JP2008543836A - 複素環置換フェニルフランおよび関連化合物を含む抗ウイルス組成物 - Google Patents
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Abstract
HIVの進入を遮断することでHIVの複製を阻害する一群の化合物を同定した。NB-206と称される代表的な化合物およびその類似体は、ナノモルレベルのIC50値でHIVの複製（p24産生）を阻害した。NB-206とその類似体は、以下の(1)‐(4)により、HIVのgp41を標的とするHIV進入阻害剤であることが証明された。(1)NB-206およびその類似体が、HIV介在の細胞融合を阻害した(2)ウイルスを添加してから1時間より前にNB-206およびその類似体を添加した時にのみHIV複製を阻害した(3)NB-206およびその類似体が、gp41コアの形成を遮断した。これは、立体構造特異的MAb NC-1を用いたサンドイッチ酵素免疫測定法(ELISA)で検出されたものである。（4)NB-206およびその類似体が、gp41の6へリックス束の形成を阻害した。これは、蛍光ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動法(FN-PAGE)で明らかにされたものである。これらの結果は、NB-206とその類似体が疎水性空洞に作用して融合活性を有するgp41のコイルドコイル領域の形成を阻害することにより、HIV-1介在の膜融合とウイルスの進入を阻害することを示唆している。
【選択図】図１
【選択図】図１
Description
本出願は、2005年6月15日に出願された米国出願番号60/691,120号の利益を主張するものであり、この出願の内容を参照することによりその全体を本出願に含む。
ここに開示した発明の一部は、NIH助成金（National Institute of Health Grant）RO1 AI46221の支援を受けていた。したがって、アメリカ合衆国政府が本発明に何らかの権利を有する可能性がある。
本出願を通じて、様々な出版物が参照されており、これら出版物の詳細な引用情報は、参照した本文に記されている。これら出版物で開示されている内容の全体を参照することにより本出願に含み、本発明に付随する最新技術をさらに詳細に説明する。
人免疫不全ウイルス１型（HIV-1）の宿主細胞への進入は、HIV-1 gp120の表面のサブユニットが宿主細胞のCD4受容体と結合することで介在される。これによりgp120の立体構造が変化し、gp120の特異的領域が露出する(文献1-4)。これらの領域はその後、細胞コレセプター、即ちCXCR4またはCCR5と作用し、gp120-gp41複合体を不安定化する(文献5,6)。その結果、gp41は立体構造が変化して疎水性融合ペプチドが露出する。該gp41が標的細胞膜に挿入され、HIV-1の膜が細胞膜とともに融合を開始する(文献7,8)。したがって、gp41が宿主細胞へのウイルスの進入の初期段階に重要な役割を果たしており、HIV-1進入阻害剤を開発するための重要なターゲットであると考えられている。gp41分子は、3つの領域、即ち細胞質領域、膜貫通領域および細胞外領域（エクトドメイン）からなる。エクトドメインは、3つの主な機能領域、即ち融合ペプチド(FP)、N-末端７アミノ酸リピート(NHRまたはHR1) およびC-末端７アミノ酸リピート(CHRまたはHR2)を含む。７アミノ酸リピート領域は、一般に典型的なα-ヘリックス構造を形成している。Wild et al (文献9,10)およびJiang et al (文献11)は、約10年前に、HR1およびHR2領域によるペプチドが低ナノモル濃度でHIV-1感染を阻害することを示した。これが、進入阻害剤T-20 (Fuzeon, Enfuvirtide)の発見をもたらした。この薬剤は、抗HIV-1薬として米国食品医薬局（FDA）から2003年に認可された(文献12,13)。これはまた、6へリックス束（six-helix bundle）の形成を阻害するという概念が、抗ウイルス薬を開発する有効な戦略であるということを直接的に証明した。この薬剤が発見されたことは、抗HIV薬開発の大きな突破口となった。これは、この薬剤がHIV逆転写酵素阻害剤やプロテアーゼ阻害剤(文献14,15)などの、現在利用できる抗レトロウイルス薬に反応しないHIV-1感染者の治療に使用できるからである。しかしながら、T-20の今後の用途は、経口アベイラビリティーがないことおよび製造原価が高いために抑制されると考えられる。したがって、C-ペプチドに類似する作用機序を有するが、ペプチド性治療薬の欠点を持たない低分子抗HIV-1化合物を開発することが不可欠である。
C-ペプチドのHIV-1融合阻害機序に関する研究は、gp41のN-ペプチドとC-ペプチドを等モル濃度で混合すると、逆平行ヘテロ2量体の安定なα-ヘリカル2量体を形成し、融合活性のgp41コアを示すことを実証した(文献16,17)。該コアの結晶学的データからは、NHRペプチドが疎水性溝からなる内部3量体コイルドコイルを形成すること、およびCHRペプチドが逆平行に折り畳まれて6へリックス束と呼ばれる安定なヘアピン状の構造を形成することが明らかになった(文献7,18)。この安定な6へリックス束の形成は、膜融合の前提条件である、ウイルス膜と宿主細胞膜の接合をもたらすと考えられている。この6へリックス束の形成は、融合穴を形成するために必要な段階であることが最近報告されている(文献19)。したがって、疎水性溝を標的とすることにより6へリックス束の形成を阻害することが、抗ウイルス薬を開発する一つの戦略であると認識されてきた(文献7,20)。
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いくつかの小分子化合物が、gp41ポケットを標的構造として用いることにより同定された。例えば、ADS-J1 (文献21,22)、XTT formazan (文献23)、NB-2およびNB-64(文献24)が挙げられる。これらの研究は、複数の技術を組み合わせて行われた。例えば、細胞に基づくHIV融合分析(文献25,26)、サンドイッチ酵素免疫測定法(ELISA)(文献27)、モノクローナル抗体(mAb) NC-1を用いた蛍光酵素免疫測定法(FLISA)(文献28)（該NC-1は、融合活性gp41コア構造を特異的に認識する(文献29)）、およびコンピュータ支援分子ドッキング法(文献21)が挙げられる。これらの化合物は、おそらくgp41ポケットにドッキングしてgp41の6へリックス束形成を妨げることで、HIV-1の融合を阻害するのであろう。しかしながら、これらの分子は、抗HIV-1治療薬を開発するための良いリード化合物ではないかもしれない。この理由は、それら分子の抗HIV-1活性があまり強力ではないからである（IC50値はマイクロモルレベルである）。それでもなお、これらの化合物の同定は、小分子有機化合物が融合活性のあるgp41の6へリックス束形成を阻害して、HIV-1または他のウイルスの細胞内への進入を阻害するという概念を立証したことで有用である。ここに、我々は、NB-206およびその類似体として表される3- [5- (2 , 4-ジオキソ-チアゾリジン-イリデンメチル)-フラン-2-イル]-安息香酸および3-[5-(4-オキソ-2-チオキソ-チアゾリジン-イリデンメチル)-フラン-2-イル]-安息香酸の一連の誘導体を抗ウイルス組成物として同定したことを報告する。これら組成物として例えば新規HIV-1融合阻害剤が挙げられる。これらの化合物は、融合中間体立体構造時のgp41と作用可能であり、おそらく該化合物がgp41の疎水性ポケットおよび周辺領域に結合し、gp41の6へリックス束形成を阻害することで、ウイルス膜と標的細胞膜の融合を阻害するものと考えられる。NB-206とその類似体は、「薬らしい（drug-like）」化合物であり、例えばHIV-1進入阻害剤など、より強力な抗ウイルス組成物をデザインするためのリード物質として利用できる。これにより、例えば抗HIV-1薬などの新規クラスの抗ウイルス薬が開発されることが期待される。
本発明の１つの目的は、HIV感染に対して有効な化合物および組成物を提供することである。
本発明の目的はまた、HIVの進入を遮断することによる新規クラスの抗HIV治療薬をデザインし開発するための化合物および組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、有害な副作用を誘発することなく、HIVの複製もしくは感染性を阻害する、または対象のHIV感染を治療するための方法を提供することである。
本発明は、下式構造式Ｉ（化１）により表される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を含む。
上記R1、R2、R3、R4、R5またはR6の少なくとも一つが、COOHまたはその他の酸性基を含む。
上記XおよびX'、YおよびY'は、C、N、OまたはSであり、ZおよびZ'はOまたはSである。XおよびX'、YおよびY'がOまたはSである場合、Cなどの隣の原子との結合は単結合となり、OまたはSは置換されない。また、XおよびX'、YおよびY'がNである場合、置換されない、またはH、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルもしくはヘテロシクリル基で置換される。一実施形態では、R1-R6は、それぞれ、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、ヘテロシクリル、テトラゾイル、アダマンチル、ハロゲン、トリフルオロメチル、OH、CN、NO2およびOR7（該R7はアルキル、アリールまたはアリールアルキル）、COOR8（該R8はHおよびアルキル）、SO3R9（該R9はHおよびアルキル）、SO2NHR10（該R10はHもしくはアルキル）およびCONHR11（該R11はHまたはアルキル）からなる群のうちいずれであってもよいが、これらに限定されない。
