JP2009079002A - 口腔内レンサ球菌の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ミュータンスレンサ球菌数を口腔内レンサ球菌数で除した値である齲蝕菌比率を求める際等に必要になる、口腔内レンサ球菌数を迅速簡便に測定する方法を提供すること。
【解決手段】 カルシウムイオン等の２価の金属イオン存在下で、アグルチニンと口腔内レンサ球菌とを接触させて、該アグルチニンと口腔内レンサ球菌の結合物を形成させ、このアグルチニンと口腔内レンサ球菌の結合物量を測定することで、迅速簡便に口腔内レンサ球菌を測定する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、口腔内に存在する微生物、具体的には口腔内レンサ球菌の測定方法に関する。

一般に、ミュータンスレンサ球菌と呼ばれる一群の乳酸発酵性細菌が、齲蝕発症に深く関わっていることが知られている。

これらミュータンスレンサ球菌群は、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ、血清型ａ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ、血清型ｂ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、血清型ｃ、ｅ、ｆ）、ストレプトコッカス・フェルス（Ｓ．ｆｅｒｕｓ、血清型ｃ）、ストレプトコッカス・マカカ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ、血清型ｃ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ、血清型ｄ、ｇ）、ストレプトコッカス・ドウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｙ、血清型ｈ）として、血清学的、遺伝学的に異なる７種の型に分類されている。

従来、これらミュータンスレンサ球菌の唾液中の濃度が１０^５〜１０^６個／ｍＬの場合には、齲蝕の危険あり、１０^６個／ｍＬ以上の場合は特に危険であると言われており、人の口腔内におけるミュータンスレンサ球菌の存在量を知ることで、その人の齲蝕危険度の判定を行なうことが可能である。一般に、これらミュータンスレンサ球菌の濃度は、バシトラシンを入れた培地を用いて唾液中のミュータンスレンサ球菌を選択的に培養してコロニー数を調べることにより測定されている（そのための測定キットも市販されている）。そして、唾液中の各ミュータンスレンサ球菌の濃度についても、同様に培養を行なって得られたコロニーの中から各菌のコロニーを同定し、その数を調べることにより知ることができる。なお、同定の方法としては、糖発酵試験等の生化学的方法、ＤＮＡプローブを用いる遺伝学的方法、血清型特異的抗体を用いる免疫学的方法等が知られている。

近年、ミュータンスレンサ球菌の中でヒトの口腔に存在するのは主にストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスの２菌種であることが明らかとなった。特に、ストレプトコッカス・ミュータンスはヒト口腔から高頻度に分離され（９割以上の人から分離される）、齲蝕の発生に深く関連することが判明した。

現在、口腔内のミュータンスレンサ球菌の測定法としては培養法が広く実施されている。しかし、培養法は、培養操作が不可欠であること、更に分離したコロニーの形態からの菌種の同定には熟練した手技が必要であることから、検査時間および操作の煩雑さの点で問題があったが、近年、各種モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体を用いた免疫学的測定方法が報告された。これらの方法は培養する必要が無く、検出に要する時間が大幅に短縮できるという利点がある（例えば非特許文献１参照）。

唾液中のミュータンスレンサ球菌数の測定結果は、唾液採取条件、唾液採取から測定までの保存条件等の影響を受ける。唾液中のミュータンスレンサ球菌数が同等であっても、唾液採取条件や保存条件を一定にしないと、ミュータンス菌数が変動してしまい、正確に齲蝕危険度の判定ができない場合がある。例えば、ミュータンスレンサ球菌測定に使用する被検体の採取は、通常はガム等の咀嚼物を口全体の歯をまんべんなく使って一定時間噛み、唾液を採取することで実施されるが、ガムを特定の部位のみで噛んでしまったり、ガムを噛む時間が短すぎたりすると、口腔内のミュータンスレンサ球菌が十分に採取できず本来のミュータンスレンサ球菌数より少ない菌数となる可能性がある。また、例えば、培養法で菌数を測定する場合は、唾液採取から測定までの保存条件によっては菌が死んでしまい、本来の菌数より少ない菌数となる可能性がある。

