JP2009042212A

JP2009042212A - ＲＭ２抗体で規定されるハプトグロビンβ鎖を利用した癌の評価方法

Info

Publication number: JP2009042212A
Application number: JP2008106074A
Authority: JP
Inventors: Seiichi Saito; 誠一齋藤; Yoichi Arai; 陽一荒井
Original assignee: Tohoku Techno Arch Co Ltd; Tosoh Corp
Current assignee: Tohoku Techno Arch Co Ltd; Tosoh Corp
Priority date: 2007-07-19
Filing date: 2008-04-15
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2028-04-15
Also published as: EP2182360B1; US20100173334A1; JP5193663B2; EP2182360A4; EP2182360A1; US9046521B2; WO2009011466A1; CA2696458A1

Abstract

【課題】RM2抗体が癌患者組織や血清中において特異的に認識する分子を特定し、当該分子を指標とした、簡便で特異性の高い癌の診断方法を提供すること。
【解決手段】被験者から単離した組織あるいは体液中における、RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖あるいはその断片のレベルを指標として、当該被験者の泌尿生殖器系癌の罹患可能性あるいは悪性度を評価する。
【選択図】なし

Description

本発明は、被験者から単離した組織あるいは体液中における、RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖のレベルを指標とした癌の診断方法に関する。

従来、前立腺癌の早期診断マーカーとしてはPSAが知られている。しかし、PSAは前立腺癌だけでなく良性前立腺疾患においても上昇し、特異性に欠ける。したがって、PSA値4-10 ng/mLの男性の25%しか前立腺生検によって癌の診断を受けないばかりか、最近ではPSA値4 ng/mL以下の男性でも15%に前立腺癌が見つかることも指摘されている。また、PSAは悪性度を反映しないため、PSAのみで前立腺癌の病理学的病期を予測することはできない。そのためPSAの欠点を代償あるいは補填する、新たな診断マーカーが求められている。

現在、前立腺癌と前立腺肥大症との鑑別に利用可能なものとしては、血清蛋白プロファイリング、血清抗-p53抗体、血清caveolin-1、50 KDa蛋白等が、前立腺癌の病気・予後予測に利用可能なものとしては、IGFBP-2と-3、IL-6とIL-6sR、TGF-β1、尿中 MMP and VEGFが、両者に利用可能なものとしては、血清 hK2が報告されている。一方、組織学的マーカーとしては、前立腺に特異的なものとしては上述のPSAやhK2が、前立腺癌特異的なものとしてはDD3が、前立腺癌の殆どで発現しているものとしてはAMACR、Apolipoprotein-Dが報告されている。しかしながら、PSAの他に生検適応の決定や悪性度判定を行うための血清マーカーとして臨床的に実用化されたマーカーは現時点では存在しない。最近、EPCA-2という前立腺癌特異的とされる血清マーカーが報告されたものの、EPCA-2抗体の標的分子は核マトリックス蛋白とされるが同定には至っていない。

こうしたなか、最近注目されているものにRM2がある（非特許文献１）。RM2抗体は、当初腎癌組織より抽出されたジシアロガングリオシド分画から単離された新規ガングリオシドDSGb5 (disialosyl globopentaosylceramide)を標的として確立されたモノクローナル抗体である。しかし、その後の研究過程で、RM2抗体の認識抗原はDSGb5ではなく、これもまた新規糖鎖であるβ1,4-GalNAc-disialyl Lc4（RM2抗原）であることが判明した（非特許文献２及び３）。すなわち、RM2抗体は、薄層クロマトグラフィー上DSGb5と同じ移動度のジシアロガングリオシドを有する腎癌由来のTOS-1細胞株をマウスに免役して作成したが、後日、TOS-1細胞株自身の糖鎖分析により、TOS-1はDSGb5でなく、DSGb5と同じ移動度を有するRM2抗原を発現していることがわかった（非特許文献３）。以上のために、抗体作成時に意図した糖鎖と結果として抗体が認識する糖鎖が異なることになった。

このRM2抗原は、ラクトシリーズI型糖鎖とガングリオシリーズ糖鎖の極めてユニークなハイブリッド構造をしているが、ラクトシリーズI型糖鎖を有する消化器系腫瘍マーカーCA19-9は、上皮、腺に広く分布しており、ガングリオシリーズ糖鎖は神経外胚葉由来の細胞に豊富に存在することが知られている。そのため、発明者らは、腺上皮由来の癌であり、臨床的にneuroendocrine differentiation（神経内分泌学的分化）が観察される前立腺癌におけるRM2抗原の発現を期待し、前立腺全摘術を施行した前立腺癌を調べた。そして、RM2抗体が悪性度を反映して前立腺癌に反応すること、一方で良性腺管に対するRM2抗体の反応性は弱いか陰性であることを見出した（非特許文献４）。前立腺全摘術標本はホルマリン固定標本であり、ガングリオシドのような糖脂質は大部分が溶出してしまうため、RM2抗体が反応しているのは糖蛋白と考えられた。しかしながら、前立腺癌組織や前立腺癌患者血清中においてRM2抗体が反応する糖蛋白上にRM2抗原が発現しているか否かは確認されておらず、RM2抗体によって認識されるマーカーの実体はわかっていなかった。

米国特許出願２００５／０２２１３９７号公報 Saito S., et al.: RM2 antigen (β1,4-GalNAc-disialyl-Lc4) "A Novel Carbohydrate Marker for Prostate Cancer." Biotherapy 20: 418-426, 2006 Saito S, Levery SB, Salyan MEK, et al: Common tetrasaccharide epitope NeuAcalpha2-3Galbeta1-3(NeuAcalpha2-6)GalNAc, presented by different carrier glycosylceramides or O-linked peptides, is recognized by different antibodies and ligands having distinct specificities. J Biol Chem 269: 5644-5652, 1994. Ito A, Levery SB, Saito S, et al: A novel ganglioside isolated from renal cell carcinoma. J Biol Chem 276: 16695-16703, 2001. Saito S, Egawa S, Endoh M, et al: RM2 antigen (beta1,4-GalNAc-disialyl-Lc4) as a new marker for prostate cancer. Int J Cancer 115: 105-113, 2005.

本発明の課題は、RM2抗体が癌患者組織や血清中において特異的に認識する分子を特定し、当該分子を指標とした、簡便で特異性の高い癌の診断方法を提供することにある。

上記課題を解決するために、発明者らは、早期前立腺癌患者と良性前立腺疾患患者のRM2反応レベルを調べた。さらにプロテオミクス解析の手法を用いて、RM2抗体が特異的に反応する分子の同定を試みた。その結果、良性前立腺疾患患者に比較して、早期前立腺癌患者では40kDaの血清糖蛋白質上でRM2反応レベルが有意に増加することを見出した。

そして、この40kDaの糖蛋白質はハプトグロビンβ鎖由来のものであり、癌患者ではその量的変化に加えて、ハプトグロビンβ鎖自体の構造変化を伴う質的変化が生じていることを確認した。また、RM2抗体のハプトグロビンβ鎖に対する反応は、前立腺癌だけでなく、他の泌尿生殖器系癌についても共通に観察されることを確認した。

本発明は、上記知見に基づいて完成されたものであり、被験者から単離した組織、体液あるいは排泄物（喀痰、糞便）中における、RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖あるいはその断片のレベルを指標として、当該被験者の泌尿生殖器系癌の罹患可能性、予後（癌の残存や再発の有無）あるいは悪性度を評価する方法に関する。

本発明の方法において、前記RM2抗体のハプトグロビンβ鎖あるいはその断片への結合は、従来RM2抗原として公知のβ1,4-GalNAc-disialyl Lc4を介したものではない。

本発明の評価の対象となる泌尿生殖器系癌としては、たとえば、前立腺癌、腎癌、尿路上皮癌（膀胱癌、腎盂尿管癌）、精巣癌等を挙げることができる。

用いる検査方法にもよるが、検体である組織あるいは体液としては、簡便さという点で全血あるいは血清が好ましいが、尿路上皮癌の場合には、尿中のハプトグロビンβ鎖を測定する方法も好ましい。

RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖あるいはその断片のレベルは、たとえば、SELDI-TOF-MS、MALDI-TOF-MS等の質量分析法、又はウエスタンブロット、ドットブロット、スロットブロット、ELISA、及びRIA等ならびにこれらの変法（たとえば、サンドイッチ法）の固相免疫法あるいは免疫沈降法といった免疫学的手法によって測定できる。

本明細書では、簡便さと多検体処理という点から、前記測定の好ましい実施形態として、SELDI-TOF-MS、MALDI-TOF-MS、ELISAを利用した方法について詳述する。

