JP2009029812A - bcl−2遺伝子発現の調節 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(i)配列TCTCCCAGCGTGCGCCAT(配列番号17、当該配列中の少なくとも1個のヌクレオシド間結合がフォスフォロチオエート結合である)を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなるアンチコードオリゴマー;(ii)1又は2以上の癌化学療法剤;および(iii)医薬として許容される担体、を含有することを特徴とする、bcl−2タンパクを高レベルで発現している癌治療用医薬組成物。
【選択図】なし
Description
本発明の上記目的およびその他の目的は、以下の詳細な説明から明白となるであろう。
本明細書においては、“アンチコードオリゴマー”とはアンチコードオリゴヌクレオチドおよびそのアナログを意味し、標的配列のヌクレオチド塩基と水素結合の相互作用を介してポリヌクレオチド標的配列を認識する化学種群を含む。この標的配列は一本鎖若しくは二本鎖RNAまたは一本鎖若しくは二本鎖DNAであることができる。
ムアセタール、スルフォン、スルファメート、およびニトロキサイド基本骨格修飾物、および塩基部が修飾されているアナログが挙げられるがこれらに限定されない。加えて、オリゴマーのアナログは次のようなポリマーであることもできる。即ち、糖部分が修飾されている、あるいはその他の適切な部分によって置換されてその結果モルフォリノアナログやペプチド核酸(PNA)(但しこれらに限定されない)を含むようにされたポリマーである[エグホルム(Egholm)ら、“ペプチド核酸(PNA)−アキラルのペプチド基本骨格を有するオリゴヌクレオチドアナログ”(1992年)]。アンチコードアナログは、オリゴヌクレオチドアナログの各種タイプの混合物、あるいは生DNAまたはRNAとの組合せであることができる。同時にオリゴヌクレオチドとそのアナログは単独で、あるいは一以上の追加のオリゴヌクレオチドまたはそのアナログとの組合せで用いることもできる。オリゴヌクレオチドは約10〜1000のヌクレオチド長であることができる。本発明においては10〜100ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを用いることができるが、好ましいオリゴヌクレオチドは約15から約24の塩基長のものである。
本明細書においては、bcl−2遺伝子発現とはヒトbcl−2遺伝子からのbcl−2タンパク生産をいう:例えばbcl−2遺伝子発現の低下はbcl−2タンパクレベルの低下を意味する。本明細書においては、“戦略的部位(ストラテジックサイト)”とは、請求項に記載のアンチコード分子やそのアナログと結合した時にbcl−2遺伝子の発現を阻害する部位として定義される。本明細書においては、“配列部分”とは、RNAオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部を指す。文脈によっては、“配列部分”がDNAオリゴヌクレオチドやDNAセグメントのヌクレオチド配列の一部を指すこともある。
本発明において用いるアンチコードオリゴマーはまた、bcl−2 mRNAに沿う戦略的部位またはその他の部位の配列部分と相補的であるか実質的に相補的なオリゴヌクレオチドに隣接するオリゴヌクレオチドを包含してもよい点を理解するべきである。隣接する(フランキング)配列部分は好ましくは約2〜約100塩基、より好ましくは約5から約20塩基長である。アンチコードオリゴマーは、他の遺伝子からのプレ−mRNAあるいはmRNAコード化鎖に対するアンチコードオリゴマー同士の相同性を最小にするために、他の遺伝子のプレ−mRNAあるいはmRNAに共通に見いだされることのないプレ−mRNAあるいはmRNAの配列部分に相補的であることが好ましい。
好ましいアンチセンスの、あるいは相補的なオリゴデオキシヌクレオチドを表1に示す。
bcl−2 オリゴデオキシヌクレオチド
翻訳開始アンチセンス(TI-AS) 3′…CCCTTCCTACCGCGTGCGAC…5′
bcl−2 5′…CTTTTCCTCTGGGAAGGATGGCGCACGCTGGGAGA…3′
スプライス供与体アンチセンス(SD-AS) 3′…CCTCCGACCCATCCACGTAG…5′
bcl−2 5′…ACGGGGTAC…GGAGGCTGGGTAGGTGCATCTGGT…3′
スプライス受容体アンチセンス(SA-AS)3′…GTTGACGTCCTACGGAAACA…5′
bcl−2 5′…CCCCCAACTGCAGGATGCCTTTGTGGAACTGTACGG…3′
実施例には次のプロトコールを用いた。
本研究のために用いたヒト白血病細胞株はRS11846濾胞性リンパ腫細胞、697プレ−B細胞急性リンパ球性白血病細胞、およびJURAT T細胞急性リンパ球性白血病細胞であり、これらはツジモトらによってProc.Natl.Acad.Sci.USA、83:5214−5218(1986年)に、またワイス(Weiss) らによってProc.Natl.Acad.Sci.USA、138:2169−2174(1987年)に記載されている。ヒト末梢血リンパ球(PBL)を新鮮全血から、リードら、J.Immunol.、134:314−319(1985年)に記載のようにして単離した。全リンフォイド細胞を1mMのグルタミン、抗生物質、および次の何れかを含むRPMI培地中で5×105細胞/mLの濃度で培養した:5〜10%(v:v)のウシ胎児血清(FBS)、5〜10%(v:v)の子ウシ血清(CS)(両者ともハイクローンラボラトリーズ製)、あるいは無血清培養には1%(v:v)のHLI濃縮補充剤(ベントレックスラボラトリーズ)。マウス繊維芽細胞株を、グルタミン、抗生物質、および5〜10%(v:v)のFCSを含有するDMEM培地中に、103細胞/cm2添加した。繊維芽細胞株はNIH 3T3細胞、3T3−B−α−S細胞、および3T3−B−αーAS細胞であった。このうちの後の2つの細胞株は、発現ベクター構築物での安定した形質移入によって、センス配向、アンチセンス配向のいずれかでヒトbcl−2−α cDNAを高レベルに発現するNIH 3T3細胞である。
アンチコードオリゴマーの存在下あるいは不在下、培養細胞株の成長を次の二つの方法で測定した:血球計を用いた細胞カウント;およびリードら、J.Immunol.、134:314−319(1985年)に基本的に記載されている、[3H]−チミジン導入量をアッセイすることによるDNA合成。即ち、細胞を96穴の平底マイクロタイタープレート(ファルコン社)にウェルあたり0.2mL加えて培養した。適切な時間に細胞を再懸濁し、25μlを取り出し細胞数をカウントした。この25μl量は20UCi/Mlの[3H]−チミジン(特異活性=6.7Ci/mmole)(ニューイングランド・ニュークリアー)で置き換えた。次いでマイクロタイター培養物を37℃で95%空気:5%炭酸ガス雰囲気に8時間戻し、その後細胞とガラスフィルターを溶解し、シンチレーションカウンティングでDNAへの[3H]−チミジンの導入の相対レベルを決定した。細胞のカウントは、トリパンブルー染料の存在下、二重に用意したマイクロ培養物中の生存可能細胞の濃度を決定することにより行った。
全細胞RNAを、チョムジンスキー(Chomczynski) らがAnalyt.Biochem.、162:156−139(1987年)に記載しているクゥォニジニウム・イソチオシアネート/フェノール手続によって単離した。ポリアデニル化された分画をオリゴデオキシチミジン−セルロースクロマトグラフィーによってアヴィブ(Aviv)らがProc.Natl.Acad.Sci.USA、69:1408−1412(1972年)に記載のようにして精製した。約5μg分割量のmRNAを0.8%アガロース/6%フォルムアルデヒドゲル中でサイズ分画し、ナイロン膜に移した。ブロットは、リードらがMol.CellBiol.、5:3361−3366(1985年)に記載した方法を正確に行って、まず予ハイブリダイズ、次いでハイブリダイズ後に洗浄した。これには、ツジモトがProc.Natl.Acad.Sci.USA、83:5214−5218(1986年)に記載したヒトbcl−2に対する32P−cDNAあるいはネグリニ(Negrini) らがCell、49:455−463(1987年)に記載したマウスbcl−2プローブであるpMBCL5.4を利用した。ブロットは、強調スクリーンと共に−70℃で1〜10日間コダック社のXARフィルムに露光した。32P−bcl−2プローブを膜から溶出させ、32Pプローブと共にマウスのβ−マイクログロブリンに関して再ハイブリダイズさせると、ブロット上の全サンプルについて略等量のmRNAが確認された。