口腔内には、様々な細菌が存在しているが、最も多い菌群は、通性嫌気性菌のレンサ球菌で（以後、口腔内レンサ球菌と略す場合がある）、おおよそ全体の半分を占めているといわれている。口腔内レンサ球菌は多数の菌種の混合物であり、ミュータンスレンサ球菌も口腔内レンサ球菌に含まれる。これら口腔内レンサ球菌は、全ての人の口腔内に、一般的には唾液中に１０^８個／ｍＬ程度存在すると言われている。

そこで、唾液中のミュータンスレンサ球菌数と口腔内レンサ球菌数とを測定し、ミュータンスレンサ球菌数を口腔内レンサ球菌数で除した値（以後齲蝕菌比率という場合がある）を算出することで、上記唾液採取や唾液保存による変動を補正する方法が知られている（例えば非特許文献２参照）。前記の理由等により、採取した唾液中のミュータンスレンサ球菌数が本来のミュータンスレンサ球菌数より少なくなってしまったとしても、口腔内レンサ球菌数も同様に減少するので、齲蝕菌比率を算出することで、サンプリング時の菌数のブレを補正することが可能である。この方法によれば、齲蝕菌比率が０．１〜１％の場合が齲蝕の危険小、１〜５％の場合が齲蝕の危険中、５％以上の場合が齲蝕の危険大というように、安定して齲蝕危険度を判定することが可能となるが、口腔内レンサ球菌は多種類の菌種の混合物であるため、迅速に測定できる免疫学的測定法で測定するためには、多数の抗体を準備する必要があるため非現実的であり、口腔内レンサ球菌の測定は、結果が判明するまで日数を要する培養法により実施されているという問題があった。迅速な口腔内レンサ球菌の測定方法が望まれていた。

大森かをる，私の愛すべき道具たち，デンタルダイヤモンド 第３１巻，２００６年，１１４−１１８ 花田信弘監修，「ミュータンスレンサ球菌の臨床生物学」 第１版，クインセッテンス出版株式会社，２００３年，１５２−１６４

本発明は上記事情に鑑みなされたものであり、口腔内レンサ球菌を迅速簡便に測定する方法を提供することを目的とする。

本発明者等は上記課題を解決するために、鋭意検討してきた。その結果、唾液中に存在するタンパク質であって、口腔内レンサ球菌を凝集させることが知られているアグルチニン（Ａｇｇｕｌｕｔｉｎｉｎ）が、口腔内レンサ球菌に結合する性質を利用することで、口腔内レンサ球菌を迅速簡便に測定できることを見出した。そして、更に検討を進め、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、アグルチニンと口腔内レンサ球菌とを接触させることでアグルチニンと口腔内レンサ球菌の結合物を形成させ、該アグルチニンとレンサ球菌の結合物量を測定することを特徴とする口腔内レンサ球菌の測定方法である。

本発明の口腔内レンサ球菌の測定方法により、迅速簡便に口腔内レンレンサ球菌を測定することが可能となり、例えば、ミュータンスレンサ球菌の迅速な測定法（例えば免疫学的測定法）と組合せることで、迅速に齲蝕菌比率を算出することが可能となった。

本発明の口腔内レンサ球菌の測定法では、唾液中のタンパク質であるアグルチニン（Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）の口腔内レンサ球菌に結合する性質を利用する。本発明におけるアグルチニンとは、唾液中に存在する、２価の金属イオン存在下に口腔内レンサ球菌の表面に存在するレセプターに結合し該菌体を凝集させることが知られているタンパク質を指す（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７巻，２００２年，３２１０９−３２１１５）。

本発明で使用するアグルチニンは、例えば、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７巻，２００２年，３２１０９−３２１１５ページに記載されている公知の方法に従って唾液から調製することができるが、アグルチニンがストレプトコッカス・ミュータンス菌体に結合し該菌体を凝集させるという性質を利用して精製する方法は、回収量の多さ、簡便さ等から好適な方法である。上記のストレプトコッカス・ミュータンス菌体を利用する精製法や、その他の公知の方法で調製したアグルチニンは、通常、アグルチニンに加えてアグルチニン以外の唾液中に存在する成分（タンパク質等）を夾雑物として含有する場合が多い。アグルチニンの精製に使用した唾液の種類、精製方法等により該夾雑物の種類、含量は変動するが、該夾雑物が、口腔内レンサ球菌に結合し、口腔内レンサ球菌を凝集させるというアグルチニンの作用を妨害することがない限り、唾液から精製したアグルチニンが夾雑物を含有していても、本発明のアグルチニンとして制限なく使用することができる。

