍｉｎｉ
Ｃ１８（５μｍ）２５０×４．６ｍｍ、ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を用い、試料としてＮ−ニトロソジエタノールアミン、Ｎ−ニトロソジメチルアミンおよびＮ−ニトロソピロリジンを含有する水試料を用いた以外、実施例１と同様にしてニトロソアミン類の発光量を測定した。また、各ニトロソアミン類の検量範囲を既知濃度の試料を用いて測定した。結果を表２に示す。表２に示すように、上記のニトロソアミン類の検出限界は９．８〜２０ｎｇ／Ｌであり、検量範囲は０．２０〜５０×１０^−９Ｍであった。

実施例７
実試料測定
試料として水道水を用いた以外、実施例６と同様にして試料中の窒素酸化物含有化合物の発光量を測定した。結果を図７（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に示す。保持時間３分付近に硝酸イオンの強いピークが観察された以外、ニトロソアミン類以外のピークは観察されず、本発明の方法が感度だけでなく、高い特異性を有していることがわかる。

本発明の実施形態による窒素酸化物含有化合物の検出装置を示す概略図である。本発明の別の実施形態による窒素酸化物含有化合物の検出装置を示す概略図である。紫外線照射時間と発光量との関係を示すグラフである。紫外線照射時の溶液のｐＨと発光量との関係を示すグラフである。発光反応時の溶液のｐＨと発光量との関係を示すグラフである。ルミノール溶液の緩衝液の種類と発光量との関係を示すグラフである。試料中のニトロソアミン類の検出ピークを示すクロマトグラムであり、（ａ）は標準ニトロソアミン混合液によるクロマトグラムであり、（ｂ）は水道水によるクロマトグラムであり、（ｃ）は水道水に標準ニトロソアミン混合液を添加した試料によるクロマトグラムである。

符号の説明

１・・・インジェクター
２・・・試料分離部
３・・・紫外線照射部
４・・・発光検出部
５・・・発光性化合物導入部
６・・・ｐＨ調整溶媒導入部
１０，１１，１２・・・ポンプ
１２・・・データ処理装置
２１，２２，２３・・・流路

Claims

ｐＨ１０．５〜１１．５の水性溶媒中に存在する窒素酸化物含有化合物に紫外線を照射し、紫外線照射した前記窒素酸化物含有化合物と発光性化合物を酸化剤の非存在下で反応させ、生成した発光を検出する、窒素酸化物含有化合物の検出方法。
窒素酸化物含有化合物が、ニトロソ化合物、ニトロ化合物、亜硝酸、亜硝酸エステル、亜硝酸塩、硝酸、硝酸エステルまたは硝酸塩である、請求項１に記載の検出方法。
窒素酸化物含有化合物がニトロソアミン類である、請求項１に記載の検出方法。
紫外線の波長が１７０〜４００ｎｍである、請求項１〜３のいずれかに記載の検出方法。
紫外線照射により生成したペルオキシナイトライトと発光性化合物とを反応させることを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の検出方法。
発光性化合物がルミノール類、ルシゲニン類、アクリジニウム化合物、ルシフェリン類、シュウ酸エステル類またはルテニウム錯体類である、請求項１〜５のいずれかに記載の検出方法。
発光性化合物がルミノールである、請求項６に記載の検出方法。
ルミノールが、炭酸緩衝液中で調製されたルミノールである、請求項７に記載の検出方法。
窒素酸化物含有化合物に紫外線を照射する前に、試料中の窒素酸化物含有化合物を分離する段階を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の検出方法。
試料中の窒素酸化物含有化合物を分離する試料分離部と、窒素酸化物含有化合物に紫外線を照射する紫外線照射部と、紫外線照射した窒素酸化物含有化合物と発光性化合物を反応させ、反応により生成した発光を検出する発光検出部と、前記試料分離部と紫外線照射部の間にｐＨ調整溶媒を導入するｐＨ調整溶媒導入部とを有する、窒素酸化物含有化合物の検出装置。
紫外線照射部と発光検出部との間または発光検出部に発光性化合物導入部を有する、請求項１０に記載の検出装置。