JP2009013077A - 中皮腫の治療剤及び治療方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の中皮腫の治療剤及び治療方法の提供を目的とする。
【解決手段】本発明はセラミドを有効成分とする、中皮腫、特に、悪性の中皮腫の治療剤を提供するものであり、また、該治療剤を用いた中皮腫、特に、悪性中皮腫の治療方法を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明はセラミドとその付加塩又はそれらの水和物、並びにそれらの化合物を含有する医薬組成物に関する。

中皮腫とは、肺、心臓、胃腸、肝臓などを包んでいる膜の表面を覆っている中皮細胞が腫瘍化したものである。中皮腫には、悪性と良性が存在するが、悪性中皮腫は予後が悪く、その治療法の早期確立が強く望まれている。
胸膜、腹膜に発生する悪性中皮腫の多くは、アスベストを吸引したことが原因で発生することが分かっており、吸引から発生までの期間が非常に長いという特徴を有している（最短で３０年〜４０年）。

悪性中皮腫には限局性のものと、びまん性のものがあり、多くはびまん性で胸膜や腹膜などに広範に浸潤し、広がっていく。現在のところ、効果的な治療法は確立されておらず、外科的な治療、放射線療法、化学療法などが行われているが、非常に予後が不良であるため、発生が確認されてから数年以内に死亡するケースが多い。中皮腫の治療に有効なものとして、これまでにメチロール含有化合物（特許文献１）、４−ピリジルメチルフタラジン誘導体（特許文献２）、ウィルムス腫瘍抗原ポリペプチド断片（特許文献３）などが報告されているが、実際に治療効果を示す段階には至っていない。

一方、抗腫瘍剤として、セラミド類似体（特許文献４）、スフィンゴミエリン（特許文献５）などが有効であるとの報告も行われている。しかしながら、これらの化合物が中皮腫に効果的に作用することなどは明らかとなっておらず、現状においては、中皮腫の有効な治療方法、治療剤は依然として不明のままである。

特開２００５−１０４９８２号 特開２００６−５０７３１９号 ＷＯ０１／０６２９２０号 ＷＯ０１／００７４１８号 ＷＯ００／５７９１６号

本発明は、中皮腫を効果的に治療するための治療剤、治療方法の提供を目的とする。

本発明者らは、中皮腫の治療剤として効果的な薬剤の創出を目的に、鋭意研究を重ねた結果、下記一般式で表されるセラミドが中皮腫に治療に効果を示すことを見出し、本発明を完成した。即ち本発明は、
一般式（１）〜（５）

[式中、ｎ１は１０〜１６の整数を表し、Ｒは炭素数１〜３４の直鎖又は分岐の飽和、不飽和又はヒドロキシの炭化水素基

（ただし、ｍは０〜３３の整数を表す）のいずれかである]
一般式（２）：

[式中、ｎ２は９〜１５の整数を表し、Ｒは炭素数１〜３４の直鎖又は分岐の飽和、不飽和又はヒドロキシの炭化水素基

（ただし、ｍは０〜３３の整数を表す）のいずれかである]
一般式（３）：

[式中、ｎ３は９〜１５の整数を表し、Ｒは炭素数１〜３４の直鎖又は分岐の飽和、不飽和又はヒドロキシの炭化水素基

（ただし、ｍは０〜３３の整数を表す）のいずれかである]
一般式（４）：
[式中、ｎ４は１１〜１７の整数を表し、Ｒは炭素数１〜３４の直鎖又は分岐の飽和、不飽和又はヒドロキシの炭化水素基

（ただし、ｍは０〜３３の整数を表す）のいずれかである]
一般式（５）：

[式中、ｎ５は１２〜１８の整数を表し、Ｒは炭素数１〜３４の直鎖又は分岐の飽和、不飽和又はヒドロキシの炭化水素基

（ただし、ｍは０〜３３の整数を表す）のいずれかである]
で表されるセラミド、若しくはその薬剤上許容される塩又はそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする中皮腫治療剤である。

本発明に係る薬剤は、中皮腫の腫瘍細胞の増殖を抑制し、死滅させる効果を有する。

一般式（１）〜（５）において、Ｒは、炭素数１〜３４の直鎖又は分岐の飽和、不飽和又はヒドロキシの炭化水素基のいずれかであってもよいが、直鎖の飽和炭化水素基が好ましい。
ｎ１は１０〜１６、ｎ２は９〜１５、ｎ３は９〜１５、ｎ４は１１〜１７、ｎ５は１２〜１８の整数を表す。
また、ｍは０〜３３の整数を表す。
好ましくは、式（１）において、ｎ１が１２のときｍが０又は１６であり、式（２）においてｎ２が１１のときｍが２２であり、式（３）においてｎ３が１１のときｍが２１である。最も好ましくは、式（１）において、ｎ１が１２のとき、ｍが０である。