以下、唾液とストレプトコッカス・ミュータンス菌体を接触させ、アグルチニンを菌体に結合させた後に回収する方法の具体例を説明する。ここでストレプトコッカス・ミュータンスとは、血清型ｃ、ｅ、ｆ型のミュータンスレンサ球菌を指し、具体的には、血清型がｃ型の標準菌株としてＩｎｇｂｒｉｔｔ、ＭＴ６Ｒ等の菌株、血清型がｅ型の標準菌株としてＬＭ７、Ｐ４等の菌株、血清型がｆ型の標準菌株としてＳＥ１１、ＯＭＺ１７５等の菌株を例示できる。ストレプトコッカス・ミュータンス菌体は、ブレインハートインヒュージョン液体培地（以下ＢＨＩ液体培地と略す場合がある）等で培養して調製した菌体を使用する。唾液は、ガム等の咀嚼物を噛ませ採取した刺激唾液を使用する。該菌体と唾液を混合し、ストレプトコッカス・ミュータンス菌体にアグルチニンを結合させる。

アグルチニンは２価の金属イオンに対して依存的にストレプトコッカス・ミュータンス菌体に結合する。唾液中には通常数ｍＭのカルシウムイオンが存在するため、このままでもアグルチニンを菌体に結合させることは可能であるが、より回収を確実にするため、２価の金属イオンを添加することが望ましい。２価の金属イオンとしては、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン等が使用できるが、アグルチニンの菌体への結合を促進する効果が高いという理由から、カルシウムイオンが好適に使用できる。２価の金属イオンの好適な濃度は１〜１００ｍＭの範囲である。２価の金属イオンの具体的な添加方法は、例えば、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カルシウム等の金属塩を、上記濃度範囲内になるように添加すれば良く、前記金属塩は、例えば、菌体と唾液を混合した混合物に添加しても良いし、予め唾液に添加してから菌体と混合しても良い。

次いで、遠心分離によりアグルチニンが結合したストレプトコッカス・ミュータンスの菌体を沈殿として回収し、該沈殿をリン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと略すこともある）等の緩衝液で洗浄するが、アグルチニンの回収量を上げるために、低濃度の、具体的には１〜５ｍＭ程度の２価の金属イオンを含有する緩衝液で洗浄することが好適である。次いでアグルチニンを溶出する。アグルチニンの溶出は、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質Ｉ（東京科学同人 １９９０年）２１４−２５７ページ記載のアフィニティークロマトグラフィーでの溶出方法に従って実施できる。具体的には、アグルチニンが結合した菌体を、例えば、極端なｐＨ（酸性またはアルカリ性）の溶液に懸濁する、尿素等の変性剤を含む溶液に懸濁する、チオシアン酸カリウム等のカオトロピックイオンを含む溶液に懸濁する等の方法で溶出できる。また、アグルチニンは２価の金属イオン存在下で菌体と結合することを利用して、例えば、アグルチニンの結合した菌体をエチレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−四酢酸二ナトリウム（以下ＥＤＴＡと略す場合がある）、クエン酸、フェナントロリン等のキレート剤を含む溶液に懸濁することでも実施できる。このキレート剤による溶出は、他の方法に比べ、アグルチニンを変性させる可能性が最も低いので、好適である。キレート剤による溶出の具体的方法としては、例えば、溶出時のｐＨは中性付近（ｐＨ６〜８）であることが好ましいので、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等の緩衝液にキレート剤を５〜５００ｍＭの濃度となるように溶解し、該溶液にアグルチニンの結合した菌体を懸濁し、次いで、遠心分離により上清を回収するという方法を示すことができる。溶出後の溶液を、例えば、中性付近（ｐＨ６〜８）の緩衝液（トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等）に対し透析し、アグルチニン溶液とすれば良い。

