JP2009042141A - 細胞の物性値測定方法及び物性測定装置 - Google Patents

Abstract

【課題】非等方的形状の細胞についても、その電気的特性を示す物性値を非破壊的に測定できる細胞の物性値測定方法及び物性値測定装置を提供する。
【解決手段】先ず、測定対象の細胞の形状をモデル化し、その細胞にＡＣ電場が印可されたときの複素誘電率応答を数値解析により求める（ステップＳ１）。その結果に基づいて、膜キャパシタンスＣ_ｍ及び細胞質導電率κ_ｉの値を変化させながら数値計算して、誘電スペクトルを算出する（ステップＳ２）。算出した誘電スペクトルを誘電緩和式に回帰させて、比誘電率上昇Δε及び緩和時間τを求める（ステップＳ３）。次に、（Δε，τ）の（Ｃ_ｍ，κ_ｉ）への依存性を求め、測定対象の細胞の形状に応じた回帰式を作成する（ステップＳ４）。細胞の誘電スペクトルを実測し、その値と回帰式とを比較することで、測定対象の細胞の膜キャパシタンスＣ_{ｍ，ｅｘｐ}及び細胞質導電率κ_{ｉ，ｅｘｐ}を求める（ステップＳ５）。
【選択図】図１

Description

本発明は、細胞の物性値を測定する方法及び装置に関する。より詳しくは、誘電分光法を利用して細胞の電気的特性を測定する技術に関する。

一般に、細胞は、その種類及び状態等によって、導電率、誘電率及び透電率等の電気的特性を示す物性値が異なることが知られている。例えば、細胞外液及び細胞内液の導電率（以下、細胞質導電率という）は、水分が少ない皮膚細胞よりも、筋細胞及び神経細胞の方が高い値を示す。また、周波数を掃引して細胞の誘電率を測定すると、細胞の形態に応じて誘電緩和特性が変化する。そこで、このような特性を利用することにより、細胞の定性及び定量分析、識別、更には疾患の有無の確認等が可能となる。そして、従来、フローサイトメトリーによって細胞等を分離する際の識別方法として、細胞の誘電特性の差を利用する技術も提案されている（例えば、特許文献１及び２参照。）。

一方、細胞は電場下で界面分極（Ｍａｘｗｅｌｌ−Ｗａｇｎｅｒ分極）を引き起こすことから、細胞を含む溶液について誘電分光測定を行うと、複素誘電率の周波数分散が得られる。そして、得られた誘電スペクトルにＭａｘｗｅｌｌ−Ｗａｇｎｅｒ式等の緩和式を適用すれば、細胞質導電率κ_ｉ及び膜キャパシタンスＣ_ｍ等の細胞の電気的特性を示す物性値が求められる。このように、誘電分光法を利用して血球等の細胞の電気的特性を測定することにより、その状態を非破壊的に知ることができる。
特表２００３−５０７７３９号公報 特表２００５−５１２０４２号公報

しかしながら、前述した従来の技術には、以下に示す問題点がある。即ち、界面分極は細胞の形状に大きく影響を受けるが、従来解析に用いられているＭａｘｗｅｌｌ−Ｗａｇｎｅｒ式は、球状又は楕円体形状の細胞でしか成立しないという問題点がある。図１０は円盤状赤血球（Discocyte）を示すＳＥＭ（Scanning Electron Microscope：走査型電子顕微鏡，倍率：１５０００倍）写真であり、図１１は突出形赤血球（Echinocyte）を示すＳＥＭ写真（倍率：１５０００倍）である。図１０に示すように正常形の赤血球は中心にくぼみがある円盤状である。また、血球の形状は身体の状態や疾病等により敏感に変化するため、図１１に示すような突出形の赤血球もある。このように、細胞には種々の形状のものが存在しているが、誘電分光法を利用した方法は球状及び楕円体形状以外の形状の細胞には適用することができず、従来、これら非等方的形状の細胞について、非破壊的にその細胞質導電率κ_ｉ及び膜キャパシタンスＣ_ｍ等の電気的特性を示す物性値を知ることはできなかった。

そこで、本発明は、非等方的形状の細胞についても、その電気的特性を示す物性値を非破壊的に測定できる細胞の物性値測定方法及び物性測定装置を提供することを主目的とする。