本発明の方法は、さらに他の臓器特異的癌マーカーと併せて評価を行なうことにより、特定の癌についてより特異性の高い評価を行なうことができる。たとえば、評価対象とする癌が前立腺癌である場合、前立腺癌特異的なPSAを併用することができる。

本発明はまた、本発明の評価方法に用いられる泌尿生殖器系癌の評価用キットも提供する。前記キットは、その必須構成要素として、１）RM2抗体、２）抗ハプトグロビン抗体を含む。

さらに、前記キットは、他の臓器特異的マーカーや、検出に必要な二次抗体、ラベル体の検出試薬、プロテインチップ、反応用緩衝液、酵素、基質等を含んでいてもよい。

本発明によれば、患者の血清等を用いて、簡便かつ無侵襲に、前立腺癌をはじめとする泌尿生殖器系癌の早期診断や病後予測が可能になる。

１．定義
本発明では、RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖あるいはその断片のレベルを指標として、被験者の泌尿生殖器系癌の罹患可能性、予後あるいは悪性度を評価する。以下、本発明の方法にかかる用語について、説明する。

RM2抗体
本発明にかかる「RM2抗体」とは、腎癌組織から単離された新規ガングリオシドDSGb5 (disialosyl globopentaosylceramide)を標的として確立されたモノクローナル抗体であり、その後の研究過程で新規糖鎖β1,4-GalNAc-disialyl Lc4を特異的に認識することが判明した抗体である。

RM2抗体は、既報（Saito S, et al., J Biol Chem 269: 5644-5652, 1994）に従い、腎細胞癌株TOS1を免疫源として用いることにより作製することができる。

発明者らは、既に、RM2抗体が前立腺癌に反応し、良性前立腺疾患と前立腺癌を鑑別する組織学的マーカーとして利用可能であること、またその反応性は癌の悪性度を反映することを確認している。しかしながら、先に述べた如くRM2抗体の前立腺癌に対する反応は糖鎖としてのRM2抗原を認識することによると考察していたが、RM2抗体が反応する糖蛋白は不明であった。

ハプトグロビンβ鎖
本発明にかかる「ハプトグロビンβ鎖」は、血漿糖蛋白ハプトグロビンを構成するペプチド鎖である。ハプトグロビンは、1938年にPolonovskiによって発見された血漿糖蛋白で、ヘモグロビンと特異的に結合する特性を有している。ハプトグロビンは主に肝臓で産生され（最近、癌からも産生されることが示されている）、α鎖と糖が結合したβ鎖の大小2つのペプチドが2個ずつSS結合して成り立っている。α鎖はα1、α2の2種類、β鎖は1種類で、その組み合わせにより1-1型、2-1型、2-2型の3つの遺伝子型が存在し、それぞれHp1-1（(α1β)₂: 分子量約100,000）、Hp2-1（(α1β)₂ + (α2β)_n: 分子量約200,000以上）、Hp2-2（(α2β)_n: 分子量約400,000以上）の蛋白に対応する。最近では、このハプトグロビンの遺伝型と各種疾患の難易罹患性との関係等が報告されている。

臨床的には、ハプトグロビンは溶血反応に伴うヘモグロビン血症、ヘモグロビン尿症の治療に利用されており、また血中ハプトグロビン値は、急性相反応物質や溶血の有無のチェック及び肝障害の程度、不適合輸血の判定に利用可能である。ハプトグロビンは、卵巣癌、乳癌、急性骨髄性白血病、肝細胞癌、頭頚部癌、肺小細胞癌、腎癌において高発現することが報告されているが、それは単なるハプトグロビンの量的変化であって、質的変化を伴うものではない。

ヒトハプトグロビンは分子量約430,000で、Hpの重合体であるHp2-1型とHp2-2型を主としたものであると考えられている。

RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖
本発明にかかる「RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖（RM2抗体結合性ハプトグロビンβ鎖）」とは、前記したRM2抗体が特異的に認識して結合するハプトグロビンβ鎖であって、RM2抗体の反応性において、健常人にみられる通常のハプトグロビンβ鎖と質的及び量的に区別される。

この「RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖」は、良性前立腺疾患に比較して前立腺癌患者で有意に高レベルで産生され、また他の泌尿生殖器系癌患者においても有意に高レベルで産生される。すなわち、泌尿生殖器系癌患者においては、ハプトグロビンが量的に変化するだけでなく、癌患者血清由来のハプトグロビンβ鎖に対するより選択的なRM2抗体の反応に示されるように質的変化が見られる。

発明者らは、上記したRM2抗体のハプトグロビンβ鎖への結合は、従来RM2抗原として知られているβ1,4-GalNAc-disialyl Lc4を介したものではないことも確認した。現在のところ、RM2抗体のハプトグロビンβ鎖への特異的結合が、他の糖鎖との交差反応によるものか、ハプトグロビンβ鎖自体の構造変化に伴うものなのかは、特定できていない。しかしながら、「RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖」が、泌尿生殖器系癌の特異的マーカーとして利用可能なことは明らかである。

なお、本発明ではRM2抗体が特異的に結合する部分である限り、「RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖」の断片であってもよい。

泌尿生殖器系癌
上述のとおり、本発明で評価対象となる癌は、「泌尿生殖器系癌」であり、たとえば、前立腺癌、腎癌、尿路上皮癌（膀胱癌、腎盂尿管癌）、精巣癌等を挙げることができる。

但し、上記は単に現在発明者らが臨床において実証した範囲であって、他の癌についても、「RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖」をマーカーとして利用しうる可能性を本発明の範囲から除外するものではない。すなわち、ハプトグロビンは卵巣癌、乳癌、急性骨髄性白血病、肝細胞癌、頭頚部癌、肺小細胞癌、腎癌において高発現すること、膵癌、肝細胞癌、胃癌、大腸癌においてはフコシル化されたハプトグロビンβ鎖が増加することが報告されていることから、これらの癌についても同様にRM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖の量的かつ質的変化が認められる可能性もある。

２．RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖を指標とした癌の評価方法
２．１試料の調製
本発明の評価方法は、被験者から採取した組織、末梢血（血清）、尿、組織抽出液等の体液、排泄物（喀痰、糞便）を用いて非侵襲的に行われる。

検体が血液の場合は、遠心を行うことにより不溶性の血球成分等を沈降した後血清を採取し、その後の検出方法に応じて適宜調製される。

ELISA／RIA（あるいはこれらの変法）用試料は、血清を緩衝液で適宜希釈したものを用いる。ウエスタンブロット用（電気泳動用）試料は、血清をカラム（例としてAurum^TM Serum Protein Mini Kit (Bio-Rad)）に通してアルブミンやIgGを除去後、緩衝液で適宜希釈して、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用の２−メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液（シグマ社製等）と混合したものを用いる。ドット／スロットブロット用試料は、血清を緩衝液で適宜希釈したものを用いる。

SELDI-TOF-MSやMALDI-TOF-MS用試料は、サンプル調製を血清：Urea buffer（変性条件）あるいはPBS（非変性条件）=1 : 9でミックスした後、Binding/Washing bufferで10倍希釈し、上清を使用する。SELDI-TOF-MSでは、RM2抗体をコーティングしたプロテインチップを用いることで、また、MALDI-TOF-MSの場合には、血清をあらかじめRM2抗体で免疫沈降した試料を用いることで、バックグランドノイズを大幅に低下させることができ、目的とするピークはウエスタンで示した如く明瞭に検出が可能である。

２．２ RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖の測定
抗ハプトグロビンポリクローナル抗体及びRM2抗体それぞれによるウエスタンブロッティングの結果から、RM2抗体は癌由来のハプトグロビンβ鎖により選択的に反応するという性質が明らかにされた。これは、すなわちRM2抗体が、癌由来と良性由来のハプトグロビンβ鎖の質的違いを認識することを示している。したがって、このRM2抗体の特異性を利用することにより、高感度で特異度の高い癌の診断が可能になると考えられる。

指標とするRM2抗体結合性ハプトグロビンβ鎖のレベルは、RM2抗体と抗ハプトグロビン抗体を用いた免疫学的手法、あるいはRM2抗体を用いた質量分析法により検出することができる。ここで「レベル」とはRM2抗体結合性ハプトグロビンβ鎖の量に限定されず、これを間接的に示す力価（抗体価等）であってもよい。なお、抗ハプトグロビン抗体は糖鎖に対するものであってもよいが、その場合はRM2とは認識部位が重複しないものを用いる必要がある。なお、抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、市販のものを用いてもよい。

質量分析法としては、たとえばSELDI-TOF-MS、MALDI-TOF-MS等を好適に利用できる。また免疫学的手法としては、ウエスタンブロット、ドットブロット、スロットブロット、ELISA、及びRIA（サンドイッチ法などこれらの変法を含む）等の固相免疫法あるいは免疫沈降法を利用することができる。