本発明の一般式（１）〜（５）で表される化合物は、当業者にとって公知の方法より製造することができるが、市販のもの（例えば、Sigma A7191 N-Acetyl-D-sphingosine）を入手することもできる。

本発明に係る薬剤は、生体に対して悪影響を及ぼさない医薬組成物の形態で中皮腫の治療薬として使用することができる。通常、そのような組成物には、本発明の化合物の他、薬剤上許容される担体が含まれる。
「薬剤上許容される担体」は、溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌及び抗真菌剤、アイソトニックに作用して吸着を遅らせる薬剤及びその類似物を含み、薬剤的投与に適するもののことである。該担体及び該担体を希釈するために好ましいものの例には、限定はしないが、水、生理食塩水、フィンガー溶液、デキストロース溶液、コラーゲン、ヒト血清アルブミン、有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等などが含まれる。また、リポソーム及び不揮発性油などの非水溶性媒体も用いられる。さらに、本発明の化合物の活性を保護又は促進するような特定の化合物が、該組成物中に包含されていてもよい。

本発明に係る医薬組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入なども含む）、経皮及び経粘膜への投与を含み、治療上適切な投与経路に適合するように製剤化される。非経口、皮内、又は皮下への適用に使用される溶液又は懸濁液には、限定はしないが、注射用の水などの滅菌的希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒、ベンジルアルコール又は他のメチルパラベンなどの保存剤、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなどの無痛化剤、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、酢酸塩、クエン酸塩、又はリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウム又はデキストロースなど浸透圧調製のための薬剤を含んでもよい。
ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調製することができる。非経口的標品はアンプル、ガラスもしくはプラスチック製の使い捨てシリンジ又は複数回投与用バイアル中に収納される。

注射に適する医薬組成物には、滅菌された注射可能な溶液又は分散媒を、使用時に調製するための滅菌水溶液（水溶性の）又は分散媒及び滅菌されたパウダーが含まれる。静脈内の投与に関し、適切な担体には生理食塩水、静菌水、又はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。注射剤として使用する場合、組成物は滅菌的でなくてはならず、また、シリンジを用いて投与されるために十分な流動性を保持していなくてはならない。該組成物は、調剤及び保存の間、化学変化及び腐食等に対して安定でなくてはならず、細菌及び真菌などの微生物由来のコンタミネーションを防止する必要がある。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及び適切な混合物を含む溶媒又は分散媒培地を使用することができる。例えば、レクチンなどのコーティング剤を用い、分散媒においては必要とされる粒子サイズを維持し、界面活性剤を用いることにより適度な流動性が維持される。種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールなどは、微生物のコンタミネーションの防止に対して使用可能である。また、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール及び塩化ナトリウムのような等張性を保つ薬剤が組成物中に含まれてもよい。吸着を遅らせることができる組成物には、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が含まれる。

滅菌的な注射可能溶液は、必要な成分を単独で、又は他の成分と組み合わせた後に、適切な溶媒中に必要量の活性化合物を加え、滅菌することで調製される。一般に、分散媒は、基本的な分散培地及び上述したその他の必要成分を含む滅菌的媒体中に活性化合物を取り込むことにより調製される。滅菌的な注射可能な溶液を調製するための滅菌的パウダーの調製方法には、活性な成分及び滅菌溶液に由来する何れかの所望な成分を含むパウダーを調製する真空乾燥及び凍結乾燥が含まれる。

経口組成物には、不活性な希釈剤又は体内に取り込んでも害を及ぼさない担体が含まれる。経口組成物には、例えば、ゼラチンのカプセル剤に包含されるか、加圧されて錠剤化される。経口的治療のためには、活性化合物は賦形剤と共に取り込まれ、錠剤、トローチ又はカプセル剤の形態で使用される。また、経口組成物は、流動性担体を用いて調製することも可能であり、流動性担体中の該組成物は経口的に適用される。さらに、薬剤的に適合する結合剤、及び／又はアジュバント物質などが包含されてもよい。
錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ及びその類似物は以下の成分又は類似の性質を持つ化合物の何れかを含み得る：微結晶性セルロースのような賦形剤、アラビアゴム、トラガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトースなどの、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、又はコーンスターチなどの膨化剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳＴＲＲＯＴＥＳなどの潤滑剤；コロイド性シリコン二酸化物などの滑剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味剤；又はペパーミント、メチルサリチル酸又はオレンジフレイバーなどの香料添加剤。