本発明に係る細胞の物性値測定方法は、任意の膜キャパシタンスＣ_ｍ及び細胞質導電率κ_ｉを設定して数値解析することにより、特定形状の細胞について誘電スペクトルを算出する工程と、前記誘電スペクトルを誘電緩和式に回帰させて、前記細胞の比誘電率上昇Δε及び緩和時間τを求める工程と、前記比誘電率上昇Δε及び緩和時間τに基づいて、前記細胞の形状に応じた回帰式を作成する工程とを有する。
この細胞の物性値測定方法では、前述した各工程に加えて、更に、前記細胞の誘電スペクトルを測定し、その結果と前記回帰式とを比較することにより、前記細胞の膜キャパシタンスＣ_{ｍ，ｅｘｐ}及び細胞質導電率κ_{ｉ，ｅｘｐ}を求める工程を有していてもよい。
また、細胞の形状毎に前記回帰式を作成し、その細胞の形状に応じた回帰式を適用して膜キャパシタンスＣ_{ｍ，ｅｘｐ}及び細胞質導電率κ_{ｉ，ｅｘｐ}を求めることもできる。
更に、前記細胞は、例えば非等方的形状であってもよい。
一方、本発明に係る細胞の物性測定装置は、任意の膜キャパシタンスＣ_ｍ及び細胞質導電率κ_ｉを設定して数値解析することにより、特定形状の細胞について誘電スペクトルを算出する手段と、前記誘電スペクトルを誘電緩和式に回帰させて、前記細胞の比誘電率上昇Δε及び緩和時間τを求める手段と、前記比誘電率上昇Δε及び緩和時間τに基づいて、前記細胞の形状に応じた回帰式を作成する手段と、を有する。

本発明によれば、実測した誘電スペクトルと、シミュレーションにより作成した回帰式とを比較することで、測定対象の細胞の膜キャパシタンスＣ_{ｍ，ｅｘｐ}及び細胞質導電率κ_{ｉ，ｅｘｐ}を決定しているため、従来の緩和式には適合しない非等方的形状の細胞についても、非破壊的にその細胞質導電率κ_ｉ及び膜キャパシタンスＣ_ｍ等の電気的特性を示す物性値を求めることができる。

以下、本発明を実施するための最良の形態について、添付の図面を参照して詳細に説明する。図１は本発明の実施形態に係る細胞の物性値測定方法をその工程順に示すフローチャート図である。図１に示すように、本実施形態の細胞の物性値測定方法（以下、単に測定方法ともいう）においては、先ず、正常形赤血球及び突出形赤血球等のように非等方形状の細胞について、その形状のモデルを用いて、薄膜によって外相と内相とが区切られた比等方的三次元形状にＡＣ電場が印加された時の複素誘電率応答を数値解析的に求める（ステップＳ１）。その際の計算方法は特に限定されるものではないが、例えば、三次元有限差分法等を利用することができる。

次に、ステップＳ１で求めた複素誘電率応答に基づき、膜キャパシタンスＣ_ｍ及び細胞質導電率κ_ｉをそれぞれ独立に変化させながら数値計算を行い、各形状の細胞の誘電スペクトルを算出する（ステップＳ２）。

次に、ステップＳ２により得られた各誘電スペクトルから、比誘電率上昇Δε及び緩和時間τの２つのパラメータを算出する（ステップＳ３）。各細胞の誘電スペクトルは、単純な緩和式では完全には表すことができないが、下記数式１に示すＣｏｌｅ−Ｃｏｌｅ型緩和式に回帰させることにより、誘電緩和特性を示す３つの値、即ち、比誘電率上昇Δε、緩和時間τ、及び緩和の広がりを示すＣｏｌｅ−Ｃｏｌｅパラメータβに変換することができる。そこで、本実施形態においては、計算により求めた各誘電スペクトルの実部（ε’）を、下記数式１に示すＣｏｌｅ−Ｃｏｌｅ型緩和式でフィッティングすることにより、比誘電率上昇Δε及び緩和時間τを求める。なお、下記数式１におけるωは角周波数、ε_０は真空の誘電率、κ_ｌは低周波極限での溶液の導電率、ε_∞は高周波極限での比誘電率であり、ｉ^２＝−１である。

