JP2009005649A - 核移植卵、単為発生胚および単為発生哺乳動物の作出方法 - Google Patents
核移植卵、単為発生胚および単為発生哺乳動物の作出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009005649A JP2009005649A JP2007171707A JP2007171707A JP2009005649A JP 2009005649 A JP2009005649 A JP 2009005649A JP 2007171707 A JP2007171707 A JP 2007171707A JP 2007171707 A JP2007171707 A JP 2007171707A JP 2009005649 A JP2009005649 A JP 2009005649A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- egg
- gene
- ovum
- region
- stage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 title claims abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 230000001776 parthenogenetic effect Effects 0.000 title claims description 30
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims abstract description 47
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 29
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 16
- 101150002416 Igf2 gene Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 101150102995 dlk-1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 40
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 claims description 9
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 claims description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 3
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 abstract description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 abstract description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 115
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 12
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 9
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 8
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 6
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 6
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 4
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 description 4
- 238000010449 nuclear transplantation Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 3
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 3
- 230000021595 spermatogenesis Effects 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N UNPD149280 Natural products N1C(=O)C23OC(=O)C=CC(O)CCCC(C)CC=CC3C(O)C(=C)C(C)C2C1CC1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N bucladesine Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](OC(=O)CCC)[C@@H]2N1C(N=CN=C2NC(=O)CCC)=C2N=C1 CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N 0.000 description 2