アンチコードオリゴマーの調製
アプライド・バイオシステムズ社380B DNA合成器を使用して、ここに特に全文をレファレンスとして援用するスタインら,Nucl.AcidsRes.,16:3209−3221(1988)に記載の方法により、ノーマルおよびホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、HPLC逆相クロマトグラフィ(PRP−1カラム)により精製した。いくつかのケースにおいては、非特異的な細胞毒性作用を除去するために、さらにオリゴデオキシヌクレオチドをカーンら,J.Clin.Invest.,81:237−244(1988)にすでに記述されているように、C18−Sep−PaKクロマトグラフィ(Waters Associates,Millipore,Inc.)により精製する必要があった。30%酢酸ニトリルに溶出したオリゴデオキシヌクレオチドを蒸発乾燥させ、滅菌したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水またはハンクスの緩衝塩溶液(ともにGibco製)に1−2mM濃度に再懸濁させ、少量のアリコートに分けて−80℃で保存した。
合成したオリゴデオキシヌクレオチドおよびそれらのヒトbcl−2遺伝子のセンス−ストランドとの関係を表1に示した。ヒトbcl−2遺伝子のコードストランド配列部分を示しているが、これには翻訳開始部位(上)、スプライス供与部位(中央)およびスプライス受容部位(下)、ならびにbcl−2プレmRNAの5'非翻訳部分中の経験的に選択した部位が含まれている。ATG開始コドン、GTスプライス供与体、およびAGスプライス受容コンセンサス配列はボックスで囲んだ部分である。
これらの研究のために合成されたオリゴデオキシヌクレオチドの配列が示され、それらのヒトbcl−2 mRNAのセンス−ストランドとの関係が示されている。TI−ASオリゴデオキシヌクレオチドは翻訳開始部位のアンチセンスであり、TI−Sはその相補センス体である。SD−ASおよびSD−Sはそれぞれ、スプライス供与領域に対するアンチセンスおよびセンス配向を有するオリゴデオキシヌクレオチドである。
オリゴデオキシヌクレオチドTI−ASはbcl−2 mRNAの予測される翻訳開始部位にまたがり、この領域に対して相補的(アンチセンス)である。対照として、この20bpオリゴデオキシヌクレオチドのセンス配列TI−Sを合成した。
bcl−2 mRNAのスプライシングを特異的に遮断するために、20bpオリゴデオキシヌクレオチドのアンチセンス配列SD−ASを合成したが、これはbcl−2の一次転写産物のスプライス供与部位とオーバーラップする。さらに、表1に示されているように相補センスオリゴデオキシヌクレオチドSD−Sも調製した。ヒトbcl−2遺伝子は、ツジモトら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:5214−5218(1986)にあるように、別のスプライス部位選択によりいくつかの転写産物をもたらす。これら転写産物の優位性はスプライシングに依存し、26KDaタンパクであるbcl−2−アルファをコードする。しかしながら、マイナーな1つの転写産物はスプライスされず、したがって22KDaタンパクのbcl−2−ベータをコードする。このようにSD−ASオリゴデオキシヌクレオチドは基本的に、すべてではないが殆どのbcl−2転写産物の完成を遮断することができる。
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドのIn Vitro研究のための血清の処理
ノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは血清中に存在するヌクレアーゼによる劣化に敏感なため、56℃で30分間加熱(血清補体を不活性化するための通常の手順)した牛胎児血清(FBS)中におけるTI−ASオリゴデオキシヌクレオチドの効果と、68℃で1時間加熱(多くのヌクレアーゼ類を非可逆的に不活性化するのに充分な温度)した牛胎児血清(FBS)中におけるTI−ASオリゴデオキシヌクレオチドの効果を比較した。RS11846小胞リンパ腫細胞系統を使用した。RS11846細胞はbcl−2発現を自由にするt(14;18)染色体転座を含み、その結果bcl−2 mRNAを高レベルで蓄積する(ツジモトら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:5214−5218(1986))。
RS11846小胞リンパ腫細胞を、予め56℃で0.5時間または68℃で1時間加熱した牛胎児血清5%(容量/容量)を含む培地で培養した。培養の開始時にTI−ASノーマルオリゴデオキシヌクレオチドを加え、2日後に生存細胞の密度を測定した。
TI−ASノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは68℃処理血清の方がこれらリンパ腫細胞の培養の成長を効果的に抑制した。以下の実験ではすべて、培養に供する前に68℃で1時間加熱した血清を使用した。この処理は血清の成長支援能力を阻害するものではない。
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドによるリンパ細胞成長の特異的阻止
bcl−2の翻訳開始部位に対するアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチド(TI−AS)およびスプライス供与部位に対するアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチド(SD−AS)について、正常および新生物リンパ細胞の増殖抑制力を試験した。
RS11846小胞リンパ細胞、JUKRAT T細胞白血病細胞、および新鮮な単離抹消血液リンパ球を、予め68℃で1時間加熱した10%(容量/容量)FBSを含む培地で培養した。培養開始時に種々の濃度のTI−AS、TI−S、SD−AS、およびSD−Sなどのノーマルオリゴデオキシヌクレオチドを加えた。培養2−3日後に、[3H]−チミジン取り込み量を測定することにより、培養物中の相対DNA合成率を測定した。オリゴデオキシヌクレオチド処理培養物と等量のPBSまたはHBSSを含む対照培養物に対するパーセンテージを計算してデータを求め、複製培養の平均(±標準偏差)を求めた。
低温チミジン阻止を除いて、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドで処理した培養中のDNA合成抑制の1つの指標として、細胞数を計測し同様のデータを求めた。
図1および図2に示されているように、TI−ASおよびSD−ASオリゴデオキシヌクレオチドはともに、RS11846細胞の成長を濃度に依存して抑制した。SD−ASオリゴデオキシヌクレオチドはTI−ASオリゴデオキシヌクレオチドにくらべて細胞成長を抑制する効果は少なかった。これらのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと対照的に、センスオリゴデオキシヌクレオチド(TI−SおよびSD−S)は濃度250μG/mLまで抑制効果は認められなかった。さらに非センスオリゴデオキシヌクレオチド(すなわち、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと同じ塩基組成を有するが、スクランブル配列となっているもの)もまた、RS11846細胞の増殖を抑制しなかった。これらのデータはしたがって、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドがこれらの腫瘍性細胞の増殖を特異的に遮断することを示している。bcl−2遺伝子を発現するその他いくつかの白血性細胞種についても、TI−ASおよびSD−ASオリゴデオキシヌクレオチドによってそれらの増殖が抑制されるか試験した。JURKAT T細胞急性リンパ細胞白血性細胞の場合と同様、すべてのケースにおいてアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを含む培養中で、これらのヒト白血性細胞の成長は特異的かつ濃度依存性で減少するのが観察された。