本発明の化合物は、植込錠及びマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの、生物分解性、生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬剤的に受容可能な担体として使用することができる。有用なリポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノール（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製される。

本発明の化合物による特定の疾患の予防又は治療において、適切な投与量レベルは、投与される患者の状態、投与方法等に依存するが、当業者であれば、容易に最適化することが可能である。
注射投与の場合は、例えば、一日に患者の体重あたり約０．１μｇ／ｋｇから約５００ｍｇ／ｋｇを投与するのが好ましく、一般に一回又は複数回に分けて投与され得るであろう。好ましくは、投与量レベルは、一日に約０．１μｇ／ｋｇから約２５０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日に約０．５μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。
経口投与の場合は、組成物は、好ましくは１．０から１０００ｍｇの活性成分を含む錠剤の形態で提供され、好ましくは活性成分が１．０，５．０，１０．０，１５．０，２０．０，２５．０，５０．０，７５．０，１００．０，１５０．０，２００．０，２５０．０，３００．０，４００．０，５００．０，６００．０，７５０．０，８００．０，９００．０及び１０００．０ｍｇである。化合物は一日に１〜４回の投与計画で、好ましくは一日に一回又は二回投与される。

医薬組成物又は製剤は、一定の投与量を保障すべく、均一単位投与量により構成されなくてはならない。単位投与量は、患者の治療に有効な一回の投与量を含み、薬剤的に受容可能な担体と共に製剤化された一単位のことである。本発明の単位投与量を決定する場合には、製剤化される化合物の物理的、化学的特徴、期待される治療上の効果、及び該化合物に特有な製剤化における留意事項等により影響を受ける。

本発明の医薬組成物はキットの形態で、容器、パック中に投与の説明書と共に含めることができる。本発明に係る薬剤組成物がキットとして供給される場合、該薬剤組成物のうち異なる構成成分が別々の容器中に包装され、使用直前に混合される。このように構成成分を別々に包装するのは、活性構成成分の機能を失うことなく長期間の貯蔵を可能にするためである。

キット中に含まれる試薬は、構成成分が活性を長期間有効に持続し、容器の材質によって吸着されず、変質を受けないような何れかの種類の容器中に供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性ガスの下において包装されたバッファーを含む。アンプルは、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレンなどの有機ポリマー、セラミック、金属、又は試薬を保持するために通常用いられる他の何れかの適切な材料などから構成される。他の適切な容器の例には、アンプルなどの類似物質から作られる簡単なボトル、及び内部がアルミニウム又は合金などのホイルで裏打ちされた包装材が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、シリンジ、又はその類似物が含まれる。容器は、皮下用注射針で貫通可能なストッパーを有するボトルなどの無菌のアクセスポートを有する。

また、キットには使用説明書も添付される。当該医薬組成物からな成るキットの使用説明は、紙又は他の材質上に印刷され、及び／又はフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、オーディオテープなどの電気的又は電磁的に読み取り可能な媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明は、キット内に実際に添付されていてもよく、あるいは、キットの製造者又は分配者によって指定され又は電子メール等で通知されるウェブサイトに掲載されていてもよい。

さらに、本発明には、中皮腫に罹患した、又は罹患する危険性のある哺乳動物の該疾患に関する予防又は治療方法も含まれる。
ここで「治療」とは、中皮腫に罹患するおそれがあるか又は罹患した哺乳動物において、中皮腫の病態の進行を阻止又は緩和することを意味し、治療的処置のみならず予防的処置をも含む広い意味として使用される。
治療の対象となる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、特に限定はしないが、例えば、ヒトの他、イヌ、ネコなどのペット動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの家畜動物などのことである。特に好ましい「哺乳動物」は、ヒトである。

以下に本発明のセラミドの１例として、Ｃ２−セラミドを用いて、セラミドの中皮腫細胞への影響について詳細に記載する。

〔実施例１〕Ｃ２−セラミド（６）の中皮腫細胞への影響
式（６）で示されるセラミド（以下、Ｃ２−セラミドと称する）が、中皮腫細胞へ与え
る様々な影響について検討した。
本実施例で使用したＣ２−セラミドは、Ｓｉｇｍａ社（Sigma A7191 N-Acetyl-D-sphingosine）から入手した。