以下、限定するものではないが、簡便さと多検体処理が可能という点で好ましい実施態様について例示する。
（１）質量分析法
SELDI-TOF-MS
SELDI（Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization：表面増強レーザー脱離イオン化）は、チップ（プロテインチップ）表面に工程した化学官能基や分子を利用して、サンプル中に存在する特定の分子をチップ上に補足・精製した後、レーザー照射することで補足分子の脱離、イオン化を行なう手法である。このイオン化された分子を飛行時間型質量分析法（TOF-MS）を用いて分析するのが、SELDI-TOF-MSである。

具体的には、プロテインチップにRM2抗体をコーティングして、サンプルをインキュベートした後、チップを洗浄する。つぎに、サンプルの載ったチップにレーザーを照射し、質量分析を行う。ハプトグロビンβ鎖の分子量は既知（40kDa）であるため、サンプルとしての良性前立腺疾患と前立腺癌の血清のパターンを比較すればどのピークが求める「RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖」であるかが容易にわかる。

この結果を、さらに抗ハプトグロビンポリクローナル抗体をコーティングした場合のデータと比較すれば、RM2抗体のコーティングの方が癌ではより強いピークが出るのに対して、良性前立腺疾患ではポリクローナル抗体のコーティングと同じか弱いピークが出るため、診断がより簡便になる。

SELDI-TOF-MSは、多数のサンプルを同時処理できるというメリットがあるため、簡便さ、時間、経費のいずれについても優れた方法といえる。

MALDI-TOF-MS
MALDI（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization：マトリックス支援レーザー脱離イオン化）は、サンプルとマトリックスの混合結晶を調製し、それにレーザー光を照射する事でイオン化を行う方法である。このイオン化された分子を飛行時間型質量分析法（TOF-MS）を用いて分析するのが、MALDI-TOF-MSである。レーザー源として、窒素レーザー（波長337nm）やYAGレーザー（波長355nm）が一般的に用いられるため、マトリックスにはこの波長領域に吸収帯を持つ物質が使用される。MALDI-TOF-MSによる検出は、あらかじめ試料（血清）をRM2抗体で免疫沈降した後、前述のSELDI-TOF-MSにしたがって実施できる。

（２）免疫学的手法
ELISA−サイズ分画を利用したELISA法
血清をナノセップ遠心濾過デバイスでサイズ分画を行い、40kDa付近の分子量を溶出する。ついで、溶出液を２分して、市販のELISAプレートに吸着させる。各々のwellに対して抗ハプトグロビンポリクローナル抗体及びRM2抗体で反応させ、反応強度を比較することにより、RM2抗体結合性ハプトグロビンβ鎖を検出することができる。

サンドイッチ法を用いる場合であれば、RM2抗体をコーティングしたELISAプレートにサイズ分画した血清を加えてインキュベートし、洗浄後、抗ハプトグロビンポリクローナル抗体と反応させることで、前立腺癌と良性前立腺疾患とを鑑別できる。

上記の方法では、RM2抗体及び抗ハプトグロビン抗体をあらかじめ標識することにより検出を行う。前記標識の種類として好ましいものは、酵素（アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）又はビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（又は標識ストレプトアビジン）としては、予め標識された抗体（又はストレプトアビジン）が、各種市販されている。これら標識された酵素の活性を検出することにより、RM2抗体結合性ハプトグロビンβ鎖のレベルが測定される。アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合、これら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。

発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法を利用すれば、目視で検出できる。ELISA法では、市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度又は蛍光強度（測定波長は基質により異なる）を測定することが好ましい。

一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては、Ｘ線フィルム又はイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。また、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。さらに、ELISA法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。

なお、RIAの場合は、上記したサイズ分画の後、¹²⁵Ｉ等の放射性同位元素で標識された抗体を用いて、ガンマーカウンター等を用いて測定を行う。

免疫沈降法
免疫沈降法による検出の場合、例えば、被験者から単離した血清をサイズ分画した後、標識したRM2抗体及び/又は抗ハプトグロビン抗体を加えて放置し、遠心分離等によってRM2抗体及び/又は抗ハプトグロビン抗体とハプトグロビンβ鎖の複合体を沈殿として回収する。回収された沈殿について、用いた標識の蛍光あるいは放射活性を測定することにより、RM2結合性ハプトグロビンβ鎖の検出を行なう。

２．３判定・評価
被験者から単離したサンプル中からRM2抗体結合性ハプトグロビンβ鎖あるいはその断片が健常人に比較して有意に高いレベル（たとえば、p<0.05）で検出された場合、当該被験者は泌尿生殖器系癌の罹患可能性が高いと判定・評価できる。また、同一被験者について、そのレベルの変化をみることにより、癌の悪性度（進行）や予後（癌の残存や再発の有無）を評価することができる。

RM2レベルの評価方法
ウエスタンブロッティングでは半定量的な測定法を施行した。すなわちRM2抗体の75kDa蛋白に対する反応が、前立腺癌と良性前立腺疾患との間で殆ど変化がないため、RM2抗体のハプトグロビンβ鎖に対する反応をRM2抗体の75kDa蛋白に対する反応で標準化したところ（Scion imageで測定）、ROC（receiver operating characteristics）曲線上、感度-（１-特異度）の最大値となる値が0.59であった。したがって、これ以上の値を有する場合に感度、特異度ともに高く前立腺癌の診断を行うことができる。したがって、SELDI-TOF-MS、MALDI-TOF-MSやELISA assayでも同様に、評価することが可能である。

さらに、癌由来のハプトグロビンβ鎖を標準物質として単離する技術を確立することにより、PSAと同様に質量測定を行うことができ、具体的な数値として表すことが可能である。

悪性度評価
まだ多数の症例数ではないが、悪性度の低い移行帯領域由来の前立腺癌は有意にハプトグロビンβ鎖/75kDa蛋白の値が低いため、悪性度判定にも用いられる可能性がある。

後述する実施例２に、尿路上皮癌患者血清に対するRM2反応を記載したが、筋層に浸潤した尿路上皮癌の血清におけるハプトグロビンβ鎖のレベルが、筋層に浸潤していない表在癌より有意に高かった。したがって、RM2が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖は尿路上皮癌の悪性度や進行度評価にも役立つと考えられる。また、付記において精巣癌においても進行度の進んだ多発性の肺転移例に著明なレベル増加が認められていることからも、癌種による可能性もあるが、種々の癌の悪性度や進行度評価にも役立つ可能性がある。

３．臓器特異的マーカーとの併用
前述したとおり、RM2が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖の高発現は、癌（とくに泌尿生殖器係癌）に特異的ではあるが、前立腺等の特定の臓器に特異的なものではない。そこで、目的とする癌の特異的診断のためには、臓器特異的な他のマーカーと組み合わせることにより、ある特定の癌については、より正確な診断が可能となる。

たとえば前立腺癌の場合、従来から前立腺癌マーカーとして汎用されているPSAを本発明の方法と併用することにより前立腺癌特異的な診断が可能となる。また、精巣癌の場合であれば、触診や画像に加え従来からマーカーとして汎用されているα-fetoprotein, human chorionic gonadotropin-βによる診断方法が確立しているため、これらのマーカーの補助的役割として有用な可能性がある。

しかしながら現在、前立腺癌におけるPSAのような臓器特異的マーカーは、他系癌では存在しない。それでもなお、超音波やCTなどの画像診断で容易に消化管以外の癌の診断を行うことができるため、RM2で規定されるハプトグロビンβ鎖は癌のスクリーニングとして優れた検査法になりうる。

例えば腎癌や尿路上皮癌はCTなどの画像で容易に診断可能である。泌尿器系癌だけでなく、肺癌、肝臓癌、膵癌、乳癌（マンモグラフィー）なども画像検査で診断可能である。しかしながら、早期癌を見いだすのにX線の被爆を頻回受けるようでは二次発癌の可能性や経済性からも安易に勧めることはできないが、RM2が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖を用いることで、必要な患者にだけ被爆を伴う画像検査を適応させることができる。さらに、早期前立腺癌にRM2が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖が検出されたことは、他系癌においても同様に早期癌を発見する優れた手段になりうる。

４．癌の評価用キット
本発明はまた、泌尿生殖器系癌の評価用キットを提供する。本発明のキットは、必須の構成要素としてRM2抗体及び抗ハプトグロビン抗体を含む。

前記抗ハプトグロビン抗体は、目的とするRM2結合性ヒトハプトグロビンβ鎖あるいはその断片が検出可能であれば特に限定されず、ポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよい。また、ヒト由来ハプトグロビンβ鎖に対するものであることが好ましいが、他の種に由来するハプトグロビンβ鎖に対するものであっても、目的とするRM2結合性ヒトハプトグロビンβ鎖あるいはその断片が検出可能であればよい。また、抗ハプトグロビン抗体は糖鎖に対するものであってもよいが、その場合はRM2とは認識部位が重複しないものを用いる必要がある。なお、抗体はモノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、市販のものを用いてもよい。