健常なヒト抹消血液リンパ球(PBL)の増殖が刺激される時、これらの中でbcl−2の発現が一時的に誘発されることが示されており、これはこの遺伝子が正常なリンパ球の成長調節にある役割をはたしていることが示唆されている(リードら,Science236:1295−1297(1987))。よって、それらの増殖を刺激するモノクローナル抗体OKT3(ヴァン・デン・エルセンら,Nature312:413ー418(1984))をPBLとともに培養した場合、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドのPBLの成長抑制に対する能力を試験した。PBLは50μlの精製OKT3モノクローナル抗体で刺激した。図1および図2に示されているように、TI−ASオリゴデオキシヌクレオチドはPBLの増殖を濃度依存性で特異的に抑制した。このようにこれらのノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは、bcl−2遺伝子を構成的に発現する白血病細胞の培養物中の成長ならびにbcl−2発現が誘発されるノーマルなリンパ球の培養中の増殖を抑制した。
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドによる阻止の時間的経過
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の力学をRS11846小胞リンパ腫細胞および697プレ−B細胞急性リンパ細胞白血病細胞で検査した。これら両方の新生物B細胞種はbcl−2mRNAを高レベルで転写・蓄積した(ツジモトら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:5214−5218(1986))。
RS11846小胞リンパ腫細胞および697プレ−B細胞急性リンパ細胞白血病細胞を、68℃で処理したFBSおよびノーマルオリゴデオキシヌクレオチドを10%(容量/容量)含む培地中で培養した。細胞は、50μg/mLのTI−AS、100μg/mLのSD−AS、50μg/mLのTI−S(RS11846細胞)または100μg/mLのSD−S(697細胞)、あるいは対照としてのPBSとともに培養した。培養開始後種々の時間でDNA合成(kcpm/105生存細胞数)および細胞密度(105生存細胞数/mL)を測定した。
アンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドはこれらの細胞培養物中で測定されるDNA合成を24時間以内に著しく抑制した。これらの培養物における細胞密度の低下は明らかに2日以内に起きている。このようにアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは白血病細胞のIn Vitro成長を急激に抑制した。センスオリゴデオキシヌクレオチドはこれら培養物中の増殖を阻害しなかったことから、アンチセンスオリゴデオヌクレオチドの作用は特異的なものである。細胞の生存はしばしば培養の後期に低下するが、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと一緒の培養では細胞死の増加は最初の1−2日には認められず、これは非細胞毒性メカニズムであることを示唆している。
異なる血清調製品の比較
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる白血病細胞の増殖抑制は培養に使用される血清のロットによって大幅に変わる。
増殖抑制に対する血清の効果を測定するために、200μMのTI−ASノーマルオリゴデオキシヌクレオチドの添加2日後の697プレ−B細胞白血病細胞培養物中の相対DNA合成を測定した。1%(容量:容量)HL1−コンセントレート(無血清状態)、5%(容量:容量)ウシ血清(CS1およびCS2)の異なる2ロット、または5%(容量:容量)牛胎児血清(FBS1およびFBS2)を添加した培地中で細胞を培養した。すべての血清は培養に使用する前に68℃で1時間加熱した。
ノーマルTI−ASオリゴデオキシヌクレオチドはDNA合成(92%)ならびに697細胞の無血清培養物(HL1)における細胞増殖を著しく抑制した。このアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは5%(容量:容量)牛胎児血清(FBS2)を含む培養物中でも同様に効果的(94%)であった。対照的に、その他の血清調製品(CS1、CS2、FBS1)を含む培養物中では抑制作用は顕著に低下した。一般的にはアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは牛胎児血清(FBS)を含むものよりもウシ血清(CS)を添加した培養物中での効果が少ないことが観察されている。
無血清培養におけるアンチセンスノーマルオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の濃度依存性
1%(容量:容量)HL1−コンセントレート(無血清状態または5%(容量:容量)68℃処理FBS2)のいずれかを含む培地中で697プレ−B細胞白血病細胞を培養した。種々の濃度のノーマルTI−ASオリゴデオキシヌクレオチドを含む培養物中で2日後のDNA合成および細胞密度の相対レベルを測定した。TI−ASオリゴデオキシヌクレオチドは、無血清培養に使用された場合、低濃度で抑制的であった。たとえば、100μMにおいては、FBS2を含む培養物中では細胞増殖の抑制は見られなかったのに対し、無血清培養物中では細胞数は約75%減少した。しかしながら、より高濃度のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(200−250μM)の場合は、両方のタイプの培養物中の697細胞増殖の抑制は同程度であった。無血清培養物中のノーマルオリゴデオキシヌクレオチドの増進する効果は特異的なものであったが、これはセンスオリゴヌクレオチド(TI−S)が同一濃度では抑制的でないからである。
アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド:抑制の時間的経過
ヒト白血病細胞成長抑制に関するホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの効果とノーマルホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの効果を比較するために、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドを697プレ−B細胞白血病細胞とともに培養し、その抑制効果を測定した。697プレ−B細胞白血病細胞を無血清培地中で何回か培養し、DNA合成(kcpm)および細胞密度(106細胞数/mL)を測定した。
細胞は当初密度0.2×105細胞/mLまたは0.5×105細胞/mLのいずれかで接種した。培養条件は25μMTI−ASホスホロチオエート、25μM TI−Sホスホロチオエートとし、対照培養はHBSSで処理した。
血清ロットの差による実験変動を避けるために、697白血病細胞を無血清条件で培養した。当初接種密度0.5×106細胞/mLで培養した場合、697細胞は培養4−5日で最高のDNA合成および細胞密度を達成した。これらの培養開始時に25μMのセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(TI−S)を添加しても697細胞成長には効果がほとんど無かった。しかしながら、25μMのアンチセンスホスホロチオエート(TI−AS)を含む複製培養物中では、2日以内にDNA合成のある程度の減少が明白となり、4−5日で最高となった。細胞数計測で測定される697細胞成長の最大抑制は培養開始後6日後に見られた。
697細胞を当初0.2×106細胞/mLで接種した場合、アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(TI−AS)は2日目にわずかな抑制を示し、これら培養物中でのDNA合成の最大抑制は7日目に達成された。ノーマルオリゴヌクレオチドの場合と同様に、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制は非細胞毒性メカニズムに仲介されるものと思われる。なぜならば細胞生存数は培養の後期にならないと低下しなかったからである。したがって、ノーマルアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドと比較した場合、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは作用開始時期が遅い。
アンチセンスbcl−2ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の濃度依存性
無血清培地中での697細胞の培養におけるホスホロチオエートおよびノーマルTI−ASオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の濃度依存性を下記のようにして比較した。