１．材料と方法
１−１．細胞培養
ＡＣＣ−及びＹ−中皮腫細胞は、関戸好孝博士（愛知県立がんセンター）より供与頂いた。細胞は、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）及び抗生物質（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＵＫ）中で、３７℃、５％ＣＯ_２条件下で培養した。実験を行う１２−１８時間前に１×１０^６細胞をディッシュに播種した。Ｃ２−セラミドはＤＭＳＯに溶解させて使用した。
１−２．トリパンブルー排除法
中皮腫細胞の成長又は細胞死に対するＣ２−セラミドの効果は、トリパンブルー排除法によって測定した。細胞（３×１０^５）は、種々の濃度のＣ２−セラミドの存在下又は非存在下において２４時間培養した。その後、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳに懸濁した。培養液中に浮遊する死細胞とトリプシン処理された細胞の数をトリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ）中で、ヘモサイトメーターを用い、顕微鏡下にてカウントした。
１−３．細胞増殖アッセイ
細胞増殖の測定は、９６−ウェル細胞培養プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて行った。中皮腫細胞は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０中に、各ウェルあたり、約０．１−０．５×１０^５細胞の初期密度となるように播き、各ウェルに種々の濃度のＣ２−セラミドを添加したのち、総体積を２００μｌとした。その後、細胞をウェル接着させるため２４時間インキュベートした。セラミド依存下での培養をコントロールとして用いた。細胞の数はＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８；Ｗａｋｏ）を用いて測定した。１０μｌのＣＣＫ−８溶液をプレートの各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２の加湿インキュベーター中で１時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞の増殖の程度を４５０ｎｍにて、比色法により決定した（Ｔｉｔｅｒｔｅｃ Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ Ｐｌｕｓ，Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＭｃＬｅａｎ，ＶＡ，ＵＳＡ）。細胞数はスタンダード曲線と比較して、吸光度から算出した。

１−４．フローサイトメーター分析
細胞を６ウェルプレート中で培養し、接着細胞及び浮遊細胞を集め、遠心により沈殿させ、ＰＢＳで洗浄後、冷７０％エタノール中、−２０℃にて一晩固定した。細胞を洗浄した後、１．０ｍｌのヨウ化プロピジウム溶液（１００μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ ヨウ化プロピジウム）に懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。アポトーシス細胞は、ＦＡＣＳｏｒｔ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｋｉｎｓｏｎ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、４８８ｎｍでアッセイし、データは、ＣＥＬＬ Ｑｕｅｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅで解析した。サブ−Ｇ_１期のヨウ化プロピジウムの取り込みのある細胞がアポトーシスを起こしていると考えられる。アポトーシス細胞のパーセンテージは、全細胞集団に対するサブ−Ｇ１細胞集団の割合として計算した。
１−５．ＤＮＡ断片化解析
Ｃ２−セラミド（８０μＭ）又はＤＭＳＯ（０．４％）の処理後２４時間において、接着した中皮腫細胞と非接着の中皮腫細胞を、アッセイを行うために沈殿に回収した。細胞を１ｍｌのＰＢＳでリンスした後、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｌａｄｄｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｗａｋｏ，Ｊａｐａｎ）を使用し、説明書に従って、細胞からＤＮＡを抽出した。抽出の間、サンプルをＲＮａｓｅ（０．１μｇ／ｍｌ）と３７℃で６０分間インキュベートした。抽出したＤＮＡは、１．５％アガロースゲルで電気泳動し、Ｃｈｅｍｉ ＤｏｃＸＲＳ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）を用いて、断片化のパターンを視覚化し検出した。
１−６．カスパーゼ３アッセイ
タンパク質の濃度は、ＢＳＡをスタンダートとしてブラッドフォード法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で測定した。カスパーゼ−３活性は、Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ，ＵＳＡ）を説明書に従って使用し、ＭｕｌｔｉＳｃａｎ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒでアッセイを行った。