次に、ステップＳ３で算出した比誘電率上昇Δε及び緩和時間τに基づいて、細胞の形状毎に比誘電率上昇Δε及び緩和時間τの（Ｃ_ｍ，κ_ｉ）への依存性を求め、回帰式を作成する（ステップＳ４）。誘電スペクトルから求められる各係数は、細胞の形状の影響を大きく受けるが、細胞の分極の本質は界面分極であるため、比誘電率上昇Δε及び緩和時間τの（Ｃ_ｍ，κ_ｉ）への依存性は、Ｍａｘｗｅｌｌ−Ｗａｇｎｅｒ式と同様の関数形を成すと考えられる。そこで、本発明の測定方法では、下記数式２及び数式３に示す関係を設定し、ステップＳ３の結果に対して定数ａ、ｂ、ｃ及びｄを重回帰分析することにより、比誘電率上昇Δε及び緩和時間τの（Ｃ_ｍ，κ_ｉ）への依存性を求めた。なお、下記数式２におけるＰはステップＳ１で使用した各形状のモデルから求めた細胞の体積分率である。

このように、予め、細胞の形状毎に複素誘電率の周波数分散を数値解析的に求め、その結果を誘電緩和式に回帰させることにより、比誘電率上昇Δε及び緩和時間τの（Ｃ_ｍ，κ_ｉ）への依存性についての回帰式を作成しているため、従来の緩和式には適合しない非等方的形状の細胞についても、非破壊的にその細胞質導電率κ_ｉ及び膜キャパシタンスＣ_ｍ等の電気的特性を示す物性値を、迅速かつ簡便に測定することができる。

また、本実施形態の測定方法により、細胞の細胞質導電率κ_ｉ及び膜キャパシタンスＣ_ｍを求める場合は、先ず、測定対象の細胞を生理食塩水中等に分散させたものについて、インピーダンスアナライザー等により周波数を掃引して複素誘電率を測定する。次に、得られた誘電スペクトルの実数部（ε’）を上記数式１に示すＣｏｌｅ−Ｃｏｌｅ型緩和式でフィッティングして、比誘電率上昇Δε_ｅｘｐ及び緩和時間τ_ｅｘｐを求める。そして、（Δε_ｅｘｐ，τ_ｅｘｐ）とステップＳ４で作成した回帰式（ｆ（Ｃ_ｍ，κ_ｉ），ｇ（Ｃ_ｍ，κ_ｉ））とを比較することにより、測定対象の細胞の膜キャパシタンスＣ_{ｍ，ｅｘｐ}及び細胞質導電率κ_{ｉ，ｅｘｐ}を決定する（ステップＳ５）。

上述の如く、本実施形態の測定方法においては、実測した誘電スペクトルと、シミュレーションにより作成した回帰式とを比較することで、測定対象の細胞の膜キャパシタンスＣ_{ｍ，ｅｘｐ}及び細胞質導電率κ_{ｉ，ｅｘｐ}を決定しているため、従来の緩和式を適用できない非等方的形状の細胞についても、その電気的特性を示す物性値を非破壊的に測定することができる。また、細胞質導電率等の未知量を予測して無数の計算を行うことにより得られる誘電スペクトルのうちで、実測した誘電スペクトルに最も合致するものを選ぶことにより、測定試料の想定数を導く従来の方法に比べて、測定に要する手間及び時間を大幅に短縮することができる。

更に、本実施形態の測定方法により決定された細胞の物性値は、膜タンパクの脱離及び細胞質の異常等の情報に変換して、疾病等の診断に供することが可能である。更にまた、例えば血球カウンターにおいては、計数のみならず、血球の状態まで高速に同時計測することができるようになると共に、異常細胞の割合等の統計的な検討も可能となる。

なお、上述した実施形態においては、細胞質導電率κ_ｉ及び膜キャパシタンスＣ_ｍを求める場合を例に説明しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、細胞の物性値としては、前述した細胞質導電率κ_ｉ及び膜キャパシタンスＣ_ｍ以外に、例えば膜導電率及び細胞質誘電率等も測定することが可能である。