697細胞を無血清培地中で、3日間(ノーマルオリゴデオキシヌクレオチド)または4日間(ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド)培養し、細胞密度およびDNA合成のレベルを測定した。培養物へのオリゴデオキシヌクレオチドの添加物には、TI−ASホスホロチオエート、TI−Sホスホロチオエート、TI−ASノーマルおよびTI−Sノーマルが含まれる。
図2に示されているように、TI−ASホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは25−50μMで697細胞の増殖を顕著に抑制した。対照的に、ノーマルTI−ASオリゴデオキシヌクレオチドは同等の697細胞増殖抑制をするためには5倍から10倍高い濃度(約250μM)を必要とした。アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドTI−ASによる抑制は、この濃度範囲では特異的であったが、これはその相補センスオリゴデオキシヌクレオチド(TI−S)が複製培養において697細胞抑制をほとんどしなかったためである(図3参照)。
アンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制に対する血清調製品の影響
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの抑制作用に関する血清調製品の効果をさらに明確にするために、培養物への添加の前に56℃で30分間もしくは68℃で1時間加熱した、または加熱しないFBSをRS11846リンパ腫細胞の培養物へ添加した。
RS11846細胞は、予め56℃で0.5時間もしくは68℃で1時間加熱した、または加熱をしていない1%(容量:容量)HL1−コンセントレートまたは5%(容量:容量)FBSを含む培地中で培養した。複製培養物の4日および5日目の細胞数を、等濃度のTI−Sホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドで処理した対照培養に対するパーセンテージとして計測し、平均パーセンテージを求めた(標準偏差はすべての値について10%以下であった)。TI−ASホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは25μMで完全にRS11846の成長を抑制し、半−最大抑制濃度は11μMと推定された。対照的に、このホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは5%(v:v)FBSを含む培養中では極端に効果が少なかった。さらに、培養液に添加する前にFBSを加熱しても、TI−ASホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのRS11846リンパ腫細胞の成長を抑制する能力は顕著には改善されなかった。オリゴデオキシヌクレオチドの濃度が50μMの場合、RS11846細胞の増殖抑制は、加熱操作の有無にかかわらず、血清を含んだ培養中では48%を超えることはなかった。
ノーマルおよびホスホロチオエートアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制に対する血清の透析の影響
血清中の妨害物質の性質をさらに明らかにするために、68℃加熱血清を697白血病細胞の培養物に添加する前に、厳密に透析(遮断分子量=3500)して実験を行った。実験は12.5μMのTI−ASホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドおよび200μMのノーマル酸素ベースのTI−ASオリゴデオキシヌクレオチドを使用して行った。
697細胞を、1%(容量:容量)HL1−コンセントレート(A)または68℃加熱処理の3ロットの5%(容量:容量)FBS(B、C、D)を含む培地中で培養した。各血清調製品は厳密な透析前(ND)および透析後(D)で対比した。TI−AS(+)およびTI−S(−)オリゴデオキシヌクレオチドは、ノーマル酸素ベースのオリゴデオキシヌクレオチドについては200μM(OXY)、およびホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(PT)については12.5μMを、複製培養物に添加した。ノーマルおよびホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドそれぞれの培養2ないし4日目にDNA合成の相対レベル(kcpm)を測定した。
試験したFBSの3つの異なるロットの内、2つは透析後もノーマルまたはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのいずれかを含む培養物でほとんど変化を示さなかった。しかしながらFBSの1ロットは、透析後これらのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの抑制作用に僅かの影響を与えた。
安定的に形質転換したNIH3T3細胞を使用した実験
ここで述べるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはbcl−2mRNA翻訳(TI−AS)およびスプライシング(SD−AS)を遮断するように設計されたものであるが、それらの作用の分子メカニズムはまだ解明されていない。細胞内でのオリゴデオキシヌクレオチド−RNAハイブリッドの形成の細胞成長抑制に対する効果を調べるために、ヌクレオチドの配列に関係なく、ヒトbcl−2 cDNA転写物を発現するように形質転換した細胞をノーマルオリゴデオキシヌクレオチドとともに培養した。
200μMのノーマルTI−ASおよびTI−Sオリゴデオキシヌクレオチドを、典型的なNIH 3T3細胞の培養物、ならびに通常のセンス(3T3−アルファ−S細胞)またはアンチセンス(3T3−アルファ−AS細胞)ストランドのいずれかのヒトbcl−2 cDNA転写物を高レベルで産生するような発現体として安定的に形質転換したこれらの細胞の培養物に、添加した。
RNAブロット分析を行うために、ノーマルNIH 3T3細胞、ならびにセンス(3T3−アルファ−S細胞)またはアンチセンス(3T3−アルファ−AS細胞)リコンビナントbcl−2−アルファmRNAを高レベルで産生するような発現体として安定的に形質転換した細胞から、ポリアデニル化mRNAを13の方法に基づいて精製した。約5μgのmRNAを、基本的に(16)に記載したように、ヒトまたはネズミbcl−2配列由来の32P−標識ハイブリダイゼーションプローブを使用したRNAブロット検定に供した。
ノーマル3T3細胞、3T3−アルファ−AS細胞、および3T3−アルファ−S細胞からのRNAを含むブロットに対する1日曝露によるオートラジオグラムでは、3T3−アルファ−ASおよび3T3−アルファ−S細胞に形質転換したbcl−2発現構築物から産生されたリコンビナント2.4および1.4kbp bcl−2転写産物が高い相対レベルを示した。
RNAを採取する時点で増殖中または鎮静状態のいずれかのノーマル3T3細胞からのRNAを含むブロットの10日間の曝露では、増殖中の3T3細胞中に低レベルではあるが検出可能なレベルのノーマル7.5および2.4kbpネズミbcl−2転写産物の存在が示された。
TI−ASオリゴデオキシヌクレオチドはノーマルNIH 3T3細胞の培養中のDNA合成および細胞複製を特異的に抑制したが、これは低レベルではあるが線維芽胞がbcl−2転写産物を含むという他者の発見とも符合するものである。ここで開示したこのTI−ASオリゴデオキシヌクレオチドは、マウスbcl−2配列においてその20塩基中18が相補的であり(17)、ネズミNIH3T3細胞の成長を抑止する役割を果たしているものと思われる。
NIH 3T3細胞、3T3−アルファ−AS細胞、および3T3−アルファ−S細胞を、5%(容量:容量)の68℃処理血清、ならびにHBSS、200μM TI−Sノーマルオリゴデオキシヌクレオチド、または200μM TI−ASノーマルオリゴデオキシヌクレオチドのいずれかを含む培地中で培養した。3日目の培養物中のDNA合成の相対レベル(kcpm)を測定し、[3H]−チミジンの0.5μci/穴の16時間インキュベートと比較した。位相差顕微鏡による推定細胞密度は測定した培養物中のDNA合成と一致した。TI−ASオリゴデオキシヌクレオチドを含む培養物中のDNA合成の抑制パーセンテージは、HBSSを含む対照培養物との相対比較で求めた。