- 229960005263 bucladesine Drugs 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N cytochalasin B Natural products C[C@H]1CCC[C@@H](O)C=CC(=O)O[C@@]23[C@H](C=CC1)[C@H](O)C(=C)[C@@H](C)[C@@H]2[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O GBOGMAARMMDZGR-JREHFAHYSA-N 0.000 description 2
- GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N cytochalasin B Chemical compound C([C@H]1[C@@H]2[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]3/C=C/C[C@H](C)CCC[C@@H](O)/C=C/C(=O)O[C@@]23C(=O)N1)=C)C)C1=CC=CC=C1 GBOGMAARMMDZGR-TYHYBEHESA-N 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 2
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 230000000624 ovulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N (-)-demecolcine Chemical compound C1=C(OC)C(=O)C=C2[C@@H](NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- PXGPLTODNUVGFL-BRIYLRKRSA-N (E,Z)-(1R,2R,3R,5S)-7-(3,5-Dihydroxy-2-((3S)-(3-hydroxy-1-octenyl))cyclopentyl)-5-heptenoic acid Chemical compound CCCCC[C@H](O)C=C[C@H]1[C@H](O)C[C@H](O)[C@@H]1CC=CCCCC(O)=O PXGPLTODNUVGFL-BRIYLRKRSA-N 0.000 description 1
- 101150084229 ATXN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N Demecolcine Natural products C1=C(OC)C(=O)C=C2C(NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 description 1
- 101100496858 Mus musculus Colec12 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000008627 meiotic prophase Effects 0.000 description 1
- 210000000479 mitotic spindle apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000034004 oogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008186 parthenogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- PXGPLTODNUVGFL-UHFFFAOYSA-N prostaglandin F2alpha Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(O)C1CC=CCCCC(O)=O PXGPLTODNUVGFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150116497 sacm1l gene Proteins 0.000 description 1
- 201000003624 spinocerebellar ataxia type 1 Diseases 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229910052712 strontium Inorganic materials 0.000 description 1
- CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N strontium atom Chemical compound [Sr] CIOAGBVUUVVLOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001631 strontium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- AHBGXTDRMVNFER-UHFFFAOYSA-L strontium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Sr+2] AHBGXTDRMVNFER-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0273—Cloned vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
- C12N15/8775—Murine embryos