アルキル基は、任意に置換された１乃至６の炭素原子を有する直鎖あるいは分岐鎖アルキル鎖であり、好ましくはメチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、i-ブチル、三級ブチル、ペンチルまたはヘキシルが挙げられる。
アルケニル基は、任意に置換された２乃至６の炭素原子を有する直鎖あるいは分岐鎖アルケニル鎖であり、好ましくはビニル、1-プロペニル、2-プロペニル、i-プロペニル、ブテニルおよびその異性体、ペンテニルまたはヘキセニルが挙げられる。
アルキニル基は、任意に置換された２乃至６の炭素原子を有する直鎖あるいは分岐鎖アルキニル鎖であり、好ましくはエチニル、プロピニルおよびその異性体、ブチニルおよびその異性体、ペンチニルまたはヘキシニルが挙げられる。
アルキル、アルケニルおよびアルキニルの好適な置換基は、アミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アリール、ヘテロシクリル、カルボキシ、ニトロ、アルキルスルフォニル、アリールスルフォニル、チオ、アルキルチオ、アリールチオの一種以上から選択できる。
シクロアルキル基は、任意に置換された３乃至６の炭素原子を含むシクロアルキル基であり、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、またはアダマンチルから選択できる。これらの基は全て、環状に縮合して例えばフェニル基などの芳香族環状基となってもよい。
アリール基は、任意に置換されたフェニルまたはナフチルである。一実施形態では、フェニル基またはナフチル基の両方が、アミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、カルボキシ、ニトロ、チオ、アルキルまたはトリフルオロメチル基で任意に置換される。
複素環基は、任意に置換された飽和、部分飽和、芳香族環状基であり、窒素、酸素、硫黄から選択される1つ以上のヘテロ原子を含む。この基は、環状に縮合して任意の置換の芳香族環状基または芳香族ヘテロ環状基となってもよい。
複素環基は、キノリニル、ピリジル、インドリル、フリル、オキサゾリル、チエニル、トリアゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、ベンゾチアゾリルから選択されるが、これらに限定されない。
アリールおよびヘテロシクリルの置換基は、アルキル基について述べたものから選択可能である。
ハロゲン基は、クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨードである。
酸性基を有する構造式Iの化合物は、無機塩基および有機塩基と反応して薬学的に許容可能な塩を形成することができる。該塩基としては、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、N-エチルピペリジン、および類似するその他の塩基が挙げられる。構造式Iが、その持つ性質において塩基性である場合には、無機酸や有機酸と反応して薬学的に許容可能な塩を形成できる。該酸としては、例えば塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、メタンスルホン酸、および類似するその他の酸が挙げられる。
構造式Iを含む化合物、組成物または実施形態のいずれにも、例えばE-異性体やZ-異性体などの立体異性体が存在する可能性がある。
合成ペプチド薬であるT-20は、臨床試験で、HIVの進入を遮断することによる強力な抗HIV活性を示している。しかしながら、T-20の将来の臨床への応用は、経口アベイラビリティーがないため、限定されるであろう。強力な抗HIV活性を有する一群の低分子量の有機化合物が同定され、これはT-20と類似の作用機序でHIVの進入を遮断する。我々は、NB-206およびその類似体が、低IC50値で、HIVの複製（p24の産生）を阻害し、HIV介在の細胞変性効果(CPE)および細胞融合を阻害することを見いだした（表２の1〜２参照）。NB-206とその類似体は、以下の（1)‐（4)により、HIVのgp41を標的とするHIV進入阻害剤であることが証明された。
（1)NB-206およびその類似体が、HIV介在の細胞融合を阻害した。
（2)ウイルスを添加してから2時間より前にNB-206およびその類似体を添加した時にのみHIV複製を阻害した。
（3) NB-206およびその類似体が、gp41コアの形成を遮断した。これは、立体構造特異的MAb NC-1を用いたサンドイッチ酵素免疫測定法(ELISA)で検出されたものである。
（4) NB-206およびその類似体が、gp41の 6へリックス束の形成を阻害した。これは、蛍光ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動法(FN-PAGE)で明らかにされたものである。
これらの結果は、NB-206とその類似体が疎水性空洞に作用して、融合活性を有するgp41のコイルドコイル領域の形成を阻害することにより、HIV-1が介在する膜融合とウイルスの進入を阻害することを示唆している。
（1)NB-206およびその類似体が、HIV介在の細胞融合を阻害した。
（2)ウイルスを添加してから2時間より前にNB-206およびその類似体を添加した時にのみHIV複製を阻害した。
（3) NB-206およびその類似体が、gp41コアの形成を遮断した。これは、立体構造特異的MAb NC-1を用いたサンドイッチ酵素免疫測定法(ELISA)で検出されたものである。
（4) NB-206およびその類似体が、gp41の 6へリックス束の形成を阻害した。これは、蛍光ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動法(FN-PAGE)で明らかにされたものである。
これらの結果は、NB-206とその類似体が疎水性空洞に作用して、融合活性を有するgp41のコイルドコイル領域の形成を阻害することにより、HIV-1が介在する膜融合とウイルスの進入を阻害することを示唆している。
HIV-1のgp41コア構造を標的にした抗ウイルス化合物のスクリーニング法については、特許協力条約(PCT)出願、PCT/US00/06771、公開公報No.WO00/55377、US特許6,596,497に記載されている。さらに、PCT出願、PCT/US2003/036359、公開公報WO2004/047730には、以下の抗ウイルス化合物をスクリーニングする方法が記載されている。
a) マウス以外の動物から、HIV-1 gp41が有する3個のN-ペプチドおよびHIV-1 gp41が有する3個のC-ペプチドを含むHIV-1 gp41の3量体構造に対するポリクローナル抗体を獲得して固相上におくことにより、ポリクローナル抗体がコーティングされた固相を形成し、
b) HIV-1 gp41のN-ペプチドと試験化合物の混合物を調製し、次にHIV-1 gp41のC-ペプチドを添加し、
c) 段階(b)で得られた混合物を段階(a)で得られたポリクローナル抗体がコーティングされた固相に加え、非結合ペプチドと非結合化合物を除去し、HIV-1 gp41およびHIV-1 gp41の3個のC-ペプチドと特異的に反応するがHIV-1 gp41の個々のN-ペプチドとは反応せず、HIV-1 gp41の個々のC-ペプチドとも反応しないモノクローナル抗体を添加し、
d) 前記モノクローナル抗体の結合を測定する。
a) マウス以外の動物から、HIV-1 gp41が有する3個のN-ペプチドおよびHIV-1 gp41が有する3個のC-ペプチドを含むHIV-1 gp41の3量体構造に対するポリクローナル抗体を獲得して固相上におくことにより、ポリクローナル抗体がコーティングされた固相を形成し、
b) HIV-1 gp41のN-ペプチドと試験化合物の混合物を調製し、次にHIV-1 gp41のC-ペプチドを添加し、
c) 段階(b)で得られた混合物を段階(a)で得られたポリクローナル抗体がコーティングされた固相に加え、非結合ペプチドと非結合化合物を除去し、HIV-1 gp41およびHIV-1 gp41の3個のC-ペプチドと特異的に反応するがHIV-1 gp41の個々のN-ペプチドとは反応せず、HIV-1 gp41の個々のC-ペプチドとも反応しないモノクローナル抗体を添加し、
d) 前記モノクローナル抗体の結合を測定する。
スクリーニングに用いられるモノクローナル抗体は、NC-1と称される。上記免疫スクリーニング分析とともに生物学的検定法を使用することができる。前記生物学的検定法は、以下に示すようにHIV介在細胞融合分析を含むが、これに限定されない。該分析は、蛍光ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動法(FN-PAGE)であってもよい。
前記スクリーニングの結果、いくつかのリード化合物が同定された。
本発明は、有効量の構造式（I）（化２）で表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む。
上記R1、R2、R3、R4、R5またはR6の少なくとも一つが、COOHまたはその他の酸性基を含む。