本発明における口腔内レンサ球菌とは、口腔内に存在する通性嫌気性のストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌で、ミティス−サリバリウス培地（以下、ＭＳ培地と略す場合がある）で嫌気培養した場合に生育してくる細菌を指す。具体的には、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓ．ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓ．ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・フェルス（Ｓ．ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ、）、ストレプトコッカス・ドウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｙ）等のミュータンスレンサ球菌、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ストレプトコッカス・サンギス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓ）、ストレプトコッカス・ミティス（Ｓ．ｍｉｔｉｓ）、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・ゴルドニイ（Ｓ．ｇｏｒｄｏｎｉｉ）、ストレプトコッカス・オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）等が該当する。

本発明の口腔内レンサ球菌の測定方法で使用する被検体としては、上記口腔内レンサ球菌を含有するものであれば制限なく使用できる。例えば、微生物の培養液、微生物の懸濁液、食品およびその懸濁液、または、唾液、血漿、血清、尿等の体液、或いは歯垢等が挙げられる。齲蝕菌比率を検査する場合には、唾液、歯垢が特に好適に使用される。なお、唾液及び歯垢は、被検体中にそれぞれ単独で含まれていてもよいし、混合物として含まれていてもよい。

例えば歯垢のみを含む被検体は、口腔内をうがい等により洗浄し唾液成分を除去した後に採取した歯垢を用いて調製すればよい。歯垢の採取は、口腔内の特定部位の歯垢をつまようじ、綿棒、スパチュラ等の従来公知の方法で採取することも出来るし、口腔内より無作為に採取することも出来る。このように採取された歯垢を緩衝液等の液体に懸濁し被検体とすればよい。

例えば、歯垢と唾液の混合物を被検体とする場合は、パラフィンペレット、ガム等の咀嚼物を３０秒〜１０分間噛ませ、分泌された唾液を吐き出させることにより採取できる。また、唾液のみを含む被検体液は、例えば、スポイト、ピペット等の従来公知の方法で採取された唾液を用いて調製することが出来る。採取された唾液は、そのまま或いは、緩衝液等の液体で適宜希釈して被検体とすればよい。

本発明では、上記のようにして調製した被検体とアグルチニンを接触させ、アグルチニンと口腔内レンサ球菌の結合物を形成させる。唾液、歯垢中の口腔内レンサ球菌は、表面が歯垢（不溶性多糖）で覆われていたり、また、唾液中のタンパク質等が菌体表面に結合している場合があるので、そのまま本発明の測定方法の被検体として使用すると、歯垢や唾液中のタンパク質等が妨害し、アグルチニンと口腔内レンサ球菌の結合物が形成されない場合がある。このため、特に、被検体が唾液または歯垢である場合には、前処理を行い、歯垢及び／又は唾液中のタンパク質等を被検体中の口腔内レンサ球菌菌体表面から取り除く必要がある。

前処理は、一般的にタンパク質の変性方法や不溶性多糖の可溶化法として知られている方法により実施することができ、例えば、生化学実験講座４ 糖質の化学（上）（東京化学同人 第一版 １９７６年）８１−２５８ページに記載されている不溶性多糖の可溶化法（抽出法）に従って実施できる。具体例として、アルカリ処理、酸処理、界面活性剤処理、変性剤処理等が表示でき、具体的な操作方法として、アルカリ処理の場合には、０．０５〜５Ｍの、水酸化ナトリウム、または水酸化カリウム溶液中で、酸処理としては０．１Ｍ〜５Ｍの、塩酸、または酢酸溶液中で、界面活性剤処理の場合は、０．０１％〜１０％の、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシルコール酸ナトリウム等のイオン性界面活性剤、またはトリトンＸ−１００、ツイーン２０等の非イオン性界面活性剤の溶液中で、変性剤処理の場合は１〜８Ｍの、塩酸グアニジン、または尿素溶液中で、４℃〜１２０℃にて５分〜２４時間放置するという方法等が例示できる。

上記の方法中、アルカリ処理、酸処理は、反応後、緩衝液、酸、アルカリ等を添加しｐＨを中性に調製するという操作を行なうだけで本発明の測定方法に供することができるので、特に好適である。例えば、アルカリ処理の場合は、反応後に、塩酸、酢酸、クエン酸等の酸を添加することでｐＨを６〜８程度に調整すれば良い。また、酸処理の場合には、反応後に、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を添加することでｐＨを６〜８程度に調整すればよい。