１−７．乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイ
細胞に対する毒性は、細胞からの乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の放出を測定することにより決定した。中皮腫細胞を、８０μＭのＣ２−セラミドで、１時間、６時間、１２時間及び２４時間処理した後、培養上清をＬＤＨ活性のアッセイに使用した。ＬＤＨは、日本臨床化学会認定の方法に従い（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ＣＫ Ｒｅｃｏｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａｅｎｄｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｍｅｔｈｏｄ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｓｃｉ １９９２；２１：１５９−１６０；Ｏｈｓａｗａ Ｓ．Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＬＤ，ＣＫ．Ｊ Ｍｅｄ Ｔｅｃｈ １９９３；３７：５１２−５１８）、日立型自動化学分析器（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で解析した。
１−８．ウェスタンブロッティング
細胞は、ホモジナイズ用バッファー（１０ｍＭ リン酸ナトリウム、１０ｍＭ フッ化ナトリウム、１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１μｌ／ｍｌ プロテアーゼインヒビター混合物（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｅｈｍｉｃａｌｓ）、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））で集めた。その後、細胞をソニケート（超音波処理で破砕し）し、遠心した。上清中のタンパク質濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて測定した。抽出したタンパク質（４０μｇ）を１０又は１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動し、ＰＶＤＦ膜に転写した。タンパク質が転写されたＰＶＤＦ膜を１次抗体で、４℃、一晩インキュベートし、ＴＴＢＳ（０．５％ ツイーン２０／ＴＢＳ）で１回、ＴＢＳで３回洗浄した。洗浄後ＰＶＤＦ膜を２次抗体で、室温、１時間インキュベートし、ＴＴＢＳで１回、ＴＢＳで３回洗浄した。次に、抗体−抗原複合体をｐｈｏｔｏｔｏｐｅ−ＨＲＰウェスタンブロット検出システム（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用し、Ｃｈｅｍｉ Ｄｏｃ ＸＲＳ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で検出した。シグナル強度は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定量した。

１−９．インビボの実験
培養細胞（５×１０^６）を洗浄し、０．３ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、６週齢のＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）マウスの右背部の皮下にインジェクトした。また、コントロールとして０．３ｍｌのＰＢＳのみを、コントロールマウス群の右背部の皮下にインジェクトした。中皮腫細胞のインジェクション７日後、腫瘍が明らかに見分けられる頃（腫瘍サイズが直径６−９ｍｍ程度）にセラミドによる処理を開始した。ＡＣＣ−及びＹ−中皮腫細胞を各々６匹のマウスに移植し、各グループ、以下の処理を行った：１）溶媒のみのコントロール（ＤＭＳＯ，１％）、２）Ｃ２−セラミド（０．０４６ｍｇ）を腫瘍に直接インジェクション（ＤＩ）、３）Ｃ２−セラミド（０．１３７ｍｇ）を腹腔内へインジェクション（ＩＰ）。Ｃ２−セラミドは、１日おきに、ＤＩ（０．２ｍｌ ＰＢＳ）又はＩＰ（０．４ｍｌ ＰＢＳ）処理を行った。処理後、マウスの腫瘍サイズを一日おきに測定した。腫瘍体積は、キャリパーを用いて長さ×幅^２×０．５で算出した。本研究は、東京大学動物実験委員会の承認を受け、マウスの扱いは、そのガイドラインに従って行った。腫瘍組織を摘出し、１０％ リン酸バッファーホルマリン液中で固定した。組織をパラフィンに包埋し、切片化し、ヘマトキシリン−エオシン染色を行った。組織サンプルは組織学的検査に使用した。
１−１０．統計分析
結果は、値±標準偏差として示す。統計分析は独立スチューデントテストを用いて行った。グループ間の腫瘍体積の差は、２ウェイ分散分析を用いて統計的有意を検査した（ＡＮＯＶＡ）。ｐ値＜０．０５を統計的に有意とした。

２．結果
２−１．Ｃ２−セラミドによる中皮腫細胞の増殖阻害
Ｃ２−セラミドは、ＡＣＣ−及びＹ−中皮腫細胞の成長を濃度依存的（５〜８０μＭ）、時間依存的（３〜２４時間）に阻害した（図１及び図２）。８０μＭのＣ２−セラミドにより、ＡＣＣ−中皮腫及びＹ−中皮腫の成長が、各々、２８．５％及び２３．７％抑制された。一方、Ｃ２−セラミドを溶解したＤＭＳＯには有意の抑制効果は認められなかった。これらの結果から、以降の実験では、８０μＭのＣ２−セラミドを使用することとした。
２−２．Ｃ２−セラミド誘導アポトーシスの測定
Ｃ２−セラミドにより誘導される細胞増殖の阻害がアポトーシスによるかどうかを検討するため、アポトーシス情報伝達系の主要な阻害因子であり、細胞死プログラムの担い手であるカスパーゼ３活性のアッセイを行った。検討した２つの細胞株において、８０μＭのＣ２−セラミドの抗増殖効果は、カスパーゼ３活性の増大とパラレルに上昇した。予想通り、ＡＣＣ−中皮腫細胞中のカスパーゼ３活性は添加後６時間以内に上昇しはじめ、１２−１６時間後にピークに達した（図３Ａ及びＢ）。これらの結果から、Ｃ２−セラミドを誘導する細胞死は、カスパーゼ３によって担われていることが明らかとなった。
２−３．乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）解析
次に、ＬＤＨアッセイを使用して、Ｃ２−セラミド処理後の細胞の生存に対するＣ２−セラミドの影響を評価した。死に向かう細胞はＬＤＨを培養液中に放出する。Ｃ２−セラミド（８０μＭ）は、無処理のグループと比較すると、乳酸デヒドロゲナーゼの放出を有意に増大させた（図４）。