前記したRM2抗体や抗ハプトグロビン抗体は、適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよい。また、前記RM2抗体や抗ハプトグロビン抗体は、目的とする検出方法に応じて、適当な支持体に固相化されていてもよいし、あるいは固相化可能なように支持体がキットに含まれていてもよい。そのような支持体としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド等の蛋白を付着可能な合成樹脂、ガラス、ニトロセルロース、セルロース、及びアガロース製の支持体、あるいはゲル型支持体を使用することができる。支持体の形態は特に限定されないが、極小球あるいはビーズ（例えば“ラテックス”ビーズ）などの微粒子、微量遠心チューブなどのチューブ（内壁）、マイクロタイタープレート（ウェル）等の形態で提供される。

他の臓器特異的癌マーカーと併用する場合には、これらのマーカーもキットに含まれていてもよい。

本発明のキットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、二次抗体、ラベル体の検出のための試薬、プロテインチップ、反応用緩衝液、酵素、基質等、本発明の実施に必要な他の要素を含んでいてもよい。

実施例１：モノクローナル抗体RM2が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖の前立腺癌患者血清中における増加
１．対象と方法
（1）血清サンプル
前立腺生検により診断された前立腺癌あるいは良性前立腺疾患の患者血清、及びその他の泌尿生殖器系癌の患者血清は、東北大学病院泌尿器科より得られた。臨床病期(TNM)は、1997年版を用い、すべてのスライドのGleason scoreは一人の病理医によって診断された。
（2）細胞株
PC3, LNCaP, DU145はヒューマンサイエンス研究資源銀行より得た。正常ヒト前立腺上皮細胞のPrECは、Cambrex Bioscienceより購入した。
（3）抗体
モノクローナル抗体RM2は、既報に従い、腎細胞癌株TOS1を免疫源として用いることにより以下のようにして確立した（Saito S, et al., J Biol Chem 269: 5644-5652, 1994.）。ハプトグロビンに対するポリクローナル抗体はDako社から購入した。

[RM2抗体の取得方法]
1) ガングリオシドに対するモノクローナル抗体スクリーニング用抗原の調製
ハイブリドーマのスクリーニングに用いる糖鎖抗原の抽出は、以下に示す方法で調製した。複数患者より採取した腎癌細胞組織に対して、癌組織容量の19容量のクロロフォルム／メタノール混合溶液（2:1）、クロロフォルム／メタノール混合溶液（1:1）、イソプロパノール／ヘキサン／水混合溶液（55:25:20）でそれぞれ抽出し、それらを混合後、ロータリーエバポレーターで濃縮乾固した。抽出物を元の癌組織容量の10倍容量のクロロフォルム／メタノール混合溶液（2:1）に溶解し、これに1/6容量の水を加えてFolch分配した。次いで理論的上相（theoretical upper phase）を回収し、これに元の（回収前の）容量になるまでクロロフォルム／メタノール／0.1％ NaCl水溶液混合溶液（1:10:10）を加え、Folch分配を3回行った。上相をあわせ、エバポレーターで10mLまで濃縮後、蒸留水に対して4℃、3日間透析を行った。透析した液をロータリーエバポレーターで濃縮後、凍結乾燥を行った。得られた凍結乾燥物を少量のクロロフォルム／メタノール／水混合溶液（30:60:8）に溶解し、同溶媒で平衡化したDEAE-Sephadex A-25にかけた。ガングリオシド画分はクロロフォルム／メタノール／0.5M酢酸ナトリウム水溶液混合溶液（30:60:8）で溶出し、蒸留水に対して4℃、3日間透析を行った後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を少量のクロロフォルム／メタノール（2:1）に溶解し、高分解能薄層クロマトグラフィープレート（Merck社）に載せ、クロロフォルム／メタノール／0.05％CaCl₂水溶液の混合溶液（50:40:10）で展開した。展開後、0.01％プリムリン（Aldrich社）を含む80％アセトン水溶液及びUV照射によりガングリオシド画分を検出した。構造中にシアル酸をそれぞれ１つおよび2つ含むガングリオシド（モノシアロガングリオシド画分、ジシアロガングリオシド画分）の位置を確認後、UV照射下、それぞれのガングリオシド画分を含む薄層クロマトグラフィープレート上のシリカゲルを剃刀で別々に削りだし試験管に移した。これにイソプロパノール／ヘキサン／水混合溶液（55:25:20）を加え、超音波をかけてガングリオシドを抽出した。この操作を計3回行い、抽出液を合わせて濃縮、凍結乾燥し、使用時まで乾燥状態で冷蔵保存した。

2）動物免疫及びハイブリドーマの調製
腎細胞癌株TOS1（1〜2x10^７細胞）をPBSに懸濁し、本懸濁液をBALB/Cマウスの腹腔内に注射した。同一量の懸濁液を同様に14日後に追加免疫、35日目に最終免疫を実施し、3日後にマウスの脾臓を摘出し、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株NS1とを定法に従い細胞融合を実施しハイブリドーマを得た。

3) RM2抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマのスクリーニングは、ハイブリドーマ培養上清のRM2抗原への反応性をELISA法で評価することにより実施した。具体的には前述の方法にて調製したモノシアロガングリオシド画分、ジシアロガングリオシド画分をそれぞれ別のELISAプレートに1ウエル当り10ng加え固定化し、ハイブリドーマの培養上清を反応させた。抗原との反応性をELISA法にて評価した。酵素標識抗マウスイムノグロブリン抗体で反応性を検出し、モノシアロガングリオシド画分には反応せずジシアロガングリオシド画分にのみ反応が確認されたハイブリドーマの繰り返し限界希釈を実施しモノクローナル化した。

（4）血清のウエスタンブロッティング
Bio-Rad社のAurum Serum Protein Mini Kitを用いてIgG及びアルブミンを除去した後、20μLの血清を10%SDS-PAGE上で電気泳動し、Hybond P PVDF膜に移した。血清中の分子量40kDa (GPX)の糖蛋白に対するRM2反応の濃度測定はScion imageを用いて施行し、40kDa (GPX)の糖蛋白の測定値は、同一レーン上の分子量75kDaの測定値に対して標準化した。

（5）アジレントカラムによる血清の前処理と二次元電気泳動
アジレント社の複数分子吸着除去システムカラムは、ヒト血清中に存在する６種類の豊富な蛋白（アルブミン、免疫グロブリンのIgG及びIgA、トランスフェリン、ハプトグロビン、アンチトリプシン）の98-99%を吸着するが、そのカラムと蛋白の吸着ならびに溶出用のA及びB液をアジレント社より購入した。二次元電気泳動、アルキル化、ウエスタンブロッティング、ゲル消化は以前に記載したように施行した。

（6）蛋白の同定
トリプシン消化物は、アジレント社の質量分析計が組み込まれた110 capillary HPLC (high performance liquid chromatography)を用いて分析した。データはTurboSEQUESTを用いてNCBIのヒト配列データベースを探索した。

（7）ハプトグロビンβ鎖のmRNAレベル
Total RNAをPC3、LNCaP、DU145、PrECよりTrizol試薬を用いて抽出した。Total RNAをExScript逆転写キットを用いてfirst strand cDNAに逆転写した。PCRをハプトグロビンβ鎖及びβアクチンに対するプライマーを用いて施行した。

（8）抗ハプトグロビンポリクローナル抗体による前立腺癌組織の免疫染色
ハプトグロビンβ鎖に対する特異的抗体は存在しないため、抗ヒトハプトグロビンポリクローナル抗体を用いた。以前述べた前立腺全摘術標本のうちの２０例を抗ハプトグロビンポリクローナル抗体により免疫染色した。

（9）統計解析
統計解析はSAS研究所のソフトウエアを用いて行った。

２．結果
２．１前立腺癌及び良性前立腺疾患の血清に対するRM2反応
43名の良性前立腺疾患患者と比較して62名の早期前立腺癌患者の大部分で、分子量40kDaの血清糖蛋白（GPXと名付ける）上でRM2反応が増加していた（図1a, 1b, 4b右）。IgMを陰性コントロールとして用いた場合、血清蛋白上に反応は認められなかった（データは示していない）。これらの患者はすべて生検による組織診断を受けており、PSA値は10 ng/mL未満であった。2つのグループ間で年齢とPSAに有意差はなかった。Scion imageにより計算したGPXに対するRM2反応は、内部コントロールとして用いた75kDaに対するRM2反応に対して標準化した。前立腺癌におけるGPXに対するRM2反応レベル (0.96 ± 0.43)は、良性前立腺疾患における反応レベル(0.35 ± 0.32)よりも有意に高かった (p < 0.0001)（図1c）。