本発明の口腔内レンサ球菌の測定法では、前記のように調製したアグルチニンと口腔内レンサ球菌を含む被検体とを接触させ、アグルチニンとレンサ球菌の結合物を形成させ、該アグルチニンと口腔内レンサ球菌の結合物量を測定することで、口腔内レンサ球菌の量を求める。アグルチニンと口腔内レンサ球菌の接触、アグルチニンと口腔内レンサ球菌の結合物の測定は、従来公知の種々の免疫学的測定法に準じて実施することができる［例えば、新生化学実験講座１２ 分子免疫学III 抗原・抗体・補体（東京化学同人 第一版 １９９２年）３３−１２５ページ］。従来の免疫学的測定法において抗体を使用しているところをアグルチニンに置きかえれば、従来の免疫学的測定方法と同様に実施することができる。

但し、アグルチニンと口腔内レンサ球菌の結合には２価の金属イオンが必要なので、本発明の口腔内レンサ球菌測定法を実施する際には、反応系内に２価の金属イオンを共存させる必要がある。２価の金属イオンとしては、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、鉄イオン、コバルトイオン等が使用できるが、アグルチニンの菌体への結合を促進する効果が高いという理由から、カルシウムイオンが好適に使用できる。２価の金属イオンの好適な濃度は１〜１００ｍＭの範囲である。２価の金属イオンの具体的な添加方法は、例えば、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、酢酸カルシウム等の金属塩を、上記濃度範囲内になるように添加すれば良く、前記金属塩は、例えば、被検体、アグルチニンを含む測定試薬のどちらか一方または両方に添加すれば良い。

以下好適な方法について説明する。
［遊離のアグルチニンを使用する方法］
該方法は、不溶性担体にアグルチニンを担持させることなく口腔内レンサ球菌を測定する方法である。具体例として、口腔内レンサ球菌を含む被検体と遊離アグルチニンを混合し、口腔内レンサ球菌の凝集による濁度の変化で口腔内レンサ球菌を定量する方法（凝集法）、または、口腔内レンサ球菌を含む被検体と放射性物質、酵素、蛍光色素、色素等で標識したアグルチニンとを混合し、遠心分離により沈殿を回収することで、口腔内レンサ球菌に結合しなかった遊離の標識アグルチニンを除去し、最終的に、口腔内レンサ球菌に結合した標識アグルチニンの標識物の量、すなわち標識物質に由来する放射活性、酵素活性、蛍光強度、着色（色調の変化）等を測定することによって、被検体中の口腔内レンサ球菌を検出、定量する方法（標識アグルチニン法）等が挙げられる。遊離のアグルチニンを使用する方法で使用する好適なアグルチニン量は、アグルチニンと被検体と混合した後の懸濁液中の濃度が０．００１〜５ｍｇ／ｍＬ、特に、０．０１〜１ｍｇ／ｍＬの範囲である。

前記のように公知の精製法により調製したアグルチニン画分は、通常アグルチニン以外の夾雑物を含有するため、アグルチニン画分のタンパク質量を測定しただけでは実際のアグルチニン濃度が不明である。このような場合は、例えば、新生化学実験講座１ タンパク質Ｉ（東京科学同人 １９９０年）３５６−３５９ページ記載のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（以下ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す場合がある）によりアグルチニン画分を分析することで実際のアグルチニン量を定量できる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは分子量により分画する方法なので、アグルチニン画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、電気泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルー等の色素でタンパク質を染色し、全タンパク質バンドに対するアグルチニンバンド（３５０ｋＤａ）の占める割合を求める。アグルチニン画分のタンパク質量と上記のように求めたアグルチニンの含有率からアグルチニン画分中の実際のアグルチニン濃度が算出できる。このようにして算出した実際のアグルチニンの濃度が前記の好適な範囲になるようにアグルチニン濃度を調整すれば良い。
［固定化アグルチニンを使用する方法］
該方法は、不溶性担体にアグルチニンを担持させた固定化アグルチニンを使用して口腔内レンサ球菌を測定する方法である。