２−４．ＦＡＣＳ解析を用いたＣ２−セラミドによるアポトーシスの検出
ＡＣＣ−（図５Ａ）及びＹ−（図５Ｂ）中皮腫細胞が時間依存的にアポトーシスを起こすことをＦＡＣＳ解析により示した。Ｃ２−セラミドの処理により中皮腫細胞が特異的な細胞周期のパターンを示すかどうかを検討した。Ｇ_０−Ｇ_１期にある細胞の割合が増加し、ＡＣＣ−及びＹ−中皮腫細胞のいずれにおいてもサブＧ_１期の存在が認められた。サブＧ_１期にある細胞はアポトーシス状態にあると考えられている。Ｇ_０−Ｇ_１期にある細胞の増加の他、これに対応してＳ及びＧ_２−Ｍ期の細胞量の減少が認められる。
２−５．ヌクレオソームＤＮＡの断片化アッセイ
セラミドによって誘導されるアポトーシスをさらに確認するために、ＤＮＡの断片化について解析を行った（図６）。Ｃ２−セラミドを一過的に中皮腫細胞へ導入した２４時間後、Ｃ２−セラミドによりＤＮＡの断片化が顕著に誘導された。この場合、ＤＭＳＯのみではＤＮＡの断片化は誘導されなかった（図６、レーン２及び５）。

２−５．中皮腫細胞中の種々のタンパク質発現に対するＣ２−セラミド処理の影響
Ｂａｘはアポトーシスの制御において中心的な役割を果たしており、Ｂｃｌ−２ファミリーに属する細胞死プロモーターである。本発明において、Ｃ２−セラミド処理を行ったＡＣＣ−及びＹ−中皮腫細胞中でＢａｘが増大することが見出された。Ｃ２−セラミドで細胞を処理し、ある一定の時間後に細胞から抽出された総タンパク質に対して、抗Ｂｃｌ−２抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った（図７Ａ）。Ｂｃｌ−２は２４時間後にわずかに減少した。セラミドによって誘導されるアポトーシスには、ＭＡＰＫシグナル経路が関与していることが報告されているため、次に、中皮腫細胞においてセラミドによって誘導されるアポトーシスがＭＡＰＫサブファミリーの活性化と関連性を有するか検討した。細胞を種々の時間セラミドで処理し、ＥＲＫ及びｃ−ＪＵＮ Ｎ末端プロテインキナーゼの活性化を、各リン酸化フォームに特異的な抗体を用いウェスタンブロッティングによって検討した。図７Ｂに示される様に、セラミドはＥＲＫの活性化を誘導し、処理後６時間には明確な活性化を示した。同様に、Ｃ２−セラミドはＪＮＫの活性化に対しても顕著に影響を与えた。また、ＥＲＫの活性化は、ＥＲＫの上流キナーゼであるＭＥＫ１／２の特異的な阻害剤であるＵ０１２６によって阻害された（図７Ｄ）。さらに、Ｕ０１２６はセラミドによって誘導されるアポトーシスを濃度依存的に抑えることが明らかとなった（図７Ｃ）。以上の結果から、ＭＡＰＫがセラミドによって誘導されるＡＣＣ−及びＹ−中皮腫細胞のアポトーシスにおいて、重要な役割を果たしていることが示唆される（図７Ｃ）。

２−６．皮下に移植した腫瘍に対するインビボにおけるＣ２−セラミドの影響
インビボにおいて、Ｃ２−セラミドが中皮腫の進行を阻害するかどうか検討した。腫瘍の増殖に対するＣ２−セラミドの効果を調べるために、ヌードマウスに移植した腫瘍の体積の減少について検討した。マウスの皮下に移植した中皮腫に対し、無処理及びＣ２−セラミドを腫瘍に直接インジェクトした腫瘍の状態を図８に示す。Ｃ２−セラミドを腫瘍に直接（ＤＴ）又は腹腔内（ＩＰ）にインジェクトした３日目以降の腫瘍体積の変化を、インジェクト３日目を０日として、２０日まで測定した（図９）。腫瘍のサイズは無処理群と比較すると、Ｃ２−セラミドの処理により著しく縮小した。