ノーマルNIH 3T3細胞の場合と同様に、TI−ASおよびTI−Sオリゴデオキシヌクレオチドとともに培養した3T3−アルファ−S細胞(ヒトbcl−2−アルファセンス転写物を産生)は特異的な抑制を示した。なぜならば、センスオリゴデオキシヌクレオチドTI−Sは抑制的でなかったからである。しかしながらアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる細胞増殖抑制のレベルは3T3−アルファ−S細胞ほど大きくはなかった。これは予想されるとおり、これらの細胞がより多くのbcl−2 mRNAを含んでいるからである。
3T3−アルファ−AS細胞培養物(アンチセンスbcl−2転写物を産生)に対するTI−Sオリゴデオキシヌクレオチドの添加は、オリゴデオキシヌクレオチド−RNAハイブリッド形成を含む非特異的なメカニズムを通して細胞成長の抑制を妨げた。TI−Sオリゴデオキシヌクレオチドは3T3−アルファーAS細胞増殖をほとんど抑制しなかったが、一方TI−ASオリゴデオキシヌクレオチドはこれら細胞に対して著しく抑制的であった。TI−ASおよびTI−Sホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドについても同様のデータが得られた。
ヒトリンパ腫細胞におけるbcl−2アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド介在プログラム細胞死の指標としてのDNA断片化の測定
表2に示す配列を有するオリゴヌクレオチドのヒトt(14:18)含有ヒトリンパ腫細胞種RS11486のプログラム細胞死(DNA断片化)を誘発する能力を調べるための試験を行った。これらのオリゴヌクレオチドはすべてホスホジエステルであり、bcl−2プレ−mRNAの翻訳開始部位または5'−キャップ領域を標的とするものである。
対照オリゴデオキシヌクレオチドは、TI−AS(配列番号:7)のbcl−2センス型(TI−S)、および同じ塩基組成を有するがヌクレオチド順序がバラバラのTI−ASのスクランブル型を含めた。
配列 配列番号
CGCGTGCGAC CCTCTTG(3′→5′) 8
TACCGCGTGC GACCCTC(3′→5′) 9
CCTTCCTACC GCGTGCG(3′→5′) 11
GACCCTTCCT ACCGCGT(3′→5′) 12
GGAGACCCTT CCTACCG(3′→5′) 13
GCGGCGGCAG CGCGG(3′→5′) 14
CGGCGGGGCG ACGGA(3′→5′) 15
CGGGAGCGCG GCGGGC(3′→5′) 16
2つの実験の結果を図4および5に示す。bcl−2 mRNAの翻訳開始ATG部位近辺を標的とする6種類のbcl−2アンチセンスオリゴヌクレオチドを試験した。「C−オリゴ−2」は4つの意図的なミスマッチを有するオリゴヌクレオチドを示す。「U」は無処理の対照細胞を示す。図5は図4に示したオリゴヌクレオチドの試験結果を示す。「Sc20」はTI−ASと同じ塩基組成を有するがスクランブル配列である20merを指す。図5(b)はbcl−2mRNAの5'−キャップを標的とする3つのオリゴヌクレオチドの試験結果を示す。数字はこれらのオリゴマーのATG−翻訳開始部位からの距離を示す。
DNA断片(単位サイズ約200bp)のラダー(はしご)の存在はプログラム細胞死を示唆している。50μMにおいて、TI−ASはほとんどDNAを断片化しなかったのに対し、配列番号9および配列番号10、ならびに5'−キャップオリゴヌクレオチドの一つ(配列番号14)は顕著なDNA断片化をもたらした。
無血清培養物中におけるアンチセンスホスホジエステルオリゴデオキシヌクレオチドによる抑制の濃度依存性
697プレ−B細胞白血病細胞を、1%(容量:容量)HL1−コンセントレート(無血清状態[0]または3%(容量:容量)68℃加熱処理血清(FBS2)[_]を含む培地中で培養した。図6参照。示されているのは、種々の濃度のホスホジエステルTI−ASオリゴデオキシヌクレオチドを含む培養液中の培養2日目における細胞密度である。これらのデータはセンスオリゴヌクレオチドで処理した対照培養に対する相対パーセンテージで示されており、複製サンプルの平均±標準偏差も表している。
オリゴデオキシヌクレオチド処理697細胞中のbcl−2タンパクレベルの免疫蛍光分析
オリゴデオキシヌクレオチドとの関係を検討するために、0.25×104(ホスホロチオエート)または0.5×105(ノーマルオリゴデオキシヌクレオチド)の697細胞を1mLのHL−1無血清培地で24穴培養皿(Linbro.Flow Lab,Inc.)で培養した。2日目(ノーマルの場合)または4日目(ホスホロチオエートの場合)に、細胞を培養液から回収し、[PBS、pH7.4(Gibco)−0.1%ウシ血清アルブミン−0.1%アジ化ナトリウム]中で1回洗浄し、1%パラホルムアルデヒド/PBS溶液中で5−10分間氷上固定した。次いで細胞をPBSで1回洗浄し、1mLの純粋メタノール中で20℃、10分間インキュベートした。PBS−A中で1回洗浄後、細胞を0.05%のTriton−X100を含むPBS中に氷上で3分間再懸濁させ、PBS−A中で洗浄し、PBS中4℃で30分間10%(v/v)加熱非活性化ヤギ血清で予備遮断した。
第1の抗体を添加するために、予備遮断した細胞を100μlのPBS−G(PBS−1%ヤギ血清−0.1%アジ化ナトリウム)に再懸濁させ、BCL−2抗体(ハルダーら,Nature(ロンドン),342:195−197(1989))またはアフィニティ精製したノーマルウサギ対照IgG(Cappel6012−0080)のいずれかを含有させた個別の試験管に50μlずつに分割し、氷上で1時間インキュベートした。これらの検討に使用したBCL2抗体は、BCL2タンパクのアミノ酸(98−114)に相当する合成ペプチドをウサギに使用し、プロテインA−セファロースクロマトグラフィによりアフィニティ精製し、約1mg/mLで使用した。細胞は次にPBS−A中で洗浄し、0.5−1.0mL PBS−A中で氷上15−20分間インキュベートし、非特異性の細胞会合抗体を分散させたあと、5μgのビオチニル化scat抗ウサギIgG(BAIOOO;Vector Labs)を含む100μlのPBS−G中に細胞を30分間再懸濁させた。PBS−Aで1回洗浄および15分間インキュベートした後、細胞を最終的に、2μgのFITC接合アビジン(VectorLabs A2011)を含む100μlのPBS−Aに20分間再懸濁させ、PBS−Aで3回洗浄した後、オルソ2150データ処理システムに連結されたオルソチトフルオログラフ50−Hで分析した。本法のBCL2タンパク検出特異性は免疫蛍光顕微鏡(細胞質ゾル着色ペプチド競合を示す)、ならびに遺伝子トランスファー操作により種々のレベルのBCL2 mRNAおよびタンパクを発現する細胞種を調べることにより確認した。
表面HLA−DR抗原発現を測定するために、間接免疫蛍光分析法(リードら,J.Immunol.134:1631−1639(1985))を使用したが、これは生存細胞をネズミ抗HLA−DRモノクローナル抗体(IgG2a)(Becton−Dickinson7360)または負の調節抗体 R3−367(IgG2a)、続いてFITC接合scat抗マウスIgG(Cappel 1711−0081)とともにインキュベートすることを含むものである。細胞はFACS分析に供する前に1%パラホルムアルデヒド/PBS中に固定した。
697細胞を種々のオリゴヌクレオチドとともに2日(PO)または4日間(PS)培養した図7および図8において、黒のカラムはセンスオリゴヌクレオチドの結果を、また斜線のカラムはアンチセンスオリゴヌクレオチドTI−ASの結果を示す。細胞は抗−bcl−2抗血清で標識し、FACSにより分析した。データは無処理697細胞により得られた平均蛍光度に対する相対パーセンテージで表した。
図9および図10は697細胞を100μlのPO bcl−2アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する前および処理した後の典型的なFACS結果を示している。A:抗−bcl−2抗血清(斜線部分)またはノーマルウサギ血清対照(白い部分)のいずれかで標識した無処理の697細胞;B:抗−HLA−DR抗体(斜線部分)または負の調節抗体(白い部分)のいずれかで標識した無処理の697細胞;C:ノーマルbcl−2 TI−AS(白い部分)またはTI−AS(斜線部分)オリゴデオキシヌクレオチドのいずれかとともに2日間培養し、抗−bcl−2抗体で標識した697細胞;D:TI−ASおよびTI−Sオリゴデオキシヌクレオチド(Cで示されている)とともに培養し、ただし抗−HLA−DR抗体で標識した697細胞。