不溶性担体としては、形状は、例えば、膜、粒子、プレート、試験管等の従来公知のものが特に制限なく使用できる。材質は、例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ラテックス、ゼラチン、金属コロイド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート等の従来公知のものが何ら制限なく使用できる。

固定化アグルチニンは、一般的に、アグルチニンが緩衝液等の水溶液に溶解しているアグルチニン溶液と不溶性担体を一定時間接触させることにより、アグルチニンを該不溶性担体に結合させることにより製造される。固定化アグルチニン製造時の溶液のｐＨは一定の範囲内に（例えば、ｐＨ４〜９）保つことが好ましく、この目的のために、緩衝液中でアグルチニンと不溶性担体を接触させることが好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が使用できる。具体的なアグルチニンと不溶性担体を接触させる方法として、例えば、アグルチニン溶液を調製し、該アグルチニン溶液と不溶性担体を４〜５６℃にて、２分以上接触させる、という方法を示すことができる。アグルチニンの好適な濃度は、０．００１〜５ｍｇ／ｍL、特に、０．０１〜１ｍｇ／ｍLの範囲である。前記の［遊離のアグルチニンを使用する方法］で述べたように、唾液から精製したアグルチニンをＳＤＳ−ＰＡＧＥ等で分析し、実際のアグルチニン濃度を算出し、上記の好適な濃度範囲となるようにすれば良い。

固定化アグルチニンを使用する具体的な方法として、公知の方法が特に制限なく適用できるが、反応媒体の濁度または色調の変化で測定する方法が、感度の高さや操作の簡便性から好ましい。例えば、ラテックス粒子にアグルチニンを担持させた固定化アグルチニン（以下、感作粒子という場合がある）と口腔内レンサ球菌を含む被検体を混合し、ラテックス粒子の凝集による濁度変化により口腔内レンサ球菌を測定するラテックス凝集法が挙げられる。

別の測定法として、例えば、標識アグルチニンを使用する方法を示すことができる。該方法は固定化アグルチニンと標識アグルチニンを組合わせて、口腔内レンサ球菌を測定する方法である。標識物としては、遊離のアグルチニンを使用する方法で述べた、放射物質、酵素、蛍光色素、色素に加えて、着色粒子（金コロイド、炭素コロイド、着色ラテックス等）や標識物質（酵素、放射性物質等）を結合させたラテックス粒子等の不溶性担体も使用することができる。着色粒子や標識物質を結合させたラテックス粒子等にアグルチニンを担持させたものは、固定化アグルチニンであると同時に標識アグルチニンでもあると言える。

具体的な測定法としては、例えば、膜、イムノプレート等の不溶性担体にアグルチニンを担持させた固定化アグルチニンに、被検体中の口腔内レンサ球菌を結合させ、次いで標識アグルチニンを更に結合させて、固定化アグルチニン−口腔内レンサ球菌−標識アグルチニンのサンドイッチ複合体を形成させて標識物の量を測定する方法を示すことができる。このような方法の更に具体的な例として、ニトロセルロース等の膜にアグルチニンを担持させた固定化アグルチニンと、着色コロイドまたは各種着色粒子等にアグルチニンを担持させた標識アグルチニンを使用し色調の変化により測定する方法［標識アグルチニンクロマト法（免疫クロマト法に準じた方法）］を挙げることができる。

固定化アグルチニンを使用する方法は、遊離アグルチニンを使用する方法に比べて、感度が高い、操作が簡便等の特徴を持つので、より好適な実施形態であるといえる。固定化アグルチニンを使用する方法の中でも、上記説明した、標識アグルチニンクロマト法、ラテックス凝集法は、高感度、簡便、迅速に測定できるという特徴があり、特に好ましい実施形態である。

本発明の口腔内レンサ球菌の測定法とミュータンスレンサ球菌の測定法とを組合わせて齲蝕菌比率を算出する場合は、例えば、ミュータンスレンサ球菌の測定に免疫学的測定法を採用すれば、培養する必要がなく、迅速簡便に齲蝕菌比率が算出でき特に好適である。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。