上記XおよびX'、YおよびY'は、C、N、OまたはSであり、ZおよびZ'はOまたはSである。XおよびX'、YおよびY'がOまたはSである場合、Cなどの隣の原子との結合は単結合となり、OまたはSは置換されない。また、XおよびX'、YおよびY'がNである場合、置換されない、またはH、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキルもしくはヘテロシクリル基で置換される。一実施形態では、R1-R6は、それぞれ、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、テトラゾイル、アダマンチル、ハロゲン、トリフルオロメチル、OH、CN、NO2およびOR7（該R7はアルキル、アリールまたはアリールアルキル）、COOR8（該R8はHおよびアルキル）、SO3R9（該R9はHおよびアルキル）、SO2NHR10（該R10はHもしくはアルキル）およびCONHR11（該R11はHまたはアルキル）からなる群のうちいずれであってもよいが、これらに限定されない。
本発明は、構造式Iを有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供し、前記Xは炭素、X'は窒素、YおよびZ'は酸素、Y'およびZは硫黄である。
前記R1-R6は、それぞれ、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、ヘテロシクリル、テトラゾイル、アダマンチル、ハロゲン、トリフルオロメチル、OH、CN、NO2およびOR7（該R7はアルキル、アリールまたはアリールアルキル）、COOR8（該R8はHおよびアルキル）、SO3R9（該R9はHおよびアルキル）、SO2NHR10（該R10はHもしくはアルキル）、CONHR11（該R11はHまたはアルキル）からなる群のうちいずれであってもよいが、これらに限定されない。
前記R1-R6は、それぞれ、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、アルキルアリール、ヘテロシクリル、テトラゾイル、アダマンチル、ハロゲン、トリフルオロメチル、OH、CN、NO2およびOR7（該R7はアルキル、アリールまたはアリールアルキル）、COOR8（該R8はHおよびアルキル）、SO3R9（該R9はHおよびアルキル）、SO2NHR10（該R10はHもしくはアルキル）、CONHR11（該R11はHまたはアルキル）からなる群のうちいずれであってもよいが、これらに限定されない。
一実施形態では、アルキル基は、１乃至６の炭素原子を有する直鎖あるいは分岐鎖アルキル鎖で置換される。
他の実施形態では、アルキルは、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、i-ブチル、三級ブチル、ペンチルまたはヘキシルである。
別の実施形態では、アルケニルは２乃至６の炭素原子を有する直鎖あるいは分岐鎖アルケニル鎖で置換される。該アルケニルはビニル、1-プロペニル、2-プロペニル、i-プロペニル、ブテニルまたはその異性体、ペンテニルまたはヘキセニルを含むが、これらに限定されない。
一実施形態では、アルキニルは２乃至６の炭素原子を有する直鎖あるいは分岐鎖アルキニル鎖で置換される。アルキニル基は、エチニル、プロピニルもしくはその異性体、またはブチニルもしくはその異性体、ペンチニルまたはヘキシニルを含むが、これらに限定されない。
本発明によると、アルキル、アルケニルおよびアルキニル基の適切な置換基は、アミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アリール、ヘテロシクリル、カルボキシ、ニトロ、アルキルスルフォニル、アリールスルフォニル、チオ、アルキルチオ、またはアリールチオの一種以上から選択できる。
一実施形態では、本発明は上記化合物を提供する。前記シクロアルキルは３乃至６の炭素原子を含むシクロアルキル基で置換される。該シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペニル、シクロヘキシルまたはアダマンチルを含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、シクロアルキルは環状に縮合して芳香族環状基となる。
別の実施形態では、アリールは、フェニルまたはナフチルで置換される（共に、アミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、アルコキシ、カルボキシ、ニトロ、チオ、アルキルまたはトリフルオロメチルで任意に置換される。）
本発明は、上記化合物を提供する。前記複素環基は、飽和、部分飽和、または芳香族環状基で置換され、窒素、酸素または硫黄から選択される１つ以上のヘテロ原子を含む。一実施形態では、該化合物は環状に縮合して、置換の芳香族環状基または芳香族ヘテロ環状基である。さらなる実施形態では、複素環基は、キノリニル、ピリジル、インドリル、フリル、オキサゾリル、チエニル、トリアゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ピペリジニル、ベンゾチアゾリルを含むが、これらに限定されない。
本発明は、上記化合物を提供する。前記ハロゲン基は、クロロ、ブロモ、フルオロまたはヨードである。
本発明は、構造式Iを有する化合物を提供する。前記化合物は酸性基を有し、無機塩基および有機塩基と薬学的に許容可能な塩を形成することができる。該塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、水酸化マグネシウム、N-エチルピペリジンが含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、構造式Iを有する化合物を提供する。前記Xは炭素、X'は窒素、YおよびZ'は酸素、Y'およびZは硫黄であり、R1はCOOH、R2はクロロ、R3-R5は水素、R6はプロピルベンゼンである。
構造式Iを含む化合物、組成物または実施形態のいずれにも、例えばE-異性体やZ-異性体などの立体異性体が存在する可能性がある。
本発明は、構造式Iを有する化合物または薬学的に許容可能な塩の有効量と、薬学的に許容可能な担体からなる抗ウイルス医薬組成物を提供する。
「薬学的に許容可能な担体」とは、標準的な医薬の担体のいずれかである。この技術分野ではよく知られている適切な担体の例として、リン酸緩衝生理食塩溶液、Polysorb80を含有するリン酸緩衝食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および各種の湿潤剤が挙げられるが、これらに限定されない。その他の担体として、滅菌溶液、錠剤、コート錠およびカプセルも含まれる。
一般的に、そのような担体は、デンプン、ミルク、糖類、ある種のクレー、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、タルク、植物性脂肪、ゴム、グリコール、またはその他既知の賦形剤を含む。このような賦形剤は、香料用添加物や着色添加物、もしくはその他の成分を含むことがある。このような担体を含む組成物は、よく知られた従来の方法で調製される。
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症を治療するための上記医薬組成物であって、さらに抗HIV薬、抗感染薬、免疫賦活剤からなる群から選択される後天性免疫不全症候群(AIDS)治療薬を有効量含む医薬組成物を提供する。
本発明は、細胞内におけるヒト免疫不全ウイルスの複製を阻害するための方法を提供し、該方法は、構造式Iを含む化合物を細胞に有効量接触させてヒト免疫不全ウイルスの複製を阻害する方法である。
本発明は、ヒト免疫不全ウイルスに感染した対象を治療する方法を提供し、該方法は、構造式Iを有する化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効量、該対象に投与する方法である。
本発明は、対象の後天性免疫不全症候群(AIDS)の徴候を予防する方法を提供し、該方法は、該対象の症候群を予防するために有効な量の構造式Iを含む化合物を、該対象に投与する方法である。
上記方法の一実施形態では、該対象はヒトである。
本発明は、以下に続く実施例を参照することでよりよく理解できる。しかしながら、当業者であれば直に理解できるように、具体的な実施例は単に例示に過ぎず、この後に記載する請求項によって定義される本発明を制限するものではない。
＜材料と方法＞
（試薬）MT-2細胞、HIV-1IIIB感染H9細胞(H9/HIV-1IIIB)、U87-T4-CXCR4およびU87-T4-CCR5細胞、実験室適応HIV-1株および一次HIV-1株、ならびに抗p24mAb (183-12H-5C)を、NIH AIDS Research and Reference Reagent Programから入手した。リンパ細胞系CEMx174 5.25M7は、C. Cheng-Mayerにより親切にも提供されたものであり、これは、HIV-1の長い末端反復配列(LTR)グリーン蛍光タンパク質(GFP)リポーターおよびルシフェラーゼリポーターコンストラクトが安定に形質導入されている。この細胞は、CD4と両方のコレセプターCXCR4およびCCR5を発現する（文献30）。これらの細胞を10%ウシ胎仔血清(FBS)、1μg/mlピューロマイシン、200μg/ml G418が添加されたRPMI-1640培地で維持した。組み換え可溶性CD4(sCD4)は、ジェネンテック社（Genentech Inc. (South San Francisco, CA)）から入手した。ペプチドN36、C34(文献7,17)、IQN17(文献31)およびT22(文献32,33)は、ニューヨーク血液センター（New York Blood Center）の微量化学研究所（MicroChemistry Laboratory）で標準の固相FMOC法を用いて合成した。ビオチン化D-ペプチドであるD10-p5-2K(文献31)についても、前述のように(文献31)、D-アミノ酸を使って施設内で合成し、酸化させた。ペプチドは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で、均質になるまで精製された。精製したペプチドの同定は、レーザー脱離質量分析(PerSeptive Biosystems)を用いて確認した。N36/C34の混合物およびIQN17に対するウサギ抗血清は、前述の方法(文献29)で調製した。gp41の6へリックス束に特異的なマウスのmAb NC-1を調製し、前述のように(文献29)特性付けた。ウサギおよびマウスの免疫グロブリン（IgG）は、プロテインA/Gビーズ（Protein A/G beads）(Pierce, Rockford, IL)を用いて精製した。CXCR4に特異的なマウスmAb 12G5は、R&D Systems (Minneapolis, MN)から購入した。スクリーニングのための化学物質ライブラリーは、Nanosyn (Menlo Park, CA)から購入した。NB-206およびその類似体はChemBridge Corporation (San Diego, CA) から購入した。クロロペプチンは、北里研究所（日本 東京）のSatoshi OmuraおよびHaruo Tanakaからの有り難い提供によるものである。