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
【解決手段】本発明は、(1)除核した卵核胞期卵(GV期卵)に、非成長期卵(ng卵子)を導入した後、体外成熟培養しMII期(第2減数分裂中期)まで移行させ第1核移植卵とする工程、(2)該第1核移植卵からMII期染色体を取り出し、別のMII期卵(fg卵子)に導入し第2核移植卵とする工程からなる、ng卵子およびfg卵子由来の半数体ゲノムセットを有する核移植卵を作出する方法において、ng卵子またはfg卵子として、(A)H19遺伝子およびIgf2遺伝子の発現を制御する領域(領域A)並びに(B)Gtl2遺伝子およびDlk1遺伝子を発現制御する(領域B)の双方を欠損する卵子を用い、従来法よりも成体発生率を格段に向上させたものである。
【選択図】図1
Description
このようなインプリント遺伝子の発現パターンを解析するため、本発明者は、マウスの新生仔卵母細胞由来のゲノムと成熟雌由来の卵子ゲノムから核移植卵を作出する方法を提案した(非特許文献1参照)。かかる方法は、(1)除核した卵核胞期(GV期)卵に、新生仔卵母細胞(ng卵子)を導入した後、体外成熟培養しMII期(第2減数分裂中期)まで移行させ第1核移植卵とする工程、(2)該第1核移植卵からMII期染色体を取り出し、別のMII期卵(fg卵子)に導入し第2核移植卵とする工程からなる。この方法で得られる第2核移植卵は、ng卵子由来の半数体ゲノムセットおよびfg卵子由来の半数体ゲノムセットを有する。
本来、新生仔卵母細胞(ng卵子)は、卵子成長過程の後期(マウスでは卵子の直径がおよそ60μm)になるまでは減数分裂を再開することがなく、第1減数分裂前期のディプロテン期で細胞周期を停止している。本発明者は、この細胞周期を停止している新生仔卵母細胞(ng卵子)を、十分に成長した卵母細胞の細胞質へ導入すると、減数分裂を再開することを見出し、上記方法を提案した。
その後の研究により、本発明者は、上記方法においてng卵子またはfg卵子として精子形成過程で後天的遺伝子修飾をうけるインプリント遺伝子、特にH19遺伝子を欠損する卵子を用いると、成体までの発育能を有する核移植卵が得られることを見出し、特許出願し(特許文献1)、文献に発表した(非特許文献2)。この方法は、成体までの発育能を有する核移植卵が得られる点において優れた方法であるが、成体は単為発生胚に対して1.5%程度しか作出せず、成体の作出効率の向上が望まれていた。
河野友宏著、「卵子形成過程におけるゲノム刷込みと胚発生」、蛋白質 核酸 酵素Vol.43 No.4(1998),p267−274 Tomohiro Kono et al, Nature Vol.428, No.6985, pp.860-864, 22 April 2004
そこで、本発明者は、卵子由来の半数ゲノム2セットを有する第2核移植卵のゲノム遺伝子を、より精子と卵子の生殖におけるゲノム遺伝子に近づけるべく、遺伝子の父方発現と母方発現に着目して検討した。
その結果、特許文献1記載の方法において、ng卵子またはfg卵子として、(A)H19遺伝子およびIgf2遺伝子の発現を制御するDNAメチル化インプリント領域(領域A)並びに(B)Gtl2遺伝子およびDlk1遺伝子の発現を制御するDNAメチル化インプリント領域(領域B)の双方を欠損する卵子を用いると、成体の作出効率を格段に向上させることができることを見出し、本発明を完成した。
(1)除核した卵核胞期卵(GV期卵)に、非成長期卵(ng卵子)を導入した後、体外成熟培養しMII期(第2減数分裂中期)まで移行させ第1核移植卵とする工程、
(2)該第1核移植卵からMII期染色体を取り出し、別のMII期卵(fg卵子)に導入し第2核移植卵とする工程、
からなる、ng卵子由来の半数体ゲノムセットおよびfg卵子由来の半数体ゲノムセットを有する核移植卵を作出する方法において、ng卵子またはfg卵子として、(A)H19遺伝子およびIgf2遺伝子の発現を制御するDNAメチル化インプリント領域(領域A)並びに(B)Gtl2遺伝子およびDlk1遺伝子の発現を制御するDNAメチル化インプリント領域(領域B)の双方を欠損する卵子を用いることを特徴とする、前記核移植卵の作出方法である。
しかし、一部の遺伝子には父方発現するものと母方発現するものがある。例えば、胚成長因子Igf2(Insulin like growth factor II)遺伝子は、父方遺伝子座(精子由来)で発現するが、母方遺伝子座(卵子由来)では発現しない。逆に、Igf2遺伝子の下流に位置するH19遺伝子は、母方遺伝子座からのみ発現する。このような遺伝子をインプリント遺伝子と呼ぶ。これはIgf2遺伝子とH19遺伝子が、H19遺伝子の下流に存在するエンハンサー(遺伝子発現増強配列)を共有しているためである。このエンハンサーは、通常H19遺伝子に対して優位に機能するが、H19遺伝子上流の発現調節領域(領域A)が精子形成過程で後天的遺伝子修飾(DNAメチル化)を受けるとH19遺伝子に対して機能することができなくなり、Igf2遺伝子に対して機能するようになる。その結果、H19遺伝子は父方での発現が抑制され、Igf2遺伝子は父方で発現するといった相互関係が成り立つ。
即ち、通常の精子と卵子による生殖においては、母方でH19およびGtl2遺伝子が発現し、父方でIgf2およびDlk1遺伝子が発現することにより、正常な胚成形が行われている(表1参照)。卵子同士の単為生殖では、双方の遺伝子が母方に由来するため、母方で発現するH19およびGtl2遺伝子が過剰発現され、父方で発現するIgf2およびDlk1遺伝子の発現が生じないことが予想される(表2参照)。そこで、本発明のように、ng卵子またはfg卵子として、領域Aおよび領域Bの双方を欠損する卵子を用いると、通常の精子と卵子による生殖に近い発現調節が行なわれ、成体発生率を格段に向上させることができるものと推定される(表3参照)。