実施例１［標識アグルチニンクロマト法による口腔内レンサ球菌の測定］
（１）ストレプトコッカス・ミュータンスの培養
ＢＨＩ３．７ｇを１００ｍＬの純水に溶解後、オートクレーブ処理し、ＢＨＩ液体培地を調製した。ＢＨＩ液体培地１００ｍＬ中でＩｎｇｂｒｉｔｔ（ストレプトコッカス・ミュータンス、血清型ｃ）を３７℃、１５時間、嫌気条件下（Ｎ_２：Ｈ_２：ＣＯ_２＝８０：１０：１０）で培養した後、培養液を６，０００ｒｐｍ、１０分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。

次いで、沈殿物を５ｍＬのＰＢＳに懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。
（２）アグルチニンの精製
複数の被験者にガムを噛ませることで１５０ｍＬの刺激唾液を採取し、カルシウムイオンが１０ｍＭとなるように塩化カルシウムを添加した。上記（１）で調製したストレプトコッカス・ミュータンス培養菌体の沈殿物と塩化カルシウムを添加した唾液を混合し、４℃にて１時間転倒混和し、５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。沈殿を２ｍＭの塩化カルシウムを含むＰＢＳに懸濁し、５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、沈殿に５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０を添加し、よく懸濁した。５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し上清を回収し、沈殿を再度５０ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０に懸濁し、同様の方法にて上清を回収した。回収した上清を混合し、１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．０に対し透析した後、セントリプレップー１０（アミコン）で濃縮し、アグルチニン溶液を調製した。アグルチニン溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、アグルチニン溶液中のアグルチニン含有率は８０％で、アグルチニン溶液中のアグルチニン濃度は、２ｍｇ／ｍＬであることが分かった。
（３）口腔内レンサ球菌測定用標識アグルチニンクロマト法ストリップの作製
（イ）金コロイド標識アグルチニンの調製
コロイド粒径が４０ｎｍの市販金コロイド溶液（Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）１０ｍＬに１００ｍＭＫ_２ＣＯ_３を８８μＬ添加し、ｐＨを９．０に調製後、０．２２μｍフィルター処理した。金コロイド溶液の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ_５２０＝１．０であった。

次いで、アグルチニン濃度１ｍｇ／ｍＬに調整したアグルチニン溶液６４μＬを、上記金コロイド溶液に撹拌しながら添加し、室温下５分放置した。次いで、１０％スキムミルク−２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１．１ｍＬ撹拌しながら添加し（スキムミルク終濃度１％）、室温下３０分放置した。次いで、反応溶液を１０℃、１００００ｇ、３０分遠心処理し、上清を除去後、２ｍＬの２ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、下層の金コロイド画分を再懸濁した。得られた金コロイド画分（以下、「金コロイド標識アグルチニン」と表記することもある）は、４℃にて保存した。
（ロ）標識アグルチニンクロマト法ストリップの作製
ニトロセルロースメンブレン（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＨＦ７５、２５ｍｍ×６ｍｍ）からなる展開メンブレン上の検出ライン上に、アグルチニン濃度２ｍｇ／ｍＬのアグルチニン溶液１μＬをスポットし、インキュベーター内で３７℃、６０分乾燥しアグルチニンを固定化した。該アグルチニン固定化メンブレンを１％スキムミルク−０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００水溶液中で室温下、５分振とうした。次いで、該メンブレンを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温下、１０分振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。

また、コンジュゲートパッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。該コンジュゲートパッドにＡ_５２０＝１．０に調整した金コロイド標識アグルチニンを２５μＬ添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。更に、サンプルパッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、１７ｍｍ×６ｍｍ）を１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。尚、吸収パッド（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、２０ｍｍ×６ｍｍ）は未処理のまま用いた。