図7および図8に示されているように、POおよびPS bcl−2アンチセンスオリゴヌクレオチドは、HLA−DR(図9および図10)およびその他の調節抗原の発現レベルを変えることなく、bcl−2タンパクのレベルを特異的な濃度依存性で減少させた。たとえば150μMにおいて、POアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはbcl−2蛍光を約75−95%減少させ、一方対照センスオリゴデオキシヌクレオチドはbcl−2タンパクのレベルを10−20%だけ減少させた(図7)。同様に、PSアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド25μMとともに4日間培養した697細胞は、bcl−2蛍光が約70%減少した。これに対し、センスPSオリゴデオキシヌクレオチドTI−ASは、本検定における測定ではbcl−2タンパクレベルを約15%減少させただけであった(図8)。
重要性
ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドにおいては、各ヌクレオチド間のホスフェート結合中の非ブリッジ酸素原子のひとつはイオウ原子で置換することができる。この修飾によりホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドはヌクレアーゼによる開裂に対して極端に抵抗性が与えられる。スタインら,Nucl.Acids Res.,16:3209−3221(1988)。酸素原子をイオウ原子に置換しても、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは水溶液への良好な溶解性を維持し;RNA−オリゴデオキシヌクレオチド複合体の溶解温度がいくらか低下するものの良好にハイブリッド化し;また広く使用されているホスホロアミド類とのオリゴデオキシヌクレオチド自動合成法で簡便に合成することができる。
アンチセンスbcl−2ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド類は、それらのノーマル酸素ベースのものに比べて白血病細胞成長のより有効な抑制剤であることが判明している。無血清状態で試験した場合、これらのオリゴデオキシヌクレオチド類は約15−23μMの濃度で細胞増殖を半減させるのに対し、ノーマルオリゴデオキシヌクレオチドは125−250μMで50%の抑制を達成する。この知見は、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの細胞性ヌクレアーゼに対する感受性の低さ、またはその他のメカニズムに起因するものとして説明することができるであろう。たとえば、mRNAとホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドとのハイブリッド化はRNAアーゼH様活性に関わるメカニズムによって劣化が促進されることになろう。
抑制作用が増加するにもかかわらず、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは配列特異性を維持した。試験した濃度(25μM以下)においては、これらのオリゴデオキシヌクレオチドのセンス型は白血病細胞の成長にほとんど効果が無かった。ノーマルおよびホスホロチオエートアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドはともに、当初非細胞毒性メカニズムにより白血病細胞の増殖を抑制したようである。培養の最初の数日間、細胞の複製は抑制されたが、細胞死の増加とは一致しなかった。しかしながら、培養の後期(ノーマルオリゴデオキシヌクレオチドについては4−5日目、ホスホロチオエートについては6−8日目)では細胞生存性は低下した。
ノーマルおよびホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの抑制動態の比較において、後者の物質は作用の開始時点が遅いことが判明した。ノーマルアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによる白血病細胞増殖の最大抑制は培養開始後2日目に起きたが、ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドは最大抑制を達成するのに4−7日間必要とした。
本発明の実施例により、bcl−2遺伝子を発現するヒトリンパ腫/白血病細胞およびその他のタイプの癌細胞の抑制に対するアンチオリゴマー類の有用性が示された。ヒトbcl−2遺伝子のmRNAの少なくとも有効部分に相補的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、RS11846ヒト小胞性リンパ腫細胞t(14;18)染色体転座および高いbcl−2発現、697ヒトプレB細胞白血病細胞(高いbcl−2発現)、JURKATヒト急性リンパ球白血病細胞(中度bcl−2発現)、ノーマルヒトリンパ球(中度bcl−2発現)ならびにネズミ線維芽胞(低bcl−2発現)の成長を抑制することが判明した。bcl−2アンチセンス薬剤は多くのタイプの細胞の成長を抑制することができるが、t(14:18)リンパ腫および白血病細胞は敏感であり、悪性細胞の特異的な抑制が可能となる。
以下の実施例に示されているように、本発明には各種のDNA相同体を使用することができる。たとえば、ホスホロチオエート類、メチルホスホネート類、ならびにホスホジエステル類およびホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオシド類の組み合わせを含む混合オリゴマー類である。また本発明にはRNA相同体も使用することができるのは当然である。
メチルホスホネート(MP)/ホスホジエステル(PO)bcl−2アンチセンスオリゴマー類はDoHH2リンパ腫細胞の死を誘発する
本検討の目的はリンパ腫細胞の生存を抑制するアンチコードオリゴマー類の各種の相同体の効果を調べることにある。
DoHH2はbcl−2遺伝子を賦活するt(14:18)−転座を含むヒトリンパ腫細胞種である。DoHH2細胞を3日間オリゴマーを加えずに、または各種濃度のアンチセンス(As)およびスクランブル(Sc)メチルホスホネート(MP)/ホスホジエステル(PO)オリゴマーの存在下で3日間培養した。細胞の生存性はトリパンブルー色素排除法により評価し、データはオリゴマー無しで培養したDoHH2細胞に対する相対パーセンテージで示した。MP/POオリゴマーはbcl−2オープンリーディングフレームの最初の6つのコドンを標的とする18−merであり、オープンリーディングフレームの中の5つの内部結合はホスホジエステルであり、フランキングヌクレオシドはメチルホスホネートである。これらの結果は、
これらのアンチコードオリゴマー相同体はリンパ腫細胞生存に効果を有する特異的な抑制剤であるということを示している。
メチルホスホネート(MP)/ホスホジエステル(PO)キメラオリゴマー類はMCF−7ヒト乳癌細胞の成長を抑制する
本検討の目的は本願請求の範囲のアンチコードオリゴマー相同体がbcl−2を高度に発現する固体腫瘍細胞の生存を抑制する効果を調べることにある。
MCF−7は比較的高レベルのbcl−2タンパクを含むヒト胸(乳房)アデノカルチノーマ細胞種である。この細胞をMP/POオリゴマーの存在下または非存在下で96穴マイクロタイタープレートで、1穴当り4000個で培養した。次に、1穴当りの相対細胞数を、新しく接種した無処理のMCF−7細胞を使用して作成した標準曲線に基づいて、MTTアッセイにより推定した。アンチセンス(As)およびスクランブル(Sc)MP/POオリゴマーは実施例15に述べたものと同様である。データは判定のための平均+/−標準偏差を表す。
この結果は、本願請求の範囲のアンチコードオリゴマー相同体によるsolid腫瘍細胞の成長の配列特異的な抑制を示している。
アンチコードbcl−2オリゴマー配列の最適化
本検討の目的は、コンピュータで作成した配列の本願請求の範囲の各種のアンチコード分子を細胞に接触することによって細胞の生存を抑制する場合に、最適のmRNA標的部位または配列部分を調べることにある。
DoHH2リンパ腫細胞をbcl−2 mRNAの異なった部位を標的とする種々の濃度のオリゴマーで処理した。ATGオリゴマーは翻訳開始部位を標的とし、オープンリーディングフレームの最初の6つのコドンに相補性である。Dscore23(図22中のSc23)およびDscore72(図23中のSc72)オリゴマーはmRNAの5'非翻訳領域部位を標的とする。スクランブル(Sc)オリゴマーは同じ長さと塩基組成を有するがスクランブル型配列の負の対照である。すべてのオリゴマーはホスホジエステル(PO)/ホスホロチオエート(PS)キメラとして調製され、最後の(3')2つの内部ヌクレオシド結合だけがホスホロチオエートである。オリゴマーを直接培養液に添加し、3日後にMTTアッセイにより相対生存細胞数を推定した。データは平均+/−標準偏差を表す。