また、本実施形態の測定方法は、例えば、上述した各工程を実行する装置を使用することにより実施することができる。本実施形態において使用される細胞の物性値測定装置としては、少なくとも、任意の膜キャパシタンスＣ_ｍ及び細胞質導電率κ_ｉを設定して数値解析することにより、特定形状の細胞について誘電スペクトルを算出する手段と、誘電スペクトルを誘電緩和式に回帰させて、細胞の比誘電率上昇Δε及び緩和時間τを求める手段と、比誘電率上昇Δε及び緩和時間τに基づいて、細胞の形状に応じた回帰式を作成する手段とを備える構成であればよい。

以下、本発明の実施例について、本発明の範囲から外れる比較例と比較して、その効果について具体的に説明する。なお、本発明は、以下に示す実施例に限定されるものではない。本実施例においては、図１に示す細胞の物性測定方法により、各種形状の赤血球の細胞質導電率κ_ｉ及び膜キャパシタンスＣ_ｍを測定した。

先ず、ウサギ保存血液（コージンバイオ社製）に遠心処理を施し、赤血球のみを抽出した。そして、抽出した赤血球を、ｐＨ５．３になるように濃度を調整した生理用食塩水に分散させて球状赤血球（Spherocyte）の試料（Ｎｏ．１）を、ｐＨ８．５になるように濃度を調整した生理用食塩水に分散させて円盤状赤血球（Discocyte）の試料（Ｎｏ．２）を、ｐＨが７．７になるように濃度を調整した生理用食塩水に分散させて突出形赤血球（Echinocyte）の試料（Ｎｏ．３）をそれぞれ調整した。なお、球状血球を得るためには、浸透圧差を利用して試料を調整するのが一般的であるが、本実施例においては、血球の形状を均一にするために、上述した手法により試料の調整を行った。また、各試料について顕微鏡観察を行ったところ、全ての試料において、測定対象となる形状の赤血球の割合が全赤血球数に対して数分率で９０％以上となっていた。更に、本実施例においては、参考のためにＰＢＳ（リン酸緩衝生食水）中に正常形ヒト血球（Normocyte）を分散させた試料（Ｎｏ．４）も調整した。

次に、上述の方法で調整した各試料について、インピーダンスアラナイザ（アジレント・テクノロジー社製 ４２９４Ａ）により、１０ｋＨｚ〜１１０ＭＨｚの範囲で、電極分極を抑えながら誘電率を測定した。そして、球形赤血球の試料（Ｎｏ．１）については、既知の値、即ち、外水相の比誘電率ε_ａ＝７８．３、導電率κ_ａ＝１．６７Ｓ／ｍ、細胞膜導電率κ_ｍ＝１×１０^−７Ｓ／ｍを使用し、測定により得られた誘電スペクトルに薄殻Ｍａｘｅｌｌ−Ｗａｇｎｅｒ式を適用することにより、体積分率Ｐ、細胞膜の単位面積あたりの膜キャパシタンスＣ_ｍ（＝ε_ｍ・ε_０／ｄ_ｍ；但し、ｄ_ｍは膜の厚さ、ε_ｍは膜の比誘電率、ε_０は真空の誘電率である。）、赤血球内水相の誘電率ε_ｉ、及び導電率κ_ｉを求めた。

一方、円盤状赤血球（Discocyte）及び突出形赤血球（Echinocyte）については、体積分率Ｐは楕円体モデル及び球体モデルを使用して算出し、複素誘電率は三次元有限差分法を用いたシミュレーションにより求めた。なお、光学顕微鏡により円盤状赤血球（Discocyte）の長軸長さを測定したところ、７．９μｍ程度で、ヒトのＲＢＣ（赤血球）の形状とほぼ同じであった。そこで、円盤状赤血球（Discocyte）のシミュレーションでは、ヒトのＲＢＣの数式を参考にした。また、突出形赤血球（Echinocyte）は、突起数も様々で、種々の形状のものが存在しているが、本実施例では光学顕微鏡による観察結果を基にシミュレーションを行った。図２は円盤状赤血球（Discocyte）のシミュレーションモデルを示す図であり、図３は突出形赤血球（Echinocyte）のシミュレーションモデルを示す図である。

希薄性の仮定が成り立つ場合、正常形では、主軸と電場の方向が直行又は平行する場合について解き、それらを確率密度の重みをつけて平均化することにより、複素誘電率を求めることができる。そこで、希薄性の仮定が成り立つように、計算は体積分率Ｐが小さいところ（Ｐ≦０．０４％）で行い、計算結果（ε’ε”）は下記数式４及び数式５に示すようにＰで規格化した。なお、下記数式５におけるκ_ｌは低周波極限での導電率である。