受信者動作特性（receiver operating characteristic: ROC）分析を施行したところ、GPXに対するRM2反応のROC曲線下面積（area under the ROC curve: AUC）は0.8874と高かった。GPXに対するRM2反応のカットオフレベルを0.59にセットすると、前立腺癌検出におけるGPXに対するRM2反応は、感度87%、特異度84%であった（図1d）。

単回帰分析によりGPXに対するRM2反応レベルの予測変数を探索したところ、GPXに対するRM2反応レベルは62名の治療前の変数とは関連していなかった（表 2a）。それは前立腺全摘術を受けた24名の術後変数のなかで主要な癌の発生部位と有意に関連していた（表2b）。すなわち、transition zone由来の癌は、peripheral zone由来の癌に比べてRM2反応レベルが低かった。

15名について、前立腺全摘術前後のGPXに対するRM2反応を調べた。これら患者は、術前PSAレベルは様々であるが、術後のPSAレベルで再発なしと考えられている0.1 ng/mL未満に低下した症例である（表1c）。GPXに対するRM2反応レベルは、その程度は様々であるが、15例中13例で低下した（図2a, 2b）。前立腺全摘術後におけるRM2反応レベルの低下は有意であった（術前vs 術後、0.92 ± 0.52 vs 0.60 ± 0.43, p=0.006）（図2b）。他の泌尿生殖器系癌の血清に対するRM2反応のプロフィールは、前立腺癌の血清に対するプロフィールと殆ど同じであり（実施例２参照）、GPXに対するRM2反応レベル0.59以上は、腎癌8例中7例で、精巣腫瘍8例中2例で認められた。尿路上皮癌については37例について施行したが、表在癌か浸潤癌/進行癌かによりRM2反応レベルに有意な違いが観察された（実施例２参照）。すなわち、GPXに対するRM2反応は前立腺癌に特異的なものではなく、他の泌尿生殖器系癌でも認められるものであった。

２．２ GPXの同定
GPXの分子学的パラメーターを解析し、その分子の同定を行なった。まず、GPXをアジレントカラムで分離した後、二次元電気泳動、ゲル消化、HPLC、イオン化質量分析を行った。その結果、GPXはハプトグロビンβ鎖であることが明らかになった（図3）。

二次元電気泳動においては、癌患者血清（specimen II-c、図3a）と良性患者血清（specimen II-b、図3a）との間で、近接する4スポット（スポット1, 2, 3,4と名付ける）からなる一つの分画に明らかな違いが認められた。良性患者血清と癌患者血清との間の違いは、二次元電気泳動をRM2によるウエスタンブロッティングを施行するとさらに著明になった。すなわち、RM2によりブロットされたスポットは、前立腺癌血清検体II-cに対して強いが、良性血清検体II-bに対しては陰性であった。検体II-cより近接する４スポットを切り出し、トリプシンによるゲル消化を行った後、蛋白同定のためLC-MS/MSで分析した。GPXのスポット2をトリプシン消化したペプチドの基準ピーククロマトグラムの例を、図3bに示した。TurboSEQUESTによるデータ探索の結果は、図3cに表示した。この結果は、GPXがヒトハプトグロビン2前駆体であることを示している。9つのトリプシン消化ペプチド（これらの配列は図3c下部にfile nameを右に辿ってsequenceとして示されているが、合計10のうち2つは同じ配列なので9つ）が見いだされたが、これらはヒトハプトグロビン前駆体の25%をカバーしていた。しかしながら、ヒトハプトグロビン前駆体（PubMed Entry P00738, gi: 123508）はシグナルペプチド（1-18残基）、アルファ鎖（19-160残基）、β鎖（162-406残基）からなる。全てのトリプシン消化ペプチドはβ鎖由来であった。ハプトグロビンβ鎖のペプチドカバー率は、スポット2は38.8%であった。他のスポットも同様であり、GPXがハプトグロビンβ鎖であることを同定した。スポット1, 3, 4のカバー率は、それぞれ35.5%, 20.0%, 35.5%であった。図3dは質量荷電比680における二重荷電前駆体イオンのMS/MSスペクトラムが、SC(PAM)AVAEYGVYVK（配列番号１）であることを示している。図3eは質量荷電比710におけるMS/MSスペクトラムが、DIAPTLTLYVGKK（配列番号２）であることを示している。図3d及び図3eにおけるアミノ酸配列は、ハプトグロビン前駆体の、380-391残基及び216-228残基に相当する。

２．３前立腺癌由来ハプトグロビンβ鎖に対するRM2の選択的反応性
RM2による血清に対する反応プロフィールは、抗ハプトグロビンポリクローナル抗体によるそれと非常に似ていた（図4a, 4b）。この知見は、上述したプロテオミクス解析の結果を支持するものである。さらに、RM2は良性由来よりむしろ癌由来のハプトグロビンβ鎖に対して選択的な反応を示した（図4a, 4b, 図3a）。ハプトグロビンβ鎖mRNAのレベル増加は、ヒト正常前立腺上皮のPrECに比較した場合、LNCaP、PC3、DU145においても観察された（図4c）。また、良性腺管や間質と比較して、前立腺癌細胞において抗ハプトグロビンポリクローナル抗体による反応増加が、観察された（図4d）。これらの結果は、ハプトグロビンβ鎖が前立腺癌患者と良性前立腺疾患患者との間で量的にも質的にも異なることを示唆している。

３．考察
モノクローナル抗体RM2は、そもそもジシアロガングリオシドに対して確立され、後日糖鎖抗原（β1, 4-GalNAc-disialyl Lc4）を認識することが判明した。本研究において、われわれはRM2が、ハプトグロビンβ鎖にも反応することを見いだした。さらに、RM2は前立腺癌患者血清由来のハプトグロビンβ鎖により選択的に反応した。ハプトグロビンβ鎖の量的な変化に加えて質的な変化が前立腺癌と良性前立腺疾患との間におけるRM2反応の有意な違いの根拠であることが示唆される。

本研究の知見に基づいて血清ハプトグロビンβ鎖の糖鎖の状況を調べた。その結果、ハプトグロビンβ鎖は４つのN結合型糖鎖の他、わずかながらO結合型糖鎖を有していること、前立腺癌と良性前立腺疾患との間でハプトグロビンβ鎖の糖鎖に違いがあることを見いだした。

しかしながら、RM2により認識される糖鎖抗原（RM2抗原：β1, 4-GalNAc-disialyl Lc4）は、ハプトグロビンβ鎖のN結合型糖鎖上には検出されなかった。

このことから、RM2の前立腺癌由来血清ハプトグロビンβ鎖に対する選択的な反応性は、第一に、モノクローナル抗体RM2はβ1, 4-GalNAc-disialyl Lc4以外の糖鎖に交差反応すること、第二に、RM2は糖鎖付加により惹起しうるハプトグロビンβ鎖の構造変化に反応する可能性が考えられる。さらに第三として、最近明らかにされつつある、モノクローナル抗体の多面的反応性という現象、すなわち、モノクローナル抗体がその目的として作成された分子とは構造的に全く関係のない大きく複雑な分子に結合するという可能性が考えられる。例えば、GD3のようなジシアロガングリオシドを認識するモノクローナル抗体は、アクチン、サイログロブリン、ssDNA、dsDNAにも反応する。特にIgMアイソタイプのモノクローナル抗体はしばしば多面的反応性を示す。RM2抗体はIgMクラスであり、ハプトグロビンβ鎖に対するRM2の反応性は多面的反応性で説明できる可能性もある。

いずれにしても、RM2抗体によって規定されるハプトグロビンβ鎖のレベルが前立腺癌で有意に上昇することが判明した。そして、RM2反応性の上昇は、他の泌尿器系癌でも同様に観察された。

よって、早期前立腺癌検出の目的に対して、RM2抗体は臓器特異的マーカーであるPSAの補助的なマーカーとして有用といえる。

本研究ではハプトグロビンのレベルはRT-PCRや組織免疫染色によって、正常前立腺上皮細胞と比較して前立腺癌で量的に増加し、前立腺癌と良性前立腺疾患との間におけるハプトグロビンβ鎖の質的な違いが、ウエスタンブロッティングにより示唆された。ハプトグロビンの質的な違いは、頭頚部癌でも示唆された。すなわち、癌患者血清由来のハプトグロビンは免疫抑制を示すのに対して、正常血清のそれは免疫抑制を示さなかった。