（試薬）MT-2細胞、HIV-1IIIB感染H9細胞(H9/HIV-1IIIB)、U87-T4-CXCR4およびU87-T4-CCR5細胞、実験室適応HIV-1株および一次HIV-1株、ならびに抗p24mAb (183-12H-5C)を、NIH AIDS Research and Reference Reagent Programから入手した。リンパ細胞系CEMx174 5.25M7は、C. Cheng-Mayerにより親切にも提供されたものであり、これは、HIV-1の長い末端反復配列(LTR)グリーン蛍光タンパク質(GFP)リポーターおよびルシフェラーゼリポーターコンストラクトが安定に形質導入されている。この細胞は、CD4と両方のコレセプターCXCR4およびCCR5を発現する（文献30）。これらの細胞を10%ウシ胎仔血清(FBS)、1μg/mlピューロマイシン、200μg/ml G418が添加されたRPMI-1640培地で維持した。組み換え可溶性CD4(sCD4)は、ジェネンテック社（Genentech Inc. (South San Francisco, CA)）から入手した。ペプチドN36、C34(文献7,17)、IQN17(文献31)およびT22(文献32,33)は、ニューヨーク血液センター（New York Blood Center）の微量化学研究所（MicroChemistry Laboratory）で標準の固相FMOC法を用いて合成した。ビオチン化D-ペプチドであるD10-p5-2K(文献31)についても、前述のように(文献31)、D-アミノ酸を使って施設内で合成し、酸化させた。ペプチドは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で、均質になるまで精製された。精製したペプチドの同定は、レーザー脱離質量分析(PerSeptive Biosystems)を用いて確認した。N36/C34の混合物およびIQN17に対するウサギ抗血清は、前述の方法(文献29)で調製した。gp41の6へリックス束に特異的なマウスのmAb NC-1を調製し、前述のように(文献29)特性付けた。ウサギおよびマウスの免疫グロブリン（IgG）は、プロテインA/Gビーズ（Protein A/G beads）(Pierce, Rockford, IL)を用いて精製した。CXCR4に特異的なマウスmAb 12G5は、R&D Systems (Minneapolis, MN)から購入した。スクリーニングのための化学物質ライブラリーは、Nanosyn (Menlo Park, CA)から購入した。NB-206およびその類似体はChemBridge Corporation (San Diego, CA) から購入した。クロロペプチンは、北里研究所（日本 東京）のSatoshi OmuraおよびHaruo Tanakaからの有り難い提供によるものである。
（HIV-1融合阻害剤のスクリーニングのための合胞体形成分析）
2×105/mlのHIV-1IIIB感染H9細胞(H9/HIV-1IIIB)を、スクリーニング対象である化合物の存在下（化合物の最終濃度25μg/ml）で、MT-2細胞(2×106/ml)とともに共培養した。この培養は96ウェルプレート中で37℃2日間行った。HIV-1誘導の合胞体形成を倒立顕微鏡下で観察し、「−」（合胞体が観察されなかった）、「±」（50％の合胞体が阻害された）、「＋」（合胞体形成が阻害されなかった）の評価をつけた。「−」と「±」の評価を受けた前記化合物を選択し、さらにgp41の6へリックス束形成に対する阻害物質についてELISA法を用いてスクリーニングを行った。
2×105/mlのHIV-1IIIB感染H9細胞(H9/HIV-1IIIB)を、スクリーニング対象である化合物の存在下（化合物の最終濃度25μg/ml）で、MT-2細胞(2×106/ml)とともに共培養した。この培養は96ウェルプレート中で37℃2日間行った。HIV-1誘導の合胞体形成を倒立顕微鏡下で観察し、「−」（合胞体が観察されなかった）、「±」（50％の合胞体が阻害された）、「＋」（合胞体形成が阻害されなかった）の評価をつけた。「−」と「±」の評価を受けた前記化合物を選択し、さらにgp41の6へリックス束形成に対する阻害物質についてELISA法を用いてスクリーニングを行った。
（gp41の6へリックス束形成を阻害する化合物をスクリーニングするためのELISA法）
前述のサンドイッチELISA法(文献27)を用いて、gp41の6へリックス束形成を阻害する化合物をスクリーニングした。簡潔に述べると、ペプチドN36 (2μM)を試験化合物と一緒に指定濃度で37℃30分間プレインキュベートし、その後C34 (2μM)を加えた。対照実験では、N36はC34とともに37℃で30分間プレインキュベートし、その後試験化合物を添加した。37℃で30分間インキュベートした後、混合物を96ウェルポリスチレンプレート(Costar, Corning Inc., Corning, NY)のウェルに加えた。該ウェルは、N36/C34混合物に対するウサギ抗血清から精製したIgG (2μg/ml)を予めコーティングしておいたものである。その後、該mAb NC-1、ビオチン標識ヤギ抗マウスIgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、ストレプトアビジン標識ホールラディッシュペルオキシダーゼ(SA-HRP)(Zymed, S. San Francisco, CA)、および基質3,3 ',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB) (Sigma)を連続的に加えた。ELISAリーダー(Ultra 384, Tecan, Research Triangle Park, NC) を用いて、450 nmの吸光度を測定した。該化合物による阻害率を前述の方法(文献34)で計算し、50%阻害濃度(IC50)を指定ソフトウェアCalcusyn(文献35)を用いて算出した。このソフトウェアは、Dr. T. C. Chou (Sloan-Kettering Cancer Center, New York, New York)により、親切にも提供されたものである。
前述のサンドイッチELISA法(文献27)を用いて、gp41の6へリックス束形成を阻害する化合物をスクリーニングした。簡潔に述べると、ペプチドN36 (2μM)を試験化合物と一緒に指定濃度で37℃30分間プレインキュベートし、その後C34 (2μM)を加えた。対照実験では、N36はC34とともに37℃で30分間プレインキュベートし、その後試験化合物を添加した。37℃で30分間インキュベートした後、混合物を96ウェルポリスチレンプレート(Costar, Corning Inc., Corning, NY)のウェルに加えた。該ウェルは、N36/C34混合物に対するウサギ抗血清から精製したIgG (2μg/ml)を予めコーティングしておいたものである。その後、該mAb NC-1、ビオチン標識ヤギ抗マウスIgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)、ストレプトアビジン標識ホールラディッシュペルオキシダーゼ(SA-HRP)(Zymed, S. San Francisco, CA)、および基質3,3 ',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB) (Sigma)を連続的に加えた。ELISAリーダー(Ultra 384, Tecan, Research Triangle Park, NC) を用いて、450 nmの吸光度を測定した。該化合物による阻害率を前述の方法(文献34)で計算し、50%阻害濃度(IC50)を指定ソフトウェアCalcusyn(文献35)を用いて算出した。このソフトウェアは、Dr. T. C. Chou (Sloan-Kettering Cancer Center, New York, New York)により、親切にも提供されたものである。
（抗HIV-1感染性の評価）