次に、膜キャパシタンスＣ_ｍ及び細胞質導電率κ_ｉをそれぞれ独立に変化させながら、円盤状赤血球（Discocyte）及び突出形赤血球（Echinocyte）について計２５の条件で形状に関する数値計算を行い、それぞれについて誘電スペクトルを算出した。その後、計算によって得られた誘電スペクトルを簡便に特徴付けるため、それぞれの時粒を上記数式１に示すＣｏｌｅ−Ｃｏｌｅ型緩和式でフィッティングし、比誘電率上昇Δε及び緩和時間τを算出した。そして、各２５条件についての計算結果を重回帰分析し、上記数式２及び数式３における定数ａ、ｂ、ｃ及びｄを決定した。その結果、円盤状赤血球（Discocyte）では、ａ＝１．１０×１０^６ｍ^２／Ｆ、ｂ＝２．８６×１０^−２ｍ／Ｓ、ｃ＝４．５２×１０^−６ｍ、ｄ＝１．１９×１０^−６ｍ^２／Ｓという値が得られた。また、突出形赤血球（Echinocyte）では、ａ＝２．０８×１０^６ｍ^２／Ｆ、ｂ＝５．２６×１０^−３ｍ／Ｓ、ｃ＝１．０２×１０^−５ｍ、ｄ＝２．１６×１０^−６ｍ^２／Ｓという値が得られた。図４（ａ）及び（ｂ）は計算により得られた円盤状赤血球（Discocyte）の回帰曲面を示す図であり、図４（ａ）は比誘電率上昇Δεについての３Ｄ曲面であり、図４（ｂ）は緩和時間τについての３Ｄ曲面である。また、図５（ａ）及び（ｂ）は計算により得られた突出形赤血球（Echinocyte）の回帰曲面を示す図であり、図５（ａ）は比誘電率上昇Δεについての３Ｄ曲面であり、図５（ｂ）は緩和時間τについての３Ｄ曲面である。

次に、細胞質導電率κ_ｉ及び膜キャパシタンスＣ_ｍが未知のＮｏ．２及びＮｏ．３の試料の誘電スペクトル（実測値）も同様に、その複素誘電率の実部（ε’）を上記数式１に示すＣｏｌｅ−Ｃｏｌｅ型緩和式でフィッティングし、緩和パラメータ（Δε_ｅｘｐ，τ_ｅｘｐ）を算出した。そして、図４及び図５に示す回帰曲面と、Δε＝Δε_ｅｘｐ及びτ＝τ_ｅｘｐが共有する曲線とをそれぞれ求めた。図６は横軸に細胞質導電率κ_ｉをとり、縦軸に膜キャパシタンスＣ_ｍをとって、円盤状赤血球（Discocyte）について計算により求めた値と実測値との関係を示すグラフ図であり、図７は横軸に細胞質導電率κ_ｉをとり、縦軸に膜キャパシタンスＣ_ｍをとって、突出形赤血球（Echinocyte）について計算により求めた値と実測値との関係を示すグラフ図である。なお、図６には、正常形ヒト血球（Normocyte）の値も併せて示す。そして、図６及び図７に示す２つの曲線の交点から測定試料（Ｎｏ．２及びＮｏ．３）の膜キャパシタンスＣ_{ｍ，ｅｘｐ}及び細胞質導電率κ_{ｉ，ｅｘｐ}を決定した。以上の工程により決定したＮｏ．１〜Ｎｏ．４の試料の膜キャパシタンスＣ_{ｍ，ｅｘｐ}及び細胞質導電率κ_{ｉ，ｅｘｐ}の値を下記表１にまとめて示す。