すなわち、ハプトグロビンβ鎖の量的ならびに質的な変化は、前立腺癌を含む泌尿生殖器癌の早期診断あるいは病後予測の有用な指標となりうることが確認された。そして、他のあらゆる癌についても、その早期診断、病後予測のためのマーカーとして利用可能なことが示唆された。

実施例２：尿路上皮癌患者血清に対するRM2抗体の反応
１．対象と方法
血清サンプルは尿路上皮癌37例（膀胱癌26例、腎盂尿管癌11例、すべて男性）より得られた。平均年齢は65.2 ± 10.9歳であった。RM2による血清との反応及び定量的測定は、実施例１と同様に施行した。

２．結果
表在癌（浸潤が粘膜下層までの癌, n=18）か浸潤癌（筋層浸潤, n=16）あるいは進行癌（手術不能な局所浸潤あるいは転移を有する尿路上皮癌,n=3）かで、ハプトグロビンβ鎖に対するRM2反応に有意な違いがみられた（図５）。すなわち、浸潤癌/進行癌において明らかにRM2反応が上昇していた（RM2反応（75kDa蛋白に対するRM2反応により標準化した値）：表在癌0.31 ± 0.33, 浸潤/進行癌0.96 ± 0.49, p < 0.0001）（図６）。

３．考察
これまで、尿路上皮癌に有用な血清マーカーは存在しなかったため、RM2が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖は非特異的癌マーカーではあるが、尿路上皮癌の進行を客観的に評価できることを示した。また、筋層へ浸潤する癌は通常尿路上皮癌のGrade 3に相当するため、浸潤癌はすなわち高悪性度の癌であることを意味する。このことは、尿路上皮癌患者に対してより適切な治療法を施行する上で役立つ可能性を示している。さらに、手術後の癌の残存や再発を非侵襲的に見いだす手段としても有用である可能性があるため、術後補助化学療法の適応や、再発を早期にチェックする上で役立つことが期待される。

実施例３：RM2抗体で規定されるハプトグロビンβ鎖レベルによる前立腺全摘術後の前立腺癌非再発率の違い
１．定義
PSA再発とは前立腺癌に対し前立腺全摘術等の治療により血清PSA濃度が正常域に低減された後に、再度血清PSA値が規定濃度を超えた場合に用いられる。「PSA再発」は、CTやMRIなどの画像では検出できない前立腺癌再発のごく初期の段階であり、別名「生化学的再発」ともいわれる。PSA再発を放置しておくといずれ「臨床再発」とよばれる、画像で検出することのできる局所（前立腺摘出部）の腫瘤形成や骨転移へ進行する。

２．対象及び方法
ハプトグロビンβ鎖に対するRM2反応レベルを調査した62例の前立腺癌患者のうち、前立腺全摘術を施行した24例について、RM2反応レベルの違いによりPSA再発率に差がないかを調べた。本研究ではPSA再発を0.1ng/mLを超えた時、術後に0.1ng/mL以下にならないときは手術時と定義した。

なお、前立腺癌におけるRM2反応レベルは、実施例１の１−（４）に記載の方法により数値化した。

３．結果
結果を図７に示した。縦軸にPSA非再発率、横軸は観察期間（単位；月）を表す。前立腺癌におけるRM2反応レベルの平均値は、0.96であったため、それ以上（＞0.96）及び以下（＜0.96）に分類し、Kaplan-Meier curveによりPSA非再発率を算定したところ、＞0.96症例（11例）は＜0.96症例（13例）に比較してPSA非再発率が低く、Log-rank testでp=0.0527と殆ど有意に近い差が観察された。これらの結果から、RM2により規定されるハプトグロビンβ鎖は、そのレベルにより前立腺全摘術後のPSA再発予測因子となることが示された。すなわち、RM2が規定する血清ハプトグロビンβ鎖レベルは早期前立腺癌の悪性度を反映することが示唆された。

実施例４：前立腺癌細胞株におけるRM2が認識ガングリオシドβ1, 4-GalNAc-disialyl Lc4の発現確認
１．材料及び方法
糖脂質の抽出に使用した株化された前立腺癌細胞はPC3、LNCaP、AICaP1（東北大学泌尿器科学教室で新たに樹立されたアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株）及び腎癌細胞株（TOS1；東北大学泌尿器科学教室で以前に樹立された腎癌細胞株）を用いた。糖脂質の抽出法は以下のように実施した。3x10⁷の各細胞株（約200mgに相当）を遠心分離により集め、これに2mLのイソプロパノール／ヘキサン／水混合溶液（55:25:20, v/v/v）を加え、抽出操作を２回行った。抽出液を合わせ窒素パージにより濃縮乾固した。次いで乾固物中のリン脂質は2mLの0.1M濃度のNaOHを含むメタノール溶液に溶解し、40℃で2時間保持することで加水分解を行い、その後200μLの1N-塩酸で中和した。生成した脂肪酸は繰り返しヘキサン抽出（2mL／抽出）することにより除去した。下相中の糖脂質はSepPak C18カートリッジ（ミリポア社）により脱塩・精製した。回収した総糖脂質は凍結乾燥し、クロロフォルム／メタノール混液（2:1）に再溶解し、各細胞株15mg相当量をTLC（Merck）にスポットし、クロロフォルム／メタノール／0.5％CaCl₂水溶液の混合溶液（50:40:10）で展開した。TLCのプレートは風乾後、0.5％濃度のポリイソブチルメタクリレートを溶解したヘキサン／クロロフォルム（9:1）に１分間浸漬し、3％牛血清アルブミンを含むPBS溶液に室温１時間浸漬しブロッキングを行った。TLCをPBSで軽く洗浄した後、１次抗体としてRM2抗体を２時間反応させた後、２次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスIgM抗体（Zymed社）を１時間反応させ、コニカイムノステインHRP1000（コニカ社）を用いて検出した。

２．結果
結果を図８に示した。TLCには各前立腺癌細胞PC3、LNCaP、AICaP1、各15mg相当から抽出した糖脂質をスポットし、RM2抗体を用いた免疫染色による検出を行ったが、β1, 4-GalNAc-disialyl Lc4(GalNAcDSLc4)発現が確認されているTOS1（陽性コントロール）のみにRM2抗体との反応性が認められ、何れの前立腺癌細胞株において発色バンドは認められなかった。従って、これら前立腺癌細胞中ではRM2抗体の認識ガングリオシドであるβ1, 4-GalNAc-disialyl Lc4は発現していないか、検出限界以下の僅かな量であると考えられた。また、データは示していないが、これら前立腺癌細胞株ならびにTOS1の何れの培養上清中においてもβ1, 4-GalNAc-disialyl Lc4は検出されなかった。

実施例５：ヘモグロビンカラム処理によるRM2反応性の変化
実施例１でRM2反応性タンパク質がイオン化質量分析の結果ハプトグロビンβ鎖である事を示した。本実験では、ハプトグロビンはヘモグロビンに吸着する性質を利用して、前立腺癌細胞株DU145の細胞抽出液のヘモグロビンカラム処理を行い、処理前後の試料を電気泳動にかけ、ウエスタンブロットにより、RM2反応性のタンパク質の挙動を調べることで、RM2反応性のタンパク質がハプトグロビンであることを検証した。

１．材料及び方法
(1) ヘモグロビンカラムの調製
弱陰イオン交換樹脂（DEAE樹脂）で精製されたヒトヘモグロビンはシグマ社より購入した。CNBr活性化Sepharose（GEヘルスケアバイオサイエンス）5g（乾燥重量）を膨潤させた後、1mM HCl溶液にて３回洗浄した。次いでゲルを固定化溶液（0.5M NaClを含む0.1M NaHCO₃溶液（pH8））で洗浄し、同溶液に再懸濁（約25mL）し脱気を行った。これに予め固定化溶液に対して透析した2mLのヘモグロビン溶液（濃度25mg/mL）を加え室温で1時間反応させた。反応後、ゲルは前述の固定化溶液で3回洗浄（計200mL）した。未反応の活性基は0.1M Tris-HCl緩衝液（pH8.0）で2時間反応させ、ブロッキングを行った。ヘモグロビンの固定化率は98％であった。ヘモグロビン固定化ゲル懸濁液は脱気後、カラム（1.5cm IDx20cm）に充填し、PBS溶液（0.15M NaCl、20mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄pH7.2）、と0.15M NaCl溶液（pH11）の洗浄のサイクルを2回行った後、PBS溶液で平衡化した。