実験室適応HIV-1株による感染に対する化合物の阻害活性を前述の方法(文献34)により決定した。簡潔に述べると、1×104個のMT-2細胞に、100 TCID50（50%組織培養感染量）のHIV-1を、10%FBSを含むRPMI 1640培地200μl中で感染させた。これは、一晩中、段階的に化合物の濃度の変える条件下、またはその非条件下で行われた。添加時期検定（time- of addition assay）では、感染後の様々な時点で化合物を添加した。その後、培養上清を除去して新鮮培地を加えた。感染4日後に100μlの培養上清をそれぞれのウェルから採取し、等量の5% Triton X-100と混合してp24抗原を分析した。この分析は、ELISA法で定量化した(文献23)。簡潔に述べると、ポリスチレンプレート(Immulon IB, Dynex Technology, Chantilly, VA)のウェルをHIV免疫グロブリン(HIVIG)でコーティングした。これは、前述のように(文献36)、HIV-1IIIBに対して高い中和力価を有するHIV血清反応陽性ドナーの血漿を、0.085 M炭酸塩−重炭酸イオン緩衝液(pH 9.6)中４℃で一晩おいて調製された。コーティング後、PBS-T緩衝液(0.05% Tween-20を含む0.01M PBS)で洗浄し、1%乾燥脱脂粉乳(Bio-Rad Inc., Hercules, CA)を含むPBSで遮断した。ウイルス溶解物をウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。全面を洗浄した後、抗p24 mAb(183-12H-5C)、ビオチン標識抗マウスIgG1 (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA)、SA-HRPおよびTMBを連続的に加えた。１N H2SO4を加えることにより反応を停止させた。ELISAリーダー(Ultra 384, Tecan)を用いて、450nmの吸光度を記録した。標準用量応答曲線を確立するにあたり、組み換えタンパク質p24 (US Biological, Swampscott, MA)を含めた。
実験室適応HIV-1株による感染に対する化合物の阻害活性を前述の方法(文献34)により決定した。簡潔に述べると、1×104個のMT-2細胞に、100 TCID50（50%組織培養感染量）のHIV-1を、10%FBSを含むRPMI 1640培地200μl中で感染させた。これは、一晩中、段階的に化合物の濃度の変える条件下、またはその非条件下で行われた。添加時期検定（time- of addition assay）では、感染後の様々な時点で化合物を添加した。その後、培養上清を除去して新鮮培地を加えた。感染4日後に100μlの培養上清をそれぞれのウェルから採取し、等量の5% Triton X-100と混合してp24抗原を分析した。この分析は、ELISA法で定量化した(文献23)。簡潔に述べると、ポリスチレンプレート(Immulon IB, Dynex Technology, Chantilly, VA)のウェルをHIV免疫グロブリン(HIVIG)でコーティングした。これは、前述のように(文献36)、HIV-1IIIBに対して高い中和力価を有するHIV血清反応陽性ドナーの血漿を、0.085 M炭酸塩−重炭酸イオン緩衝液(pH 9.6)中４℃で一晩おいて調製された。コーティング後、PBS-T緩衝液(0.05% Tween-20を含む0.01M PBS)で洗浄し、1%乾燥脱脂粉乳(Bio-Rad Inc., Hercules, CA)を含むPBSで遮断した。ウイルス溶解物をウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。全面を洗浄した後、抗p24 mAb(183-12H-5C)、ビオチン標識抗マウスIgG1 (Santa Cruz Biotech., Santa Cruz, CA)、SA-HRPおよびTMBを連続的に加えた。１N H2SO4を加えることにより反応を停止させた。ELISAリーダー(Ultra 384, Tecan)を用いて、450nmの吸光度を記録した。標準用量応答曲線を確立するにあたり、組み換えタンパク質p24 (US Biological, Swampscott, MA)を含めた。
一次HIV-1分離株による感染に対する化合物の阻害活性を前述の方法(文献37)で決定した。PBMCは、Histopaque-1077 (Sigma)を用いた標準密度勾配遠心分離法により、ニューヨーク血液センターの健常供血者の血液から単離した。その細胞を75cm2のプラスチック製フラスコにまき、37℃で2時間インキュベートした。非接着性細胞を採集し、10% FBS、5μg/ml PHAおよび100 U/ml IL-2 (Sigma)を含む10 mlのRPMI-1640培地中に5 ×106の濃度で再懸濁し、その後37℃で3日間インキュベートした。PHA-刺激細胞に、対応する一次HIV-1分離株を、感染の多重度(MOI) 0.01で感染させた。これは、段階的に化合物の濃度を変える条件下、またはその非条件下で行われた。培地は3日ごとに交換した。感染7日後に上清を集め、上述のELISA法でp24抗原について試験した。p24産生の阻害率とIC50値については、前述の方法で計算した。
（細胞間融合の阻害）
色素移動分析（dye transfer assay）を用いて、前述のように(文献11,25,26)、HIV-1介在の細胞融合を検出した。H9/HIV-1IIIB細胞を蛍光試薬であるCalcein-AM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)で標識し、MT-2細胞とともに(比= 1:5)、96ウェルプレート中で37℃2時間、試験化合物の存在下または非存在下でインキュベートした。倒立蛍光顕微鏡(Zeiss, Germany)に測微接眼レンズディスクを装着して、融合および非融合のCacein標識HIV-1感染細胞を数えた。細胞融合の阻害率とIC50値については、前述の方法(文献11)で計算した。
色素移動分析（dye transfer assay）を用いて、前述のように(文献11,25,26)、HIV-1介在の細胞融合を検出した。H9/HIV-1IIIB細胞を蛍光試薬であるCalcein-AM (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)で標識し、MT-2細胞とともに(比= 1:5)、96ウェルプレート中で37℃2時間、試験化合物の存在下または非存在下でインキュベートした。倒立蛍光顕微鏡(Zeiss, Germany)に測微接眼レンズディスクを装着して、融合および非融合のCacein標識HIV-1感染細胞を数えた。細胞融合の阻害率とIC50値については、前述の方法(文献11)で計算した。
CEMx174 5.25 M7細胞中の、一次HIV-1株(X4ウイルスおよびR5ウイルス)が感染した末梢血単核球（PBMC）間の融合阻害を、ルシフェラーゼアッセイで決定した。該M7細胞は、CD4およびCXCR4とCCR5の両方のコレセプターを発現する。簡潔に述べると、3段階濃度を変えた化合物50μlを、等量のPHA刺激のPBMC (1×105/ml)とともにインキュベートした。該PBMCは、上述の方法で7日間、それぞれ対応する一次HIV-1株を感染させたものである。37℃で30分間インキュベートした後、100μlのCEMx174 5.25 M7細胞（2×105）を加え、37℃で3日間インキュベートした。細胞を採集して、洗浄し、ルシフェラーゼキット(Promega, Corp., Madison, WI)に含まれている溶解試薬を用いて溶解した。アリコート（一定分量）の細胞溶解物を96ウェル平底ルミノメーター・プレート(Costar, Corning Inc., Corning, NY)に移し、続いてルシフェラーゼ基質(Promega)を添加した。Ultra 384 ルミノメーター(Tecan)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
（インビトロ細胞毒性の検出）
MT-2細胞に対する化合物のインビトロ細胞毒性を、前述のように(文献21)、XTTテトラゾリウム色素を用いる比色法で測定した。簡潔に述べると、細胞数(5×105/ml)と等量の段階的に濃度を変えた化合物を、96ウェルプレート中の同じウェルに加えた。37℃で4日間インキュベートした後、XTT (1 mg/ml; 50 ml/ウェル; PolySciences, Inc., Warrington, PA)を添加した。4時間後に、可溶性の細胞内ホルマザンを、570nmを基準とした450 nmで比色分析をして定量化した。細胞毒性率(文献37)およびCC50（50%の細胞毒性を示す濃度）の値を、ソフトウェアCalcusyn(文献35)を用いて計算した。
MT-2細胞に対する化合物のインビトロ細胞毒性を、前述のように(文献21)、XTTテトラゾリウム色素を用いる比色法で測定した。簡潔に述べると、細胞数(5×105/ml)と等量の段階的に濃度を変えた化合物を、96ウェルプレート中の同じウェルに加えた。37℃で4日間インキュベートした後、XTT (1 mg/ml; 50 ml/ウェル; PolySciences, Inc., Warrington, PA)を添加した。4時間後に、可溶性の細胞内ホルマザンを、570nmを基準とした450 nmで比色分析をして定量化した。細胞毒性率(文献37)およびCC50（50%の細胞毒性を示す濃度）の値を、ソフトウェアCalcusyn(文献35)を用いて計算した。
（CD4に対するgp120の結合阻害）
ポリスチレンプレートのウェルは、2μg/mlのヒツジ抗gp120抗体D7324 (Cliniqa, Fallbrook, CA) 100μlでコーティングした。該コーティングは、炭酸塩緩衝液（pH9.6）中4℃で一晩行ったものである。その後、1%乾燥脱脂粉乳を含むPBS溶液で37℃1時間かけて遮断した。PBS中0.5μg/mlの組み換えgp120分子(Immunodiagnostics, Woburn, MA)を100マイクロリットル添加し、37℃で1時間インキュベートし、その後、PBS-Tで3回洗浄した。可溶性CD4(sCD4)0.25μg/mlを、化合物(25μM)の存在下で添加し、37℃で1時間インキュベートした。3回洗浄した後、ウサギ抗sCD4 IgG (PBS中0.25μg/ml、100μl/ウェル)を加え、37℃で1時間インキュベートした。ウサギ抗sCD4 IgGの結合は、ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG、SA-HRP、およびTMBを連続的に添加して決定した。その反応が終了した後、450 nmの吸光度をELISAリーダー(Tecan)で記録した。