このように調製した、図１に示すような標識アグルチニンクロマト法ストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図２に示すような標識アグルチニンクロマト法ストリップを組み立てた。
（４）〔被検体の調製〕
被験者にガムを５分間噛ませ、分泌された唾液を採取し、２０秒間、６０Ｗで超音波処理することで被検体を得た。
（５）〔培養法による被検体中の口腔内レンサ球菌の測定〕
上記（４）の方法に従い得られた被検体を適宜希釈して、１００μＬをＭＳ固体培地上に添加し、３７℃、嫌気条件下、４８時間培養した。ＭＳ培地上に生じるコロニー数を計数し、被検体液の希釈率から、口腔内レンサ球菌濃度を個／ｍＬとして算出した。
（６）〔標識アグルチニンクロマト法ストリップによる被検体中の口腔内レンサ球菌の測定〕
上記（３）にて作製した標識アグルチニンクロマト法ストリップを用いて、被検体中の口腔内レンサ球菌数の測定を実施した。上記（５）で使用した被検体のそれぞれ０．１ｍＬに１．０Ｍ水酸化ナトリウム溶液を０．０１ｍＬ添加し、１０分間室温で放置した後、１．０Ｍ塩酸溶液を０．０１ｍＬ添加し中和し、次いで、１Ｍ塩化カルシウム溶液を０．００１ｍＬ添加した。この被検体全量を標識アグルチニンクロマト法ストリップのサンプルパッドに滴下し、１５分後のスポット発色強度を、４段階（＋＋＋：強い陽性、＋＋：陽性、＋：弱い陽性、−：陰性）に識別した結果と、（５）の培養法により得られた口腔内レンサ球菌数とを比較した。結果を表１に示す。

表１に示したように、培養法により得られた口腔内レンサ球菌濃度と相関するスポット発色強度が得られた。本発明の口腔内レンサ球菌の測定法により、被検体中の口腔内レンサ球菌を迅速且つ濃度依存的に検出可能であった。

実施例２［ラテックス凝集法による口腔内レンサ球菌の測定］
（１）アグルチニン感作ラテックス粒子の調製
実施例１（２）で調製したアグルチニン溶液を希釈し、アグルチニン濃度０．５ｍｇ／ｍＬに調整した。このアグルチニン溶液１ｍＬに０．５％のポリスチレンラテックス粒子（ＪＳＲ社）１ｍＬを加え、室温で１時間放置し、次いで、１％ウシ血清アルブミン溶液を０．５ｍＬ添加し、室温で１時間放置した。遠心分離によりアグルチニンの結合したラテックス粒子を単離し、０．０５Ｍの塩化ナトリウムと０．０１Ｍの塩化カルシウムを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（以下緩衝液Ａとよぶ場合がある）で１回洗浄し、抗体固定化ラテックス粒子が０．５％となるように緩衝液Ａで懸濁した。
（２）アグルチニン感作ラテックス粒子による口腔内レンサ球菌の測定
実施例１で使用した被検体を実施例１（５）と同様の方法により前処理を行なった。前処理済み被検体にアグルチニン感作ラテックス粒子懸濁液を０．１ｍＬ添加、混合し、室温で３０分放置後、ラテックス粒子の凝集を目視で観察し、結果を４段階（＋＋＋：強い凝集、＋＋：やや強い凝集、＋：弱い凝集、−：凝集せず）に識別した結果を表２に示す。

アグルチニン感作ラテックス粒子によるラテックス凝集法によっても、被検体中の口腔内レンサ球菌を迅速且つ濃度依存的に検出可能であった。

本図は、本発明の口腔内レンサ球菌測定法で使用する標識アグルチニンクロマト法で使用するストリップの各部材の概略図である。 本図は、本発明の口腔内レンサ球菌測定法で使用する標識アグルチニンクロマト法で使用するストリップの各部材の側面図である。

符号の説明

１・・・ストリップ
２・・・サンプルパッド
３・・・コンジュゲートパッド
４・・・展開メンブレン
５・・・吸収パッド
６・・・検出ライン

Claims (4)

1. アグルチニンと口腔内レンサ球菌とを、２価の金属イオンの存在下で接触させることでアグルチニンと口腔内レンサ球菌の結合物を形成させ、該アグルチニンとレンサ球菌の結合物量を測定することを特徴とする口腔内レンサ球菌の測定方法。
2. ２価の金属イオンが、カルシウムイオンである請求項１記載の口腔内レンサ球菌の測定方法。
3. 不溶性担体にアグルチニンを担持させた固定化アグルチニンを使用することを特徴とする請求項１または請求項２記載の口腔内レンサ球菌の測定方法。
4. アグルチニンと口腔内レンサ球菌の結合物量を、濁度または色調の変化で測定することを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の口腔内レンサ球菌の測定方法。

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