(2) カラム操作
100μLのDU145細胞抽出液を前述のヘモグロビン固定化担体充填カラムにかけ、溶離液としてPBSを流し、UV280nmをモニターしながら素通り画分を回収した（レーン２。インキュベーション無し）。同様に100μLのDU145細胞抽出液をヘモグロビン固定化担体と4℃で24時間バッチ反応させた後、空カラムに充填し5分静置後、同様にＰＢＳを流し素通り画分を回収した（レーン３）。ヘモグロビン固定化カラムをＰＢＳで洗浄し、次いで0.15M NaCl溶液（pH11）で吸着画分を溶出させた（レーン４）。それぞれ回収した分画は脱塩後、真空乾燥にて濃縮し、50μLのサンプルブッファーに溶解し、煮沸処理5分を行った後、SDS-PAGEにかけ、RM2抗体を用いて、定法に従ってウエスタンブロット分析をおこなった。なお、陽性コントロールとして未処理の細胞抽出液を用いた（レーン１）。

２．結果
結果を図９に示した。レーン１は未処理のDU145細胞抽出液、レーン２はDU145細胞抽出液のインキュベーションをしないヘモグロビンカラムの素通り分画、レーン３はDU145細胞抽出液の24時間インキュベーション後のヘモグロビンカラムの素通り分画、レーン４はインキュベート後のカラムのPBS溶出分画である。コントロールに対しレーン２では、ハプトグロビンβ鎖（40kDa）並びにα鎖との複合体（50kDa）の分子量に相当するバンドの強度が弱い。またレーン３に示す通り、24時間反応させたサンプルでは、さらにバンド強度が弱くなっておりハプトグロビンβ鎖（40kDa）並びにα鎖との複合体（50kDa）と考えられる分画に対するRM2との反応性がほとんど消失する（レーン３）。一方、24時間反応後のハプトグロビン固定化担体カラムをPBSにて溶出することにより回収された分画には、RM2との反応性が認められた。（レーン４）。これら結果は、DU145細胞に存在するRM2反応性抗原がハプトグロビンであることを強く示唆する。また図８に示したように、株化された前立腺癌細胞（PC3、LNCaP、AICaP1及び腎癌細株TOS1から抽出したガングリオシド画分のTLCによる免疫染色分析では、陽性コントロールのTOS1以外はRM2抗体との反応性が認められず、またRM2抗体の認識構造であるβ1, 4-GalNAc-disialyl Lc4は、前述の前立腺癌細胞株ならびにTOS1のどちらの培養上清中においても検出されなかった。これらの結果から、RM2が認識するガングリオシドが癌細胞より血清に放出されてハプトグロビンβ鎖に結合して、それをRM2が認識するという可能性は否定されると考えられる。前立腺癌細胞に対するRM2反応の殆どはハプトグロビンβ鎖に付加した糖鎖構造あるいは糖鎖付加により生じたハプトグロビンβ鎖の構造変化に依存することを示していると考えられる。

実施例６．血清中のハプトグロビンβ酵素処理によるRM2反応性の変化
１．材料及び方法
PSAの値が2.1〜4.8ng/mLの前立腺癌患者及び前立腺肥大患者の血清をSDS-PAGEにかけ、定法に従ってタンパク質をPVDF膜に転写した。転写した膜（3枚準備）は室温にて2時間1％牛血清アルブミン溶液を用いブロッキングし、次いで0.05％Tween 20を含むPBS溶液で洗浄した。洗浄後膜を、プラスチック製の袋に移し、一つは2Uのジャック豆由来のβ−ヘキソサミニダーゼ（Sigma社）を加え37℃一晩反応させた。もう一つは25mUのニューカッスル病ウイルス由来のシアリダーゼ（Glyko社）を加え37℃一晩反応させた。さらにもう一つはジャック豆由来のβ−ヘキソサミニダーゼ処理（37℃一晩）に続いて25mUのニューカッスル病ウイルス由来のシアリダーゼ（Glyko社）を加え37℃一晩反応させた。コントロール膜（未処理）は酵素を含まない溶液に反応させ上記と同様に処理した。いずれの膜も0.05％Tween 20を含むPBS溶液で洗浄した後、RM2抗体を用いて、定法に従ってウエスタンブロット分析をおこなった。

２．結果
結果を図１０に示した。図中１〜４が前立腺癌患者血清、５〜８が前立腺肥大患者の血清である。ａは未処理、ｂはジャック豆由来のβ−ヘキソサミニダーゼ処理、ｃはβ−ヘキソサミニダーゼに続いてニューカッスル病ウイルス由来のシアリダーゼ処理を行ったものである。それぞれ単独処理ではRM2反応は低下しないが（パネルｂ、シアリダーゼ単独処理もｂと同様のため図には示さず）、ジャック豆由来のβ−ヘキソサミニダーゼに続いてニューカッスル病ウイルス由来のシアリダーゼ処理により40kDa（ハプトグロビンβ鎖）に対するRM2反応はほぼ消失する。これにより、ハプトグロビンβ鎖に対するRM2反応はハプトグロビンβ鎖上への糖鎖付加が関与していることが示された。

実施例７．RM2抗体を用いたELISA試験
１．材料と方法
１）ELISAプレート調製及び操作手順
PBSにてヤギ抗マウスIgM抗体（KPL社）を5μg/mLの濃度に希釈し、ELISA用96穴マイクロプレート（ファルコン社製）に100μL分注し4℃で一晩吸着させた。0.05％Tween 20 PBS溶液で2回洗浄した後、5μg/mLのRM2抗体を含むPBS溶液を各ウエル当り100μL加え37℃で１時間反応させた。0.05％Tween 20 PBS溶液で2回洗浄後、1％BSAを含むPBS溶液を各ウエル当り200μLを加え、ブロッキングを行った。続いて0.05％Tween 20 PBS溶液で2回洗浄した後、PBSで希釈した検体100μL（検体8μL＋PBS 92μL）を加え、37℃で１時間反応させた。0.05％Tween 20 PBS溶液で5回洗浄し、0.1％BSAを含むPBS溶液で1000倍希釈したウサギ抗ハプトグロブリンポリクローナル抗体（Dako社）100μLを加え、37℃で1時間反応させた。0.05％Tween 20 PBS溶液で5回洗浄した後、1000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体（Santa cruz社）100μLを37℃で1時間反応させた。西洋ワサビペルオキシダーゼの基質ＴＭＢ溶液（Sigma社T8665）を各ウエル当り100μLを加えて、室温で5分反応させた後、100μLの反応停止液（0.5M-H₂SO₄）を加えた後、450nmの吸光値を測定した。

２．結果
結果を図１１に示した。前立腺癌患者血清12例、良性前立腺疾患患者12例についてELISAを施行したところ、良性前立腺疾患患者12例測定値の平均±標準偏差は0.58±0.48であるの対し、前立腺癌患者血清12例の平均値±標準偏差は1.1±0.64と高値を示し（P=0.0352）、反応性に明らかな有意差が認められた。

実施例８．尿路上皮癌患者尿サンプルのRM2抗体を用いたウエスタンブロット分析
１．材料と方法
（１）尿サンプルのウエスタンブロット
尿路上皮癌患者（内訳；膀胱癌ｎ＝３、腎盂癌＋膀胱癌ｎ＝２）及び健常人（ｎ＝２）の尿、40μLに10μLの5Xサンプルバッファー（125mM Tris-HCl、25％グリセロール、5％ SDS、0. 5％ブロモフェノールブルー、5％ 2−メルカプトエタノール pH6.5）を加え、5分間煮沸後、20-30μLを10％ SDS−ポリアクリルアミド電気泳動をかけ、15Vで45分間、エレクトロブロット法により、ゲル中のタンパク質をHybond P PVD膜に転写した。TBST溶液（50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％ Tween 20 pH7.6）にて室温10分間洗浄し、続いて1％BSAを含むTBST溶液で37℃30分ブロッキングを行った。膜をプラスチックバッグに入れTBST溶液で希釈したRM2抗体（最終濃度10μg/mL）を加え4℃で一晩反応させた。膜はTBST溶液にて10分間、計3回洗浄した。4000倍希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウスIgM抗体（Zymed社）を37℃30分間反応させた後、TBST溶液にて10分間、計3回洗浄した。RM2抗体と反応した蛋白質は、ECLPlusキット（GEヘルスケアバイオサイエンス社）を用いて化学発光させ、VersaDoc3000（Bio-Rad社）を用いて画像化した。

２．結果
RM2抗体を用いたウエスタンブロット分析の結果を図１２に示した。図中、１−３は膀胱癌、４、５は腎盂癌＋膀胱癌、６、７は健常人である。尿路上皮癌5例中3例で、約75kDaのバンドがRM2抗体で陽性に検出された。健常人2名はRM2抗体に対する反応が全く見られなかった。