ポリスチレンプレートのウェルは、2μg/mlのヒツジ抗gp120抗体D7324 (Cliniqa, Fallbrook, CA) 100μlでコーティングした。該コーティングは、炭酸塩緩衝液（pH9.6）中4℃で一晩行ったものである。その後、1%乾燥脱脂粉乳を含むPBS溶液で37℃1時間かけて遮断した。PBS中0.5μg/mlの組み換えgp120分子(Immunodiagnostics, Woburn, MA)を100マイクロリットル添加し、37℃で1時間インキュベートし、その後、PBS-Tで3回洗浄した。可溶性CD4(sCD4)0.25μg/mlを、化合物(25μM)の存在下で添加し、37℃で1時間インキュベートした。3回洗浄した後、ウサギ抗sCD4 IgG (PBS中0.25μg/ml、100μl/ウェル)を加え、37℃で1時間インキュベートした。ウサギ抗sCD4 IgGの結合は、ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG、SA-HRP、およびTMBを連続的に添加して決定した。その反応が終了した後、450 nmの吸光度をELISAリーダー(Tecan)で記録した。
＜結果＞
（ハイスループットスクリーニング（HTS）によるNB-145の同定）
合胞体形成分析、およびサンドイッチELISA法を基礎にしたHTS技術を用いて、単一用量(25μg/ml)で46,640種の化合物からなるNanosyn Corporationの化学物質ライブラリーのスクリーニングを行った。これらの化合物は「薬らしい（drug-like）」分子であり、「ユニバーサル」ライブラリーとなるように合理的に選定されたものである。このライブラリーは、最小数の化合物で最大限の多様な薬理作用性に及ぶものである。ある濃度のNB-145と称される化合物が、HIV-1介在の合胞体形成とgp41 N-ペプチドN36およびC-ペプチドC34間の６へリックス束形成を完全に阻害した。これは、該化合物が、gp41介在の膜融合を阻害することによりHIV-1感染を阻害する可能性があることを示唆している。したがって、この化合物は、より強力なHIV-1融合阻害剤を同定するためのリード化合物として使用できると考えられる。
（ハイスループットスクリーニング（HTS）によるNB-145の同定）
合胞体形成分析、およびサンドイッチELISA法を基礎にしたHTS技術を用いて、単一用量(25μg/ml)で46,640種の化合物からなるNanosyn Corporationの化学物質ライブラリーのスクリーニングを行った。これらの化合物は「薬らしい（drug-like）」分子であり、「ユニバーサル」ライブラリーとなるように合理的に選定されたものである。このライブラリーは、最小数の化合物で最大限の多様な薬理作用性に及ぶものである。ある濃度のNB-145と称される化合物が、HIV-1介在の合胞体形成とgp41 N-ペプチドN36およびC-ペプチドC34間の６へリックス束形成を完全に阻害した。これは、該化合物が、gp41介在の膜融合を阻害することによりHIV-1感染を阻害する可能性があることを示唆している。したがって、この化合物は、より強力なHIV-1融合阻害剤を同定するためのリード化合物として使用できると考えられる。
（実験室適応HIV-1IIIB株の感染に対して強力な阻害活性を有するNB-206およびその類似体の同定）
NB-145の化学構造に基づいて、我々は、Chembridge Corporationの化学データベースを検索し、NB-145に類似した構造を有する73種の化合物を発見した。そこで、我々は、これらの化合物を購入し、それらの阻害活性について、以下(1)HIV-1複製（p24産生）、(2)HIV-1介在の細胞変性効果(CPE)、(3)HIV-1 Env-誘発の細胞間融合、およびMT-2細胞に対する細胞毒性について試験した。CC50（50%細胞毒性濃度）およびIC50（50%阻害濃度）の値に基づき、選択指数(SI)を計算した。表２（１〜２）に示すように、化合物の1つであるNB-206と称される化合物は、HIV-1の複製阻害(IC50=19nM)およびHIV-1介在の細胞間融合阻害(IC50≦0.667μM)に最も強力であり、SIは981であった。NB-206以外に、NB-206と同一の親構造を有する他の20種の化合物もHIV-1感染に対して強力な阻害活性があり、IC50値は87〜943nM、SI値は48〜＞1778であった。これらの活性抗HIV-1化合物のほとんどは、細胞毒性が低かった。
NB-145の化学構造に基づいて、我々は、Chembridge Corporationの化学データベースを検索し、NB-145に類似した構造を有する73種の化合物を発見した。そこで、我々は、これらの化合物を購入し、それらの阻害活性について、以下(1)HIV-1複製（p24産生）、(2)HIV-1介在の細胞変性効果(CPE)、(3)HIV-1 Env-誘発の細胞間融合、およびMT-2細胞に対する細胞毒性について試験した。CC50（50%細胞毒性濃度）およびIC50（50%阻害濃度）の値に基づき、選択指数(SI)を計算した。表２（１〜２）に示すように、化合物の1つであるNB-206と称される化合物は、HIV-1の複製阻害(IC50=19nM)およびHIV-1介在の細胞間融合阻害(IC50≦0.667μM)に最も強力であり、SIは981であった。NB-206以外に、NB-206と同一の親構造を有する他の20種の化合物もHIV-1感染に対して強力な阻害活性があり、IC50値は87〜943nM、SI値は48〜＞1778であった。これらの活性抗HIV-1化合物のほとんどは、細胞毒性が低かった。
（NB-206およびその類似体が、膜融合を遮断することでHIV-1の進入を阻害する）
添加時期検定を実施し、NB-206およびその類似体がHIV-1進入阻害剤であるかどうかを決定した。MT-2細胞をHIV-1IIIBとともに、37℃で0、1、 2、3、4、6および8時間インキュベートした後、それぞれにNB-206およびNB-231を2.5μMの濃度で添加した。対照としてアジドチミジン（AZT）(0.1μM)を用いた。さらに2時間培養した後、細胞を洗浄して遊離ウイルスと化合物を除去した。感染から4日後に上澄みを採取して、p24産生量を測定した。NB-206およびその類似体は、ウイルスと一緒に細胞に添加した場合にのみHIV-1複製を阻害したが、ウイルスを細胞に加えて1時間以上経過してから添加すると阻害活性を示さなかった。しかしながら、AZTは、感染から8時間後に添加した場合であってもHIV-1複製を有効に阻害した（図1）。
添加時期検定を実施し、NB-206およびその類似体がHIV-1進入阻害剤であるかどうかを決定した。MT-2細胞をHIV-1IIIBとともに、37℃で0、1、 2、3、4、6および8時間インキュベートした後、それぞれにNB-206およびNB-231を2.5μMの濃度で添加した。対照としてアジドチミジン（AZT）(0.1μM)を用いた。さらに2時間培養した後、細胞を洗浄して遊離ウイルスと化合物を除去した。感染から4日後に上澄みを採取して、p24産生量を測定した。NB-206およびその類似体は、ウイルスと一緒に細胞に添加した場合にのみHIV-1複製を阻害したが、ウイルスを細胞に加えて1時間以上経過してから添加すると阻害活性を示さなかった。しかしながら、AZTは、感染から8時間後に添加した場合であってもHIV-1複製を有効に阻害した（図1）。
ウイルスと標的細胞膜の融合、またはHIV感染細胞と非感染細胞の融合は、新しい標的細胞にHIVが進入する重要な段階である。したがって、NB-206およびその類似体が細胞間融合を阻害するかを判断することが必須である。図2に示すように、NB-206およびその類似体(NB-231、NB-154、およびNB-179)は、HIV-1IIIB感染H9細胞と非感染MT-2細胞の融合を用量依存的に阻害した。
（NB-206およびその類似体は、実験室適応HIV-1株および一次HIV-1株による感染に強力な阻害活性を有する）
NB-206およびその類似体の阻害活性を、実験室適応HIV-1株によるMT-2細胞への感染、および一次HIV-1株によるCEMx174 5.25 M7細胞への感染に対して、前述の方法(文献23, 38)で決定した。HIV-1IIIBに加えて、NB-206およびその類似体(NB-231, NB-154, NB-179)は、他の実験室適応HIV-1株（RF、SF2、MN、AZT-R、AZT耐性株を含む）による感染をも用量依存的に阻害し、IC50値はナノモル域であった（表3）。
NB-206およびその類似体の阻害活性を、実験室適応HIV-1株によるMT-2細胞への感染、および一次HIV-1株によるCEMx174 5.25 M7細胞への感染に対して、前述の方法(文献23, 38)で決定した。HIV-1IIIBに加えて、NB-206およびその類似体(NB-231, NB-154, NB-179)は、他の実験室適応HIV-1株（RF、SF2、MN、AZT-R、AZT耐性株を含む）による感染をも用量依存的に阻害し、IC50値はナノモル域であった（表3）。
NB-206およびその類似体の感染の阻害活性を、異なるサブタイプ（クレードA,B,C,E,F,GおよびグループO）およびバイオタイプ（R5,X4およびR5/X4）の一次HIV-1分離株に対して、前述の方法(文献24)で決定した。表4に示すように、NB-206およびその類似体は一次HIV-1分離株の感染に対して強力な阻害活性があり、IC50値はナノモル域であった。これらのデータは、NB-206およびその類似体が、多様なHIV-1株に対して強力な抗ウイルス活性を有することを示唆している。