これらの結果は、5'非翻訳領域を標的とするDscore23オリゴマーは本実施例で試験したその他のアンチコードオリゴマー類に比べて、優れた細胞生存抑制作用を有することを示している。
bcl−2遺伝子発現のアンチセンス介在による低減の腫瘍細胞の化学療法抵抗性の逆転
以下の検討はbcl−2遺伝子の発現を指向したアンチコードオリゴマーが化学療法抵抗性を減少(逆転)させるものかどうか、すなわちアンチコードオリゴマーがbcl−2遺伝子を発現する癌腫瘍性細胞の癌化学療法剤に対する感受性を増加させるかどうかを検討するために行ったものである。
多様な癌化学療法剤、たとえば下記に限定されるわけではないが、Ara−C、MTX、ビンクリスチン、タキソール、シスプラチン、アドリアマイシン、エトポシド、ミトザントロン、2−クロロデオキシアデノシン、デキサメタゾン(DEX)、およびアルキル化剤などの効能に対して、高レベルのbcl−2タンパクはリンパ腫細胞の相対的抵抗性を増加させるように思われる(ミヤシタ,Tおよびリード,J.C.,Cancer Res.52:5407,1992年10月1日)。これらの薬剤は多様な生化学的作用メカニズムを有するが、これらはすべて共通してアポプトシスを起こさせる内因性の細胞経路を賦活することによって最終的に癌細胞の死を引き起こさせる能力を有するものと考えられている(イーストマン,A.Cancer Cells 2:275(1990))。本願請求の範囲のアンチコード分子およびそれらの相同体はここで使用されているように、代謝拮抗物質、アルキル化剤、植物アルカロイド、および抗生物質などの癌化学療法剤、ただしこれらに限定されるものではないが、の感受性を増強させる目的に有効であると考えられている。
代謝拮抗物質としては、特に限定されないが、メトトレキサート、5−フルオロウラシル、6−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素、2−クロロデオキシアデノシンなどが含まれる。
アルキル化剤としては、特に限定されないが、シクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、シスプラチン、パラプラチン、クロルアンブシル、およびナイトロジェンマスタードなどが含まれる。
植物アルカロイドとしては、特に限定されないが、ビンクリスチン、ビンブラスチン、VP−16などが含まれる。
抗生物質としては、特に限定されないが、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、ダウノルビシン、マイトマイシンC、ブレオマイシンなどが含まれる。その他の癌化学療法剤としては、DTIC(デカルバジン)、mAMSA、ヘキサメチルメラミン、ミトロキサントロン、タキソール、エトポシド、デキサメタゾンなどが含まれる。
本検討においては、3'−最内部ヌクレオシド結合だけがチオエート結合(PO/PS)であるヌクレアーゼ抵抗性ホスホロチオエート(PS)およびホスホジエステルを使用した。このPO/PSオリゴマーは3'エキソヌクレアーゼ(血清の基本的ヌクレアーゼ活性)に対して抵抗性があり、通常標的RNAとともにより安定な異種複合体を形成する。
細胞内コンパートメントへのオリゴマーの効果的な取り込みとその後の放出を改善するためにカチオン脂質を使用したが、これは本願請求の範囲のアンチコードオリゴマーの薬学的キャリヤの一例である。
本検討で使用したアンチセンス(AS)およびスクランブル(SC)18'merオリゴヌクレオチドを調製し、精製する方法は上記の一般的な方法およびキタダら(Antisense R&D,3:157(1993))に記述されている。ホスホジエステルオリゴヌクレオチドをホスホロアミデートの化学とヨウ素による酸化を利用して10−15マイクロモルスケールで合成し、次いでC18−逆相カラムを使用して精製した。ほとんどの場合、非特異的な細胞毒性活性を除去するためにオリゴマーをさらに5回エタノール沈降させ、次いで乾燥し、滅菌したHL−1培地(Ventrex Labs, Inc;Burlingame,CA)に1−10mMで再懸濁した。この溶液のpHは、培地中のフェノールレッド標示試薬が本来の色に回復するまで、1−10M NaOHを使用して
調節した。
使用した基本的オリゴマーは18−merで、以下のいずれかの配列を有するものである:
I.TCTCCCAGCGTGCGCCAT(配列番号17)、これはヒトbcl−2オープンリーディングフレーム(配列番号19)の最初の6つのコドンのアンチセンスである;または
II.TGCACTCACGCTCGGCCT(配列番号18)、これは対照として使用したスクランブル型である。
bcl−2遺伝子またはbcl−2 mRNAに結合するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドいずれかを発現する腫瘍細胞を作るために標準形質転換法を使用した。ベクターもまたbcl−2プレ−mRNAに結合するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドをコードすることができると考えられる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードする特定のヌクレオチド配列は、腫瘍細胞中のbcl−2遺伝子発現を低減させるのに充分なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを発現し、かつ癌化学療法剤に対する腫瘍細胞の感受性を増加させるか、または癌化学療法剤で処理した場合に腫瘍細胞を殺すのに充分な配列を選択する以外は重要ではない。ベクターにコードされたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドが腫瘍細胞中のbcl−2遺伝子発現を低減させるのに充分な条件で発現されることだけが必要である。遺伝子をほ乳類細胞に転移させるためのベクターならびに、特に発現プラスミドを調製する方法は、分子生物学の分野における通常の手法による。本発明で使用する発現プラスミドを調製する一般的な方法を開示した基本的なテキストはMolecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,サンブルックら編,ColdSpring Harbor Laboratory Press,(1989)であり、特に培養ほ乳類細胞へのクローン化遺伝子の発現に関する第16章である。以下の実施例15C−Dは、本発明で使用した発現プラスミドを調製する特定の方法を記述したものである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを転移するのに用いられる特定のベクターは決定的なものではなく、それらベクターとしてはラムダおよび関連ファージまたは糸状ファージ由来のベクターでよい。必要なことは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードし転移されるヌクレオチド配列が、腫瘍細胞中でbcl−2遺伝子発現を低減させるのに充分な条件下で形質転換腫瘍細胞中に発現されることだけである。本発明は、リコンビナントレトロウイルスベクター(リードら,T細胞リンパ細胞種におけるbcl−2介在腫瘍化:C−MYCとの相乗効果およびbcl−2アンチセンスによる抑制,PNAS USA 87:3660(1990))のような他のベクターの介在によって、染色体外の位置(たとえば、発現プラスミドから)または宿主ゲノム自体、すなわち組み込まれた位置、のいずれかのアンチセンスオリゴヌクレオチドの発現を含むものである。
散在性、組織球腫、非ホジンスリンパ腫を使用して得られたリンパ腫細胞種SU−DHL−4(エプスタインら、B5ホルマリン固定、パラフィン埋め込み組織で反応性のある2つの新しいモノクローナル抗体(LN−1、LN−2)、小胞状センターとマントルゾーンを有するヒトBリンパ球および派生腫瘍.J.Immunol.133:1028(1984))およびt(14;18)転座を含むものを、bcl−2m RNAの最初の6つのコドンへの結合を標的とするために18−mer合成bcl−2−ASオリゴデオキシヌクレオチドで処理した。対照として、SU−DHL−4細胞を、ASオリゴマーと同じヌクレオシド組成を有するが塩基の配列はスクランブル型(SC)である18−merを含む各種の対照オリゴマーで処理した。