特に本発明によれば、単為発生胚に対する成体の作出効率が7%程度となり、作出効率が1.5%程度の従来法(特許文献1)に比べその技術的意義は大きい。
除核した卵核胞期卵(GV期卵)に、非成長期卵(ng卵子)を導入した後、体外成熟培養し、MII期(第2減数分裂中期)まで移行させる工程である。
GV期卵は、成熟した哺乳動物に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンなどを投与し、過排卵処理により得られる体内成長卵子や、成熟した哺乳動物の卵巣から無処理で得られる体内成長卵子を用いることが出来る。かかる体内成長卵子は、過排卵処理、あるいは無処理により得られる雌哺乳動物の卵巣からPBS溶液等を用いて注射針等で卵胞を切り裂いたり、注射針等で卵胞から吸引することにより採取することができる。卵丘細胞が付着しているGV期卵はガラスピペットなどによるピペッティングや、トリプシン・EDTA等の酵素処理によって卵丘細胞を除去することが好ましい。
GV期卵は、透明帯の切断および除核を行いレシピエント卵とする。透明帯は、顕微鏡で観察しながらガラスナイフなどで切断することができる。除核は、除核ピペットを透明帯の切断部から挿入し、少量の細胞質とともに除去して行うことができる。
導入は、細胞融合により行うことが好ましい。レシピエント卵の囲卵腔内にng卵子をセンダイウイルス(HVJ)とともに注入し融合させることが好ましい。
その後、体外成熟培養し、MII期(第2減数分裂中期)まで移行させる。体外成熟培養は、ウシ胎仔血清(FBS)を5%添加したαMEM培地等により、炭酸ガス培養器中で培養することができる。またウシ胎仔血清(FBS)を5%添加したM16培地を用いることができる。体外成熟培養により、卵は核膜の崩壊、分裂装置の形成、減数分裂、第1極体の放出を行いMII期に達した第1核移植卵を得ることができる。
哺乳動物としては、マウス、豚、牛、ヒツジ、ヤギ、ラット、ウサギ等の非ヒト動物が好ましい。
第1核移植卵からMII期染色体を取り出し、別のMII期卵(fg卵子)に導入し第2核移植卵とする工程である。
fg卵子は、雌成熟哺乳動物からの排卵卵子であることが好ましい。かかる排卵卵子は、成熟した哺乳動物に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンやヒト絨毛性性腺刺激ホルモンなどを投与し、過排卵処理により排卵卵子を得ることが出来る。一方、成熟した哺乳動物の卵巣から無処理で得られる体内成長卵子を卵丘細胞に覆われた状態で体外成熟培養しMII期に達した卵をfg卵子として用いることも出来る。fg卵子は透明帯の一部を切断しておくことが好ましい。
本発明においては、ng卵子またはfg卵子は、領域Aおよび領域Bの双方を欠損する卵子である。
領域Aは、H19遺伝子およびIgf2遺伝子の発現を制御するDNAメチル化インプリント領域である。領域Aは、マウスでは、Igf2遺伝子とH19遺伝子との間にある、長さ10kbの領域である。H19遺伝子の5’側の直近のEcoRI制限酵素切断部位から約10kb上流のEcoRI制限酵素切断部位までの領域である。
H19遺伝子は、Leighton P.A.et al,Nature 375,34-39,1995に記載されている。H19遺伝子の長さは3kbである。Igf2遺伝子は、Leighton et al,Nature 375,34-39,1995に記載されている。
Gtl2遺伝子は、maternally expressed gene 3/gene-trap locus 2,Schmidt,J.V.et al,Genes Dev.14,1997-2002,2000に記載されている。Dlk1遺伝子は、Schmidt,J.V.et al,Genes Dev.14,1997-2002,2000) に記載されている。
領域AおよびBの双方を欠損する卵子は、それぞれの遺伝子欠損哺乳動物の交配により誕生した産子から得ることができる。
遺伝子欠損哺乳動物は、公知の標的遺伝子組換え法(ジーン・ターゲティング:例えば、Methods in Enzymology 225:803-890,1993)を用いることにより、例えばマウスの場合、以下のとおりに作成することができる。
このような遺伝子組換え細胞の選択は、G418を細胞培地に添加してNeor遺伝子を持たない非組換え細胞を除去し、さらにガンシクロビルを添加してHSV−tk遺伝子が残存するランダムな組換え細胞を除去することによって行うことができる。選択された遺伝子組換え細胞の領域AおよびBは、そのコード配列中にNeor遺伝子が挿入された変異配列であり、発現することはできない。
本発明においては、発現制御領域である領域AおよびBの双方を欠損する卵子を用いればよいが、領域AおよびBに加えてH19遺伝子自体を欠損する卵子を用いてもよい。
本発明は、上記第2核移植卵を活性化処理した後、体外発生培養することからなる単為発生胚の作出方法を包含する。卵子の活性化は、ストロンチウムで行うことが好ましい。具体的には、10mMのSrCl2を含むM16培地で培養して活性化させることができる。また、電気パルスやエタノール等によっても卵子を活性化することが出来る。体外発生培養は、5%CO2、5%O2、90%N2の気相、37〜39℃の条件で行うことができる。