本発明の治療剤及び治療方法は、これまでに有効な治療剤及び治療法が確立されていない悪性中皮腫の治療の分野に多大なる貢献をもたらすものである。

図１は、Ｃ２−セラミドが、中皮腫細胞の成長を濃度依存的に抑制することを示す結果である。Ｃ２−セラミド（２０μＭ、４０μＭ、６０μＭ及び８０μＭ）で中皮腫細胞を処理し、細胞の成長を測定した。コントロールは、０．４％ＤＭＳＯを添加した結果である。データは、コントロールグループと比較して、平均値±標準偏差、ｎ＝６で示した。^＊＊ｐ値＜０．０１ 図２は、Ｃ２−セラミド（８０μＭ）のＡＣＣ−中皮腫細胞（Ａ）及びＹ−中皮腫細胞（Ｂ）に対する影響を示す結果である。細胞を８０μＭのＣ２−セラミドで、３、６、９及び２４時間処理した。０．４％のＤＭＳＯをコントロールに使用した。ｈｒは時間を意味する。^＊＊ｐ値＜０．０１、^＊ｐ値＜０．０５ 図３は、ＡＣＣ−（Ａ）及びＹ−（Ｂ）中皮腫細胞のカスパーゼ３活性に対するＣ２−セラミド（８０μＭ）の効果を示すグラフである。種々の時点において、薬剤存在下で細胞をインキュベートした。Ｃ２−セラミドの活性化後、カスパーゼ３活性をマルチスキャン比色分析アッセイによってモニターした。結果は、Ｃ２−セラミドの存在下において、吸光度（縦軸）として表示した。各３回の実験の平均値±標準偏差である。ｈｒは時間を意味する。^＊＊ｐ＜０．０１、^＊ｐ＜０．０５（０時間の実験との比較） 図４は、Ｃ２−セラミドにより中皮腫細胞からＬＤＨが放出されることを示す結果である。ＡＣＣ−及びＹ−中皮腫細胞を、一定の時間Ｃ２−セラミド（８０μＭ）と接触させ、細胞死の程度を培地中へのＬＤＨ放出量を検出することで評価した。ＬＤＨ値は、コントロールに対して標準化し、平均値±標準偏差で示した。^＊ｐ＜０．０５（無処理グループとの比較）、ｎ＝３ 図５は、コントロール（０時間）及びＣ２−セラミドで６、１２又は２４時間処理した中皮腫細胞の核に存在するＤＮＡ量をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。ＡＣＣ−中皮腫細胞（Ａ）及びＹ−中皮腫細胞（Ｂ）のＤＮＡ量を測定した。Ｃ２−セラミドによる中皮腫細胞のアポトーシス性サブＧ_１集団の増加が明確に認められる。Ｇ_０／Ｇ_１、Ｇ_２／Ｍ及びＳ期の細胞の割合、及びサブＧ１期の細胞の割合をグラフ化した。 図６は、セラミド処理した中皮腫細胞のヌクレオソームＤＮＡの断片化アッセイの結果を示す。ＡＣＣ−（レーン１〜３）及びＹ−（レーン４〜６）中皮腫細胞をＣ２−セラミドで０時間（レーン１及び４）、２４時間（レーン３及び６）処理した。ＤＮＡの断片化をアガロースゲル電気泳動によって検出した。また、ＤＭＳＯのみの影響をレーン２及び５に示す。 図７は、ＡＣＣ−及びＹ−セラミドにおける種々のタンパク質レベルに対するＣ２−セラミド（８０μＭ）の影響を示す結果である。Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ及びアクチン抗体を用いて、各時間経過後におけるタンパク質レベルを調べた（Ａ）。また、セラミド処理後各時間経過後に抗リン酸化ＥＲＫ抗体（ｐ−Ｅｒｋ１／２）及び抗リン酸化ＪＮＫ抗体（ｐ−ＪＮＫ１／２）を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＪＮＫ及びＥＲＫ１／２のリン酸化レベルを測定した（Ｂ）。同じサンプルを用いて、ＥＲＫ１／２（Ｅｒｋ）及びＪＮＫ（ＪＮＫ）のタンパク質量も同時に測定した（Ｂ）。抽出タンパク質レベルが変動していないことを確認するために、アクチン量を抗アクチン抗体で確認した（Ｂ、Ａｃｔｉｎ）。Ｃは、Ｕ０１２６（ＭＡＰＫの阻害剤）のセラミドによって誘導されるアポトーシスへの影響を調べた結果である。無処理、ＤＭＳＯ（０．３％）処理、Ｃ２−セラミドのみの処理（Ｃ２（６０μｍ））、Ｕ０１２６のみの処理（Ｕ（１μｍ）、Ｕ（２μｍ）、Ｕ（４μｍ）、Ｕ（６μｍ））、Ｕ０１２６とＣ２−セラミドによる処理（Ｕ（１μｍ）＋Ｃ２（６０μｍ）、Ｕ（２μｍ）＋Ｃ２（６０μｍ）、Ｕ（４μｍ）＋Ｃ２（６０μｍ）、Ｕ（６μｍ）＋Ｃ２（６０μｍ））を行ったＡＣＣ−（□）及びＹ−（■）中皮腫細胞の細胞死レベルを細胞カウンティングｋｉｔ−８を用いて評価した（Ｃ２−セラミド処理と比較してｐ＜０．０５、ｎ＝６）。Ｄは、Ｃ２−セラミド処理した中皮腫細胞（ＡＣＣ又はＹ）中でのＥｒｋのリン酸化に対するＵ０１２６の影響を調べた結果である。アクチンのレベルをタンパク質総量のコントロールとして確認した（Ａｃｔｉｎ）。Ｃ２−セラミド（８０μＭ）のみ、又はＵ０１２６（６μＭ）で前処理した後Ｃ２−セラミド（８０μＭ）処理を２４時間行った後、抗リン酸化Ｅｒｋ抗体により、Ｅｒｋのリン酸化のレベルを調べた。 図８は、中皮腫細胞を移植したマウスに対する、Ｃ２−セラミド又は１％ＤＭＳＯ（コントロール）をインジェクトした後の腫瘍の様子を示した図である。 図９は、中皮腫の腫瘍体積を一日おきに測定した結果を示す。ｃｏｎｔｒｏｌはＰＢＳを、ＤＭＳＯはセラミドの代わりに１％ＤＭＳＯを腹腔内にインジェクトした。また、Ｉ．Ｐ．は腹腔内にセラミドをインジェクトしたグループ、Ｄ．Ｔ．は腫瘍に直接セラミドをインジェクトした結果である。ｐ＜０．０１（ＤＴ及びＩＰグループ共に、コントロールグループと比較して）