（NB-206およびその類似体はgp41の６へリックス束形成に干渉する）
続いて、gp41の６へリックス束形成に対するNB-206およびその類似体の作用について決定した。該６へリックス束形成は、HIV-1が標的細胞と融合する際の重要な立体構造の変化である。NペプチドとCペプチドを等しいモル濃度で混合することにより(文献16)、gp41の６へリックス束のモデル系を確立した。このモデルgp41コア構造は、サンドイッチELISA法で立体構造特異的なmAbのNC-1を使って検出できる(文献27,29)。この系を用いて、gp41の６へリックス束形成に対するNB-206およびその類似体の阻害活性を試験した。図3に示すように、NB-206およびその類似体 (NB-231, NB-154,およびNB-179)は、用量依存的にN36とC34間の６へリックス束形成を著しく阻害した。NB-206、NB-231、NB-154、NB-179のIC50値(μM)は、それぞれ0.83±0.03、0.93±0.33、1.56±0.12、2.51±0.27であった。これらの結果は、NB-206およびその類似体が、gp41のコイルドコイル領域のコンポーネントと結合し、gp41のNHR領域とCHR領域間の結合を干渉することを示唆するものである。
続いて、gp41の６へリックス束形成に対するNB-206およびその類似体の作用について決定した。該６へリックス束形成は、HIV-1が標的細胞と融合する際の重要な立体構造の変化である。NペプチドとCペプチドを等しいモル濃度で混合することにより(文献16)、gp41の６へリックス束のモデル系を確立した。このモデルgp41コア構造は、サンドイッチELISA法で立体構造特異的なmAbのNC-1を使って検出できる(文献27,29)。この系を用いて、gp41の６へリックス束形成に対するNB-206およびその類似体の阻害活性を試験した。図3に示すように、NB-206およびその類似体 (NB-231, NB-154,およびNB-179)は、用量依存的にN36とC34間の６へリックス束形成を著しく阻害した。NB-206、NB-231、NB-154、NB-179のIC50値(μM)は、それぞれ0.83±0.03、0.93±0.33、1.56±0.12、2.51±0.27であった。これらの結果は、NB-206およびその類似体が、gp41のコイルドコイル領域のコンポーネントと結合し、gp41のNHR領域とCHR領域間の結合を干渉することを示唆するものである。
＜結果の考察＞
過去20年間、HIV/AIDS研究における最大の進展の一つは、抗HIV治療薬が開発されたことである(文献39)。現在まで、20種の抗HIV治療薬が米国FDAの承認を受けており、さらなる新薬候補が控えている（文献40)。これらの薬剤のほとんどは、HIV-1の逆転写酵素とプロテアーゼを標的にしている。その中の１つであるFuzeon(T-20)だけが、ウイルスエンベロープ糖タンパク質gp41を標的にしている(文献14,38,41,42)。T-20(文献41)は、SJ-2176 (文献11,43)やC34(文献17)のようなHIV-1 gp41のCHR領域に由来する他のペプチドと同様に、HIV-1の融合と進入を阻害する。臨床試験では、これがHIVの複製に対して極めて有望であることが示されている(文献14,44)。しかしながら、T-20は2つの大きな制限がある。それらは、経口アベイラビリティーがないこと（皮下注射される）、および製造原価が高いことである(文献40)。したがって、低分子のHIV-1融合阻害剤の開発が至急必要である。
過去20年間、HIV/AIDS研究における最大の進展の一つは、抗HIV治療薬が開発されたことである(文献39)。現在まで、20種の抗HIV治療薬が米国FDAの承認を受けており、さらなる新薬候補が控えている（文献40)。これらの薬剤のほとんどは、HIV-1の逆転写酵素とプロテアーゼを標的にしている。その中の１つであるFuzeon(T-20)だけが、ウイルスエンベロープ糖タンパク質gp41を標的にしている(文献14,38,41,42)。T-20(文献41)は、SJ-2176 (文献11,43)やC34(文献17)のようなHIV-1 gp41のCHR領域に由来する他のペプチドと同様に、HIV-1の融合と進入を阻害する。臨床試験では、これがHIVの複製に対して極めて有望であることが示されている(文献14,44)。しかしながら、T-20は2つの大きな制限がある。それらは、経口アベイラビリティーがないこと（皮下注射される）、および製造原価が高いことである(文献40)。したがって、低分子のHIV-1融合阻害剤の開発が至急必要である。
以前に、いくつかの低分子HIV-1融合阻害剤（ADS-J1, NB-2、NB-64）が同定されたとの報告がなされた。これらは、細胞に基づくHIV-1融合分析、立体構造特異的なmAbのNC-1を用いたサンドイッチELISA法、およびコンピュータ支援分子ドッキング法を用いたスクリーニングによるものである(文献21,24,27)。しかしながら、これらの化合物は、抗HIV-1活性がマイクロモルレベルであるため、良好なリード化合物ではないと考えられる。したがって、さらに化学物質ライブラリーをスクリーニングして、gp41を標的とする低分子HIV-1進入阻害剤を同定する必要があった。
2段階のスクリーニング分析（合胞体形成分析と6-HB（６へリックス束）形成のELISA法）を用いて、あるHIV-1融合阻害剤 NB-145が、46,640種の「薬らしい」化合物からなる化学物質ライブラリーから同定された。
次に、我々は、化学会社からNB-145に構造が類似した化合物73種を購入し（表1の1〜５）、HIV-1複製、HIV-1-介在によるCPEおよび細胞間融合に対する阻害活性、そしてgp41の6-HB形成に対する阻害活性について調べた。極めて強力な抗HIV-1活性（低ナノモルレベルのIC50値）を持ち、比較的細胞毒性が低く、SI値が高い（約1000）化合物NB-206を同定した。我々はまた、NB-206と類似の構造を有し、HIV-1IIIB感染に対して強力な阻害活性を持ち、IC50値がnM値で、高いSI値（中には1500を超えるものもある）をさらに20種同定した（表２の１〜２）。HIV-1IIIBに加え、NB-206およびその類似体は、他の実験室適応HIV-1株の感染も強力に阻害した。該HIV-1株は、RF、SF2、MN、およびAZT-R、AZT耐性株であるAZT-Rを含むものである（表3）。これらの化合物は、異なるサブタイプやバイオタイプの代表的な一次分離株の感染に対して有効であった（表4）。NB-206およびその類似体は6-HB形成に対して強力な阻害活性を有しており、これらの低分子HIV-1進入融合阻害剤が、gp41を標的とすることでHIV-1融合を遮断することを示唆している。
NB-206およびその類似体はリピンスキー（Lipinski）の「ルールオブファイブ」（即ち、分子量＜500ダルトン、算出CLogP＜5、水素結合ドナー＜5、および水素結合アクセプター＜10）(文献45)に基づく「薬らしい」特性を有している。したがって、これらの化合物は、良好な透過性とバイオアベイラビリティーを有するものと考えられる。
タンパク質間相互作用を遮断する低分子有機化合物をデザインすることは、新薬開発の挑戦的なアプローチであるが(文献46)、そのような阻害剤の同定が報告されている(文献47-49)。最近、低分子HIV-1進入阻害剤であるBMS-378806が発見された(文献50)。この化合物は分子量406.5であり、ウイルスエンベロープ糖タンパク質gp120と細胞のCD4受容体の間の相互作用を極めて強力に遮断する。これは、低分子の化合物が疎水性ポケットのような「ホットスポット」に結合した場合には、タンパク質間相互作用を効果的に遮断できることを示唆している。NHR領域により形成されるgp41の内部3量体の表面に存在する深い疎水性ポケットは、gp41の６へリックス束の形成と安定性に重要な役割を果たすため、「ホットスポット」であると認識されてきた（文献20,51)。NB-206およびその類似体は、そのgp41のポケットに結合して、融合活性gp41コアの形成を遮断すると考えられる。
NB-206およびその類似体は、異なるHIV-1株に対する広い抗HIV-1活性を有し、標的gp41に対して高い特異性を有している。したがって、NB-206およびその類似体は、新規の抗ウイルス組成物、特にはさらに強力な低分子HIV-1進入阻害剤を、新しいクラスの抗HIV-1治療薬としてデザインするためのリード化合物として使えるものと考えられる。
Claims (26)
- 下式（化１）により表される構造式（I）を有する抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
R1、R2、R3、R4およびR5は、それぞれ、H、ハロゲン、(CH2)nCOOR、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、アダマンチル、トリフルオロメチル、OH、CN、ニトロ、OR7、SO3R、SO2NHRおよびCONHRからなる群のうちいずれであってもよく、該nは、０乃至１０の整数であり、該ヘテロシクリルは、ピリジル、フリルおよびテトラゾイルであるがこれらに限定されず、該R７は、アルキル、アリールまたはアリールアルキルであり、該RはHまたはアルキルであって、