本発明は、上記単為発生胚を哺乳動物の子宮に移植し成長させることからなる単為発生哺乳動物の作出方法を包含する。移植する哺乳動物としては、特に制限されるものではないが、人工授精させた後の妊娠初期にプロスタグランジンF2α等を用いて人工流産させ、同期化を行った哺乳動物を用いることが好ましい。哺乳動物としては、マウス、豚、牛ヒツジ、ヤギ、ラット、ウサギ等の非ヒト哺乳動物が好ましい。
(ng卵子の採取)
標的遺伝子組換え法(Methods in Enzymology 225:803-890,1993)によりH19遺伝子(3kb)およびその上流(10kb)を合わせて13Kb(H19遺伝子および領域A)を欠損したマウス(Leighton et al.,Nature375:34-39,1995)およびDlk1−Gtl2発現調節領域(領域B、長さ4.15Kb、Gtl2遺伝子上流)を欠損したマウス(Schmidt,J.V.et al,Genes Dev.14,1997-2002,2000)を交配して得られた雌の生後1日の新生仔の卵巣を採取した。採取した卵巣を0.02%EDTA溶液中に移し37℃で10分間培養した。ついで、注射針にて卵巣を切り裂き解離してきた非成長期卵子を採取した。得られた卵子の内、領域Aおよび領域Bの双方が欠損した卵子を選択しドナー用ng卵子とした。
成熟したマウス(8〜12週齢、B6D2F1、チャールズリバー/クレア)に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンを5〜7.5IU投与した後、卵巣中の発育した卵胞を27ゲージ注射針にて裂き卵丘細胞に包まれたGV期卵を採取した。卵丘細胞をピペッティングにより除去した後、GV期卵をM2培地(240μM dbcAMPおよび5%FBSを添加)で37℃にて2時間培養した。
倒立顕微鏡にマイクロマニピュレーター(成茂社製)を取り付け実施した。まず、GV期卵の透明帯をガラスナイフを用いて15〜20%切断した。ついで、GV期卵を核移植用M2培地(10μg/ml サイトカラシンB、100ng/ml コルセミド、240μM dbcAMPおよび5%FBSを添加)に移し、15分間37℃で培養した。顕微操作により除核ピペット(直径が25μm)を透明帯の切断部から挿入し、GV期卵の核を少量の細胞質とともに除去しレシピエント卵とした。
次いで、ng卵子を移植用ピペット(直径が15μm)に吸引したのち、センダイウイルス(HVJ:コスモバイオ)をピペットの先端に吸引した。ピペットをレシピエント卵の透明帯の切断部から挿入しレシピエント卵に押し付けながら注入した。得られた核移植卵を5% FCS添加αMEM培地に移し、炭酸ガス培養器中で37℃にて14時間、培養した。核移植卵は、核膜の崩壊、分裂装置の形成、減数分裂、第1極体の放出の各工程を経て、第2減数分裂中期(MII期)に達し、第1核移植卵を得た。
雌成熟マウス(8〜12週齢、B6D2F1、チャールズリバー/クレア)に妊馬絨毛性性腺刺激ホルモンおよびヒト絨毛性性腺刺激ホルモンを48時間間隔でそれぞれ5〜7.5 IU投与し、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン投与14時間後に卵管を採取した。卵管より卵丘細胞に包まれた排卵卵子の塊を採取した後、300μg/mlヒアルロニダーゼを含むM2培地中で卵丘細胞をピペッティングにより除去した後、排卵卵子(fg卵子)を採取した。顕微操作により透明帯の一部を切断した。排卵卵子および第1核移植卵を核移植用M2培地(5μg/mlサイトカラシンBを添加)に移した。上述の第1核移植卵の透明帯切断部から除核用ピペット(直径25μm)を挿入し、MII期染色体(分裂装置)を吸引した。ついで、ピペット先端にセンダイウイルスを吸引し、fg卵子の透明帯切断部にピペットを挿入して、MII期染色体を注入した。M2培地中に移し、37℃で30分間培養して両者を融合させ第2核移植卵を得た。
下記表4に核移植卵の生産効率を示す。
(単為発生胚の作出)
得られた238個の第2核移植卵を、10M塩化ストロンチウムを含むM16培地にて37℃で3時間培養し、人為的に卵子の活性化を誘起させた。その結果221個の卵子が活性化され、それらをM16培地にて37℃で3日間体外培養した。その結果、206個の胚盤胞が作出された。
(単為発生マウスの作出)
得られた206個の胚盤胞を偽妊娠2.5日目の雌マウス(定法に従い、精管結紮雄交配させ膣栓を確認した日を偽妊娠0.5日目とした雌マウス)の子宮に移植したところ、14匹の正常雌産子が誕生し、すべて成体にまで発育した。したがって、作出効率は7%と高率である。これらの遺伝子を解析した結果、H19−IGF2遺伝子およびGTL−DLK1遺伝子の発現調節メチル化領域(領域AおよびB)の欠損をそれぞれヘテロに持つことが確認できたことから、第2核移植卵由来の産子であることが確認された。
これら14匹の単為発生マウスうち5匹に関して繁殖能力を調べた結果、試験した全ての単為発生マウスは正常に交配、妊娠および出産することが判明し、正常な繁殖能力を持つことが確認された。
b:成熟雌由来fg卵子
c:核移植
d:体外成熟培養
e:成熟した核置換卵子
f:排卵卵子
g:MII期分裂装置の移植
h:卵子の人為的活性化
i:再構築されたng/fg単為発生胚
a〜eは、本発明の第1核移植工程に対応する。f〜iは、本発明の第2核移植工程に対応する。
Claims (6)
- 哺乳動物の核移植卵を作出する方法であって、
(1)除核した卵核胞期卵(GV期卵)に、非成長期卵(ng卵子)を導入した後、体外成熟培養しMII期(第2減数分裂中期)まで移行させ第1核移植卵とする工程、
(2)該第1核移植卵からMII期染色体を取り出し、別のMII期卵(fg卵子)に導入し第2核移植卵とする工程、