本発明は、前立腺癌等の泌尿生殖器系癌の早期診断や病後予測、あるいはその治療薬の開発など、医療製薬分野において広く利用可能である。

前立腺癌血清中のGPXに対するRM2反応性の増加：モノクローナル抗体RM2による血清ウエスタンブロッティング（PCa: prostate cancer（前立腺癌）、BPD: benign prostatic disease（良性前立腺疾患）。矢印（→）はサイズマーカーやGPXの位置を示す。各パネルにおいて各症例のPSA値は下端に示す。）前立腺癌血清中のGPXに対するRM2反応性の増加：モノクローナル抗体RM2による血清ウエスタンブロッティング（以下、図１aと同じ）前立腺癌血清中のGPXに対するRM2反応性の増加：良性前立腺疾患と前立腺癌患者間におけるGPXに対するRM2反応性の比較（大きなバー：標準偏差、小さなバー：平均の標準誤差）前立腺癌血清中のGPXに対するRM2反応性の増加：GPXに対するRM2反応性のROC curve（ROC curve下の面積は0.8874であった。感度-（１-特異度）の差が最大値となるのは、感度87.1%においてであった。）前立腺全摘術後のGPXに対するRM2反応性の変化：前立腺全摘術前後の血清に対するRM2反応性の例（各症例における術前のPSAレベルは下端に示した。5例全例ともグリーソンスコアは7であり、病理学的T病期は5番（3a）を除いて2bであった。b: before radical prostatectomy（前立腺全摘術前） a: after radical prostatectomy（前立腺全摘術後） M: サイズマーカー）前立腺全摘術後のGPXに対するRM2反応性の変化： 15症例における前立腺全摘術後のGPXに対するRM2反応性の変化（RP: radical prostatectomy（前立腺全摘術）） GPXがハプトグロビンβ鎖であることを確認した結果：上の左右二次元電気泳動により分離された蛋白成分：クマシーブリリアントブルーによる染色、良性前立腺疾患血清及び前立腺癌患者血清からのアジレントカラムに吸着した分画（分画II）を二次元電気泳動にて比較した。左：検体II-c（癌患者血清検体cの分画II）、右：検体II-b（良性疾患患者血清検体bの分画II）。水平方向：等電点電気泳動、垂直方向：SDS-PAGE、左右ともに点線で囲まれた領域はGPX。検体II-c（悪性）は、検体II-b（良性）よりも、CBB染色濃度が高い。各々の検体においてGPXは異なる等電点電気泳動を有する４つの近接するスポット（1, 2, 3, 4）に分離する。下の左右は上の左右と同じだが、モノクローナル抗体RM2で染色。検体II-cではRM2により染色されるバンドが明らかに観察されるが、検体II-bには観察されない。 GPXがハプトグロビンβ鎖であることを確認した結果：図３aにおけるスポット2をゲル内でトリプシン消化したペプチドを抽出後の液体クロマトグラフ−質量分析装置によるクロマトグラム（横軸：液体クロマトグラフの保持時間、縦軸：全イオンクロマトグラムの一番目の質量分析） GPXがハプトグロビンβ鎖であることを確認した結果：ハプトグロビンの同定 GPXがハプトグロビンβ鎖であることを確認した結果：質量荷電比680における二重荷電前駆体イオンのタンデム質量分析スペクトラム GPXがハプトグロビンβ鎖であることを確認した結果：質量荷電比710における二重荷電前駆体イオンのタンデム質量分析スペクトラム前立腺癌由来のハプトグロビンβ鎖に対するRM2の選択的反応及び前立腺癌細胞におけるハプトグロビンの増加：抗ハプトグロビンポリクローナル抗体及びRM2による、良性前立腺疾患ならびに前立腺癌の血清に対する反応の例（左のパネル：抗ハプトグロビンポリクローナル抗体による血清への反応、右のパネル：RM2による血清への反応、左右のパネルともに同じ患者を比較している。各症例におけるPSAレベルは下端に示している。Hpt: ハプトグロビン、Ab: antibody（抗体）前立腺癌由来のハプトグロビンβ鎖に対するRM2の選択的反応及び前立腺癌細胞におけるハプトグロビンの増加：抗ハプトグロビンポリクローナル抗体及びRM2による、良性前立腺疾患ならびに前立腺癌の血清に対する反応の例（以下、図４aと同じ）前立腺癌におけるハプトグロビンの発現レベル（上のパネル：前立腺癌細胞株におけるmRNAレベル、下のパネル：抗ハプトグロビンポリクローナル抗体による前立腺癌の組織免疫染色、左：グリーソンパターン3、右：グリーソンパターン 4）膀胱癌患者血清に対するRM2反応例（superficial cancer: 表在癌、muscle invasive / advanced cancer:筋層浸潤/進行癌）表在癌と浸潤癌/進行癌との間の血清ハプトグロビンβ鎖に対するRM2反応の比較 RM2が規定する血清ハプトグロビンβ鎖のレベル別のPSA非再発率：縦軸にPSA非再発率、横軸は観察期間（単位；月）を表す。RM2が規定する血清ハプトグロビンβ鎖のレベルが高いグループ（＞0.96）は、前立腺全摘術後のPSA非再発率が低い。前立腺癌細胞株におけるRM2が認識ガングリオシドβ1, 4-GalNAc-disialyl Lc4(GalNAcDSLc4)の発現検討：レーン１：PC3、レーン２：LNCaP、レーン３：AICaP1（東北大学泌尿器科学教室で新たに樹立したアンドロゲン非依存性前立腺癌細胞株）、レーン４：TOS1（東北大学泌尿器科学教室で以前に樹立した腎癌細胞株、β1, 4-GalNAc-disialyl Lc4の陽性コントロールとして使用）。ヘモグロビンカラム処理によるU145細胞抽出タンパク質に対するRM2反応性の変化：レーン１：未処理のDU145細胞抽出液、レーン２：DU145細胞抽出液のインキュベーションをしないヘモグロビンカラムの素通り分画、レーン３：DU145細胞抽出液の24時間インキュベーション後のヘモグロビンカラムの素通り分画、レーン４：３の後にカラム洗浄して溶出された分画（カラムに吸着されていた糖蛋白が溶出）。矢印はそれぞれハプトグロビン−β鎖（40kDa）並びにα鎖との複合体（50kDa）の分子量。糖分解酵素処理による血清タンパク質に対するRM2反応性の変化：図中１〜４は前立腺癌患者血清、５〜８は良性前立腺疾患患者の血清である。ａは未処理、ｂはジャック豆由来のβ−ヘキソサミニダーゼ処理、ｃはβ−ヘキソサミニダーゼに続いてニューカッスル病ウイルス由来のシアリダーゼ処理。 ELISA測定の結果：図中、横軸のBPDは良性前立腺疾患患者血清、PCは前立腺癌患者血清、縦軸のValuesは450nmでの吸光値。良性前立腺疾患患者12例測定値の平均±標準偏差は0.58±0.48であるの対し、前立腺癌患者血清12例測定値の平均±標準偏差は1.1±0.64。（Ｐ値=0.0352）尿路上皮癌患者尿サンプルのRM2抗体を用いたウエスタンブロット分析の結果：図中、１−３は膀胱癌、４、５は腎盂癌＋膀胱癌、６、７は健常人である。尿路上皮癌5例中3例で、約75kDaのバンドがRM2抗体で陽性に検出された。健常人2名はRM2抗体に対する反応が全く見られない。

Claims

被験者から単離した組織、体液、又は排泄物中における、RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖あるいはその断片のレベルを指標として、当該被験者の泌尿生殖器系癌の罹患可能性、予後あるいは悪性度を評価する方法。
RM2抗体のハプトグロビンβ鎖あるいはその断片への結合が、糖鎖のβ1,4-GalNAc-disialyl Lc4を介したものではない、請求項１記載の方法。
前記泌尿生殖器系癌が、前立腺癌、腎癌、尿路上皮癌、及び精巣癌から選ばれるものである、請求項１又は２記載の方法。
前記泌尿生殖器系癌が前立腺癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
被験者から単離した血清を用いることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖あるいはその断片のレベルが、SELDI-TOF-MS、及びMALDI-TOF-MSを含む質量分析法、又はウエスタンブロット、ドットブロット、スロットブロット、ELISA、RIA及びこれらの変法を含む固相免疫法あるいは免疫沈降法から選ばれる免疫学的手法を用いて行なわれる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
RM2抗体が特異的に結合するハプトグロビンβ鎖あるいはその断片のレベルが、SELDI-TOF-MS、MALDI-TOF-MS又はELISAを用いて行なわれる、請求項６に記載の方法。
さらに他の臓器特異的癌マーカーと併せて評価を行なうことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
評価対象とする癌が前立腺癌であり、前記臓器特異的マーカーがPSAである、請求項８に記載の方法。
以下を含む、泌尿生殖器系癌の評価用キット。
１）RM2抗体
２）抗ハプトグロビン抗体