ンプルのタンパク含有量を規定量(25μg)に調整し、SDS−PAGE(12%ゲル)によるタンパクのサイズ分画を行い、リードら,Cancer Res.51:6529(1991)に記載のイムノブロットアッセイを行うためにニトロセルロースフィルターに移した。予備実験において全タンパク量として25μgを含む溶液アリコートはアッセイの直線部分に入ることが確認された。ブロットは最初に、ヒトbcl−2タンパク(前記配列番号21)のアミノ酸(aa)41−54に相当する合成ペプチドに向けられた0.1%(v.v)のウサギ抗血清とインキュベートし、次いで2.8μg/mLのビオチニル化ヤギ抗ウサギIgG(Vector Labs, Inc.)とインキュベートした。次にp26−Bcl−2に対応するバンドをホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)−アビジン−ビオチン複合試薬(VectorLabs Inc.)および3,3'−ジアミノベンジジン(DAB)を使用して発色させ、可視化した。次に、着色したブロットをBcl−2タンパク(配列番号21)のaa61−76に向けられた第2の抗−Bcl−2抗体とインキュベートし、さらに0.25μCi/mLの*125I−タンパクAとインキュベートした。Bcl−2バンドをブロットから切り取り、ガンマ計測にかけた。
SU−DHL−4細胞を、無血清培地y(13,19)1mL当り5μgのカチオン脂質(リポフェクチン;BRL/Gibco,Inc.)を複合化した0.83μg/mLのオリゴマーとともに培養した。図8Aにおいて、RNA全量を1日後に細胞から単離し、bcl−2およびグリセルアルデヒド3'−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)mRNAの相対レベルを、キタダら,AntisenseR&D 3:157(1993)に記載のRT−PCRアッセイで評価した。
開始RNAの量の変動はGAPDH mRNAに特異的なプライマーを使用したRT−PCR分析によりコントロールした。
bcl−2タンパクの長い半減時間(約14時間)はbcl−2タンパクのAs介在による減少がbcl−2 mRNAの減少ほど劇的でないことを示すものであり、達成するのに長時間(約3日間)かかり、かつ変動が大きいようである。
本検討はSU−DHL−4細胞をbcl−2 AS−オリゴマーで処理した場合に、抗癌剤であるAra−C,MTX,およびDEXなどの癌化学療法剤による細胞死に対する相対的な感受性を増加させるものかどうかを調べるために行った。
以前の対照検討においてbcl−2ASオリゴマーはSU−DHL−4細胞成長および生存に、少なくとも培養の最初の3日間はわずか、またはまったく効果のないことが示されている(キタダら,Antisense R&D 3:157(1993))。これらのリンパ腫細胞ならびにその他の細胞におけるbcl−2タンパクレベルのAS介在による減少は、典型的には、培養中の細胞から血清成長ファクターが取り除かれないかぎり、細胞死滅速度を加速しない(リードら,Proc.Natl.Asad.Sci.USA87:3660(1990))。
化学療法抗ガン剤に対する感受性を高めるためのbcl−2ASオリゴマーの配列特異性を更に確認するため、ヒトbcl−2タンパクまたはbcl−2と22%しか相同性を有しないbcl−2のウイルスホモローグであるBHRF−1のいずれかをコードする発現プラスミドを安定的に移入させたインターロイキン−3(IL−3)依存のマウス造血細胞株32D.C13を用いた研究を行った。32D.C13細胞はペンシルバニア州フィラデルフィアのウィスター研究所のジョバンニ・ロベラ(Giovanni Rovera )博士から入手した。
予備実験によれば、IL−3を32D.C13細胞から離脱させると、内因性マウスbcl−2タンパクのレベルが減少し、細胞は死枯した。bcl−2とBHRF−1は、IL−3が存在しない状態で32D.C13細胞の生存を同程度にサポートした。これらタンパクを高レベルで含む32D.C13細胞の増殖率は、IL−3の存在下においてはほぼ同じであった。従って、これらの変数を化学的感受性の差異を説明するものとして除外している。
別の方法を用いて、他のトランスローケーションt(14;18)含有リンパ腫株であるRS11846中の重金属応答性ヒトメタロイオネインIIAプロモーターを使用した誘発性bcl−2 AS発現プラスミドが、bcl−2遺伝子発現 をASの媒介によって減少させ得るかどうかを調べた。RS11846はカーロ・クロース(Carlo Croce )博士から入手した(ペンシルバニア州フィラデデルフィアのウィスター研究所(ツジモトとクロース、Proc.Natil.Acad.Sci.USA、83:5214(1986))。
コントロールまたはbcl−2−Asプラスミドのいずれかを含むRS11846細胞を、0.5μMのCdCl2または50μMのZnCl2内で各種時間培養した場合、これら2つの細胞株の成長速度には著しい差はみられなかった(図11(b))。従って、Bcl−2タンパクレベルのAS介在による減少は、それ自身ではRS11846細胞の増殖または生存を損なうことはなかった。
Claims (18)
- (i)配列TCTCCCAGCGTGCGCCAT(配列番号17、当該配列中の少なくとも1個のヌクレオシド間結合がフォスフォロチオエート結合である)を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドからなるアンチコードオリゴマー;(ii)1又は2以上の癌化学療法剤;および(iii)医薬として許容される担体、を含有することを特徴とする、bcl−2タンパクを高レベルで発現している癌治療用医薬組成物。
- 各内部ヌクレオチドフォスフェート結合中の非ブリッジ酸素の一つがイオウ原子に置換しているものである請求項1記載の医薬組成物。
- アンチコードオリゴマーが、フォスフォジエステル/フォスフォロチオエートのキメラである請求項1記載の医薬組成物。
- フォスフォジエステル/フォスフォロチオエートのキメラが、少なくとも2個のフォスフォロチオエート結合を有するものである請求項3記載の医薬組成物。
- フォスフォジエステル/フォスフォロチオエートのキメラが、少なくとも3個のフォスフォロチオエート結合を有するものである請求項4記載の医薬組成物。
- 癌が、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、プレB−細胞型のリンパ性白血病、神経芽細胞腫、鼻咽頭カルチノーマ、前立腺アデノカルチノーマ、胸部アデノカルチノーマ、又は大腸アデノカルチノーマである請求項1記載の医薬組成物。
- 癌がリンパ腫、又は白血病である、請求項1記載の医薬組成物。
- 癌が前立腺、胸部、消化管、または大腸のアデノカルチノーマである、請求項1記載の医薬組成物。
- ヒト用である請求項1〜8のいずれか1項記載の医薬組成物。
- アンチコードオリゴマーが、全てのヌクレオシド間結合がフォスフォロチオエート結合であることで特徴づけられる、請求項1記載の医薬組成物。
- 医薬として許容される担体がカチオン性脂質であることを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。
- アンチコードオリゴマーがリポソームに包まれていることを特徴とする、請求項1記載の医薬組成物。
- 癌化学療法剤がデカルバジン、パクリタキセル、エトポシド、2−クロロデオキシアデノシン、デキサメタゾン、mAMSA、ヘキサメチルメラミン及びミトロキサントロンから選択される、請求項1記載の医薬組成物。
- 癌化学療法剤が代謝拮抗物質、アルキル化剤、植物アルカロイド及び抗生物質から選択される、請求項1記載の医薬組成物。
- 代謝拮抗物質がメトトレキサート、5−フルオロウラシル、6−メルカプトプリン、シトシンアラビノシド、ヒドロキシ尿素及び2−クロロデオキシアデノシンから選択される、請求項14記載の医薬組成物。
- アルキル化剤がシクロホスファミド、メルファラン、ブスルファン、シスプラチン、パラプラチン、クロルアンブシル及びナイトロジェンマスタードから選択される、請求項14記載の医薬組成物。
- 植物アルカロイドがビンクリスチン、ビンブラスチン及びVP−16から選択される、請求項14記載の医薬組成物。
- 抗生物質がドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシンC及びブレオマイシンから選択される、請求項14記載の医薬組成物。
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