からなる、ng卵子由来の半数体ゲノムセットおよびfg卵子由来の半数体ゲノムセットを有する核移植卵を作出する方法において、ng卵子またはfg卵子として、(A)H19遺伝子およびIgf2遺伝子の発現を制御するDNAメチル化インプリント領域(領域A)並びに(B)Gtl2遺伝子およびDlk1遺伝子の発現を制御するDNAメチル化インプリント領域(領域B)の双方を欠損する卵子を用いることを特徴とする、前記核移植卵の作出方法。 - 非成長期卵(ng卵子)は、新生仔の卵母細胞である請求項1記載の方法。
- 別のMII期卵(fg卵子)は、排卵卵子である請求項1記載の方法。
- 領域Aおよび領域Bの双方を欠損する卵子は、遺伝子欠損哺乳動物由来である請求項1記載の方法。
- 請求項1に記載の方法で得られた第2核移植卵を活性化処理した後、体外発生培養することからなる単為発生胚の作出方法。
- 請求項5に記載の方法で得られた単為発生胚を哺乳動物の子宮に移植し成長させることからなる単為発生哺乳動物の作出方法。
Priority Applications (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007171707A JP5078074B2 (ja) | 2007-06-29 | 2007-06-29 | 核移植卵、単為発生胚および単為発生非ヒト哺乳動物の作出方法 |
US12/213,385 US7659443B2 (en) | 2003-08-05 | 2008-06-18 | Method of constructing nucleus-implanted egg, parthenogenetic embryo and parthenogenetic mammal |
EP08011453A EP2008514A1 (en) | 2007-06-29 | 2008-06-24 | Method of constructing nucleus-implanted egg, parthenogenetic embryo and parthenogenetic mammal |
US12/615,750 US20100122364A1 (en) | 2003-08-05 | 2009-11-10 | Method of constructing nucleus-implanted egg, parthenogenetic embryo and parthenogenetic mammal |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2007171707A JP5078074B2 (ja) | 2007-06-29 | 2007-06-29 | 核移植卵、単為発生胚および単為発生非ヒト哺乳動物の作出方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009005649A true JP2009005649A (ja) | 2009-01-15 |
JP5078074B2 JP5078074B2 (ja) | 2012-11-21 |
Family
ID=39832460
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2007171707A Expired - Fee Related JP5078074B2 (ja) | 2003-08-05 | 2007-06-29 | 核移植卵、単為発生胚および単為発生非ヒト哺乳動物の作出方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2008514A1 (ja) |
JP (1) | JP5078074B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106676075B (zh) * | 2015-11-11 | 2020-06-26 | 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 | 一种孤雌单倍体胚胎干细胞及其制备与应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005011371A1 (ja) * | 2003-08-05 | 2005-02-10 | Tokyo University Of Agriculture Educational Corporation | 核移植卵、単為発生胚および単為発生哺乳動物の作出方法 |
-
2007
- 2007-06-29 JP JP2007171707A patent/JP5078074B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-06-24 EP EP08011453A patent/EP2008514A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005011371A1 (ja) * | 2003-08-05 | 2005-02-10 | Tokyo University Of Agriculture Educational Corporation | 核移植卵、単為発生胚および単為発生哺乳動物の作出方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2008514A1 (en) | 2008-12-31 |