更に、決定した値が、実測した誘電分散を再現するか確認するため、図６及び図７から求めた値を用いて、再度有限差分法により円盤状赤血球（Discocyte）及び突出形赤血球（Echinocyte）の誘電分散を計算した。図８は横軸に周波数をとり、縦軸に複素誘電率（ε’，ε”）をとって、円盤状赤血球（Discocyte）の誘電分散を示すグラフ図であり、図９は横軸に周波数をとり、縦軸に複素誘電率（ε’，ε”）をとって、突出形赤血球（Echinocyte）の誘電分散を示すグラフ図である。図８及び図９に示すように、円盤状赤血球（Discocyte）及び突出形赤血球（Echinocyte）のいずれも計算結果も実測値が再現されていた。特に、円盤状赤血球（Discocyte）の計算結果は、実測値が一般に適用されているＣｏｌｅ−Ｃｏｌｅ式では表せない「いびつ」なスペクトルであったにもかかわらず、実測値をよく再現しており、上述した簡便な相定数の推定過程が有効であることが確認された。

本発明の実施形態の細胞の物性値測定方法をその工程順に示すフローチャート図である。 円盤状赤血球（Discocyte）のシミュレーションモデルを示す図である。 突出形赤血球（Echinocyte）のシミュレーションモデルを示す図である。 （ａ）及び（ｂ）は計算により得られた円盤状赤血球（Discocyte）の回帰曲面を示す図であり、（ａ）は比誘電率上昇Δεについての３Ｄ曲面であり、（ｂ）は緩和時間τについての３Ｄ曲面である。 （ａ）及び（ｂ）は計算により得られた突出形赤血球（Echinocyte）の回帰曲面を示す図であり、（ａ）は比誘電率上昇Δεについての３Ｄ曲面であり、（ｂ）は緩和時間τについての３Ｄ曲面である。 横軸に細胞質導電率κ_ｉをとり、縦軸に膜キャパシタンスＣ_ｍをとって、円盤状赤血球（Discocyte）について計算により求めた値と実測値との関係を示すグラフ図である。 横軸に細胞質導電率κ_ｉをとり、縦軸に膜キャパシタンスＣ_ｍをとって、突出形赤血球（Echinocyte）について計算により求めた値と実測値との関係を示すグラフ図である。 横軸に周波数をとり、縦軸に複素誘電率（ε’，ε”）をとって、円盤状赤血球（Discocyte）の誘電分散を示すグラフ図である。 横軸に周波数をとり、縦軸に複素誘電率（ε’，ε”）をとって、突出形赤血球（Echinocyte）の誘電分散を示すグラフ図である。 円盤状赤血球（Discocyte）を示す図面代用写真である（ＳＥＭ写真，倍率１５０００倍）。 突出形赤血球（Echinocyte）を示す図面代用写真である（ＳＥＭ写真，倍率１５０００倍）。

Claims (5)

1. 任意の膜キャパシタンスＣ_ｍ及び細胞質導電率κ_ｉを設定して数値解析することにより、特定形状の細胞について誘電スペクトルを算出する工程と、
   前記誘電スペクトルを誘電緩和式に回帰させて、前記細胞の比誘電率上昇Δε及び緩和時間τを求める工程と、
   前記比誘電率上昇Δε及び緩和時間τに基づいて、前記細胞の形状に応じた回帰式を作成する工程と、
   を有する細胞の物性値測定方法。
2. 更に、前記細胞の誘電スペクトルを測定し、その結果と前記回帰式とを比較することにより、前記細胞の膜キャパシタンスＣ_{ｍ，ｅｘｐ}及び細胞質導電率κ_{ｉ，ｅｘｐ}を求める工程を有することを特徴とする請求項１に記載の細胞の物性値測定方法。
3. 細胞の形状毎に前記回帰式を作成し、その細胞の形状に応じた回帰式を適用して膜キャパシタンスＣ_{ｍ，ｅｘｐ}及び細胞質導電率κ_{ｉ，ｅｘｐ}を求めることを特徴とする請求項１に記載の細胞の物性値測定方法。
4. 前記細胞は、非等方的形状であることを特徴とする請求項１に記載の細胞の物性値測定方法。
5. 任意の膜キャパシタンスＣ_ｍ及び細胞質導電率κ_ｉを設定して数値解析することにより、特定形状の細胞について誘電スペクトルを算出する手段と、
   前記誘電スペクトルを誘電緩和式に回帰させて、前記細胞の比誘電率上昇Δε及び緩和時間τを求める手段と、
   前記比誘電率上昇Δε及び緩和時間τに基づいて、前記細胞の形状に応じた回帰式を作成する手段と、
   を有する細胞の物性値測定装置。