Claims (9)

1. 一般式（１）：
   [式中、ｎ１は１０〜１６の整数を表し、Ｒは炭素数１〜３４の直鎖又は分岐の飽和、不飽和又はヒドロキシの炭化水素基
   （ただし、ｍは０〜３３の整数を表す）のいずれかである]
   で表されるセラミド、若しくはその薬剤上許容される塩又はそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする中皮腫治療剤。
2. 前記ｎ１が１２、ｍが０である請求項１に記載の中皮腫治療剤。
3. 前記ｎ１が１２、ｍが１６である請求項１に記載の中皮腫治療剤。
4. 一般式（２）：
   [式中、ｎ２は９〜１５の整数を表し、Ｒは炭素数１〜３４の直鎖又は分岐の飽和、不飽和又はヒドロキシの炭化水素基
   （ただし、ｍは０〜３３の整数を表す）のいずれかである]
   で表されるセラミド、若しくはその薬剤上許容される塩又はそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする中皮腫治療剤。
5. 前記ｎ２が１１、ｍが２２である請求項２に記載の中皮腫治療剤。
6. 一般式（３）：
   [式中、ｎ３は９〜１５の整数を表し、Ｒは炭素数１〜３４の直鎖又は分岐の飽和、不飽和又はヒドロキシの炭化水素基
   （ただし、ｍは０〜３３の整数を表す）のいずれかである]
   で表されるセラミド、若しくはその薬剤上許容される塩又はそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする中皮腫治療剤。
7. 前記ｎ３が１１、ｍが２１である請求項２に記載の中皮腫治療剤。
8. 一般式（４）：
   [式中、ｎ４は１１〜１７の整数を表し、Ｒは炭素数１〜３４の直鎖又は分岐の飽和、不飽和又はヒドロキシの炭化水素基
   
   （ただし、ｍは０〜３３の整数を表す）のいずれかである]
   で表されるセラミド、若しくはその薬剤上許容される塩又はそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする中皮腫治療剤。
9. 一般式（５）：
   
   [式中、ｎ５は１２〜１８の整数を表し、Ｒは炭素数１〜３４の直鎖又は分岐の飽和、不飽和又はヒドロキシの炭化水素基
   
   （ただし、ｍは０〜３３の整数を表す）のいずれかである]
   で表されるセラミド、若しくはその薬剤上許容される塩又はそれらの水和物を有効成分として含有することを特徴とする中皮腫治療剤。