R６は、H、アリール、アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシアルキル、CH2CONHアリール、CH2CON(CH2CH2) 2O、CH2COOR、ヘテロシクリル-CH2およびCH(CH3)CO2Rからなる群から選択され、該ＲはHまたはアルキルであり、該アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシまたはヘキソキシであり、該ヘテロシクリルは、ピリジル、フリルまたはテトラゾイルであるがこれらに限定されず、該アリールは、H、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、トリフルオロメチルおよび(CH2)nCOORからなる群の1種以上で任意に置換されたフェニルまたはナフチルであり、該nは、０乃至１０の整数であり、該RはHまたはアルキルであって、
R1、R2、R3、R4およびR5の少なくとも１つが、COOHを含む。］ - 前記R1が(CH2)nCOOHであり、該nは０乃至３の整数であって、
前記R3、R4およびR5がHであって、
前記R6が置換または非置換のアルキル、アルケニル、フェニルまたはアリールアルキル基であることを特徴とする請求項１記載の抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩。 - 前記R1が(CH2)nCOOHであり、該nは０乃至３の整数であって、
前記R2がH、F、Cl、BrまたはIであって、
前記R3、R4およびR5がHであって、
前記R6が置換または非置換のアルキル、アルケニル、フェニルまたはアリールアルキル基であることを特徴とする請求項１記載の抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩。 - 前記ZがSであって、
前記R1が(CH2)nCOOHであり、該nは０乃至３の整数であって、
前記R2がH、FまたはClであって、
前記R3、R4およびR5がHであって、
前記R6がアルキルもしくは1以上の炭素原子を有する置換のアルキル基、または置換のフェニルもしくはベンジル基であることを特徴とする請求項１記載の抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩。 - 前記R2がHまたはClであって、
前記R3、R4およびR5がHであって、
前記R6が２乃至６の炭素原子を有するアルキル基、または置換のフェニルもしくはベンジル基であることを特徴とする請求項４記載の抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩。 - 下式（化２）により表される構造式を有することを特徴とする請求項５記載の抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
- 前記R6がエチルであることを特徴とする請求項６記載の抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
- 下式（化３）により表される構造式を有することを特徴とする請求項６記載の抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
- 前記ZがSであって、
前記R1が(CH2)nCOOHであり、該nは０乃至１０の整数であって、
前記R2がH、F、ClまたはIであって、
前記R3、R4およびR5がHであって、
前記R6が置換または非置換のアルキル、アルケニル、フェニルもしくはアリールアルキル基であって、該アルキル、アルケニル、フェニルもしくはアリールアルキル基がそれぞれ１２までの炭素原子を有することを特徴とする請求項１記載の抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩。 - 前記R6が置換もしくは非置換の１乃至３の炭素原子を有するアルキル基、置換もしくは非置換の６までの炭素原子を有するアルキル部分を備えるアリールアルキル基、または置換もしくは非置換のフェニルであることを特徴とする請求項９記載の抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
- 前記ZがSであって、
前記R1が(CH2)nCOOHであり、該nは０であって、
前記R2がClであって、
前記R3、R4およびR5がHであって、
前記R6がフェニルエチルであることを特徴とする請求項９記載の抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩。 - 前記ZがSであって、
前記R1が(CH2)nCOOHであり、該nは０であって、
前記R2がHであって、
前記R3、R4およびR5がHであって、
前記R6がエチル、下式（化４）により表される構造式、または下式（化５）により表される構造式であることを特徴とする請求項９記載の抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
- 下式（化６）により表される構造式（I）を有する抗ウイルス化合物またはその薬学的に許容可能な塩、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
R1、R2、R3、R4およびR5は、それぞれ、H、ハロゲン、(CH2)nCOOR、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、アダマンチル、トリフルオロメチル、OH、CN、ニトロ、OR7、SO3R、SO2NHRおよびCONHRからなる群のうちいずれであってもよく、該nは、０乃至１０の整数であり、該ヘテロシクリルは、ピリジル、フリルおよびテトラゾイルであるがこれらに限定されず、該R７は、アルキル、アリールまたはアリールアルキルであり、該RはHまたはアルキルであって、
R６は、H、アリール、アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシアルキル、CH2CONHアリール、CH2CON(CH2CH2) 2O、CH2COOR、ヘテロシクリル-CH2およびCH(CH3)CO2Rからなる群から選択され、該ＲはHまたはアルキルであり、該アルコキシは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペントキシまたはヘキソキシであり、該ヘテロシクリルは、ピリジル、フリルまたはテトラゾイルであるがこれらに限定されず、該アリールは、H、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、トリフルオロメチルおよび(CH2)nCOORからなる群の1種以上で任意に置換されたフェニルまたはナフチルであり、該nは、０乃至１０の整数であり、該RはHまたはアルキルであって、
R1、R2、R3、R4およびR5の少なくとも１つが、COOHを含む。］ - 前記ZがSであって、
前記R1が(CH2)nCOOHであり、該nは０乃至１０の整数であって、
前記R2がH、F、ClまたはIであって、
前記R3、R4およびR5がHであって、
前記R6が置換または非置換のアルキル、アルケニル、フェニルもしくはアリールアルキル基であって、該アルキル、アルケニル、フェニルもしくはアリールアルキル基がそれぞれ１２までの炭素原子を有することを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。 - 前記抗ウイルス化合物が、下式（化７）で表される化合物であることを特徴とする請求項１４記載の医薬組成物。
- 前記抗ウイルス化合物が、下式（化８）（化９）（化１０）で表される化合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１４記載の医薬組成物。
- 前記抗ウイルス化合物が、E-異性体またはZ-異性体であることを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。
- 適切な宿主細胞へのヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染を阻害または予防するための使用に適切であることを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。
- 前記感染が宿主細胞へのウイルスの進入を妨げることにより阻害または予防されることを特徴とする請求項１８記載の医薬組成物。
- 適切な宿主細胞におけるヒト免疫不全ウイルス(HIV)の複製を阻害するための方法であって、該方法は、
（a）適切な宿主細胞を、HIVの複製を阻害するために有効な量の請求項１記載の化合物または請求項１４記載の組成物と接触させる段階と、
（b）適切な条件下において、HIVを（a）段階の宿主細胞に感染させる量のHIVを、（a）段階の宿主細胞に接触させる段階と、
（c）該宿主細胞の感染レベルと、請求項１記載の化合物または請求項１３記載の医薬組成物と接触しなかった適切な宿主細胞の感染レベルとを比較する段階を備えることを特徴とする方法。 - 適切な宿主細胞がヒト細胞であることを特徴とする請求項２０記載の方法。
- ヒト免疫不全ウイルスに感染した対象を治療する方法であって、
前記方法が、有効量の請求項１記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を該対象に投与することを特徴とする方法。 - 抗HIV薬、抗感染薬および免疫賦活剤からなる群から選択される後天性免疫不全症候群(AIDS)治療薬の有効量をさらに含むことを特徴とする請求項２２記載の方法。
- 対象の後天性免疫不全症候群(AIDS)の徴候を予防する方法であって、
該対象の症候群を予防するために有効な量の請求項１記載の化合物を含む医薬組成物を該対象に投与する方法。 - 抗HIV薬、抗感染薬および免疫賦活剤からなる群から選択される後天性免疫不全症候群(AIDS)治療薬の有効量をさらに含むことを特徴とする請求項２４記載の方法。
- 前記対象がヒトであることを特徴とする請求項２２、２３、２４または２５記載の方法。
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