JP5078074B2 (ja) | 2012-11-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Krimpenfort et al. | Generation of transgenic dairy cattle using ‘in vitro’embryo production | |
sang Lee et al. | Production of transgenic cloned piglets from genetically transformed fetal fibroblasts selected by green fluorescent protein | |
JP4102450B2 (ja) | 胎仔線維芽細胞による効率的な核移入 | |
JP4275137B2 (ja) | 核移植卵、単為発生胚および単為発生哺乳動物の作出方法 | |
JP2004523239A (ja) | 人工染色体を含むトランスジェニック動物のクローニング | |
US8119785B2 (en) | Nucleic acid sequences and homologous recombination vectors for distruption of a Fel D I gene | |
EP1779724A1 (en) | Construction of chimera using es cells | |
Lai et al. | A method for producing cloned pigs by using somatic cells as donors | |
JP5078074B2 (ja) | 核移植卵、単為発生胚および単為発生非ヒト哺乳動物の作出方法 | |
US10626417B2 (en) | Method of genetically altering and producing allergy free cats | |
EP4144857A1 (en) | Animal preparation method | |
Sasaki | Creating genetically modified marmosets | |
Zhu et al. | Increasing the number of transferred embryos results in delivery of viable transgenically cloned Guangxi Bama mini-pigs | |
WO2019141052A1 (zh) | 非人灵长类的体细胞克隆动物的制备方法 | |
JP2006522609A (ja) | 動物の体細胞核移植と関係する紡錘体欠損を修正するための方法 | |
Matsunari et al. | Cloning of homozygous α1, 3-galactosyltransferase gene knock-out pigs by somatic cell nuclear transfer | |
US7659443B2 (en) | Method of constructing nucleus-implanted egg, parthenogenetic embryo and parthenogenetic mammal | |
CN111655861A (zh) | 用于原位生殖系基因组工程的方法和组合物 | |
EP3120700A1 (en) | Microinjection into a cell's nucleus following somatic cell nuclear transfer | |
WO2002019811A2 (en) | Generation of transgenic animals using nuclear transfer and oocytes at the germinal vesicle stage | |
JP4903392B2 (ja) | 遺伝子ホモ改変哺乳動物細胞、遺伝子ホモ改変非ヒト哺乳動物、及びそれらの樹立、作出方法。 | |
Lian et al. | Application status of genome-editing tools in sheep and goats | |
Xiao-Rong et al. | Effect of some factors on the fusion rate of bovine–rabbit interspecies reconstructed eggs | |
Pinkert | Genetic engineering of farm mammals | |
Balvís et al. | Optimization of RNA concentration for genome editing by CRISPR in rabbit zygotes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20100430 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120606 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120723 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120816 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120824 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150907 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |