JP2008537548A - プロキネチシン１受容体 - Google Patents

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Abstract

本発明はＰＫ１受容体のモジュレーターとして働く化合物そして特に、ＰＫ１受容体の強力なそして選択的なアンタゴニストのクラスに関する。該化合物は哺乳動物におけるＰＫ１受容体の強力なそして選択的なアンタゴニストとして、そしてＰＫ１受容体の活性により誘発される哺乳動物における疾病状態の治療剤として有用である。

Description

関連出願との関係
本出願は、２００５年３月２４日出願の米国特許仮出願第６０／６６５，００２号及び２００５年１０月２８日に出願の第６０／７３１，４２１号に対し優先権を請求する。
連邦支援研究又は開発に関する陳述
以下に記載される本発明の研究及び開発は連邦に支援されなかった。
本発明はＰＫ１受容体のモジュレーターとして働く新規化合物、そして特にＰＫ１受容体の新規クラスの強力な、そして選択的なアンタゴニストに関する。本発明はまた、哺乳動物においてＰＫ１受容体の強力な、そして選択的なアンタゴニストとして有用な、新規化合物、それらの製薬学的に許容できる塩及びそれらの製薬学的に許容できる組成物並びにＰＫ１受容体の活性により誘発される哺乳動物における疾患状態に対する治療剤としてこれらのアンタゴニストを使用する方法に関する。
本発明はまた、ＰＫ１受容体の生物学的活性の機能分析のために有用な生物学的物質及びＰＫ１受容体の生物学的活性を修飾する化合物を特定する方法におけるそれらの使用に関する。本発明は更に、プロキネチシン１受容体の生物学的活性を測定する方法に関する。特に、本発明はプロキネチシン１受容体の生物学的活性を増加又は減少する化合物を特定する方法に関する。
消化は身体の個々の細胞に送達され、それにより利用されることができる分子への食物の分解を伴う。これらの分子はエネルギー源として働くことができ、それらはカルシウム、窒素又は鉄のような必須化学元素を提供することができ、又はそれらは完全な分子、例えば、細胞が必要とするがそれら自体は合成することができない特定のアミノ酸、脂肪酸及びビタミンであることができる。食物の分解及び同化並びに非消化廃棄物の排除の工程を組み入れる消化は、胃腸（ＧＩ）管として知られる口腔から肛門に至る長い渦巻き形の管中で実施される。ＧＩ管は口腔、口で開始し、続いて、咽頭、食道、胃、小腸、大腸及び肛門を包含する。ＧＩ管は開始部分から末端まで、４種の（ｆｏｕｃａｌｒ）組織層：（１）一番内側の層であり、摂取された物質と直接接触し、流体及び電解質の輸送並びに栄養物の消化及び吸収を容易にする、管状の上皮細胞で形成される粘膜、結合組織及び、平滑筋の薄い層よりなる下に横たわる土台の膜、（２）二番目に内側の層であり、神経細胞及び神経繊維並びに血管及びリンパ管の小さい束を含有する結合組織で形成される粘膜下組織、、（３）第３番目に内側の層であり、相対する方向に配向され、神経細胞束の広大な網目及びこれらの層間に挟まれた神経繊維を含有する平滑筋組織の２つの別の層で形成される外部筋肉組織（ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ ｅｘｔｅｒｎａ）、並びに（４）一番外側の層であり、腹部の腹膜腔の環境と接する結合組織の皮膜よりなる漿膜、を有する。
大部分のＧＩ管に沿って、外部筋肉層組織層は、その細胞の配向が腸の縦軸に対して垂直な、平滑筋の内側層並びにその細胞の配向が腸の縦軸に平行である外側層、の２種の相対する層より形成される。これらの筋肉層の共働収縮が食物を混合する輪状収縮並びにＧＩ管に沿って食物を移動する、蠕動として知られる波状運動をもたらす（図２９参照）。幾つかの地点で、筋肉の輪状層が太い帯に厚くなり、括約筋と呼ばれる弁様の収縮体を形成し、それが弛緩及び収縮によりＧＩ管の１つの領域からもう１つの領域への食物の通過を調節するように働く。
食物からの栄養物の分解及び同化は主として、胃及び小腸の高度の共働作用により達成される。胃は神経及び内分泌系双方により影響を受ける。食物の予期及び口中の食物の存在が胃の撹拌運動及び胃液の生成を刺激する。食物が胃に到達すると、その存在が胃の内分泌細胞から血流中にホルモンのガストリンの放出を誘発する。ガストリンが胃の細胞に働いて、胃液のそれらの分泌を増加する。
食物は胃内で、ペプシン、塩酸を包含する胃液及び撹拌運動の結果として半固体の固まりに転化される。次に食物は小腸中に送られて空にされ、そこで食物の分解が完了する。次に生成される栄養物の分子が循環系中に吸収され、そこからそれらは個々の細胞に送達される。小腸は、幾つかは小腸細胞により生産され、そして幾つかは膵臓及び肝臓により生産される種々の消化分泌物を含有する。他の上皮細胞、粘膜のゴブレット細胞は粘液を分泌する。小腸の消化作用はホルモンにより共働され、制御される。腸管はホルモンの影響に加えて更に、消化酵素の分泌及び収縮に関与する自律神経系により調節される。従って、刺激及び検査及び平衡化の複雑な相互作用が消化酵素を活性化し、化学環境を調整し、そして腸内の摂取物質の運動を制御するために働く。
大腸は水、ナトリウム及び他の電解質の吸収に関与する。その幾つかの上皮細胞は不消化食物残留物を潤滑化する粘液を分泌する。大量の水が、体液から浸透圧により又は消化管を裏打ちしている腺の分泌物として胃及び小腸中に侵入する。吸収過程が妨げられそして／又は、下痢におけるように粘液腺からの分泌物が高まる時に、重大な脱水が起こる可能性がある。
機能性大腸障害はＧＩ管の器官内の異常な運動及び分泌を伴ない、腹部の不快／疼痛を特徴として示す。これらの障害の基準は「Ｒｏｍｅ ＩＩ基準」中で胃腸科専門医により要約されている。（例えば、Ｒｏｍｅ ＩＩ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｃｒｉｔｅｒｉａ
ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｅｎｉｏｒ Ｅｄｉｔｏｒ Ｄｏｕｇｌａｓ Ａ．Ｄｒｏｓｓｍａｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＭｃＬｅａｎ，ＶＡ（２０００）を参照されたい。）これらの基準によると、その障害は一般的で、それらに限定はされないが、機能性消化不良、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ）、胃食道逆流疾患（ＧＥＲＤ）、非糜爛性逆流疾患（ＮＥＲＤ）及び慢性便秘（結腸の活動不全、特発性擬似閉塞症を包含する）を包含する。ＧＥＲＤは極めて蔓延しており、通常、非心臓性胸痛を伴い、制酸剤及び運動促進剤（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃ）で処置することができる。ＩＢＳはガス膨張／貯留及び腹部不快感／疼痛を伴う可能性がある再発性便秘及び／又は下痢の存在を特徴として示す（非特許文献１参照）。ＩＢＳの疼痛の開始は便の頻度及び／又は形態の変化を伴い、排便により緩和され得る。ＩＢＳは人口の１０〜１５％に種々の重篤度で起る極めて一般的な状態である（非特許文献２参照）。疼痛は平滑筋弛緩剤及び抗鬱剤で処置することができる（非特許文献３〜６参照）。重篤な下痢が主訴のＩＢＳはアロセトロン（ａｌｏｓｅｔｒｏｎ）により処置され、他方便秘が主訴のＩＢＳはテガセロッド（ｔｅｇａｓｅｒｏｄ）により処置される。機能性消化不良は食物により悪化される症状を伴い、早期満腹、嘔気及び嘔吐を伴う上部ＧＩ管の障害である。その原因は未知であるが、運動促進剤はＩＢＳの症状を緩和することができる。何人かの患者において、ＧＥＲＤ／ＮＥＲＤ、機能性消化不良及びＩＢＳ間の症状には重複が存在する。ＩＢＳのような機能性腸障害の処置は低い効率を有し、副作用を伴う。例えば、アロセトロンは、それが虚血性大腸炎において増加を伴うので、ＦＤＡにより危険管理プログラム上に承認されている。どんな処置も機能性大腸障害の疼痛を有効には緩和しない。
機能性障害に加えて、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）は一般的であり、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）を包含する。ＣＤには遺伝的要素があるかも知れないが、ＵＣ及びＣＤ両者の原因は未知である。ＵＣは下痢及び腹部痙攣を伴う炎症及び潰瘍を特徴として示す結腸の散発性粘膜疾患である。粘膜の炎症は直腸領域から進展して、最終的には大腸を通って進行する。ＣＤはもっとも頻繁には遠位小腸及び結腸に関与する経粘膜性炎症である。該炎症は種々のかかわりをもつ潰瘍をもたらし、重症の症例では経粘膜性瘢痕及び慢性の炎症をもたらす可能性がある。感染性及び調節障害性免疫機能の両者が、疾患の発病に寄与するかも知れない。ＩＢＤの治療はコルチコステロイド、免疫抑制剤（アザチオプリン、メルカプトプリン及びメトトレキセート）及びアミノサリチレート（５−ＡＳＡ）を包含する。これらの治療はコルチコイドを模倣することにより免疫系の抑制を伴なうか又は未知の作用機序をもつ。経口コルチコステロイドの使用は重症の副作用を伴い、他方免疫抑制剤及びアミノサリチレートは中程度にのみ有効である。インフリキシマブ（キメラモノクローナル抗腫瘍壊死因子抗体）はＣＤに有効であるが、その使用はその効力を減少させる、抗体の存在を伴う。現在、腸の炎症に伴う、運動及び分泌の異常又は疼痛感覚を標的とする処置は存在しない。
プロキネチシン１（ＰＫ１）及びプロキネチシン２（ＰＫ２）として知られるシステインの豊富なタンパク質並びにＰＫ活性をもつバリアント、フラグメント及び分子が特定されている。ＰＫ１及びＰＫ２は胃腸の平滑筋を収縮し（非特許文献７）そして食餌供給（ｆｅｅｄｉｎｇ）を抑制する（非特許文献８）ことが示されている（非特許文献７及び８参照）。ＰＫ１及びＰＫ２は、ＰＫ１及びＰＫ２受容体両者に作用し、これらの関連ＰＫのＣ−末端のシステイン豊富な領域の、限定された構造変化は許容される。例えば、ＰＫ１及びＰＫ２のシステインの豊富な領域が二者間で交換されたキメラＰＫ、並びにそのＣ−末端領域に２１残基挿入物を包含するＰＫ２の接合バリアントは活性を保持した（非特許文献９参照）。ＰＫバリアントは一次感覚ニューロンの受容体に結合し、そして熱及び機械的刺激に対して末梢侵害受容体の強度な過敏化をもたらす（非特許文献１０及び１１参照）。
ＰＫ１は内分泌腺から由来される毛細内皮細胞の増殖、移動及び開窓（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ）を誘発する。ＰＫのｍＲＮＡの発現はステロイド生成腺、卵巣、睾丸、副腎及び胎盤に認められた（非特許文献１２参照）。２００２年に、ＰＫ１受容体の特定により、内分泌腺における脈管形成の制御のための新規の分子的基礎が提供された（非特許文献１３及び１４参照）。例えば、マウス睾丸に対するＰＫ１のアデノウイルスの送達は、強力な脈管形成反応をもたらす（非特許文献１５参照）。近年、ＰＫ１のｍＲＮＡは通常、結腸直腸の正常粘膜中には発現されず、結腸直腸の癌細胞中に検出されることが示された（非特許文献１６参照）。
従って、ＰＫ１受容体モジュレーターそしてとりわけＰＫ１受容体アンタゴニストは種々の哺乳動物の疾患状態、例えば、ＩＢＳ及びＩＢＤと関連する内蔵痛の処置及び予防に有用であるかも知れない。更に、ＰＫ１受容体モジュレーターそしてとりわけＰＫ１受容体アンタゴニストはＧＥＲＤ又は分泌性下痢の他の形態の処置に有用であるかも知れない。更にＰＫ１受容体モジュレーターそしてとりわけＰＫ１受容体アンタゴニストは大腸及び生殖器官の癌特異的脈管形態因子を処置するのに有用であるかも知れない。
特許文献１は、ＰＫ１及びＰＫ２ポリヌクレオチド及びポリペプチド及びそれらの使用を開示している（特許文献１参照）。
特許文献２及び対応する特許文献３は腸の炎症を処置するためのＰＫ１及びＰＫ２のペプチドアンタゴニストの使用を開示している（特許文献２及び３参照）。該引用文献は、該アンタゴニストがＰＫ１及びＰＫ２と特異的に結合する抗体並びにその中に開示されたアミノ酸配列に結合する受容体を包含することを開示している。
特許文献４は胃酸分泌の１つ又は複数の症状を変えるためにプロキネチシン受容体アン
タゴニストを投与することにより胃酸又はペプシノーゲン分泌を修飾する方法を開示している（特許文献４参照）。該引用文献はプロキネチシン受容体アンタゴニストがそこに開示されたアミノ酸配列に少なくとも８０％類似するアミノ酸配列を含有する、いずれかの種からのプロキネチシンの修飾バージョンであることを開示している。
引用文献のどれも、ＰＫ１受容体の小分子モジュレーターを開示又は示唆していない。このようなモジュレーターの特定は、損傷された又は高められた胃腸運動及び／又は分泌を伴う障害に対する新規治療剤の開発を容易にするにちがいない。
ＰＫ１受容体モジュレーターそしてとりわけＰＫ１受容体アンタゴニストを提供することが本発明のアスペクトである。更に、ＰＫ１受容体により仲介される状態を処置又は緩和する方法を提供することが本発明の目的である。そして、ＰＫ１受容体アンタゴニストとして有用な本発明の化合物を含んでなる、有用な製薬学的組成物を提供することが本発明の目的である。
本発明のもう１つのアスペクトは動物におけるＰＫ１受容体の生物学的活性をモニターする方法である。
本発明の様々なアスペクト及び利点が以下の説明により明白になるであろう
国際公開出願第２００２３６６２５号パンフレット 米国特許第２００４０１５６８４２号明細書 米国特許第６，４８５，９３８号明細書 国際公開出願第２００４０８７０５４号パンフレット Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｗ．Ｇ．ａｎｄ Ｈｅａｔｏｎ，Ｋ．Ｗ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １９８０，７９，２８３−２８８ Ｓａｉｔｏ，Ｙ．Ａ．；Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ，Ｐ．：ａｎｄ Ｌｏｃｋｅ，Ｇ．Ｒ．Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００２，９７，１９１０−１９１５ Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．；Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，Ｐ．Ｇ．；Ｔｏｍｋｉｎｓ，Ｇ；Ｂａｌｄｅｎ，Ｅ．；Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｊ．；ａｎｄ Ｋｒｏｅｎｋｅ，Ｋ．；Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０００，１０８，６５−７２ Ｊａｉｌｗａｌａ，Ｊ．；Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ，Ｔ．Ｆ．；ａｎｄ Ｋｒｏｅｎｋｅ，Ｋ．；Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２０００，１３３：１３６−１４７ Ａｋｅｈｕｒｓｔ，Ｒ．ａｎｄ Ｋａｒｔｅｎｔｈａｌｅｒ，Ｅ．Ｇｕｔ ２００１，４８，２７２−２８２ Ｐｏｙｎａｒｄ，Ｔ．；Ｒｅｇｉｍｂｅａｕ，Ｃ．；ａｎｄ Ｂｅｎｈａｍｏｕ，Ｙ；Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００１，１５，３５５−３６１ Ｌｉ，Ｍ．；Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｃ．Ｍ．；Ｋｎａｕｅｒ，Ｄ．Ｊ．；Ｅｈｌｅｒｔ，Ｆ．Ｊ．；ａｎｄ Ｚｈｏｕ，Ｑ．Ｙ．；Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１，５９，６９２−６９８ Ｎｅｇｒｉ，Ｌ．；Ｌａｔｔａｎｚｉ，Ｒ．；Ｇｉａｎｎｉｎｉ，Ｅ．；Ｄｅ Ｆｅｌｉｃｅ，Ｍ．；Ｃｏｌｕｃｃｉ，Ａ．；ａｎｄ Ｍｅｌｃｈｉｏｒｒｉ，Ｐ．Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４，１４２，１８１−１９１ Ｂｕｌｌｏｃｋ，ＣＭ；Ｌｉ Ｊ．Ｄ．；Ｚｈｏｕ，Ｑ．Ｙ．；Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４，６５（３），５８２−８ Ｍｏｌｌａｙ，Ｃ．；Ｗｅｓｃｈｅｌｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．；Ｍｉｇｎｏｇｎａ，Ｇ．；Ｎｅｇｒｉ，Ｌ．；Ｍｅｌｃｈｉｏｒｒｉ，Ｐ．；Ｂａｒｒａ，Ｄ．；Ｋｒｅｉｌ，Ｇ．；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９，３７４，１８９−１９６ Ｎｅｇｒｉ，Ｌ．；Ｌａｔｔａｎｚｉ，Ｒ．；Ｇｉａｎｎｉｎｉ，Ｅ．；Ｍｅｔｅｒｅ，Ａ．；Ｃｏｌｕｃｃｉ，Ｍ．；Ｂａｒｒａ，Ｄ．；Ｋｒｅｉｌ，Ｇ．；Ｍｅｌｃｈｉｏｒｒｉ，Ｐ．；Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２，１３７（８），１１４７−５４ ＬｅＣｏｕｔｅｒ，Ｊ．；Ｋｏｗａｌｓｋｉ，Ｊ．；Ｆｏｓｔｅｒ，Ｊ．；Ｈａａｓ，Ｐ．；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．；Ｄｉｌｌａｒｄ−Ｔｅｌｍ，Ｌ．；Ｆｒａｎｔｚ，Ｇ．；Ｒａｎｇｅｌｌ，Ｌ．；ＤｅＧｕｚｍａｎ，Ｌ．；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｇ．Ａ．；Ｐｅａｌｅ，Ｆ．；Ｇｕｒｎｅｙ，Ａ．；Ｈｉｌｌａｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．；Ｎａｔｕｒｅ ２００１，４１２（６８５０），８７７−８４ Ｍａｓｕｄａ，Ｙ．；Ｔａｋａｔｓｕ Ｙ．；Ｔｅｒａｏ，Ｙ．；Ｋｕｍａｎｏ，Ｓ．；Ｉｘｈｉｂａｓｈｉ，Ｙ．；Ｓｕｅｎａｇａ，Ｍ．；Ａｂｅ，Ｍ．；Ｆｕｋｕｓｕｍｉ，Ｓ．；Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．；Ｓｈｉｎｔａｎｉ，Ｙ．；Ｙａｍａｄａ，Ｔ．；Ｈｉｎｕｍａ，Ｓ．；Ｉｎａｔｏｍｉ，Ｎ．；Ｏｈｔａｋｉ，Ｔ．；Ｏｎｄａ，Ｈ．；Ｆｕｊｉｎｏ，Ｍ．；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００２，２９３（１），３９６−４０２ ＬｅＣｏｕｔｅｒ，Ｊ．；Ｌｉｎ，Ｒ．；Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ．２００２，６７，２１７−２１ ＬｅＣｏｕｔｅｒ，Ｊ．；Ｌｉｎ，Ｒ．；Ｔｅｊａｄａ，Ｍ．；Ｆｒａｎｔｚ，Ｇ．；Ｐｅａｌｅ，Ｆ．；Ｈｉｌｌａｎ，Ｋ．Ｊ．；Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３，１００，２６８５−９０ Ｇｏｉ，Ｙ．；Ｆｕｊｉｏｋａ，Ｍ．；Ｓａｔｏｈ，Ｙ．；Ｔａｂａｔａ，Ｓ．；Ｋｏｎｅｒｉ，Ｋ．；Ｎａｇａｎｏ，Ｈ．；Ｈｉｒｏｎｏ，Ｙ．；Ｋａｔａｙａｍａ，Ｋ．；Ｈｉｒｏｓｅ，Ｋ．；ａｎｄ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００４，６４，１９０６−１９１０
本発明者はＰＫ１受容体の強力なアンタゴニストを発見した。従って、本発明は式（Ｉ）：
Figure 2008537548
［式中：
Ａ１は水素、アリール、ヘテロアリール、Ｃ５−８シクロアルキル又はヘテロシクリルであり、但しＡ１はピペリジン−４−イル、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−ピペリジン−４−イル又はＮ−メチル−ピペリジン−３−イル以外であることとし、そしてここで、水素以外のＡ１の置換基は、場合により、独立してＣ１−６アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、シアノ、ヒドロキ
シ、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルキルチオカルボニル、ホルミル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルアミノスルホニル及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノスルホニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｌ１は、場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル及びハロゲンよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい−（ＣＨ２）ｒ−又は−ＣＨ２ＣＨ２Ｘ（ＣＨ２）ｓ−であり、ただしＡ１が水素である時は、ｒは４以上であることとし、
ｒは１〜５の整数であり、
ｓは１〜３の整数であり、
ＸはＯ又はＳであり、
Ｄは−Ｐ−Ａ２であり、
Ａ２は水素、フェニル、未置換ピリジン−２−イル以外のヘテロアリール又はＣ３−８シクロアルキルであり、ここでフェニルは場合によりメタ又はパラ位で置換されていてもよく、そして水素及びフェニル以外のＡ２の置換基は、場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−６アルコキシ、アリール（Ｃ１−６）アルコキシ、フェニル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルキルチオカルボニル、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ及び非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、但しＡ２上の２個を超えない置換基はアリール（Ｃ１−６）アルコキシ、フェニル又は非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシであることとし、
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）２−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２は未置換フェニル、アリール（Ｃ１−６）アルコキシ又はフェニルで置換されたフェニル、あるいはシアノによりメタ位で置換されたフェニル、以外であることとし、そして更に
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）３−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２はメトキシで置換されたフェニル以外であることとし、そして
但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルでありそしてＰが−ＣＨ２−である時は、Ａ２はトリフルオロメチル又はトリフルオロメトキシによりメタ位で置換されたフェニル以外であることとし、そして更に
但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルでありそしてＰが−（ＣＨ２）２−である時は、Ａ２は４−メトキシ−フェニル以外であることとし、
更に、Ａ２が水素である時は、Ｐは−（ＣＨ２）４−６−であり、そしてＡ２が水素以外である時は、Ｐは−（ＣＨ２）１−２−又は−ＣＨ２Ｘ２−であることとし、
ＷはＮ又はＣＨであり、
Ｌ２は、
式（Ｉ）のトリアジン環にその窒素原子を介して結合されたピロリジニル又はピペリジニル（ここで該ピロリジニル又はピペリジニルは−（ＣＨ２）０−２−により炭素原子上で置換されている）、
−ＮＨ−Ｃ５−７シクロアルキル−（ＣＨ２）０−２−（但しＣ５−７シクロアルキルがシクロヘキシルである時は、Ｑは−ＮＨ−の位置に対して２−又はシス−４−位のいずれかで結合されていることとする）、
−Ｘ１−Ｃ２−６アルキル−、
−Ｘ１−（ＣＨ２）１−３−Ｘ２−（ＣＨ２）１−３−、
−Ｘ２−（ＣＨ２）０−４−、
−Ｘ１−（ＣＨ２）２−３−Ｘ３−（ＣＨ２）２−３−、
−ＮＨ（ＣＨ２）１−４Ｃ（＝Ｏ）−（但し、Ｒｂ、Ｒｃ又はＲｄの少なくとも１個は水素ではなくそしてｍは０であることとする）、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−４−及び
−Ｘ１−ＣＨ（Ｒｘ）−（ＣＲｘＲｙ）１−５−、
よりなる群から選択される２価の基であり、
ここでＸ１は−ＮＨ−又は直接結合であり、Ｘ２は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｘ３はＯ、Ｓ、ＮＨ又はＣ＝Ｏであり、Ｒｘ及びＲｙは独立してＨ又はＣ１−４アルキルであり、そして但しＬ２はどんな場合にも７原子の長さを超えないこととし、
Ｑは−（Ｏ）ｍＮ（Ｒａ）−Ｇでありそしてｍは０又は１であり、
Ｇは−Ｃ（＝ＮＲｂ）ＮＲｃＲｄであり、
Ｒａ及びＲｄは独立して水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル又はＣ３−６アルキニルであり、ここで水素以外のＲａ及びＲｄの置換基は、場合により、独立してヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、フルオロ、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジＣ１−４アルキルアミノ及びＣ１−４アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲａ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成し、
Ｒｂは水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ２−６アルコキシカルボニル又はシアノであるか、あるいはＲｂ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成し、
Ｒｃは水素、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ３−１０アルキニル、Ｃ３−７シクロアルキル、アダマンチル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり、ここでＣ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル及びＣ２−１０アルキニル場合により、独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、トリフルオロメチル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、そしてここで、Ｒｃのいずれかのアリール−又はヘテロアリール−含有置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、フッ化Ｃ１−６アルキル、フッ化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルアミノ、ホルミル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルアミノスルホニル及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノスルホニル、ニトロ、メチルチオ、ヒドロキシ及びシアノよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲｃ及びＲｄが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合により環内に１〜２個のＯ又はＳヘテロ原子を包含してもよく、そして場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成し、
但し、いずれの場合にも、唯一の環は場合により、ＲａとＲｂ、ＲｂとＲｃ又はＲｃとＲｄの間に存在してもよいこととする］
の化合物及びそのエナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体、溶媒和及び製薬学的に許容できる塩に関する。
更に、ＰＫ１受容体を含有する標本を１種又は複数の候補化合物と接触させ、そしてＰＫ１受容体の活性を特異的に増加又は減少させる化合物を特定することにより、ＰＫ１受容体モジュレーターを特定する方法が提供される。このような化合物はＰＫ１受容体モジ
ュレーターとしての特徴を示す。
更に、ＰＫ１受容体を含有する標本を１種又は複数の候補化合物と接触させ、そしてＰＫ１受容体の信号形成を選択的に促進する化合物を特定することにより、ＰＫ１受容体アゴニストを特定する方法が提供される。このような化合物はＰＫ１受容体アゴニストとしての特徴を示す。
更に、ＰＫ１受容体を含有する標本をＰＫ１の存在下で１種又は複数の候補化合物と接触させ、そしてＰＫ１受容体の信号形成を選択的に抑制する化合物を特定することにより、ＰＫ１受容体アンタゴニストを特定する方法が提供される。このような化合物はＰＫ１受容体アンタゴニストとしての特徴を示す。
ＰＫ１受容体を修飾するための本発明の方法は、ＰＫ１受容体の信号を形成することができる細胞、組織又は動物にＰＫ１受容体アンタゴニストを投与する方法を伴うことができる。
更に、有効量のＰＫ１及び／又はＰＫ１アゴニストを哺乳動物に投与する方法を含んでなる、哺乳動物における運動性及び／又は分泌を刺激する方法が提供される。
［図面の簡単な説明］
図１はＰＫ１リガンド調製混合物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を示す。混合物は４種のＣ−末端残基切断生成物（ＭＷ＝９１７２）及び全長ＰＫ１リガンド（ＭＷ＝９６６８）を包含する。
図２ＡはＵｓｓｉｎｇ型イオンフラックスチェンバーに固定されたＰＫ１暴露ラット回腸組織中のＰＫ１ペプチドに対する短絡電流（Ｉｓｃ）反応において誘発された累積濃度−反応曲線を示す。
図２Ｂはラット回腸粘膜中にＰＫ１により誘発されたＩｓｃ反応（分泌の相関物）が、ペプチドがＵｓｓｉｎｇ型イオンフラックスチェンバーに固定された単離上皮組織の漿膜側に添加される時にのみ得られることを示すグラフ表示である。粘膜組織表面へのＰＫ１ペプチドの添加は、Ｉｓｃの変化を誘発しなかった。（データは平均及び標準偏差として報告される；ワンウェイＡＮＯＶＡ及びＮｅｕｍａｎｎ−Ｋｕｅｌｓ多数比較試験）。
図３はその筋肉層を除から、そしてそれに１０ｎＭ（〜ＥＣ５０）及び１００ｎＭ（〜最大効果）のＰＫ１ペプチドの最終濃度が累積的に添加された、Ｕｓｓｉｎｇ型イオンフラックスチェンバー中に固定されたラット回腸粘膜の単離切片から、電圧固定条件下で得られた代表的短絡電流トレースを示す。このプロトコールは、ＰＫ１ペプチドの分泌促進効果の研究を通して、そして小分子アンタゴニストの効果の特徴を調べるために使用された。
図４はラット回腸粘膜にＰＫ１により誘発されたＩｓｃの反応が内在の神経活性にも、又は内在の神経伝達物のアセチルコリンの放出によるコリン作動性ムスカリン様受容体の活性化にも依存性でないことを示すグラフ表示である。
図５は外部からのＰＫ１ペプチドが野生型［ＷＴ］同腹子に比較した、ＰＫ１受容体ノックアウト［ＫＯ］マウスからの上皮組織においてＩｓｃに有意な変化を誘発しなかったことを示すグラフ表示である。
図６はラット回腸粘膜におけるＰＫ１の分泌促進効果が専ら、上皮を横切るネットの基底外側から頂上方向の電気発生塩化物イオン輸送機序の刺激に依存性であることを示すグ
ラフ表示である。
図７はラット回腸粘膜におけるＰＫ１に誘発されたＩｓｃの増加が、シクロオキシゲナーゼによる内因性プロスタグランジンの生成に一部依存性であることを示すグラフ表示である。
図８はラット回腸粘膜におけるＰＫ１に誘発されたＩｓｃの増加が、上皮に局在するプロスタグランジンＥＰ４受容体に作用する内因性プロスタグランジンの生成に一部依存性であることを示すグラフ表示である。
図９Ａ及び９ＢはＰＫ１に誘発されたＩｓｃの増加は、ＰＫ１受容体における小分子アンタゴニストの、置換アミノグアニジン、ＪＮＪ ２７６２４６７５（以下参照）（図９Ａ）及びＪＮＪ ２８４８０８９４（以下参照）（図９Ｂ）の存在下で抑制されたことを示すグラフ表示である。
Figure 2008537548
図１０はＰＫ１に誘発されたＩｓｃの増加が、ＰＫ１受容体においては活性でないがＪＮＪ ２７６２４６７５及びＪＮＪ ２８４８０８９４に構造的に関連した小分子の、置換アミノグアニジンのＪＮＪ ２８６１１９２１（以下参照）の存在下で抑制されなかったことを示すグラフ表示である。
Figure 2008537548
図１１はＰＫ１に誘発されたＩｓｃの増加が、ＰＫ１受容体における小分子アンタゴニストの、アミノベンズイミダゾール、ＪＮＪ ２８８４５５５７（以下参照）により抑制されたことを示すグラフ表示である。
Figure 2008537548
図１２は経口ＰＫ１（１００μｇ／ｋｇ）がインビボのラット小腸における流体蓄積を刺激することを示すグラフ表示である。
図１３は腹腔内ＰＫ１（１００μｇ／ｋｇ）がインビボのラット小腸における流体蓄積を刺激することを示すグラフ表示である。
図１４は経口ＰＫ１（１００μｇ／ｋｇ）がインビボのラット小腸におけるカーマイン試験食の推進を高めることを示すグラフ表示である。
図１５はラットＧＩ管から得られ、そして１μＭのアセチルコリンにより誘発された収縮に対して標準化された組織切片の収縮反応を示す。
図１６は等尺性条件下で維持されたラット回腸の未処理切片に対するＰＫ１の適用が、２相の収縮反応を誘発したことを示す。
図１７Ａ及び１７Ｂは単離ラット回腸にＰＫ１誘発した収縮反応の早期相及び後期相、それぞれの濃度−反応相関の半対数プロットである。Ｎ＝２．
図１８はＰＫ１（２５０ｎＭ）の適用により誘発された後期収縮反応が、ラット回腸の
粘膜を含まない標本中には存在しないことを示すグラフ表示である。
図１９はＪＮＪ−２８８４５５５７が、ラット回腸の縦の平滑筋のＰＫ１誘発収縮の早期及び後期両者の成分に拮抗することを示すグラフ表示である。
図２０Ａ及び２０Ｂは（Ａ）ラット胃粘膜におけるＰＫ１−免疫反応の順守及び（Ｂ）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８−共役二次抗体のみを伴ない、しかし一次抗ＰＫ１抗血清（対照として）を伴なわずにインキュベートされた隣接切片における免疫蛍光の不在、を示す蛍光顕微鏡により得た像を示す。
図２１Ａ、２１Ｂ、２１ＣはＰＫ１受容体−免疫反応性がモルモット回腸の（Ａ）粘膜下組織叢及び（Ｂ）腸間筋組織叢内のニューロンに局在するが、（Ｃ）一次対照には存在しないことを示す、蛍光顕微鏡により得た像を示す。
図２２はネズミのＤＳＳ−誘発大腸炎におけるＰＫ１受容体ｍＲＮＡの発現レベルを示すスキームである。
図２３はＴ＝０、２時間、６時間、２４時間及び７２時間それぞれにおけるネズミのからし油誘発大腸炎におけるＰＫ１受容体のｍＲＮＡの発現レベルを示すスキームである。
図２４はＴ＝０、２時間、６時間、２４時間及び７２時間それぞれにおけるネズミのからし油誘発大腸炎におけるＰＫ１のｍＲＮＡの発現レベルを示すスキームである。
図２５は種々のラット組織におけるＰＫ１の発現及びＰＫ１ペプチド受容体の発現レベルを示すグラフ表示である。
図２６はＰＫ１受容体ノックアウトマウス（−／−）及びＰＫ１受容体野生型マウス（＋／＋）それぞれにおけるＰＫ１受容体のｍＲＮＡの発現レベルを示すスキームである。
図２７ＰＫ１受容体ノックアウトマウス（−／−）及びＰＫ１受容体野生型マウス（＋／＋）それぞれにおけるＰＫ１のｍＲＮＡの発現レベルを示すスキームである。
図２８は腸上皮上のイオン及び関連する水の輸送に対するＰＫ１の役割を示すスキームである。
図２９は円形及び縦の筋肉の交互の収縮が消化管に沿って、食物をいかに移動させるかを示すスキームである。
発明の詳細な説明
本明細書に引用されるすべての刊行物は引用により本明細書に取り入れられている。別記されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は本発明が関与する当業者に一般に理解されるものと同様な意味をもつ。
本明細書で使用される以下の下線用語は次の意味を有することが意図される：
化学
本明細書で使用される用語「アシル」はアルキルカルボニル置換基を表わす。
本明細書で使用される「アルキル」は別記されない限り、単独で使用されようと置換基の一部として使用されようと、１〜８個の炭素原子又はこの範囲内のいずれかの数を有す
る直線状及び分枝の炭素鎖を表わす。用語「アルコキシ」は、そのアルキルが前記の定義の通りの−Ｏアルキル置換基を表わす。同様に用語「アルケニル」及び「アルキニル」は、そこでアルケニル鎖は鎖中に少なくとも１個の二重結合をもち、そしてアルキニル鎖は鎖中に少なくとも１個の三重結合を有する、２〜８個の炭素原子又はこの範囲内のいずれかの数を有する直線状及び分枝炭素鎖を表わす。アルキル及びアルコキシ鎖は炭素原子上で置換されることができる。（Ｃ１−６アルキル）２アミノ−のような複数のアルキル基をもつ置換基において、ジアルキルアミノのＣ１−６アルキル基は同一でも異なってもよい。
用語「アリール」は６個の炭素員の不飽和の芳香族単環式環又は、１０〜１４個の炭素員の不飽和の芳香族多環式環を表わす。このようなアリール環の例はそれらに限定はされないが、フェニル、ナフタレニル又はアンスラセニルを包含する。本発明の実施に好ましいアリール基はフェニル及びナフタレニルである。
用語「アリールアルキル」はアリール基で置換されたアルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル）を意味する。同様に用語「アリールアルコキシ」はアリール基で置換されたアルコキシ基（例えば、ベンジルオキシ）を表わす。
用語「アルキル」又は「アリール」又はそれらの前置根のいずれかが置換基の名称中に現れる（例えば、アリールアルキル、アルキルアミノ）時はいつも、「アルキル」及び「アリール」に対して前記で与えられた限定を包含するものと解釈することとする。炭素原子の指定数（例えば、Ｃ１−Ｃ６）は、アルキル部分中の炭素原子の数又は、そこでアルキルがその前置根と見える、より大きい置換基のアルキル部分を独立に表わすこととする。アルキル及びアルコキシ置換基に対して、炭素原子の指定数は、個々に特記された範囲内に包含される独立したすべての員及び特記された範囲内の範囲のすべての組み合わせ物を包含する。例えば、Ｃ１−６アルキルはメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル及びヘキシルを個々に並びにそれらの副組み合わせ物（例えば、Ｃ１−２、Ｃ１−３、Ｃ１−４、Ｃ１−５、Ｃ２−６、Ｃ３−６、Ｃ４−６、Ｃ５−６、Ｃ２−５等）を包含すると考えられる。
「Ｃ ａ−ｂ 」（ここでａ及びｂは整数である）はａからｂ個の炭素原子を包んでなる基を表わす。例えば、Ｃ１−３は１、２又は３個の炭素原子を含有する基を意味する。
用語「シクロアルキル」は３〜２０個の炭素原子員（好ましくは、３〜１４個の炭素原子員）の飽和又は一部不飽和の、単環式又は多環式炭化水素環を表わす。このような環の例はそれらに限定はされないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル又はアダマンチルを包含する。用語シクロアルキルはベンゼン環に縮合されたシクロアルキル環（ベンゾ縮合シクロアルキル）、ヘテロアリール縮合シクロアルキルを形成するための５又は６員ヘテロアリール環（Ｏ、Ｓ又はＮのうちの１個及び場合により１個の更なる窒素を含有）を包含する。
用語「ハロゲン」はフッ素、塩素、臭素及びヨウ素を表わす。複数のハロゲンで置換された置換基は、安定な化合物を提供する方法で置換される。
「ハロゲン化アルキル」は親のアルキルからの１個の水素原子の除去により誘導される飽和分枝鎖又は直鎖アルキル基を表わし、親のアルキル鎖は、すべての水素原子のハロゲンによる置換までを含んでなる、１個又は複数の水素原子をハロゲンで置換された１〜８個の炭素原子を含有する。好ましいハロゲン化アルキル基はトリフルオロメチル置換アルキル及び過フッ化アルキルを包含し、より好ましいフッ化アルキルはトリフルオロメチルを包含する。
「ハロゲン化アルコキシ」は親構造物への結合のための１個の開放共有結合を有する酸素原子をもつ、酸素原子に結合されたハロゲン化アルキル基から誘導される基を表わす。
用語「ヘテロアリール」はその環が炭素原子よりなり、そして少なくとも１個のヘテロ原子員を有する５又は６員の芳香族環を表わす。適当なヘテロ原子は窒素、酸素又は硫黄を包含する。５員環の場合には、ヘテロアリール環は窒素、酸素又は硫黄の１員を含有し、そして更に３個までの更なる窒素を含有することができる。６員環の場合には、ヘテロアリール環は１〜３個の窒素原子を含有することができる。その６員環が３個の窒素を有する場合に対しては、最大２個の窒素原子が隣接する。用語ヘテロアリールは、ベンゼン環に縮合したヘテロアリール環（ベンゾ縮合ヘテロアリール）、５又は６員のヘテロアリール環（Ｏ、Ｓ又はＮの１個及び場合により１個の更なる窒素を含有）、５〜７員のシクロアルキル環あるいは５〜７員のヘテロシクリル環（上記に定義された、しかし更なる縮合環の選択肢をもたない）を包含する。ヘテロアリール基の例はそれらに限定はされないが、フリル、チエニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル又はピラジニルを包含し、縮合ヘテロアリール基はインドリル、イソインドリル、インドリニル、ベンゾフリル、ベンゾチエニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル又はキナゾリニルを包含する。
用語「ヘテロシクリル」はその１〜４員が窒素である５〜１０員の非芳香族環式環又は、その０、１又は２員が窒素でありそして２員までが酸素又は硫黄である５〜１０員の非芳香族環式環を表わし、ここで場合により該環は０、１又は２個の不飽和結合を含有してもよい。用語ヘテロシクリルは、ベンゼン環（ベンゾ縮合ヘテロシクリル）、５又は６員のヘテロアリール環（Ｏ、Ｓ又はＮの１個及び場合により１個の更なる窒素を含有）、５〜７員のシクロアルキル又はシクロアルケニル環、５〜７員のヘテロシクリル環（前記と同様な定義をもつが、更なる縮合環の選択肢をもたない）に縮合されたヘテロシクリル環、あるいはスピロ部分を形成するようにシクロアルキル、シクロアルケニル又はヘテロシクリル環の結合の炭素と縮合されたヘテロシクリル環を包含する。本発明の化合物に対して、ヘテロシクリル環を形成する炭素原子の環員は完全に飽和されている。本発明の他の化合物は一部飽和されたヘテロシクリル環をもってもよい。更に、ヘテロシクリルは２環式環を形成するように架橋したヘテロシクリル環を包含する。好ましい一部飽和ヘテロシクリル環は１〜２個の二重結合をもってもよい。このような化合物は完全に芳香族であるとは考えられず、ヘテロアリール化合物とは呼ばれない。ヘテロシクリル基の例はそれらに限定はされないが、ピロリニル（２Ｈ−ピロール、２−ピロリニル又は３−ピロリニルを包含する）、ピロリジニル、２−イミダゾリニル、イミダゾリジニル、２−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル及びピペラジニルを包含する。
置換基に関する、用語「独立して」は、１個を超えるこのような置換基が可能な時は、このような置換基は相互に同一でも異なってもよいことを意味する。従って炭素原子の指定された数（例えば、Ｃ１−８）はアルキル又はシクロアルキル部分中の炭素原子数あるいは、アルキルがその前置根として見えるような、より大きな置換基のアルキル部分を独立して表わすこととする。
用語「オキソ」は、単独で使用されようと置換基の一部として使用されようと、炭素又は硫黄原子のいずれかに対するＯ＝を表わす。例えば、フタルイミド及びサッカリンはオキソ置換基をもつ化合物の例である。
本開示を通して、指定される側鎖の末端部分が最初に記述され、次に結合点に向かって隣接官能基が記述される。従って、例えば、「フェニル（Ｃ１−６）アルキルアミノカルボニル（Ｃ１−６）アルキル」置換基は、式
Figure 2008537548
の基を表わす。
生物学
本明細書で使用される用語「組成物」は、特記される量の特記される成分を含んでなる生成物並びに特記される量の特記される成分の組み合わせ物から直接に又は間接的にもたらされるいずれかの生成物を包含することが意図される。
用語「ＰＫ１受容体アゴニスト」はＰＫ１受容体の活性を選択的に活性化又は増加する分子を表す。
用語「ＰＫ１受容体アンタゴニスト」はＰＫ１受容体の活性を選択的に阻害又は減少させる化合物を表す。
用語「ＰＫ１受容体モジュレーター」はＰＫ１受容体の活性を増加又は減少のいずれかをさせる化合物を表す。
本明細書で使用される用語「被験体」は、処置、観察又は実験の目的であった動物、好ましくは哺乳動物、もっとも好ましくはヒトを表わす。
本明細書で使用される用語「治療的有効量」は、処置されている疾患又は障害の症状の緩和を包含する、研究者、獣医、医師又は他の臨床家により追求されている組織系、動物又はヒトにおける生物学的又は医学的反応を誘発する有効化合物又は医薬の量を意味する。
本発明の態様は式（Ｉ）、
式中
ａ）Ａ１が水素、アリール、ヘテロアリール又はＣ５−８シクロアルキルであり、ここで水素以外のＡ１の置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、シアノ、ヒドロキシ、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルキルチオカルボニル、ホルミル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルアミノスルホニル及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノスルホニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい、
ｂ）Ａ１が水素、アリール、ヘテロアリール、Ｃ５−８シクロアルキル又はヘテロシクリ
ルであり、但しＡ１はピペリジン−４−イル、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−ピペリジン−４−イル又はＮ−メチル−ピペリジン−３−イル、以外であることとし、そしてここで水素以外のＡ１の置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル及びＣ１−６アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい、
ｃ）Ａ１が水素、アリール、ヘテロアリール、Ｃ５−８シクロアルキル又は、ピペリジニル以外のヘテロシクリルであり、ここで水素以外のＡ１の置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル及びＣ１−６アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい、
ｄ）Ａ１が水素、置換フェニル、ベンゾフラニル、フラニル、チアゾリル、チオフェニル又はシクロペンチルであり、ここで水素以外のＡ１の置換基は場合により置換されていてもよく、そしてフェニルは独立してＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ハロゲン化Ｃ１−４アルキル、ハロゲン化Ｃ１−４アルコキシ、メチルチオ、Ｃ１−４アルコキシカルボニル、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、アミノカルボニル及びＣ１−４アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されている、ｅ）Ａ１が置換フェニル、ベンゾフラニル、チアゾリル又はチオフェニルであり、ここでフェニルは置換されており、そしてベンゾフラニル、チアゾリル及びチオフェニルは場合により、独立してＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ハロゲン化Ｃ１−４アルキル、ハロゲン化Ｃ１−４アルコキシ、メチルチオ、アミノ、シアノ及びＣ１−４アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよい、
ｆ）Ａ１がフェニル又はベンゾフラニルであり、ここでフェニルは、独立してエチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、ニトロ、ジフルオロメトキシ及びメチルチオよりなる群から選択される１〜２個の置換基によりパラ−位又はメタ−及びパラ−位のいずれかで置換されている、
ｇ）Ｌ１が、場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル及びハロゲンよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい−（ＣＨ２）ｒ−であり、但しＡ１が水素である時は、ｒは４以上であることとする、ｈ）Ｌ１が、場合によりＣ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル及びＣ２−４アルキニルよりなる群から選択される置換基で置換されていてもよい−（ＣＨ２）ｒ−であり、但しＡ１が水素以外である時は、ｒは１〜３であり、又はＡ１が水素である時は、ｒは４以上であることとする、
ｉ）Ｌ１が、場合によりメチル及びアリルよりなる群から選択される置換基で置換されていてもよい−（ＣＨ２）ｒ−であり、但しＡ１が水素以外である時は、ｒは１〜３であることとする、
ｊ）Ｌ１が、場合によりメチル又はアリルで置換されていてもよい−ＣＨ２−である、
ｋ）Ａ２が水素、フェニル、未置換ピリジン−２−イル以外のヘテロアリール又はＣ３−８シクロアルキルであり、ここでフェニルは場合によりメタ又はパラ位で置換されていてもよく、そして水素及びフェニル以外のＡ２の置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−６アルコキシ、アリール（Ｃ１−６）アルコキシ、フェニル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ及び非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシよりな
る群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、但しＡ２上の２個を超えない置換基はアリール（Ｃ１−６）アルコキシ、フェニル又は非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシであることとし、
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）２−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２は未置換フェニル、アリール（Ｃ１−６）アルコキシ又はフェニルで置換されたフェニル、あるいはシアノによりメタ位で置換されたフェニル、以外であることとし、そして更に
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）３−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２はメトキシで置換されたフェニル以外であることとし、そして
但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルでありそしてＰが−ＣＨ２−である時は、Ａ２はトリフルオロメチル又はトリフルオロメトキシによりメタ位で置換されたフェニル以外であることとし、そして更に
但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルでありそしてＰが−（ＣＨ２）２−である時は、Ａ２は４−メトキシ−フェニル以外であることとし、
更に、Ａ２が水素である時は、Ｐは−（ＣＨ２）４−６−であり、そしてＡ２が水素以外である時は、Ｐは−（ＣＨ２）１−２−又は−ＣＨ２Ｘ２−であることとする、
ｌ）Ａ２がフェニル、未置換ピリジン−２−イル以外のヘテロアリール又は非縮合Ｃ３−８シクロアルキルであり、ここでフェニルは場合によりメタ又はパラ位で置換されていてもよく、そしてフェニル以外のＡ２の置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ及び非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、但しＡ２上の２個を超えない置換基は非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシであることとし、
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）２−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２は未置換フェニル以外であることとし、そして更に
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）３−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２はメトキシで置換されたフェニル以外であることとし、そして
但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルである時は、Ａ２はトリフルオロメチル又はトリフルオロメトキシによりメタ位で置換されたフェニル以外であることとし、そして更に
但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルでありそしてＰが−（ＣＨ２）２−である時は、Ａ２は４−メトキシ−フェニル以外であることとする、
ｍ）Ａ２がフェニル、フラニル、ピリジン−３−イル又はピリジン−４−イルであり、ここでフェニルは場合によりメタ又はパラ位で置換されていてもよくそしてフェニル以外のＡ２の置換基は、場合により、独立してＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン化Ｃ１−３アルコキシ、Ｃ１−３アルキルチオ、ヒドロキシ、アミノ、アミノカルボニル、Ｃ１−３アルキルカルボニルアミノ及び非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、但しＡ２上の２個を超えない置換基は非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシであることとし、
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）２−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２は未置換フェニル以外であることとし、そして更に
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）３−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２はメトキシで置換されたフェニル以外であることとし、そして
但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルである時は、Ａ２はトリフルオロメトキシによりメタ位で置換されたフェニル以外であることとする、
ｎ）Ａ２がフェニル、ピリジン−３−イル又はピリジン−４−イルであり、ここでフェニ
ルは場合によりメタ又はパラ位で置換されていてもよく、そしてフェニル以外のＡ２の置換基は場合により、独立してメチル、エチル、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アミノカルボニル及びメチルカルボニルアミノよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）２−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２は未置換フェニル以外であることとし、そして更に
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）３−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２はメトキシで置換されたフェニル以外であることとし、そして
但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルである時は、Ａ２はトリフルオロメトキシによりメタ位で置換されたフェニル以外であることとする、
ｏ）Ａ２がメトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、ジフルオロメトキシ、ヒドロキシ及びアミノカルボニルよりなる群から選択される置換基によりパラ位で置換されたフェニルであるか、又は、Ａ２がメトキシで置換されたピリジン−３−イル又はピリジン−４−イルである、
ｐ）Ｐが−ＣＨ２−であり、
ｒ）Ｌ２が、
−ＮＨ−Ｃ５−７シクロアルキル−（ＣＨ２）０−２−（但しＣ５−７シクロアルキルがシクロヘキシルである時は、Ｑは−ＮＨ−の位置に対して２−又はシス−４−位のいずれかで結合されていることとする）、
−Ｘ１−Ｃ２−６アルキル−、
−Ｘ２−（ＣＨ２）０−４−、
−Ｘ１−（ＣＨ２）２−３−Ｘ３−（ＣＨ２）２−３−、
−ＮＨ（ＣＨ２）１−４Ｃ（＝Ｏ）−（但し、Ｒｂ、Ｒｃ又はＲｄの少なくとも１個は水素ではなくそしてｍは０であることとする）、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−４−及び
−Ｘ１−ＣＨ（Ｒｘ）−（ＣＲｘＲｙ）１−５−、
よりなる群から選択される２価の基であり、
ここでＸ１は−ＮＨ−又は直接結合であり、Ｘ２は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｘ３はＯ、Ｓ、ＮＨ又はＣ＝Ｏであり、Ｒｘ及びＲｙは独立してＨ又はＣ１−４アルキルであり、そして但しＬ２はどんな場合にも７原子の長さを超えないこととする、
ｒ）Ｌ２が、
−ＮＨ−Ｃ５−６シクロアルキル−（ＣＨ２）０−２−（但しＣ５−６シクロアルキルがシクロヘキシルである時は、Ｑは−ＮＨ−の位置に対して２−又はシス−４−位のいずれかで結合されていることとする）、
−ＮＨ−Ｃ２−６アルキル−及び
−ＮＨ−（Ｒ，Ｒ−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３））−
よりなる群から選択される２価の基である、
ｓ）Ｌ２が、
−ＮＨ−シクロヘキシル−（ＣＨ２）０−２−（そしてＱは−ＮＨ−の位置に対して２−又はシス−４−位のいずれかに結合されている）、
−ＮＨ−Ｃ２−５アルキル−及び
−ＮＨ−（Ｒ，Ｒ−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３））−
よりなる群から選択される２価の基である、
ｔ）Ｌ２が、
−ＮＨ−シクロヘキシル−（ＣＨ２）０−２−（そしてＱは−ＮＨ−の位置に対して２−又はシス−４−位のいずれかに結合されている）、
−ＮＨＣＨ２ＣＨ２−及び
−ＮＨ−（Ｒ，Ｒ−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３））−
よりなる群から選択される２価の基である、
ｕ）ｍが０である、
ｖ）Ｒａ及びＲｄが独立して水素又はＣ１−６アルキルであり、ここでＣ１−６アルキルは場合により、独立してヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、フルオロ、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジＣ１−４アルキルアミノ及びＣ１−４アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲａ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成する、
ｗ）Ｒａ及びＲｄが独立して水素又はＣ１−３アルキルであり、ここでＣ１−３アルキルは場合により、独立してヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、フルオロ、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジＣ１−４アルキルアミノ及びＣ１−４アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲａ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成する、
ｘ）Ｒａ及びＲｄが独立して水素、メチル又はエチルであるか、あるいはＲａ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成する、
ｙ）Ｒａ及びＲｄが独立して水素、メチル又はエチルである、
ｚ）Ｒｂが水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルコキシカルボニル又はシアノであるか、あるいはＲｂ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成する、
ａａ）Ｒｂが水素又はＣ１−６アルキルであるか、あるいはＲｂ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成する、
ｂｂ）Ｒｂが水素である、
ｃｃ）Ｒｃが水素、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ３−７シクロアルキル、アダマンチル、アミノ、アリールカルボニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり、ここでＣ１−１０アルキルは場合により、独立してＣ１−４アルコキシ、トリフルオロメチル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、そしてここで、Ｒｃのいずれかのアリール−又はヘテロアリール−含有置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、フッ化Ｃ１−６アルキル、フッ化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、ニトロ、メチルチオ、ヒドロキシ及びシアノよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲｃ及びＲｄが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合により環内に１〜２個のＯ又はＳヘテロ原子を包含していてもよく、そして場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成する、
ｄｄ）Ｒｃが水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−７シクロアルキル、アダマンチル、ヘテロシクリル、アリールカルボニル、フェニル又はヘテロアリールであり、ここでＣ１−６アルキルは場合により、独立してＣ１−３アルコキシ、トリフルオロメチル、フェニル、ヘテロアリール及びヘテロシクリルよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、そしてここで、Ｒｃのいずれかのアリール、フェニル−又はヘテロアリール−含有置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、フッ化Ｃ１−６アルキル、フッ化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、ニトロ、メチルチオ、ヒドロキシ及びシアノよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲｃ及びＲｄが、それらが結合されている原子と一緒になって５〜８員の単環式環を形成し、そして該環が場合によりオキソで置換されていてもよい、
ｅｅ）Ｒｃが水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−７シクロアルキル、ヘテロシクリル、フェニルカルボニル、フェニル又はヘテロアリールであり、ここでＣ１
−６アルキルは場合により、独立してＣ１−３アルコキシ、フェニル、ピリジニル、フラニル及びテトラヒドロフラニルよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、そしてここで、Ｒｃのいずれかのフェニル−又はヘテロアリール−含有置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、クロロ、フルオロ、ブロモ、フッ化Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、メチルチオ、ヒドロキシ及びシアノよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲｃ及びＲｄが、それらが結合されている原子と一緒になって５〜８員の単環式環を形成する、
ｆｆ）Ｒｃが水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、シクロヘキシル、フェニルカルボニル、フェニル、ピリミジニル、フラニル、ベンゾ［１，３］ジオキソリル又はピリジニルであり、ここでＣ１−４アルキルは場合により、独立してＣ１−３アルコキシ、フェニル、ピリジニル、フラニル及びテトラヒドロフラニルよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、そしてここで、Ｒｃのいずれかのフェニル−又はヘテロアリール−含有置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、クロロ、フルオロ、ブロモ、フッ化Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、メチルチオ、ヒドロキシ及びシアノよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲｃ及びＲｄが、それらが結合されている原子と一緒になって５〜８員の単環式環を形成する、
ｇｇ）Ｒｃが水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、シクロヘキシル、フェニルカルボニル、フェニル、ピリミジニル、フラニル、ベンゾ［１，３］ジオキソリル又はピリジニルであり、ここでＣ１−４アルキルは場合により、独立してメトキシ、フェニル、ピリジニル、フラニル及びテトラヒドロフラニルよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、そしてここで、Ｒｃのいずれかのフェニル−又はヘテロアリール−含有置換基は場合により、独立してＣ１−３アルキル、Ｃ１−３アルコキシ、クロロ、フルオロ、ブロモ、トリフルオロメチル、ニトロ、ヒドロキシ及びシアノよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲｃ及びＲｄが、それらが結合されている原子と一緒になって５〜８員の単環式環を形成する、
但し、どんな場合にも、唯一の環は場合によりＲａとＲｂ、ＲｂとＲｃ又はＲｃとＲｄの間に存在してもよいこととする、
の化合物及び前記のａ）からｇｇ）の組み合わせ物、を包含する。
本発明の１つのアスペクトは式（Ｉａ）：
Figure 2008537548
［式中：
Ａ１は水素、アリール、ヘテロアリール、Ｃ５−８シクロアルキル又はヘテロシクリルであり、但しＡ１はピペリジン−４−イル、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−ピペリジン−４−イル又はＮ−メチル−ピペリジン−３−イル以外であることとし、そしてここで、水素以外のＡ１の置換基は、場合により、独立してＣ１−６アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル
、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル及びＣ１−６アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｌ１は、場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル及びハロゲンよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい−（ＣＨ２）ｒ−であり、ただしＡ１が水素である時は、ｒは４以上であることとし、
ｒは１〜５の整数であり、
Ａ２は水素、フェニル、未置換ピリジン−２−イル以外のヘテロアリール又はＣ３−８シクロアルキルであり、ここでフェニルは場合により、メタ及びパラ位で置換されていてもよくそして水素及びフェニル以外のＡ２置換基は独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−６アルコキシ、アリール（Ｃ１−６）アルコキシ、フェニル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ及び非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、但しＡ２上の２個を超えない置換基はアリール（Ｃ１−６）アルコキシ、フェニル又は非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシであることとし、
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）２−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２は未置換フェニル、アリール（Ｃ１−６）アルコキシ又はフェニルで置換されたフェニル、あるいはシアノによりメタ位で置換されたフェニル、以外であることとし、そして更に
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１−（ＣＨ２）３−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２はメトキシで置換されたフェニル以外であることとし、そして
但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルでありそしてＰが−ＣＨ２−である時は、Ａ２はトリフルオロメチル又はトリフルオロメトキシによりメタ位で置換されたフェニル以外であることとし、そして更に
但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルでありそしてＰが−（ＣＨ２）２−である時は、Ａ２は４−メトキシ−フェニル以外であることとし、
更に、Ａ２が水素である時は、Ｐは−（ＣＨ２）４−６−であり、そしてＡ２が水素以外である時は、Ｐは−（ＣＨ２）１−２−又は−ＣＨ２Ｘ２−であることとする、
ＷはＮ又はＣＨであり、
Ｌ２は、
−ＮＨ−Ｃ５−７シクロアルキル−（ＣＨ２）０−２−（但しＣ５−７シクロアルキルがシクロヘキシルである時は、Ｑは−ＮＨ−の位置に対して２−又はシス−４−位のいずれかで結合されていることとする）、
−Ｘ１−Ｃ２−６アルキル−、
−Ｘ２−（ＣＨ２）０−４−、
−Ｘ１−（ＣＨ２）２−３−Ｘ３−（ＣＨ２）２−３−、
−ＮＨ（ＣＨ２）１−４Ｃ（＝Ｏ）−（但し、Ｒｂ、Ｒｃ又はＲｄの少なくとも１個は水素ではなくそしてｍは０であることとする）、
−ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−４−及び
−Ｘ１−ＣＨ（Ｒｘ）−（ＣＲｘＲｙ）１−５−、
よりなる群から選択される２価の基であり、
ここでＸ１は−ＮＨ−又は直接結合であり、Ｘ２は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｘ３はＯ、Ｓ、ＮＨ又はＣ＝Ｏであり、Ｒｘ及びＲｙは独立してＨ又はＣ１−４アルキルであり、そして但しＬ２はどんな場合にも７原子の長さを超えないこととする、
ｍは０又は１であり、
Ｇは−Ｃ（＝ＮＲｂ）ＮＲｃＲｄであり、
Ｒａ及びＲｄは独立して水素又はＣ１−６アルキルであり、ここでＣ１−６アルキルは
、場合により独立してヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、フルオロ、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジＣ１−４アルキルアミノ及びＣ１−４アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲａ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成し、
Ｒｂは水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルコキシカルボニル又はシアノであるか、あるいはＲｂ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成し、
Ｒｃは水素、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ３−７シクロアルキル、アダマンチル、アミノ、アリールカルボニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり、ここでＣ１−１０アルキルは場合により、独立してＣ１−４アルコキシ、トリフルオロメチル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、そしてここで、Ｒｃのいずれかのアリール−又はヘテロアリール−含有置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、フッ化Ｃ１−６アルキル、フッ化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、ニトロ、メチルチオ、ヒドロキシ及びシアノよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲｃ及びＲｄが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合により環内に１〜２個のＯ又はＳヘテロ原子を包含してもよく、そして場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成し、
但し、いずれの場合にも、唯一の環は場合によりＲａとＲｂ、ＲｂとＲｃ又はＲｃとＲｄの間に存在してもよいこととする］
の化合物及びそのエナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体、溶媒和及び製薬学的に許容できる塩を含んでなる組成物に関する。
本発明の更なるアスペクトは式Ｉａ：
式中：
Ａ１は水素、アリール、ヘテロアリール、Ｃ５−８シクロアルキル又は、ピペリジニル以外のヘテロシクリルであり、ここで、水素以外のＡ１の置換基は、場合により、独立してＣ１−６アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノ、シアノ、ヒドロキシ、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル及びＣ１−６アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、
Ｌ１は、場合により、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル及びＣ２−４アルキニルよりなる群から選択される置換基で置換されていてもよい−（ＣＨ２）ｒ−であり、ただしＡ１が水素以外である時は、ｒは１〜３であり、あるいはＡ１が水素である時は、ｒは４又は５であることとし、
Ａ２はフェニル、フラニル、ピリジン−３−イル又はピリジン−４−イルであり、ここでフェニルは場合によりメタ及びパラ位で置換されていてもよくそしてフェニル以外のＡ２の置換基は場合により、独立してＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン化Ｃ１−３アルコキシ、Ｃ１−３アルキルチオ、ヒドロキシ、アミノ、アミノカルボニル、Ｃ１−３アルキルカルボニルアミノ及び非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、但しＡ２上の２個を超えない置換基は非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシであることとし、
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）２−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２は未置換フェニル以外であることとし、そして更に
但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）３−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２はメトキシで置換されたフェニル以外であることとし、そ
して
但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルである時は、Ａ２はトリフルオロメチルによりメタ位で置換されたフェニル以外であることとし、
Ｐは−ＣＨ２−であり、
ＷはＮ又はＣＨであり、
Ｌ２は、
−ＮＨ−Ｃ５−６シクロアルキル−（ＣＨ２）０−２−（但しＣ５−６シクロアルキルがシクロヘキシルである時は、Ｑは−ＮＨ−の位置に対して２−又はシス−４−位のいずれかで結合されていることとする）、
−ＮＨ−Ｃ２−６アルキル−及び
−ＮＨ−（Ｒ，Ｒ−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３））−
よりなる群から選択される２価の基であり、
ｍは０又は１であり、
Ｇは−Ｃ（＝ＮＲｂ）ＮＲｃＲｄであり、
Ｒａ及びＲｄは独立して水素又はＣ１−３アルキルであり、ここでＣ１−３アルキルは、場合により、独立してヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、フルオロ、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジＣ１−４アルキルアミノ及びＣ１−４アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲａ及びＲｃは、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成し、
Ｒｂは水素又はＣ１−４アルキルであるか、あるいはＲｂ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成し、
Ｒｃは水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−７シクロアルキル、アダマンチル、ヘテロシクリル、アリールカルボニル、フェニル又はヘテロアリールであり、ここでＣ１−６アルキルは場合により、独立してＣ１−３アルコキシ、トリフルオロメチル、フェニル、ヘテロアリール及びヘテロシクリルよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、そしてここで、Ｒｃのいずれかのアリール−、フェニル−又はヘテロアリール−含有置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、フッ化Ｃ１−６アルキル、フッ化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、ニトロ、メチルチオ、ヒドロキシ及びシアノよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲｃ及びＲｄが、それらが結合されている原子と一緒になって、５〜８員の単環式環を形成し、そして該環が場合によりオキソで置換されていてもよく、
但し、いずれの場合にも、唯一の環は場合によりＲａとＲｂ、ＲｂとＲｃ又はＲｃとＲｄの間に存在してもよいこととする、
の化合物及びそのエナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体、溶媒和及び製薬学的に許容できる塩に関する。
本発明の更なるアスペクトは式Ｉａ：
式中、
Ａ１は置換フェニル、ベンゾフラニル、チアゾリル又はチオフェニルであり、ここで、フェニルは置換されており、そしてベンゾフラニル、チアゾリル及びチオフェニルは、場合により、独立してＣ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ハロゲン化Ｃ１−４アルキル、ハロゲン化Ｃ１−４アルコキシ、メチルチオ、アミノ、シアノ及びＣ１−４アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、
Ｌ１は、場合によりメチル及びアリルよりなる群から選択される置換基で置換されていてもよい−（ＣＨ２）ｒ−であり、そしてｒは１〜３であり、
Ａ２はフェニル、ピリジン−３−イル又はピリジン−４−イルであり、ここでフェニル
は場合によりメタ又はパラ位で置換されていてもよく、そしてフェニル以外のＡ２の置換基は場合により、独立してメチル、エチル、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、ヒドロキシ、アミノカルボニル及びメチルカルボニルアミノよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルである時は、Ａ２はトリフルオロメトキシによりメタ位で置換されたフェニル以外であることとする、
Ｐは−ＣＨ２−であり、
ＷはＮ又はＣＨであり、
Ｌ２は、
−ＮＨ−シクロヘキシル−（ＣＨ２）０−２−（そしてＱは−ＮＨ−の位置に対して２−又はシス−４−位のいずれかで結合されている）、
−ＮＨ−Ｃ２−５アルキル−及び
−ＮＨ−（Ｒ，Ｒ−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３））−
よりなる群から選択される２価の基であり、
ｍは０であり、
Ｇは−Ｃ（＝ＮＲｂ）ＮＲｃＲｄであり、
Ｒａ及びＲｄは独立して水素、メチル又はエチルであるか、あるいはＲａ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成し、
Ｒｂは水素であり、
Ｒｃは水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−７シクロアルキル、ヘテロシクリル、フェニルカルボニル、フェニル又はヘテロアリールであり、ここでＣ１−６アルキルは場合により、独立してＣ１−３アルコキシ、フェニル、ピリジニル、フラニル及びテトラヒドロフラニルよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、そしてここで、Ｒｃのいずれかのフェニル−又はヘテロアリール−含有置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、クロロ、フルオロ、ブロモ、フッ化Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、メチルチオ、ヒドロキシ及びシアノよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲｃ及びＲｄが、それらが結合されている原子と一緒になって、５〜８員の単環式環を形成し、
但し、いずれの場合にも、唯一の環は場合によりＲａとＲｂ、ＲｂとＲｃ又はＲｃとＲｄの間に存在してもよいこととする、
の化合物及びそのエナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体、溶媒和及び製薬学的に許容できる塩に関する。
本発明のもう１つのアスペクトは式Ｉａ、
式中：
Ａ１はフェニル又はベンゾフラニルであり、ここで、フェニルは、独立してエチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、ニトロ、ジフルオロメトキシ及びメチルチオよりなる群から選択される１〜２個の置換基により４−位又は３−及び４−位のいずれかで置換されており、
Ｌ１は場合によりメチル又はアリルで置換されていてもよい−ＣＨ２−であり、
Ａ２はメトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、ジフルオロメトキシ、ヒドロキシ及びアミノカルボニルよりなる群から選択される置換基によりパラ位で置換されたフェニルであるか、あるいはＡ２はメトキシで置換されたピリジン−３−イル又はピリジン−４−イルであり、
Ｐは−ＣＨ２−であり、
ＷはＮ又はＣＨであり、
Ｌ２は、
−ＮＨ−シクロヘキシル−（ＣＨ２）０−２−（そしてＱは−ＮＨ−の位置に対して２−又はシス−４−位のいずれかで結合されており）、
−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−及び
−ＮＨ−（Ｒ，Ｒ−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ（ＣＨ３））−
よりなる群から選択される２価の基であり、
ｍは０であり、
Ｇは−Ｃ（＝ＮＲｂ）ＮＲｃＲｄであり、
Ｒａ及びＲｄは独立して水素、メチル又はエチルであり、
Ｒｂは水素であり、
Ｒｃは水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４アルケニル、シクロヘキシル、フェニルカルボニル、フェニル、ピリミジニル、フラニル、ベンゾ［１，３］ジオキソリル又はピリジニルであり、ここでＣ１−４アルキルは場合により、独立してＣ１−３アルコキシ、フェニル、ピリジニル、フラニル及びテトラヒドロフラニルよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよく、そしてここで、Ｒｃのいずれかのフェニル−又はヘテロアリール−含有置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、クロロ、フルオロ、ブロモ、フッ化Ｃ１−３アルコキシ、ニトロ、メチルチオ、ヒドロキシ及びシアノよりなる群から選択される１〜２個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲｃ及びＲｄが、それらが結合されている原子と一緒になって、５〜８員の単環式環を形成する、
の化合物及びそのエナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体、溶媒和及び製薬学的に許容できる塩に関する。
本発明のもう１つのアスペクトはそれらのＡ１、Ｌ１、Ｄ、Ｗ、Ｌ２及びＱが本発明に定義されている通りの、表１の式（Ｉ）の化合物に関する。
Figure 2008537548
Figure 2008537548
Figure 2008537548
Figure 2008537548
Figure 2008537548
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本発明の化合物はまた、製薬学的に許容できる塩の形態で存在することができる。医薬における使用のための本発明の化合物の塩は無毒の「製薬学的に許容できる塩」を表わす（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，１９８６，３３，２０１−２１７；Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９７（Ｊａｎ），６６，１，１参照）。しかし当業者に周知の他の塩は本発明に従う化合物又はそれらの製薬学的に許容できる塩の調製において有用であるかも知れない。代表的有機又は無機酸はそれらに限定はされないが、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、蓚酸、パモエ酸、２−ナフタレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、サッカリン酸又はトリフルオロ酢酸を包含する。代表的有機又は無機塩基はそれらに限定はされないが、ベンザチン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン、プロカイン、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛のような塩基性又はカチオン塩を包含する。
本発明は本発明の化合物のプロドラッグをその範囲内に包含する。概括的にこのようなプロドラッグは、要求される化合物にインビボで容易に転化可能な化合物の官能誘導体であろう。従って、本発明の処置法において、用語「投与する方法」は、特に開示された化合物又は、特に開示されてはいないかも知れないが、患者への投与後にインビボで特定の化合物に転化する化合物による、記載される種々の障害の処置を包含することとする。適切なプロドラッグ誘導体の選択及び調製の従来の方法は例えば、“Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ”，ｅｄ．Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５に記載されている。
本発明に従う化合物が少なくとも１個のキラル中心をもつ場合は、それらはそれに応じてエナンチオマーとして存在することができる。化合物が２個以上のキラル中心をもつ場合は、それらは更にジアステレオマーとして存在することができる。すべてのこのような異性体及びそれらの混合物が本発明の範囲内に包含されることが理解される。更に、化合物の幾つかの結晶形態は多形体として存在することができ、それらも本発明内に包含されることが意図される。更に幾つかの化合物は水（すなわち、水和物）又は一般の有機溶媒と溶媒和を形成することができ、そのような溶媒和は本発明の範囲内に包含されることが意図される。
本発明に従う化合物の調製の方法が立体異性体の混合物を与える場合は、これらの異性体は分取クロマトグラフィーのような従来の方法により分離することができる。化合物はラセミ形態で調製するか又は個々のエナンチオマーをエナンチオ特異的合成又は分割のいずれかにより調製することができる。化合物は例えば、（−）−ジ−ｐ−トルオイル−ｄ−酒石酸及び／又は（＋）−ジ−ｐ−トルオイル−ｌ−酒石酸のような光学活性酸との塩形成によるジアステレオマー対の形成、次に分別結晶及び遊離塩基の再生のような標準的方法によりそれらの成分のエナンチオマーに分割することができる。化合物はまた、ジアステレオマーエステル又はアミドの形成、次にクロマトグラフィー分離及びキラル補助剤の除去により分割することができる。あるいはまた、化合物はキラルＨＰＬＣカラムを使用して分割することができる。
本発明の化合物のいずれかの調製法中、関連するいずれかの分子上の感受性又は反応性基を防護することが必要そして／又は望ましいかも知れない。これはＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｅｄ．Ｊ．Ｆ．Ｗ．ＭｃＯｍｉｅ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９７３；及び Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｓｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９１に記載されたような従来の保護基により達成することができる。保護基は当該技術分野から知られた方法を使用して都合のよい次の段階で外すことができる。
本発明の化合物（それらの製薬学的に許容できる塩及び製薬学的に許容できる溶媒和を包含する）は単独で投与することができるが、それらは一般に、投与の意図された経路及び標準の製薬学的又は獣医学的慣例に関連して選択される製薬学的担体、賦形剤又は希釈剤と混合して投与されるであろう。従って、本発明は、式（Ｉ）の化合物及び１種又は複
数の製薬学的に許容できる担体、賦形剤又は希釈剤を含んでなる製薬学的及び獣医学的組成物に関する。
例えば、本発明の製薬学的及び獣医学的組成物において、本発明の化合物を、いずれかの１種又は複数の適当な結合剤、１種又は複数の滑沢剤、１種又は複数の懸濁剤、１種又は複数のコート剤及び／又は１種又は複数の可溶化剤と混合することができる。
化合物の錠剤又はカプセルは適宜、一度に１個又は２個以上を投与することができる。更に持続放出調合物中で化合物を投与することもできる。
あるいはまた、一般式（Ｉ）の化合物は吸入により、又は座薬もしくはペッサリーの形態で投与することができるか、あるいはそれらはローション、液剤、クリーム、軟膏又は散布剤の形態で局所投与することができる。経皮投与の代わりの方法は皮膚パッチの使用によるものである。例えば、それらはポリエチレングリコール又は流動パラフィインの水性エマルションよりなるクリームに取り入れることができる。それらはまた、１〜１０重量％の間の濃度で、必要とされるかも知れない安定剤及び保存剤と一緒に白色ワックス又は白色軟パラフィイン基剤よりなる軟膏中に取り入れることができる。
幾つかの適用に対する組成物は好ましくは、デンプン又はラクトースのような賦形剤を含有する錠剤の形態で、あるいは単独で又は賦形剤と混合したカプセル又は楕円錠で、あるいは香料又は着色剤を含有するエリキシル、液剤又は懸濁剤の形態で経口投与される。
組成物（並びに化合物単独）はまた非経口注射、例えば、海綿体中、静脈内、筋肉内又は皮下注射することができる。この場合は、組成物は適当な担体又は希釈剤を含んでなるであろう。
非経口投与のための組成物はもっとも適切には、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にさせるために十分な塩又は単糖類を含有してもよい滅菌水溶液の形態で使用される。
頬内又は舌下投与のための組成物は、従来の方法で調合することができる錠剤又はロゼンジの形態で投与することができる。
更なる例として、有効成分として本明細書に記載の本発明の１種又は複数の化合物を含有する製薬学的及び獣医学的組成物を、従来の製薬学的配合法に従って製薬学的担体と１種又は複数の化合物を均一に混合することにより調製することができる。担体は所望の投与経路（例えば、経口、非経口）に応じて広範な形態を採ることができる。従って懸濁剤、エリキシル及び液剤のような液体経口調製物に適する担体及び添加剤は水、グリコール、油、アルコール、香り付け剤、保存剤、安定剤、着色剤、等を包含し、散剤、カプセル及び錠剤のような固形経口調製物に適する担体及び添加剤は、デンプン、糖、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤等を包含する。固形経口調製物はまた、糖のような物資でコートするか又は吸収の主要部位を修飾するように腸溶コートすることができる。非経口投与のための担体は通常は、滅菌水よりなり、溶解度又は保存性を増加するために他の成分を添加することができる。注射用懸濁剤又は液剤はまた、適当な添加剤と一緒に水性担体を利用して調製することができる。
本発明の化合物は有利には、１日量を１回で投与することができるか又は、総１日量を１日に２、３又は４回に分割して投与することができる。更に、本発明の化合物は適当な鼻腔用ベヒクルの局所使用により鼻腔内形態で、又は当業者に周知の経皮的皮膚パッチにより投与することができる。経皮的送達系の形態で投与するためには用量投与はもちろん、投与期間中、間欠的でなく連続的であろう。
本発明の化合物又はそれらの製薬学的組成物の使用のための治療的有効量は、平均（７０ｋｇ）のヒトに対して１日約０．００１ｍｇ〜約１，０００ｍｇの用量範囲、とりわけ約０．１ｍｇ〜約５００ｍｇ又はより特には約１ｍｇ〜約２５０ｍｇの有効成分を含んでなる。
処置されている被験者に対する用量の、症状に応じた調整のためには、経口投与のための製薬学的組成物は好ましくは、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、１５０、２００、２５０及び５００ミリグラムの有効成分を含有する錠剤の形態で提供される。
更に、本発明の有効化合物又はそれらの製薬学的組成物の治療的有効量は、所望の効果に従って変わるであろうことは当業者に明白である。従って、投与される最適用量は容易に決定することができ、そして使用される特定の化合物、投与法、調製物の強度及び疾病の状態の進行とともに変わるであろう。更に、被験者の年齢、体重、食餌及び投与時間を包含する処置されている特定の被験者と関連する因子が、適当な治療レベルに対して用量を調整する必要をもたらすであろう。従って前記の用量は平均の症例の模範である。もちろん、より大量又は少量の用量範囲が有益である個々の症例が存在することができ、それらは本発明の範囲内にある。
本発明の化合物は、プロキネチシン受容体アンタゴニストとしての本発明の化合物の使用が投与を要する被験者に必要とされる時はいつでも、前記のどんな組成物及び投与計画で又は当該技術分野で確立された組成物及び投与計画により投与することができる。
本発明はまた、本発明の製薬学的及び獣医学的組成物の１種又は複数の成分を充填された１種又は複数の容器を含んでなる、製薬学的又は獣医学的パック又はキットを提供する。場合により１個又は複数のこのような容器に、その注意書きがヒトに対する投与のための製造、使用又は販売の当局による認可を反映する、医薬品又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関により規制された形態の注意書きが伴うことができる。
ＰＫ１受容体のアンタゴニストとしての式（Ｉ）の化合物は、その疾患又は状態が１種又は複数のＰＫ１受容体の拮抗作用により影響を受ける哺乳動物における疾患又は状態を処置又は予防するための方法において有用である。このような方法は、治療的有効量の式（Ｉ）の化合物、塩又は溶媒和を、このような処置又は予防の必要な哺乳動物に投与する方法を含んでなる。式（Ｉ）の化合物は胃腸（ＧＩ）疾患、ＧＩ管及び生殖器の癌並びに疼痛を予防又は処置する方法に有用である。本発明の範囲内にあるＧＩ疾患の例はそれらに限定はされないが、過敏性大腸症候群（ＩＢＳ、下痢主訴並びにＩＢＳの交互の下痢／便秘形態を包含する）、炎症性大腸疾患（ＩＢＤ、潰瘍性大腸炎及びクローン病を包含する）並びにＧＥＲＤ及び病原体により誘発される分泌性大腸障害を包含する。本発明の範囲内の癌の例はそれらに限定はされないが、睾丸癌、卵巣癌、ライディッヒ細胞癌及び小腸もしくは大腸の癌を包含する。本発明の範囲内に網羅される疼痛の例はそれらに限定はされないが、しばしばＩＢＳ及びＩＢＤを伴う内蔵痛覚過敏である。
本発明は１種又は複数の式（Ｉ）の化合物を含んでなる組成物を含んでなるが、本発明はまた、式（Ｉ）の化合物の製造に使用される中間体を含んでなる組成物も含んでなる。
本発明の化合物の代表的ＩＵＰＡＣ名称は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａにより提供されるＡＣＤ／ＬＡＢＳ ＳＯＦＴＷＡＲＥＴＭ Ｉｎｄｅｘ Ｎａｍｅ Ｐｒｏ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．５命名法ソフトウエアプログラムを使用して誘導した。
本明細書、特にスキーム及び実施例に使用される略語は以下である：
Ｃｒｄ又はＣｍｐｄ ＝化合物
ｄ ＝１日／複数日
ＤＩＡＤ ＝ジイソプロピルアゾジカルボキシレート
ＤＩＰＥＡ又はＤＩＥＡ ＝ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ ＝ダルベッコの改変イーグル培地
ＤＭＦ ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ＝ジメチルスルホキシド
ＥｔＯＡｃ ＝酢酸エチル
ＥｔＯＨ ＝エタノール
ｈ ＝１又は数時間
Ｍ ＝モル
ＭｅＣＮ ＝アセトニトリル
ＭｅＯＨ ＝メタノール
ｍｉｎ ＝分
ＮａＯＭｅ ＝ナトリウムメトキシド
ＰｙＢＯＰ ＝ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリ
ジノ−ホスホニウム・ヘキサフルオロホスフェート
ｒｔ／ＲＴ ＝室温
ＴＨＦ ＝テトラヒドロフラン
ＴＦＡ ＝トリフルオロ酢酸
一般的スキーム
本発明の代表的化合物は以下に記載の一般的合成法に従って合成することができ、以下のスキームに示される。以下のスキーム中に使用される出発物質及び試薬は市場で入手可能であるか又は当業者に知られた方法により調製されると理解される。スキームは図であるので、発明は表される化学反応及び状態により限定されるものと考えてはならない。
スキームＡはそこでＬ２が−ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−４−及び−Ｘ２−（ＣＨ２）０−４−以外でありそしてＬ２のＸ１がＮＨである本発明の化合物の一般的合成を表わす。式Ａ１の化合物は、メタノールのような極性溶媒中で、ヨウ化メチルのようなメチル化剤によりメチル化させると、式Ａ２の化合物を与えることができる。式Ａ２の化合物を、過剰な、ジイソプロピルエチルアミンのような第三級アミンの存在下でＮ−クロロカルボニルイソシアネートのような適当に置換されたイソシアネートと縮合させると式Ａ３のトリアジンを与えることができる。
Figure 2008537548
式Ａ３の化合物を当業者に知られた従来の化学反応を使用して、そのＬＧ１が離脱基である式Ａ４の化合物でアルキル化させることができる。例えば、ＬＧ１がヒドロキシ基である時は、化合物Ａ４は、ＴＨＦ又は塩化メチレンのような非アルコールの極性溶媒中でトリフェニルホスフィンの存在下でＤＩＡＤのようなカップリング剤の助けにより化合物Ａ３とカップリングさせることができる。あるいはまた、ＬＧ１は、ＬＧ１がＡ３の化合物のアミノ部分により置換されて式Ａ５の化合物を与えるように、ハロゲン化物、トシラート等であってもよい。
式Ａ５の化合物を更に、式Ａ６（ここでＸ１はＮＨでありそしてｍはゼロである）の化合物による求核性置換により作用させると式Ａ７の化合物を提供することができる。当業者はＬ２が非対称性である時は、競合反応を回避するために窒素保護基が必要であるかも知れないことを認めるであろう。式（Ｉ）のＧ−置換基は、そのＬＧ２がハロゲン化物、アルコキシド、イミダゾール又はピラゾール、活性化アルコキシド等のような離脱基である式Ａ８の活性化アミジンによる式Ａ７の化合物の末端アミンの処理により組み込まれて、そのｍがゼロである式（Ｉ）の化合物ＩＡを与えることができる。あるいはまた、ｍが１に等しい時は、式Ａ９の化合物による式Ａ７の化合物の処理によりオキシ−グアニジン置換基を取り入れて、そのｍが１である式（Ｉ）の化合物（Ｉ）Ａを形成することができる。
スキームＢはそこでＬ２が−ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−４−である本発明の化合物の一般的合成を表わす。式Ａ５の化合物は、アンモニア又は、水酸化アンモニウムのような他のアンモニアの原料との処理によりその対応するアミンに転化させて式Ｂ１の化合
物を与えることができる。化合物Ｂ１のアミノ基は、式Ｂ２の化合物（ここでＬＧ３は、Ｂ２が酸塩化物である時はハロゲン化物、Ｂ２がカルボン酸である時はヒドロキシ基であり、Ｂ２が無水物である時はアルキルカルボキシレートであり、又はＢ２がアシルミダゾールである時はイミダゾールのような離脱基である）と、従来の化学反応を使用してアシル化させることができる。あるいはまた、Ｂ２は活性化エステル等であることができる。式Ｂ２の化合物のＫ置換基は本明細書に定義された通りの離脱基ＬＧ１であるか、又はＫは適当なアミノ−保護基（ＰＧ）で保護されたＲａ−置換アミノ基である。
Figure 2008537548
式Ｂ４の化合物を調製するためには、式Ｂ３の化合物を当業者に知られた試薬及び方法を使用して、Ｎ−脱保護（Ｋが−ＮＲａ（ＰＧ）である時）するか、又はアミンＨ２ＮＲａ（ＫがＬＧ１である時）による求核置換を受けることができる。次に式Ｂ４の生成されるアミンを、式Ａ８の活性化アミジンで処理すると式（Ｉ）の化合物（Ｉ）Ｂを与えることができる。
スキームＣは、そこでＬ２のＸ１が直接結合である本発明の化合物の一般的合成を表わす。式Ｃ１の化合物を式Ｃ２のイソシアネートと縮合させると式Ｃ３の化合物を与え、それを加熱すると式Ｃ４のトリアジンを与えることができる。式Ｃ４の化合物のアミノ基を、式Ｃ５のアルキル化剤を使用して適当に置換すると式Ｃ６の化合物を与えることができる。Ｇ−置換基を、本明細書に記載の方法を使用して式Ｃ６の化合物中に導入すると式（Ｉ）の化合物（Ｉ）Ｃを提供することができる。
Figure 2008537548
スキームＤは、そこでＷがＣＨであり、Ｌ２が−ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−４−以外であり、そしてＬ２のＸ１がＮＨである、本発明の化合物の一般的合成を表わす。式Ｄ１の化合物を加熱により式Ｄ２（ここでＬＧ２は本明細書に定義の通りである）の化合物と縮合させると式Ｄ３の化合物を形成することができる。次に式Ｄ３の化合物をオキシ塩化リン、ＰＣｌ５等で処理し、加熱すると式Ｄ４の化合物を与えることができる。式Ｃ５の化合物を従来のアルキル化法により−Ｐ−Ａ２を挿入するために使用することができる。式Ｄ５の化合物をアミンＡ６（ここでＸ１はＮＨである）による塩化物の求核置換により処理すると式Ｄ６の化合物を与えることができる。本明細書に記載の化学反応を使用する更なる処理により式（Ｉ）の化合物（Ｉ）Ｄを提供することができる。
Figure 2008537548
スキームＥは、そこでＷがＣＨでありそしてＬ２が−ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−４−である、本発明の化合物の一般的合成を表わす。式Ｄ５の化合物を、アンモニア又は、水酸化アンモニウムのような他のアンモニアの原料で処理すると式Ｅ１の対応するアミノ化合物を与えることができる。アミノ基は式Ｂ２の化合物でアシル化し、本明細書に記
載の方法を使用して式（Ｉ）の化合物（Ｉ）Ｅに変えることができる。
Figure 2008537548
スキームＦは、そこでＷがＣＨであり、Ｌ２のＸ１が直接結合でありそしてＬ２がＸ１を包含するもののいずれか１つである、本発明の化合物の一般的合成を表わす。式Ｆ１の化合物を、低級アルキルアルコールの存在下で塩基性条件下で式Ｆ２の化合物と縮合すると式Ｆ３の化合物を形成することができる。式Ｆ３の化合物を式Ｆ４の尿素と縮合させると式Ｆ５の環式化合物を形成することができる。
Figure 2008537548
式Ｆ５の化合物を当業者に知られた従来の化学反応を使用してアルキル化剤Ｃ５によりアルキル化させると式Ｆ６の化合物を調製することができる。アミンＨ２ＮＲａによるＬ
Ｇ１の求核置換により式Ｆ７の化合物を与え、それを更に本明細書に記載の方法を使用してＧ−置換基を包含するように処理をすると、式（Ｉ）の化合物（Ｉ）Ｆを与えることができる。
スキームＧは、そこでＷがＮでありそしてＬ２が−Ｘ２−（ＣＨ２）０−４−である、本発明の化合物の一般的合成を表わす。式Ｇ１の化合物を塩基により処理し、次に式Ａ４の化合物によりアルキル化すると、式Ｇ２の化合物を与えることができる。水酸化物のような塩基水溶液の存在下で過酸化水素による式Ｇ２の化合物の処理は式Ｇ３のビス−アミド化合物を与え、次にそれを式Ｇ４の化合物と縮合すると式Ｇ５のトリアジン化合物を形成することができる。
Figure 2008537548
従来の試薬及び当業者に知られた方法を使用して、Ｇ５の化合物のカルボキシ基を対応するアルコールに還元し、次に式Ｇ６のアルデヒドに酸化することができる。第二級アミノ基をカップリング化学反応又は標準のアルキル化化学反応を使用して式Ｃ５の化合物と置換すると式Ｇ７の化合物を与えることができる。化合物のアルデヒド部分は式Ｇ８（ここでＰＧは以前に定義された通りである）の化合物とともにウィッティッヒオレフィン化に参加させると式Ｇ９（Ｌ２がアルケニル基、Ｘ２を包含する）の化合物を提供することができる。次のアミノ保護基の除去、次のグアニル化により式（Ｉ）Ｇの化合物を与える。
スキームＨは、そこでＷがＣＨでありそしてＬ２が−Ｘ２−（ＣＨ２）０−４−である本発明の化合物の一般的合成を表わす。式Ｈ１の化合物を、Ｏ−アルキル化イソ尿素と縮
合すると式Ｈ２の環式化合物を与えることができる。アミンを有機金属塩基で脱プロトン化し、次に式Ａ４の化合物で処理すると式（Ｉ）の−Ｌ１Ａ１置換基を挿入することができる。Ｈ２のアルキル化化合物のＯ−脱メチル化により式Ｈ３の化合物を与える。従来の酸化化学反応を使用してＨ３のメチル置換基をその対応するアルデヒドに転化させると式Ｈ４の化合物を与えることができる。式（Ｉ）Ｇの化合物への化合物Ｇ７の転化のためのスキームＧに記載の合成段階を使用して、アルデヒドを、そこでＬ２が−Ｘ２−（ＣＨ２）０−４−である式（Ｉ）の化合物に処理することができる。
Figure 2008537548
特定の実施例
本発明を代表する特別の化合物を以下の実施例及び反応系列のとおり調製し、実施例及び、反応系列を表わす図は本発明の理解を助けるために図により提供され、その後に続く請求項中に示される本発明をどんな方法でも限定すると考えてはならない。本発明の化合物はまた、本発明の更なる化合物を生成するためにその後の実施例において中間体として使用することができる。いずれの反応においても得られる収率を最適化することは試みられなかった。当業者は、反応時間、温度、溶媒及び／又は試薬の定常的変更により、このような収率をいかにして増加するかを知ると考えられる。
試薬は販売会社から購入した。水素原子の核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルはＢｒｕｋｅｒ ＡＭ−３６０（３６０ＭＨｚ）分光計上で、内部基準として（ＴＭＳ）を含む記載の溶媒中で測定した。値はＴＭＳからの百万分の一のダウンフィールド（ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ）で表わす。質量スペクトル（ＭＳ）は電子スプレー法を使用するＭｉｃｒｏｍａｓｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＬＣ分光計又はＡｇｉｌｅｎｔ ＬＣ分光計上で決定した。マイクロウエーブ加速反応はＣＥＭ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ又はＰｅｒｓｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｍｉｔｈ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒマイクロウエーブ装置のいずれかを使用して実施した。立体異性体化合物はラセミ混合物として又は別々のジアステレオマー及びそれらのエナンチオマーとして、Ｘ線結晶分析及び当業者に知られた他の方法を使用して特徴を調べることができる。別記されない限り、実施例に使用した材料は容易に入手できる営業的販売会社から得たか又は化学合成の当業者に知られた標準的方法により合成した。実施例間で異なる置換基は、別記されない限り水素である。
実施例１ Ｎ−｛２−［５−（４−エチル−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物４６）
Figure 2008537548
Ａ．１−（４−メトキシ−ベンジル）−６−メチルスルファニル−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（化合物１ｃ）
（４−メトキシ−ベンジル）−チオ尿素（２．００ｇ、１０．１ミリモル）（４０ｍＬのＭｅＯＨ中）にヨウ化メチル（０．６４ｍＬ、１０．１ミリモル）を添加した。反応物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を濃縮すると２．００ｇの粗化合物（１ｂ）を生成し、それを更に精製せずに次の段階で使用した。
Ｂ．化合物１ｂ（３．６ｇ、１７．１ミリモル）（４０ｍＬの塩化メチレン中）に過剰なジイソプロピルエチルアミン（６．６１ｇ、５１．３ミリモル）を添加した。反応混合物を０℃に冷却した。Ｎ−クロロカルボニルイソシアネートの一部（１．７８ｇ、１７．１ミリモル）を滴下した。反応混合物を室温に緩徐に暖めた。２４時間後、水を添加し、反応混合物を酢酸エチルで抽出した。相を分離し、有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮した。メタノールを粗生成物に添加し、固体を真空濾取すると化合物１ｃ（１．５ｇ）を与えた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ２．４５（３Ｈ，ｓ），３．７３（３Ｈ，ｓ），４．９８（２Ｈ，ｓ），６．８９−６．９２（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），７．２２−７．２５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），１１．５８（１Ｈ，ｓ）．
Ｃ．３−（４−エチル−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−６−メチルスルファニル−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（化合物１ｄ）
化合物１ｃ（０．１ｇ、０．３５ミリモル）（テトラヒドロフラン中）に４−エチルベンジルアルコール（０．０４９ｇ、０．３５ミリモル）、トリフェニルホスフィン（０．１９ｇ、０．７１ミリモル）及びジイソプロピルアゾジカルボキシレート（０．０８７ｇ、０．４３ミリモル）を添加した。反応物を室温で６４時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル中にとり、水で洗浄し、相を分離した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成する物質をＩＳＣＯ自動化システムを使用する順相クロマトグラフィーにより精製すると白色固体として化合物１ｄ（０．１４ｇ）を与えた。
Ｄ．６−（２−アミノ−エチルアミノ）−３−（４−エチル−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（化合物１ｅ）
１−（４−メトキシ−ベンジル）−６−メチルスルファニル−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（０．１４ｇ、０．３３ミリモル）（トルエン中）に過剰なエチレンジアミン（０．１０ｇ、１．７６ミリモル）を添加した。反応混合物を１１０℃で１８時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、水で希釈し、酢酸エチルで抽出した。相を分離し、有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成した化合物１ｅ（０．１１ｇ）を更に精製せずに次の段階に使用した。
Ｅ．Ｎ−｛２−［５−（４−エチル−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物４６）
化合物１ｅ（０．１１ｇ、０．２６ミリモル）の混合物（４ｍＬのアセトニトリル中）に過剰なジイソプロピルアミン（０．０６９ｇ、０．５３ミリモル）及び１Ｈ−ピラゾロ−１−カルボキサミジン塩酸、化合物１ｆ（０．０３９ｇ、０．２６ミリモル）を添加した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した。白色固体が反応混合物から沈殿し、濾取すると主題化合物４６（ＨＰＬＣにより９８％純度、０．０１１９ｇ）を与えた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．０１−１．０４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），２．４１−２．４７（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），３．２６−３．１６（４Ｈ，ｍ），３．６１（３Ｈ，ｓ），４．７５（２Ｈ，ｓ），４．９３（２Ｈ，ｓ），６．７７−６．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６４Ｈｚ），７．００−７．１２（６Ｈ，ｍ），７．５５（１Ｈ，ｍ），８．０６（１Ｈ，ｍ）．
実施例１の方法及び適当な試薬、出発物質及び当業者に知られた精製法を使用して、本発明の以下の化合物：化合物３９、４５、７７、７８、７９、８０、８２、８３、１０９、１１１、１１２、１２３、１２４、１３１、１３６、１３７、１４５及び１４６を調製した。
実施例２
Ｎ−｛２−［５−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物１７）
Figure 2008537548
Ａ．（（４−フルオロベンジル）アミノ）カルボニル）カルバムイミドチオン酸メチルエステル（化合物２ａ）
Ｓ−メチルイソチオウロニウム硫酸（１０．０ｇ、３５．９ミリモル）を８：２：１のＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／ＴＨＦ中に溶解し、混合物を３ＮのＮａＯＨ（１２ｍＬ、３５．９ミリモル）で処理した。次に溶液を０℃に冷却し、４−フルオロベンジルイソシアネート（５．４３ｇ、３５．９ミリモル）を３０分間にわたり滴下した。反応物を１晩撹拌し、緩徐に室温に暖めた。次に混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液で洗浄し、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減圧下濃縮した。生成した残渣をＩｓｃｏフラッシュクロマトグラフィー（ヘプタン中２０％ＥｔＯＡｃ〜１００％ＥｔＯＡｃ）上で精製すると白色粉末として化合物２ａ（４．１ｇ）を与えた。
Ｂ．５−（メチルチオ）−３，７−ジオキソ−１−（４−フルオロベンジル）−２−オキサ−４，６，８−トリアザノン−４−エン−９−オイン酸メチルエステル（化合物２ｂ）
化合物２ａ（４．１ｇ、１７．０ミリモル）の溶液（ジクロロメタン中）をトリエチルアミン（３．０８ｍＬ、２２．１ミリモル）で処理し、混合物を−１０℃に冷却した。メチルクロロホルメート（２．６２ｍＬ、３４．０ミリモル）を１５分間にわたり添加漏斗により滴下し、反応物を室温に緩徐に暖めながら、４時間撹拌した。次に溶液をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液で洗浄し、ジクロロメタンで抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成した残渣をＩｓｃｏフラッシュカラム（５％ＭｅＯＨ）上で精製すると化合物２ｂ（３．６３ｇ）を白色固体として与えた。
Ｃ．３−（４−フルオロ−ベンジル）−６−メチルスルファニル−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（化合物２ｃ）
化合物２ｂ（３．６３ｇ、１２．１ミリモル）をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、溶液をＭｅＯＨ中ＮａＯＭｅ（４．６Ｍ、２．９０ｍＬ、１３．３ミリモル）で処理し、反応物を室温で１時間撹拌した。ＮａＯＭｅを添加すると白色沈殿物が形成された。反応混
合物を１ＮのＨＣｌ（５０ｍＬ）で希釈し、生成された沈殿物を濾取した。固体をキシレン上１６０℃で減圧下乾燥するとそのＨＣｌ塩として化合物２ｃ（３．６ｇ）を与えた。
Ｄ．３−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−６−メチルスルファニル−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（化合物２ｄ）
化合物２ｃ（５００ｍｇ、１．６５ミリモル）をＴＨＦに溶解し、４−メトキシベンジルアルコール（２２７ｍｇ、１．６５ミリモル）、トリフェニルホスフィン（８６６ｍｇ、３．３０ミリモル）及びジイソプロピルアゾジカルボキシレート（３３４ｍｇ、１．６５ミリモル）で処理した。反応物を室温で１晩撹拌した。ＨＰＬＣにより反応物をモニター後、溶液を水と酢酸エチル間で分配した。合わせた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減少させた。粗製混合物をＩｓｃｏフラッシュカラム（ヘプタン中２０％酢酸エチル〜１００％酢酸エチル、４０分間）により精製すると３９０ｍｇの化合物２ｄを白色固体として与えた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，ｄ６）．δ３．２９（ｓ，３Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），４．９３（ｓ，２Ｈ），５．０３（ｓ，２Ｈ），６．８９−６．９２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６２），７．１２−７．３６（ｍ，４Ｈ），７．３８−７．４１（ｍ，２Ｈ）．
Ｅ．４−［３−（３，４−ジクロロ−ベンジル）−６−メチルスルファニル−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−［１，３，５］トリアジン−１−イルメチル］−ベンズアミド（化合物２ｄ）
化合物２ｃ（ジクロロベンジル）（２００ｍｇ、０．５６ミリモル）をＭｅＣＮに溶解し、ジイソプロピルエチルアミン（０．１９６ｍＬ、１．１３ミリモル）及び４−クロロメチルベンジルクロリド（９６ｍｇ、０．５６ミリモル）で処理した。反応混合物を８０℃に加熱し、１晩撹拌した。反応混合物をＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液で洗浄し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成した粗混合物をＩｓｃｏフラッシュカラム（ヘプタン中２０％〜１００％ＥｔＯＡｃ、４０分間）により精製すると白色粉末として７０ｍｇの化合物２ｄを与えた。
Ｆ．６−（２−アミノ−エチルアミノ）−３−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（化合物２ｅ）
化合物２ｄ（３９０ｍｇ、１．０１ミリモル）の溶液（８ｍＬのトルエン中）をエチレンジアミン（３０２ｍｇ、５．０３ミリモル）で処理した。反応物を９０℃に加熱し、１晩撹拌した。次に混合物を水と酢酸エチル間で分配した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、減少させた。減少により粗混合物として３９０ｍｇの化合物２ｅを与えた。粗化合物を更に精製をせずに更なる合成に使用した。
Ｇ．Ｎ−｛２−［５−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物１７）
化合物２ｅ（３９０ｍｇ、０．９８ミリモル）の粗混合物をアセトニトリル（１０ｍＬ）に溶解し、ピラゾール−１−カルボキサミジン塩酸（１４３ｍｇ、０．９８ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（０．３４０ｍＬ、１．９５ミリモル）で処理した。反応物を室温で１晩進行させた。反応混合物の観察により白色沈殿物が形成したことを示したので、沈殿物を回収し、真空濾過により乾燥した。回収した固体は白色粉末として３０７ｍｇの化合物１７を与えた。Ｍ＋（ＥＳ＋）＝４４２．３． １Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，ｄ６）．δ３．３３（ｍ，４Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），４．８９（ｓ，２Ｈ），５．０４（ｓ，２Ｈ），６．８９−６．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６６Ｈｚ），７．１０−７．１６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．９１Ｈｚ），７．２１−７．２４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６３Ｈｚ），７．３２−７．３６（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝２．９０，５．５７Ｈｚ），７．６６（ｓ，１Ｈ），８．１９（ｓ，１Ｈ）．
実施例２の方法及び適当な試薬、出発物質及び当業者に知られた精製法を使用して、本発明の以下の化合物：化合物１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２２４、２５、２５、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、４０、４１、５０、５１、５２、５７、６８、６９、８５、８６、８７、１２９、１３０、１４２、１４４及び１４７を調製した。
化合物５１：４−［３−（３，４−ジクロロベンジル）−６−（２−グアニジノエチルアミノ）−２，４−ジオキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−［１，３，５］トリアジン−１−イル−メチル］−ベンズアミド δ（ＤＭＳＯ，ｄ６）３．３０−３．３７（ｍ，４Ｈ），４．９０（ｓ，２Ｈ），５．１０（ｓ，１Ｈ），７．２７−７．３２（ｍ，３Ｈ），７．５１−７．６１（ｍ，２Ｈ），７．８３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ），７．９４（ｓ，１Ｈ），８．０８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝３．７Ｈｚ）．
実施例３
Ｎ−｛２−［１−ベンジル−３−（４−メトキシ−ベンジル）−２，６−ジオキソ−１，２，３，６−テトラヒドロ−ピリミジン−４−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物８１）
Figure 2008537548
Ａ．１−ベンジル−ピリミジン−２，４，６−トリオン（化合物３ａ）
Ｎ−ベンジル尿素（５００ｍｇ、３．３３ミリモル）をエタノール（８ｍＬ）に溶解し、混合物をマロン酸ジエチル（６４０ｍｇ、４．０ミリモル）及びＥｔＯＨ中ＮａＯＥｔ（１．２９ｍＬ、３．１Ｍ、４．０ミリモル）で処理した。次に反応を１４０℃で３０分間マイクロウエーブ条件下で進行させた。溶液を真空減少させ、残渣をエタノールで摩砕した。所望の化合物を真空濾取により回収すると白色粉末として化合物３ａ（５００ｍｇ）を与えた。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，ｄ６）．δ３．６９（ｓ，２Ｈ），４．８７（ｓ，２Ｈ），７．２１−７．３１（ｍ，５Ｈ）１１．４１（ｓ，１Ｈ）．
Ｂ．６−クロロ−３−ベンジルウラシル（化合物３ｂ）
化合物３ａ（５００ｍｇ、２．２９ミリモル）をオキシ塩化リン（３．５ｍＬ、２２．９ミリモル）中に溶解し、反応混合物を水（０．１０３ｍＬ、５．７ミリモル）で注意して処理した。溶液を６０℃に加熱し、１晩撹拌した。次に反応混合物を濃縮し、残渣を２ＮのＮａＯＨ（１５ｍＬ）上に注入した。粗物質を真空濾過により回収し、エタノールからの再結晶により精製すると白色粉末として化合物３ｂ（６０ｍｇ）を与えた。３００ｍｇの粗物質３ｂの第２の生成物を再結晶から回収し、更に精製せずに次の反応物中に使用した。１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，ｄ４）．δ５．０４（ｓ，２Ｈ），５．８７（ｓ，１Ｈ），７．２５−７．３８（ｍ，５Ｈ）．
Ｃ．１−（４−メトキシベンジル）−６−クロロ−３−ベンジルウラシル（化合物３ｃ）
化合物３ｂ（６０ｍｇ、０．２５ミリモル）の撹拌溶液（ＴＨＦ中）を４−メトキシベンジルアルコール（３５ｍｇ、０．２５ミリモル）、トリフェニルホスフィン（１３３ｍｇ、０．５１ミリモル）及びジイソプロピルアゾカルボキシレート（５１ｍｇ、０．２５ミリモル）で処理した。反応物を室温で１晩撹拌した。反応物を水で洗浄し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。生成された残渣をＩｓｃｏフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中２０％ＥｔＯＡｃ〜１００％ＥｔＯＡｃ、４０分間）により精製すると白色粉末として化合物３ｃ（６０ｍｇ）を与えた。Ｍ＋（ＥＳ＋）＝３５６．９
Ｄ．６−（２−アミノ−エチルアミノ）−３−ベンジル−１−（４−メトキシベンジル）−ウラシル（化合物３ｄ）
化合物３ｃ（６０ｍｇ、０．１７ミリモル）をエタノール（３ｍＬ）に溶解し、反応混合物をエチレンジアミン（５１ｍｇ、０．８４ミリモル）で処理した。溶液をマイクロウエーブ反応容器中で電力の最大条件下で１４０℃で２０分間処理した。溶液を水で洗浄し、酢酸エチルで抽出した。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮すると黄色の油として粗化合物３ｄ（３５ｍｇ）を与えた。粗混合物を更に精製せずに次の反応に使用した。
Ｅ．Ｎ−｛２−［１−ベンジル−３−（４−メトキシ−ベンジル）−２，６−ジオキソ−１，２，３，６−テトラヒドロ−ピリミジン−４−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物８１）
主題化合物を実施例２、段階Ｇに記載のように調製した。粗物質を逆相分取ＨＰＬＣにより精製するとそのＴＦＡ塩（８．２ｍｇ）として主題化合物を与えた。Ｍ＋（ＥＳ＋）＝４２２．９． １Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，ｄ４）．δ３．１９−３．２４（ｍ，４Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），４．７７（ｓ，１Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），５．０３（ｓ，２Ｈ），６．７７−６．８０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ），７．０１−７．０４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７５Ｈｚ），７．１２−７．２５（ｍ，５Ｈ）．
実施例３の方法及び適当な試薬、出発物質及び当業者に知られた精製法を使用して、本発明の以下の化合物：化合物８４を調製した。
化合物８４：Ｎ−｛２−［１，３−ビス−（４−メトキシ−ベンジル）−２，６−ジオキソ−１，２，３，６−テトラヒドロ−ピリミジン−４−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン （ＤＭＳＯ，ｄ６）δ３．２５−３．２７（ｍ，２Ｈ），３．３５−３．３７（ｍ，２Ｈ），３．７４（ｓ，３Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），４．８３（ｓ，１Ｈ），４．９０（ｓ，２Ｈ），５．１５（ｓ，２Ｈ），６．８１−６．８９（ｍ，４Ｈ），７．１４−７．２４（ｍ，４Ｈ），７．７０（ｓ，１Ｈ）．
実施例４
Ｎ−｛２−［５−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−Ｎ’−（４−フルオロ−フェニル）−グアニジン（化合物１１９）
Figure 2008537548
Ａ．１−（４−フルオロ−フェニル）−２−メチル−イソチオ尿素（化合物４ｂ）
４−（フルオロ−フェニル）−チオ尿素（１８．７ｍｇ、０．１１ミリモル）及びメタノール（０．２５ｍＬ）の溶液にヨードメタン（８μＬ、０．１３ミリモル）を添加した。混合物を２５℃で１６時間撹拌し、次に残渣になるまで濃縮すると粗化合物４ｂを与えた。
Ｃ．Ｎ−｛２−［５−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−Ｎ’−（４−フルオロ−フェニル）−グアニジン（化合物１２７）
化合物４ｂの溶液（０．５ｍＬのエタノール中）に化合物２ｅ（４０ｍｇ、０．１０ミリモル）を添加した。混合物を１６０℃で１５分間マイクロウエーブ反応容器中で照射し、次に濃縮した。生成した残渣をジメチルスルホキシド中に溶解し、逆相クロマトグラフィーにより精製すると主題化合物１１９（１８．３ｍｇ、０．０２４ミリモル）をそのＴＦＡ塩として与えた。１Ｈ ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）：δ７．４２（ｍ，２Ｈ），７．２４−７．１２（ｍ，６Ｈ），７．００（ｍ，２Ｈ），６．８９（ｍ，２Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），５．０１（ｓ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｍ，２Ｈ），３．４３（ｍ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５３６．２２２２，実測値５３６．２２２７．
実施例４の方法及び適当な試薬、出発物質及び当業者に知られた精製法を使用して、本発明の以下の化合物：化合物４４、５３、５４、５８、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、８８、８９、９０、９１、９２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、１２１、１２６、１２７、１２８、１３３、１３４、１３５、１３８、１３９及び１４０を調製した。
化合物５８：Ｎ−｛２−［５−（３，４−ジクロロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリア
ジン−２−イルアミノ］−エチル｝−Ｎ’−イソプロピル−グアニジン
１Ｈ ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）：δ７．５６（ｓ，１Ｈ），７．４５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．３５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．２２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．８９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），５．１２（ｓ，２Ｈ），５．０１（ｓ，２Ｈ），３．７７（ｓ，３Ｈ），３．６８（ｍ，１Ｈ），３．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．４１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），１．１７（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ）；ＨＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５３４．１７８７，実測値５３４．１７９２．
化合物９０：Ｎ−（４−シアノ−フェニル）−Ｎ’−｛２−［５−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン。
１Ｈ ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）：δ７．７４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．４４（ｍ，２Ｈ），７．３５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．２１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．０１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．８８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），５．１１（ｓ，２Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．５１（ｍ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５４３．２２６８，実測値５４３．２２７３．
化合物１０４：Ｎ−｛２−［５−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−Ｎ’−ピリミジン−２−イル−グアニジン。
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１０．９０（ｂｒ，１Ｈ），９．７８（ｂｒ，１Ｈ），８．６５（ｂｒ，２Ｈ），８．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），８．０７（ｍ，１Ｈ），７．８７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．３３（ｍ，２Ｈ），７．１３（ｍ，４Ｈ），７．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），６．７８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），４．９８（ｓ，２Ｈ），４．８６（ｓ，２Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），３．５４（ｍ，２Ｈ），３．３６（ｂｒ，２Ｈ）；ＨＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５１９．２２６８，実測値５１９．２２５３．
化合物１１８：Ｎ−｛２−［５−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−Ｎ’−（２−フルオロ−フェニル）−グアニジン。
１Ｈ ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）：δ７．４７−７．３７（ｍ，３Ｈ），７．３１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．２３（ｍ，２Ｈ），７．１８（ｄ，Ｈｚ），７．０１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．８９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），５．０６（ｓ，２Ｈ），５．０１（ｓ，２Ｈ），３．７６（ｓ，３Ｈ），３．５６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．４５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．３Ｈｚ）；ＨＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５３６．２２２２，実測値５３６．２２２７．
化合物１３４：Ｎ−ベンゾイル−Ｎ’−｛２−［５−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン。
１Ｈ ＮＭＲ（メタノール−ｄ４）：δ７．９３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．７０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．５７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．４１（ｍ，２Ｈ），７．１６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．９７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），５．０８（ｓ，２Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ），３．５５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ）；ＨＲＭＳ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ）＋計算値５４６．２２６５，実測値５４６．２２５９．
実施例５
Ｎ−｛２−［５−ベンジル−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−オキシグアニジン（化合物２７）
Figure 2008537548
Ａ．化合物５ａを実施例１、段階Ｃに記載の方法により、４−エチルベンジルアルコールに対してフェニルメタノールを置換することにより調製した。
Ｂ．３−ベンジル−１−（４−メトキシ−ベンジル）−６−メチルスルファニル−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン５ａ（０．０５６ｇ、０．１５ミリモル）（１ｍＬのＤＭＳＯ中）にＮ−（２−アミノ−エチル）−オキシグアニジン二塩酸塩（０．０５８ｇ、０．３０ミリモル）及びＣｓ２ＣＯ３（０．０９８ｍｇ、０．３０ミリモル）を添加した。反応混合物を７０℃に５時間加熱し、室温に冷却した。Ｎ−（２−アミノ−エチル）−オキシグアニジン二塩酸塩（０．０５８ｇ、０．３０ミリモル）及びＣｓ２ＣＯ３（０．０９８ｍｇ、０．３０ミリモル）を再度添加し、生成されるスラーリを４０℃で１６時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、１ｇのＣ−１８ ＳＰＥカートリッジ上に充填し、ＣＨ３ＣＮで溶離した。溶離液を濃縮し、生成した残渣を９０：１０（アセトニトリル：水、０．１％ＴＦＡを含む）〜９０：１０（アセトニトリル：水、０．１％ＴＦＡを含む）の勾配を使用する逆相液体クロマトグラフィーにより精製すると主題化合物２７（ＨＰＬＣにより９９％純度、０．０２８９ｇ）を与えた。δ ３．６５−３．７３（２Ｈ，ｍ），３．７８（３Ｈ，ｓ），３．９６−４．０４（２Ｈ，ｍ），５．０１（２Ｈ，ｓ），５．１０（２Ｈ，ｓ），６．８５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．２１−７．４０（７Ｈ．ｍ），７．７４（４Ｈ，ｂｓ）；７．８９（１Ｈ，ｍ）１１．５８（１Ｈ，ｂｓ）；Ｃ２１Ｈ２６Ｎ７Ｏ４に対するＨＲＭＳ計算値ｍ／ｚ ４４０．２０４６（Ｍ＋Ｈ），実測値：４４０．２０３０．
実施例５の方法及び適当な試薬、出発物質及び当業者に知られた精製法を使用して、本発明の以下の化合物：化合物１０を調製した。
実施例６
４−［４−（２−グアニジノ−エチルアミノ）−３−（４−メトキシ−ベンジル）−２，６−ジオキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−［１，３，５］トリアジン−１−イルメチル］−安息香酸（化合物１０１）
Figure 2008537548
Ａ．化合物６ａを実施例１に記載の方法に従い、そして４−エチルベンジルアルコールに対して４−ヒドロキシメチル−安息香酸メチルエステルを置換して調製した。
Ｂ．４−［４−（２−グアニジノ−エチルアミノ）−３−（４−メトキシ−ベンジル）−２，６−ジオキソ−３，６−ジヒドロ−２Ｈ−［１，３，５］トリアジン−１−イルメチル］−安息香酸（化合物１０１）
化合物６ａ（２０ｍｇ、０．０２８ミリモル）及び水酸化リチウム（６ｍｇ、０．０１４ミリモル）の混合物（５ｍＬのＭｅＯＨ中）及び１ｍＬのＨ２Ｏを室温で１晩撹拌した。その時点で、更に６ｍｇの水酸化リチウムを添加し、混合物を更に１８時間撹拌した。次に混合物を濃縮し、ＨＰＬＣにより精製した。主題化合物１０１をそのＴＦＡ塩（１０ｍｇ、０．０１４ミリモル）として得た．１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．２６（ｍ，２Ｈ），３．４０（ｍ，２Ｈ），３．６８（ｓ，３Ｈ），４．９７（ｓ，２Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），６．７９−６．８２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．０６−７．０９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．３５−７．３８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ），７．８６−７．８８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）．
実施例７
Ｎ−｛２−［５−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物１１０）
Figure 2008537548
Ａ．化合物７ａを実施例１に記載の方法に従い、４−エチルベンジルアルコールに対して（４−ｔｅｒｔ−ブトキシ−フェニル）−メタノール）を置換することにより調製した。
Ｂ．Ｎ−｛２−［５−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物１１０）
粗化合物７ａ（約０．２４ミリモルと推定される）をＣＨ３ＣＮに溶解した。この混合物に３ｍＬのＴＦＡを添加した。生成された混合物を室温で１晩撹拌した。混合物を濃縮し、ＨＰＬＣにより精製するとそのＴＦＡ塩（３１ｍｇ、０．０４６ミリモル）として主題化合物１１０を与えた。 １Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．２５−１．２８（ｍ，１Ｈ），３．２８−２．３１（ｍ，２Ｈ），３．３１−３．３６（ｍ，２Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），４．７８（ｓ，２Ｈ），４．９８（ｓ，２Ｈ），６．６５−６．６８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．８９−６．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．１１−７．１４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．５２−７．５４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝５．５Ｈｚ），７．９９（ｍ，１Ｈ）．
実施例８
Ｎ−｛２−［１−（４−メトキシ−ベンジル）−５−（４−ニトロ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物９５）
Figure 2008537548
Ａ．１−（４−メトキシ−ベンジル）−６−メチルスルファニル−３−（４−ニトロ−ベンジル）−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（化合物９ａ）
化合物１ｃ（２００ｍｇ、０．７３ミリモル）をＣＨ３ＣＮに溶解し、４−ニトロベンジルブロミド（１６８ｍｇ、０．８６ミリモル）及び８０μＬ（０．７３ミリモル）のジイソプロピルエチルアミンで処理した。生成された混合物を８７℃に加熱し、１晩撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、酢酸エチルで希釈し、重炭酸ナトリウム飽和溶液で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより精製すると化合物８ａ（４４ｇ、０．３６ミリモル）を与えた。
Ｂ．６−（２−アミノ−エチルアミノ）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−３−（４−ニトロ−ベンジル）−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（化合物９ｂ）
化合物８ａ（８０ｍｇ、０．１９ミリモル）（１０ｍＬのトルエン中）に過剰なエチレンジアミン（６４μＬ、０．９５ミリモル）を添加した。生成される混合物を９０℃で２６時間加熱した。混合物を酢酸エチル中に取り、水で洗浄した。有機層を分離し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。粗生成物８ｂ（７９ｍｇ、０．１８ミリモル、９７％収率）を更に精製せずに次の段階に使用した。
Ｃ．Ｎ−｛２−［１−（４−メトキシ−ベンジル）−５−（４−ニトロ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物９５）
化合物８ｂ（５１ｍｇ、０．１２ミリモル）、１Ｈ−ピラゾール−１−カルボキシアミジン塩酸（１８ｍｇ、０．１２ミリモル）及びジイソプロピルエチルアミン（２６μＬ、０．３６ミリモル）の混合物（１０ｍＬのアセトニトリル中）を数日間室温で撹拌させた
。生成される混合物を濃縮し、液体クロマトグラフィーにより精製した。主題化合物９５を白色粉末（１７ｍｇ、０．０３６ミリモル）として得て、ＴＦＡ塩として提出された。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．６５−３．７１（ｍ，４Ｈ），３．８５（ｓ，３Ｈ），５．３０（ｂｍ，４Ｈ），６．９９−７．０２（ｍ，２Ｈ），７．２６−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．５４−７．６０（ｍ，２Ｈ），８．０２−８．２０（ｂｓ，１Ｈ），８．２５（ｍ，２Ｈ）．
実施例８の方法及び当業者に知られた適当な試薬、出発物質及び精製法を使用して本発明の以下の化合物：４２、４３、４７、５５、５６、９４、９７、９８、９９、１００、１０２及び１１３を調製した。
実施例９
Ｎ−｛２−［５−（４−アミノ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物１２５）
Figure 2008537548
粗化合物９５（３９ｍｇ、０．０８３ミリモル）及び塩化錫（ＩＩ）二水和物（９４ｍｇ、０．４２ミリモル）の混合物（２０ｍＬのＥｔＯＨ中）を２４時間還流加熱した。溶液を濃縮し、残渣をＨＰＬＣにより精製するとそのＴＦＡ塩（６．５ｍｇ、０．０１５ミリモル）として主題化合物１２５を与えた。 １Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．３０（ｍ，４Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），４．８０（ｓ，２Ｈ），４．９８（ｓ，２Ｈ），６．５６−６．７８（ｍ，２Ｈ），６．８８−６．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．１３−７．２０（ｍ，４Ｈ），７．４３−７．４７（ｍ，１Ｈ），７．９２−７．９９（ｍ，１Ｈ）．
実施例９の方法及び当業者に知られた適当な試薬、出発物質及び精製法を使用して本発明の以下の化合物：化合物９６を調製した。
実施例１０
３−（３，４−ジクロロ−ベンジル）−６−［２−（２−イミノ−イミダゾリジン−１−イル）−エチルアミノ］−１−（４−メトキシ−ベンジル）−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（化合物６０）
Figure 2008537548
Ａ．化合物１０ａを実施例１、段階Ｃに記載の方法に従い、４−エチルベンジルアルコールに対して（３，４−ジクロロ−フェニル）−メタノールを置換することにより調製した。
Ｂ．６−［２−（２−アミノ−エチルアミノ）−エチルアミノ］−３−（３，４−ジクロロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（化合物１０ｂ）
化合物１０ａ（０．４００ｇ、０．９６８ミリモル）（６ｍＬのトルエン中）に２，２’−ジアミノジエチルアミン（０．３００ｇ、２．９ミリモル）を添加し、反応混合物を１１０℃で４時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、次に水を添加した。混合物を酢酸エチルで抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、濃縮すると化合物１０ｂ（０．４６ｇ）を与え、それを更に精製せずに次の反応に使用した。
Ｃ．３−（３，４−ジクロロ−ベンジル）−６−［２−（２−イミノ−イミダゾリジン−１−イル）−エチルアミノ］−１−（４−メトキシ−ベンジル）−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（化合物６０）
化合物１０ｂ（０．１００ｇ、０．２０３ミリモル）（２ｍＬのベンゼン中）に臭化シアン（０．０２２ｇ、０．２０３ミリモル）を添加した。反応混合物を室温で２．５時間撹拌した。反応混合物を濃縮し、次にアセトニトリルとメタノールの混合物に溶解した。混合物を逆相クロマトグラフィーにより精製すると主題化合物６０（０．０１７ｇ）を与えた。 １Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．２８−３．５９（８Ｈ，ｍ），３．６６（３Ｈ，ｓ），４．８３（２Ｈ，ｓ），４．９２（２Ｈ，ｓ），６．８１−６．８４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．０９−７．１２（２Ｈ，ｄ，８．７Ｈｚ），７．１９−７．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．４６（１Ｈ，ｓ），７．５１−７−５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），７．８６−７．９５（３Ｈ，ｍ）．
実施例１１
Ｎ−｛２−［１−（４−ヒドロキシ−ベンジル）−５−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物１４３）
Figure 2008537548
Ａ．化合物１１ａ（５０ｍｇ、０．０９ミリモル）を実施例２に記載の方法に従い、段階Ｄにおける４−メトキシベンジルアルコールに対して［４−（ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチル−シラニルオキシ）−フェニル］−メタノールを置換することにより、調製した。
Ｂ．化合物１１ａをＴＨＦ（２ｍＬ）中に懸濁させ、反応混合物をテトラブチルアンモニウムフルオリド一水和物（２４ｍｇ、０．０９ミリモル）で処理した。溶液を室温で１晩撹拌した。次に混合物を窒素下で濃縮し、残渣を逆相分取ＨＰＬＣにより精製すると白色固体として主題化合物１４３（３．８ｍｇ）を与えた。Ｍ＋（ＥＳ＋）＝４４０．１；１Ｈ ＮＭＲ（ＭｅＯＤ，ｄ４）．δ３．３２（ｍ，２Ｈ），３．５０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．０８Ｈｚ），３．７８（ｓ，３Ｈ），４．９９（ｓ，２Ｈ），５．０３（ｓ，２Ｈ），６．７７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５８Ｈｚ），６．８５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７１Ｈｚ），７．０７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６２Ｈｚ），７．３６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６７Ｈｚ）．
実施例１２
Ｎ−｛２−［１−（４−アミノ−ベンジル）−５−（４−クロロ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−グアニジン（化合物１２２）
Figure 2008537548
Ａ．化合物１２ａ（５０ｍｇ、０．０９ミリモル）を実施例２に記載の方法に従い、段階Ｄにおける４−メトキシベンジルアルコールに対して（４−ヒドロキシメチル−フェニル）カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを置換することにより、調製した。
Ｂ．化合物１２ａ（７０ｍｇ、０．１２９ミリモル）をジクロロメタン（３ｍＬ）中に懸濁させ、溶液をトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）で処理した。反応物を室温で１晩撹拌した。混合物を窒素下で濃縮し、残渣を逆相分取ＨＰＬＣにより精製すると白色固体として主題化合物１２２（３５．９ｍｇ）を与えた。Ｍ＋（ＥＳ＋）＝４４３．１；１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，ｄ６）．δ３．１８−３．２５（ｍ，２Ｈ），３．２８−３．３１（ｍ，２Ｈ），４．７６（ｓ，２Ｈ），４．８２（ｓ，２Ｈ），４．８８（ｓ，２Ｈ），６．７５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．２５Ｈｚ），７．０２（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．３８Ｈｚ），７．２２−７．３２（ｍ，４Ｈ），７．５３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝４．０２Ｈｚ），７．９５（ｍ，１Ｈ）．
実施例１３
Ｎ−｛２−［５−（３，４−ジクロロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−Ｎ’−シアノ−グアニジン（化合物２８）
Figure 2008537548
Ａ．化合物１３ａを実施例１に従って、段階Ｄにおける４−エチルベンジルアルコールに３，４−ジクロロフェニルメタノールを置換することにより調製した。
Ｂ．化合物１３ａ（０．０５０ｇ、０．１１ミリモル）の混合物（１ｍＬのイソプロピルアルコール中）にトリエチルアミン（０．０１７ｍＬ、０．１２ミリモル）及びジフェニルＮ−シアノカルボンイミデート（０．０２９ｇ、０．１２ミリモル）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次に真空濃縮した。生成された残渣をＥｔＯＨ（０．７５ｍＬ）中に懸濁し、そしてＮＨ４ＯＨ（０．２５ｍＬ、１４．８Ｎ水溶液）を添加した。反応混合物を５０℃で１６時間撹拌し、真空濃縮し、生成される残渣を９０：１０（水：アセトニトリル、０．１％のＴＦＡを含む）〜９０：１０（アセトニトリル：水、０．１％ＴＦＡを含む）の勾配を使用して逆相液体クロマトグラフィーにより精製すると主題化合物２８（ＨＰＬＣにより９９％純度、０．００１７ｇ）を与えた； Ｃ２２Ｈ２３Ｃｌ２Ｎ８Ｏ３ｍ／ｚに対するＨＲＭＳ計算値５１７．１２７０（Ｍ＋Ｈ），実測値：５１７．１２８１．
実施例１３の方法及び当業者に知られた適当な試薬、出発物質及び精製法を使用して本発明の以下の化合物：化合物１４３を調製した。
実施例１４
Figure 2008537548
Ａ．１，５−ジヒドロ−２−（メチルチオ）−４Ｈ−イミダゾル−４−オン一ヒドロヨージド（化合物１５ｂ）
化合物１４ａ（４２０ｍｇ、３．６ミリモル）の溶液（５ｍＬのＥｔＯＨ中）にヨードメタン（０．２６８ｍＬ、４．３ミリモル）を添加した。混合物を２５℃で１６時間撹拌し、次に残渣になるまで濃縮すると化合物１４ｂを与え、それを更に精製せずに次の反応に使用した。
Ｂ．３−（３，４−ジクロロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−６−［２−（５−オキソ−４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾル−２−イルアミノ）−エチルアミノ］−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン４（化合物５２）
化合物４ｂ（０．０３７３ｍｇ、０．１４ミリモル）の溶液（０．７５ｍＬのエタノール中）に、化合物１３ａ（５０ｍｇ、０．１３ミリモル）を添加した。混合物を１６０℃で１５分間照射し（μウエーブ）、濃縮し、生成された残渣を９０：１０（水：アセトニトリル、０．１％のＴＦＡを含む）〜９０：１０（アセトニトリル：水、０．１％ＴＦＡを含む）の勾配を使用して逆相液体クロマトグラフィーにより精製すると主題化合物４８（ＨＰＬＣにより８９％純度、０．００２５ｇ）を与えた；Ｃ２３Ｈ２４Ｃｌ２Ｎ７Ｏ４に対するＨＲＭＳ計算値ｍ／ｚ ５３２．１２６７（Ｍ＋Ｈ），実測値：５３２．１２５７．
実施例１５
３−（３，４−ジクロロ−ベンジル）−６−［２−（４，５−ジヒドロ−１Ｈ−イミダゾル−２−イルアミノ）−エチルアミノ］−１−（４−メトキシ−ベンジル）−１Ｈ−［１，３，５］トリアジン−２，４−ジオン（化合物４９）
Figure 2008537548
化合物１５ａ（０．０５４ｍｇ、０．２２ミリモル）の溶液（１ｍＬのエタノール中）に化合物１３ａ（５０ｍｇ、０．１１ミリモル）を添加した。混合物を１６０℃で１５分間マイクロウエーブ反応容器中で照射し、濃縮し、生成された残渣を９０：１０（水：アセトニトリル、０．１％のＴＦＡを含む）〜９０：１０（アセトニトリル：水、０．１％ＴＦＡを含む）の勾配を使用して逆相液体クロマトグラフィーにより精製すると主題化合物４９（ＨＰＬＣにより９３％純度、０．００８２ｇ）を与えた；Ｃ２３Ｈ２６Ｃｌ２Ｎ７Ｏ３に対するＨＲＭＳ計算値ｍ／ｚ ５１８．１４７４（Ｍ＋Ｈ），実測値：５１８．１４７９．
実施例１６
Ｎ−｛２−［５−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−エチル｝−Ｎ’−アミノ−グアニジン（化合物９３）
Figure 2008537548
化合物１６ａ（０．０６１ｍｇ、０．２２ミリモル）の溶液（１ｍＬのエタノール中）に化合物２ｅ（５０ｍｇ、０．１３ミリモル）を添加した。混合物を１６０℃で１５分間マイクロウエーブ反応容器中で照射し、濃縮し、生成された残渣を９０：１０（水：アセトニトリル、０．１％のＴＦＡを含む）〜９０：１０（アセトニトリル：水、０．１％ＴＦＡを含む）の勾配を使用して逆相液体クロマトグラフィーにより精製すると主題化合物９３（ＨＰＬＣにより９９％純度、０．００１８ｇ）を与えた； １Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ３．２２−３．７３（２Ｈ，ｍ），３．３８−３．５５（２Ｈ，ｍ），３．７５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．８Ｈｚ），３．７７（３Ｈ，ｓ），５．０１（２Ｈ，ｓ），５．０７（２Ｈ，ｓ），５．４４−４．８６（２Ｈ，ｂｓ），６．８３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．９０−７．０３（２Ｈ，ｍ），７．１６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．４８−７．３６（２Ｈ，ｍ）．Ｃ２１Ｈ２６ＦＮ８Ｏ３に対するＨＲＭＳ計算値ｍ／ｚ ４５７．２１１２（Ｍ＋Ｈ），実測値：４５７．２１０１．
実施例１７
Ｎ−｛２−［５−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−アセチル｝−Ｎ’−ｂｏｃ−グアニジン（化合物１３２）
Figure 2008537548
Ａ．［５−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−酢酸（化合物１７ａ）
化合物２ｄ（０．１０ｇ、０．２６ミリモル）の溶液（１ｍＬのエタノール中）にグリシン（０．０５６ｇ、０．７５ミリモル）及びＤＩＥＡ（０．１４３ｍＬ、０．８２ミリモル）を添加した。混合物を１５０℃で３０分間マイクロウエーブ反応容器中で照射し、次に室温に冷却した。グリシン（０．０５６ｇ、０．７５ミリモル）及びＤＩＥＡ（０．１４３ｍＬ、０．８２ミリモル）を再添加し、生成された混合物を１５０℃で３０分間照射（μウエーブ）し、室温に冷却し、濃縮し、そして生成される残渣を９０：１０（水：アセトニトリル、０．１％のＴＦＡを含む）〜９０：１０（アセトニトリル：水、０．１％ＴＦＡを含む）の勾配を使用して逆相液体クロマトグラフィーにより精製すると主題化合物１７ａ（ＨＰＬＣにより９９％純度、０．０５８ｇ）を与えた；Ｃ２０Ｈ２０ＦＮ４Ｏ５に対するＭＳ計算値ｍ／ｚ ４１５．１（Ｍ＋Ｈ），実測値：４１５．１．
Ｂ．Ｎ−｛２−［５−（４−フルオロ−ベンジル）−１−（４−メトキシ−ベンジル）−４，６−ジオキソ−１，４，５，６−テトラヒドロ−［１，３，５］トリアジン−２−イルアミノ］−アセチル｝−Ｎ’−ｂｏｃ−グアニジン（化合物１３２）
化合物１７ａ（０．０２５ｇ、０．０４７ミリモル）、ＤＩＥＡ（０．０３２ｍＬ、０．１８ミリモル）及びモノｂｏｃグアニジン（０．０１５ｇ、０．０９１ミリモル）の溶液（０．４０ｍＬのＤＭＦ中）にＰｙＢｏｐ（０．０４７ｇ、０．０９１ミリモル）を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、水（３ｍＬ）でクエンチし、そして生成する溶液を４×１ｍＬのＥｔＯＡｃで抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮し、生成する残渣を５０：５０（ＥｔＯＡｃ：ヘプタン、０．１％のＥｔ３Ｎを含む）〜ＥｔＯＡｃ（０．１％のＥｔ３Ｎを含む）の勾配を使用してシリカゲル上の順相フラッシュクロマトグラフィーにより精製すると主題化合物１３２（ＨＰＬＣにより８５％純度、０．０２６３ｇ）を与えた；１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．４６（９Ｈ，ｓ），３．７９（３Ｈ，ｓ），４．０５（２Ｈ，ｓ），５．０７（４Ｈ，ｓ），６．９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），６．９８（２Ｈ，ａｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），７．３０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），７．５０（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８．７ａｎｄ８．６Ｈｚ），８．６１（１Ｈ，ｂｓ）；Ｃ２６Ｈ３１ＦＮ７Ｏ６に対するＭＳ計算値ｍ／ｚ ５５６．２３２０（Ｍ＋Ｈ），実測値：５５６．２３４１．
生物学的実施例
生物学的実施例１
プロキネチシン−１の発現、単離及び精製
組み換えＮ−末端ＦＬＡＧ−標識ヒトＰＫ１（配列−ＭＲＧＡＴＲＶＳＩＭＬＬＬＶＴＶＳＤＣＤＹＫＤＤＤＤＫＡＶＩＴＧＡＣＥＲＤＶＱＣＧＡＧＴＣＣＡＩＳＬＷＬＲＧＬＲＭＣＴＰＬＧＲＥＧＥＥＣＨＰＧＳＨＫＶＰＦＦＲＫＲＫＨＨＴＣＰＣＬＰＮＬＬＣＳＲＦＰＤＧＲＹＲＣＳＭＤＬＫＮＩＮＦ）を、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞中で発現させた。
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン及びストレプトマイシン（各５０μｇ／ｍｌ）及びＧ４１８（４００ｍｇ／Ｌ）を含有するＤＭＥＭ選択的高グルコース培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で１００％集密に増殖させた。ＨＥＫ２９３細胞を培養するために使用されたＤＭＥＭ培地を２週間にわたり、新鮮培地で１日おきに補給した。ＰＫ−１ペプチド含有培地を回収し、５００ｍＬの０．２μｍの孔サイズのフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で濾過した。濾液を４℃の濾液ビン中に保存した。ＰＫ−１ペプチド含有培地を４℃のＭ２アガロースカラム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）上の培地の重力流通過により精製した。培地通過後、タンパク質がＯＤ２８０ｎｍにより検出できなくなるまで、アガロースカラムを滅菌１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。次にカラムをｐＨ２．８の０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ溶液で溶離した。溶離された物質を１ＭのＴｒｉｓｐＨ８含有管中に回収することにより即座に中和した。ＯＤ２８０によりピーク画分を特定し、貯留した。貯留画分を室温で１晩、Ｆｌａｇエピトープ４単位／ｍＬのエンテロキナーゼ分割（ｃｌｅａｖａｇｅ）にかけた。エンテロキナーゼを除去し、サンプルのアリコートを−８０℃で保存した。
前記の精製からのＰＫ１リガンドの質量分光分析の結果
サンプルをＭａｌｄｉ ＴＯＰ−ＭＳ及びＬＣ−電子スプレー質量分光分析を使用して分析した。
所望のタンパク質配列：
ＡＶＩＴＧＡＣＥＲＤＶＱＣＧＡＧＴＣＣＡＩＳＬＷＬＲＧＬＲＭＣＴＰＬＧＲＥＧＥＥＣＨＰＧＳＨＫＶＰＦＦＲＫＲＫＨＨＴＣＰＣＬＰＮＬＬＣＳＲＦＰＤＧＲＹＲＣＳＭＤＬＫＮＩＮＦ
計算平均分子量＝９６６７．４
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
サンプルの調製
タンパク質サンプル溶液（１０μＬ）を逆相ＺｉｐＴｉｐ，２００２ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの使用者指針に従って、Ｃ４ Ｚｉｐ Ｔｉｐを使用して脱塩した。
質量分光測定
Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＴＯＦ Ｓｐｅｃ Ｅ質量分光計を使用して分子量を決定した。システムの制御及びデータ獲得のためにＭａｓｓＬｙｎｘソフトウエア３．４を使用した。ＭＡＬＤＩ陽性イオン質量スペクトルを０〜８０，０００Ｄａの質量範囲内で獲得した。未処理ＭＳデータをＭａｓｓｌｙｎｘソフトウエアを使用して基底値を差し引き、滑らかにし、そして対照標準から得た質量に比較した。
溶離成分の質量をＡｇｉｌｅｎｔデコンボリューションソフトウエアを使用して計算した。
結果
質量スペクトルのデータは、質量スペクトル反応に基づいて、所望のタンパク質（分子量＝９６６７）及び、ほぼ同様なアバンダンスの、９１７２の測定分子量をもつ更なる関連成分の存在を示す。この質量は以下に示す最後の４個のＣ−末端残基を失った、可能なトランケーション生成物と測定誤差範囲内で一致する。
提唱される更なるタンパク質成分の配列
ＡＶＩＴＧＡＣＥＲＤＶＱＣＧＡＧＴＣＣＡＩＳＬＷＬＲＧＬＲＭＣＴＰＬＧＲＥＧＥＥＣＨＰＧＳＨＫＶＰＦＦＲＫＲＫＨＨＴＣＰＣＬＰＮＬＬＣＳＲＦＰＤＧＲＹＲＣＳＭＤＬＫ
計算平均分子量＝９１７８．８。
他の関連タンパク質性成分は検出されなかった。すべての測定値の質量精度は約０．１％である。
生物学的実施例２
機能のアッセイ
蛍光イメージングプレート読み取り装置（ＦＬＩＰＲ）上におけるＰＫ１アンタゴニストのスクリーニング法
アッセイを実施する２４時間前に、細胞培養培地（高グルコース及びＬ−グルタミン、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％ピルビン酸ナトリウム、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｚｅｏｃｉｎ２００ｍｇ／Ｌを含有するＤＭＥＭ）中に、１００μＬの１．３＊１０６／ｍｌのＨＥＫ ２９３ ＧＰＲ７３（ＰＫ１受容体）発現細胞を９６ウエルのポリ−ｄ−リシンコートプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に添加し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。アッセイを実施した当日に、培地を除去し、２００μｍＬのアッセイバッファー［ＨＢＳＳ ｗ／Ｃａ２＋及びＭｇ２＋ ｗ／ｏフェノールレッド、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１％ＢＳＡ、１０ｍＬのｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ（５ｍＬの１ＮのＮａＯＨ中７１０ｍｇのｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、次にそれに２０ｍＭのＨＥＰＥＳ含有の５ｍＬのＨＢＳＳを添加した）］で前以て再懸濁された、２００μＬの５×Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｌｕｓ Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を９６−ウエルのプレートの各ウエルに添加した。プレートを３７℃、５％のＣＯ２で暗所で３０分間インキュベートした。プレートを外し、暗所で１５分間ＲＴに到達させた。次にアッセイをＦＬＩＰＲ上で実施した。要約すると：１分間基底値を読み取り、化合物（２５μＬ）を添加し、４分、１５秒インキュベートし、前以て決定されたＥＣ５０の最終濃度のためにＰＫ１リガンド調製物（２５μＬ）を添加し、１分、４５秒間蛍光を計測した。基底値はバッファー単独が細胞に添加される時の相対的蛍光読み取り値の量と説明される。基底値をすべてのウエルから差し引いた。対照のパーセントを以下のように計算した：
（基底値を差し引いたウエルの値、割る基底値引く最大値）＊１００。阻害率は１００マイナス対照値のパーセントである。
ＩＣ５０は我々のアッセイ中で使用されるＰＫ１調製物の濃度により生成される最大信号の５０％を抑制するために必要な特定の化合物の量と定義される。ＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して計算された。
表２は実施例２に記載のＰＫ１機能アッセイからもたらされたデータを包含する。
Figure 2008537548
Figure 2008537548
Figure 2008537548
生物学的実施例３Ａ〜３Ｅ
哺乳動物における分泌及び腸粘膜のイオン輸送に対するＰＫ１の効果
生物学的実施例３Ａ
哺乳動物における分泌及び腸粘膜のイオン輸送に対するＰＫ１の効果
方法：
回腸盲腸接合部に近位２ｃｍの点で出発し、近位１０ｃｍまで延伸する回腸の全厚さにわたる切片を新鮮に切除し、クレブス−リンゲル重炭酸塩（ＫＲＢ）溶液中に入れ、そしてプラスチック棒を無処理の切片中に穏やかに挿入しながらその内容物を空にした。回腸切片を、全腸間膜の縁に沿ってメスの歯の背側で刻み目を付け（ｓｃｏｒｅｄ）、腸間筋叢を包含する無処理筋肉層を頭部の平らなメスで注意して切除した。長さが約１．５ｃｍの３枚の長方形の組織シートを、残りの、筋肉を剥ぎ取った粘膜−粘膜下組織から作製し、Ｐｅｙｅｒのパッチを避けるように注意して切断した。無処理粘膜下神経節を含有する各組織シートを、改変Ｕｓｓｉｎｇ−型フラックスチェンバー（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の組織浴レザボアの間に挿入されたアクリルの固定カセットの半分の間の、長方形の入り口（ｐｏｒｔａｌ）（露出粘膜の総断面積＝０．５０ｃｍ２）上にピンで張り付けた。Ｕｓｓｉｎｇチェンバーを使用する経上皮測定に関する考察に対しては、Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｈｕｇ，Ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｕｓｓｉｎｇ Ｃｈａｍｂｅｒ，Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ ＣＦＴＲ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（２００２）を参照されたい。
各組織の先端（すなわち粘膜）及び基底外側（すなわち漿膜）面を３６℃に維持された６ｍＬの酸素通気ＫＲＢ溶液に浸けた。組織を一旦固定後、電界刺激及び分泌促進薬又は薬剤の添加の前に０．５〜１時間、平衡化させた。ＫＲＢ溶液は１２０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＫＣｌ、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２、１．２ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１４．４ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．５ｍＭのＣａＣｌ２及び１１．５ｍＭのグルコース又は１１．５ｍＭのマニトールを含有した。ＫＲＢ溶液は９５％のＯ２：５％のＣＯ２を連続して通気され、ｐＨ７．３に維持された。各チェンバーは組織上の経粘膜電位差（ＰＤ）測定用の一対の飽和ＫＣｌ−寒天プリッジ並びに、ＰＤ−感知ブリッジ間の溶液抵抗及び０ｍＶに固定された組織上の経粘膜電位差（ＰＤ）から検出される偏りを補正する自動化電圧−固定装置（モデルＶＣＣ ＭＣ６又はモデルＶＣＣ ＭＣ８、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｓｔｕｍｅｔｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に接続された一対のＡｇ−ＡｇＣｌ寒天電極を備えていた。組織伝導性（Ｇ）をパルス発生機からの二極性パルスを使用して、１ｍＶだけＰＤを変えるために要する電流を決定することにより計算した（ｍＳで）。正味の活性（ａｃｔｉｖｅ）イオン輸送の指標である短絡電流（Ｉｓｃ、ｍＡ）を連続的に測定した。イオンの受動流動に対するバリヤ機能の指標である組織伝導性（Ｇｔ、ｍＳ）を各組織に対するＩｓｃ及び経上皮電位差の変化から計算した。
各組織の短絡電流（Ｉｓｃ）及びＧの基底記録値が獲得され、実験プロトコール開始前に更に１５分間記録された。Ｉｓｃの刺激変化をコンピュータ化データ獲得システム（ＰｏｗｅｒＬａｂ ８ＳＰ，ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＣＯ）により連続的に測定、記録した。Ｉｓｃの神経誘発変化は、各組織の相対する電極の粘膜表面と直接接触して配置されたアルミニウムフォイルの電極を介して接続された電気刺激装置（Ｓ−４８，Ｇｒａｓｓ−Ｔｅｌｅｆａｃｔｏｒ，Ａｓｔｒｏ−Ｍｅｄ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ Ｗａｒｗｉｃｋ，ＲＩ）の出力からの電界刺激（８０Ｖ、０．５ｍｓ，１０Ｈｚ，５ｓ）の適用により得た。薬理学的物質及び分泌促進薬を基底外側−側部のレザボアに定常的に添加した。Ｉｓｃに対するアゴニスト又は分泌促進薬の効果は基底外側の添加後、連続的に記録された。濃度−反応曲線を、先行する低濃度に対するピークのＩｓｃ反応において又はその近位で添加されたアゴニスト又は分泌促進薬
の前以て決められた増加量の累積的、段階的添加から構成した。分泌のアンタゴニスト又はインヒビターの効果は、その後に特定のアゴニスト又は分泌促進薬による刺激が実施される１０〜２０分間の露出期間後に評価された。
統計的分析
すべての値を平均＋／−ＳＥとして報告される。Ｕｓｓｉｎｇ−フラックス型のチェンバーで得られた電気生理学的データは組織表面積に標準化し、ｃｍ２に対して表わされる。イオン輸送の刺激変化は、刺激前の基底値と、与えられる刺激又は分泌促進薬により誘発される最大反応間の絶対差（ΔＩｓｃ）として決定された。上皮の分泌に対するＰＫ１の刺激作用の算定ＥＣ５０はＰＲＩＳＭ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，）中のコンピュータ計算された曲線−適合関数（ｆｉｔｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を使用して、７ポイント累積濃度−反応試験から決定された。いずれかの２群間、例えば、対照と実験組織間の統計的有意性を決定するために、非対、両側スチューデントｔ−検定を使用した。複数の処理群間の有意差を決定するために、この後のＮｅｕｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ複数比較試験と一緒にＡＮＯＶＡを使用した。Ｐ＜０．０５が統計的に有意であると考えられた。
結果の要約
Ｉｓｃの変化は最初の基底（未刺激）Ｉｓｃ値に比較される、一定の濃度のＰＫ１に対するピークのＩｓｃ反応、との間の差として報告され、Ｕｓｓｉｎｇ型チェンバー中に固定された組織の表面積（ｃｍ２）に対して補正されたミクロＡｍｐ（μＡ）で測定されるΔＩｓｃとして表される。反応曲線に対するＥＣ５０値は生物学的実施例３Ａに記載の通りに計算された。基底Ｉｓｃは３５．２＋／−２．４μＡ／ｃｍ２であり、組織伝導性（Ｇ）は３３．７＋／−０．９ｍＳ／ｃｍ２（３４匹のラットからｎ＝７９組織）であった。基底外側組織表面を浸けたクレブス溶液にＰＫ１の１回量添加後、Ｉｓｃは２〜４分以内にピーク値まで徐々に増加し、次に１０〜１５分以内に基底値に低下した。ＩｓｃにおけるＰＫ１誘発の増加は、累積的濃度−反応研究から決定される約８．２ｎＭのＥＣ５０を伴なって濃度依存性であった。ＰＫ１誘発反応の最大反応は１００ｎＭで起り、１００ｎＭのＰＫ１は基底値から２８．７＋／−２．９μＡ／ｃｍ２のＩｓｃの増加を誘発し（２９匹のラットからｎ＝４２の組織）、１０ｎＭのＰＫ１は１３．５＋／−２．μＡ／ｃｍ２の増加を誘発した（２２匹のラットからのｎ＝３３組織）。１０ｎＭ及び１００ｎＭの濃度はすべての次の研究に使用された。ＰＫ１はいずれの研究においてもＧに対して有意な効果をもたなかった。図４は、ＰＫ１の分泌促進効果が、神経伝導トキシンのテトロドトキシン（ＴＴＸ）、又は抗コリン作動剤のアトロピンによる粘膜のエンテロサイト（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）上に存在するムスカリン様受容体のブロックの存在下でブロックされなかったことを示す。これは、その作用が組織における内因性の神経作用に因らないことを示す。
ＰＫ１受容体ノックアウトマウスからの回腸粘膜組織に添加された外部からのＰＫ１ペプチドは、野生型同腹子に比較してＩｓｃに有意な変化を誘発しなかったので、ＩｓｃのＰＫ１誘発増加は内在のＰＫ１受容体の存在を必要とする（図５参照）。
生物学的実施例３Ｂ
ラット回腸における腸分泌のＰＫ１誘発増加の作用機序
方法
これらの研究に使用されるＵｓｓｉｎｇ型イオンフラックスチェンバーに対する基本的方法は、実験プロトコールに次の改変を伴って上記に詳述されたものと同様であった。上皮に対するＰＫ１の分泌促進作用の機序を決定するために、３種の別のアプローチを使用して、上皮上の電気発生塩化物イオン又は重炭酸イオン輸送を停止した。第１のアプローチは、腸内の流体及び電解質分泌を促進補助する基底外側から先端方向へのＣｌ−イオン
の正味の電気発生束を破壊するために基底外側のＮａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−共輸送体のインヒビターのブメタニド（５００μＭ）の添加を伴なった。第２のアプローチは、Ｕｓｓｉｎｇチェンバー内の生存組織を維持するために使用される生理学的バッファー溶液中のすべての塩化物イオンの置き換えを伴ない、これにより前記の標準ＫＲＢレシピー中に挙げた塩化物塩に対して等モルのイセチオネート及びアセテート塩の置換により、塩化物を含まないＫＲＢ溶液を置換する。第３のアプローチは、生理学的バッファー溶液中のすべての重炭酸塩イオンの置き換えを伴ない、これにより重炭酸塩に対するピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）の等モル置換及び、細胞内炭酸無水物のブロッカーの、１ｍＭのアセタゾールアミドの添加により重炭酸を含まないＫＲＢ溶液を置換して、腸細胞による重炭酸塩生成を防止する。
結果の要約
ＩｓｃのＰＫ１誘発増加に対するイオンの基底値は、基底外側Ｎａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−共輸送体をブロックするために、ブメタニド及びＣｌ−非含有クレブス溶液を使用する実験において決定された（図６参照）。ブメタニド（５００μＭ）の濃度は、他の同様なイオン輸送研究におけるその報告された有効な使用に基づいて選択された。漿膜浴溶液にブメタニドの添加後、基底Ｉｓｃは減少するように見えた（−７．１＋／−８．６μＡ／ｃｍ２、ｎ＝５）しかし、これはＤＭＳＯベヒクル単独を受ける組織に比較して有意差ではなかった（６．６＋／−４．０μＡｃｍ２、ｎ＝４）。更に、ブメタニドは基底値Ｇを有意に変化させなかった、しかしブメタニドはＩｓｃのＰＫ１誘発増加を＞９０％だけ有意に弱めた。Ｃｌ−非含有クレブス溶液中ではＰＫ１の漿膜添加に対する反応はまた＞９０％だけ減少した、しかし、アセタゾールアミドを含有する重炭酸塩非含有ＫＲＢは、ＰＫ１に対するＩｓｃの反応に効果をもたず、これは、それが重炭酸塩輸送に影響しないことを示唆する。
生物学的実施例３Ｃ
ラット回腸におけるＰＫ１刺激腸分泌は上皮ＥＰ４受容体に作用する内在プロスタノイドの合成に一部依存する。
方法
これらの研究に使用されるＵｓｓｉｎｇ型イオンフラックスチェンバーの基礎的方法は、実験的プロトコールに以下の改変を伴なって上記に詳述のものと同様であった。腸内に含有される多数の異なるペプチド及び神経ペプチドが、一部は、内在プロスタグランジン生成の刺激によりそれらの分泌促進効果を働かせることが示された。ラット回腸におけるＰＫ１刺激Ｉｓｃ反応における内在プロスタグランジン合成の可能な役割を解明するために、漿膜に添加された非選択的シクロ−オキシゲナーゼ（ＣＯＸ）インヒビターのピロキシカム（１０μＭ）、選択的ＣＯＸ−１アイソホルムインヒビターのＦＲ１２２０４７（１０ｍＭ）及び選択的ＣＯＸ−２アイソホルムインヒビターのメロキシカム（１０μＭ）でラット回腸粘膜を前以て処理する実験を実施した（図７参照）。内在的に生成されるプロスタグランジンが特異的受容体のサプタイプに作用したかどうかを決定する追跡実験において、ＰＫ１駆動プロスタグランジン刺激Ｉｓｃ反応に関与する想像上のシグナリング機序を決定するために、プロスタグランジン受容体の選択的アンタゴニストのＥＰ４（３０μＭのＡＨ２３８４８）及びスロンボキサン受容体、ＴＰ（１μＭのＧＲ３２１９１Ｂ）の漿膜添加により、組織を前以て処理した。
結果の要約
結果は、ラット回腸におけるＰＫ１仲介分泌は、ＣＯＸによる内在プロスタグランジン合成に一部依存性であることを示唆する。選択的ＣＯＸアイソホルムインヒビターが使用された実験に基づくと、結果は、誘発可能なＣＯＸ−２アイソホルムはプロスタグランジンのＰＫ１刺激生産に関与しないことを示す。追跡実験からの結果は、ＰＫ１暴露により刺激された内在プロスタグランジンは、ラットの腸上皮に優先的局在を有することが示さ
れたプロスタグランジンＥＰ４受容体サプタイプの活性化によりシグナリングすることを示唆する。
生物学的実施例３Ｄ
小分子のＰＫ１受容体アンタゴニストは、ラット回腸におけるＰＫ１及びコレラ毒素刺激の腸分泌双方を抑制する方法において有効である。
方法
これらの研究に使用されるＵｓｓｉｎｇ型イオンフラックスチェンバーに対する基礎的方法は実験プロトコールに対して以下の改変を伴って、前記に詳述されたものと同様であった。３０〜４５分間の平衡化期間後、基底−安定な組織に、電気的正方形パルス刺激装置からの極性化された散発的出力に対する組織の、相対する極上のフォイル電極に接続する接触子から適用される一連の電界刺激（ＥＦＳ；８０Ｖ、０．５ｍｓ、１０Ｈｚ、５ｓ）をかけた。各ラットからのそしてラット間の個々の組織の生存性及び反応の比較可能性を評価するために２種の連続的ＥＦＳに対する反応を使用した。組織の伝導性は、オームの法則を使用して、パルス発生装置からの１ｍＶアンプリチュードの二極パルスの適用により誘発される短絡回路電流反応のアンプリチュードの変化として、周期的間隔をおいて測定した。各ラットから３〜４個の組織を研究した。ある動物からの組織はグループにまとめ、それに従って指定され、ベヒクルのみを投与され、次に組織の基底外側面に累積的に添加されたＰＫ−１リガンドの２回の連続投与を受けた１つの対照組織、同一動物からの残りの２〜３個の組織はあるＰＫ−１受容体アンタゴニストを受けるように指定される（例えば、１ラットからの３〜４組織、対照、アンタゴニスト１、アンタゴニスト２、アンタゴニスト３）。試験化合物を、１μＭの最終濃度で基底外側組織側のレザボアに添加し、ＰＫ１ペプチドによる暴露の前に１５分のインキュベート期間を与えた。この１５分の暴露期間の終わりに、１０ｎＭ及び１００ｎＭのＰＫ１リガンドを各組織に累積的な方法で添加して試験化合物の抑制効果の特徴を調べた。実験の最後に、組織の生存性及び反応の安定性を評価するためにＥＦＳを再適用した。結果は図９〜１１に示される。
結果の要約
ＰＫ１アンタゴニストのみによる組織の前処理は、基底Ｉｓｃ及び組織伝導性（Ｇ）に測定可能な効果をもたなかった。図９〜１１に示した結果は、単離ラット回腸粘膜におけるＩｓｃのＰＫ１誘発の増加の抑制は、ＰＫ１受容体における想像上のアンタゴニストとして細胞アッセイで特定された小分子構造物（すなわち、アミノグアニジン及びアミノベンズイミダゾール（それぞれ図９Ａ及び９Ｂ及び図１１）の２種の異なる群の存在下で有効に達成されたことを示す。２群それぞれからの化合物の試験において、ＰＫ１の２種の上昇する累積濃度により誘発されるＩｓｃ反応の観察された抑制は、有意な克服することができる（ｓｕｒｍｏｕｎｔａｂｌｅ）拮抗作用の特徴を示した。アミノグアニジン、ＪＮＪ ２８６１１９２１はＰＫ１に対するＩｓｃ反応を抑制しなかったが、この化合物はＰＫ１受容体における有意な活性を欠くことが示されている。これらのデータは、腸上皮上のＰＫ１の分泌促進効果を修飾するための、小分子のインヒビターによるＰＫ１受容体の選択的機能阻害において、良好な効果を達成することができることを示唆している。
生物学的実施例３Ｅ
ＰＫ１はラット小腸においてインビボで流体の腸内貯留及び蓄積を刺激する。
方法
実験は、ラット小腸内のＰＫ１ペプチドのインビボの分泌促進効果を重力的に測定するために実施された。未処理ラットの腸内の流体の腸内貯留及び蓄積の刺激に対するＰＫ１ペプチドの効果を２種の異なる投与経路を使用して評価した。非飢餓ラットを２種の別の実験における２種の実験群（ｎ＝１０匹／１群）にランダムに指定した。第１の実験において、各ラットに１００μｇ／ｋｇのＰＫ１ペプチドの用量を含有する０．５％メチルセルロース重量／容量中６％カーマイン染料の経口ボーラス（１．５ｍｌ）又はバッファー
ベヒクルを与えた（図１２参照）。第２の実験において、ラットにＰＫ１ペプチド（１００μｇ／ｋｇ）又はバッファーベヒクルのいずれかを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、直後に０．５％メチルセルロース試験食餌（１．５ｍｌ）中の６％カーマイン染料を胃内投与した（図１３参照）。３０分後、ラットを１００％二酸化炭素による吸入麻酔後に頸部脱臼により急速に安楽死させ、全小腸を幽門から回腸盲腸接合部までを切除した。全小腸の長さを測定し、次に４−０絹の縫合ループを使用して１／３に等分して、内腔内容物の漏洩を防止するために各切片を結紮し、絶縁し、分離した。各切片（近位、中間及び遠位）を至近のミリグラムにそのまま秤量し、注意して縦に切開し、吸収紙シートで穏やかに吸い取り、その流体内容物を空にし、次に再秤量した。どんな固形又は半固形腸腔内容物を再分配又は除去しないような注意はしなかった。正味の流体内容物重量を、未処理及び空の腸切片重量間の差として近似ミリグラムに計算し、グラムの切片湿潤組織重量に標準化された。
結果の要約
結果は、ＰＫ１ペプチドがインビボのラット小腸中の流体の腸内貯留及び蓄積を刺激することを示す。概括的にこの効果は小腸の３領域すべてに関与するように見えるが、その効果は比較的遠位の領域（すなわち、中間及び遠位の切片）にもっとも有意である。これらのデータは、Ｕｓｓｉｎｇ型イオンフラックスチェンバーに固定され、エックスビボで研究されたラット回腸粘膜の単離標本で得られたＰＫ１ペプチドの分泌促進作用を示す証拠と一致する。
生物学的実施例４Ａ〜４Ｃ
胃腸平滑筋に対するＰＫ１の作用
生物学的実施例４Ａ
ＰＫ１はインビボのラット小腸における経口試験食物の通過を刺激する。
方法
小腸通過。ラットは経口供給管により、ＰＫ１（１００μｇ／ｋｇ）又はベヒクルの用量と一緒に０．５％メチルセルロース（重量／容量）中の６％カーマイン染料溶液を含有する１．５ｍｌ総容量のボーラスを摂取した。３０分後、ラットを１００％二酸化炭素による吸入麻酔後に頸部脱臼により急速に安楽死させた。各ラットの全小腸を、最初に回腸盲腸接合部で開始し、小腸全体をそのまま切除するまで、胃の幽門の方向に戻って作業して注意して切除した。切除小腸を計量直線縁に沿って縦に配置し、全小腸の長さをセンチメーターで測定した。カーマイン染料の前線の主要な縁が可視化され、カーマインが移動した距離も測定され、小腸の全切除長の割合として計算された。通過は３０分間にカーマイン染料が移動した全小腸の長さの割合として表された。結果は図１４に示される。
結果の要約
結果は、ＰＫ１で経口処置されたラットが、ベヒクル処置競合物に比較して、カーマイン試験食の小腸移動を有意に加速したことを示す。従って、ＰＫ１は処置ラットの上部胃腸管の推進運動性に対する刺激効果をもつように見える。
生物学的実施例４Ｂ
ＰＫ１はエックスビボの単離ラット小腸の収縮性を刺激する。
齧歯類の胃腸（ＧＩ）組織の単離切片に対するＰＫ１の効果が「ミオバス（ｍｙｏｂａｔｈ）」装置を使用してエックスビボで研究された。この器官浴装置は、インビトロのＰＫ１Ｒ−トランスフェクト細胞中の細胞内遊離Ｃａ２＋のＰＫ１受容体（ＰＫ１Ｒ）−仲介の増加をブロックする化合物の存在下又は不在下で、ＰＫ１の適用後のＧＩ平滑筋の収縮作用の変化を測定するために使用される。
方法
齧歯類（マウス、ラット及びモルモット）をＣＯ窒息により安楽死させ、瀉血した。胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸及び遠位結腸を包含するＧＩ組織の切片を動物から切除し、未処理の切片として（すなわち１５ｍｍ長の腸の円筒）又は縦の筋肉の軸に沿って配向された平らなストリップ（〜２．５ｍｍ×１５ｍｍ）のいずれかとして固定された。幾つかの実験においては、平らなストリップは円形の筋肉軸に沿って配向された。２種の縦に配向された平らなストリップ標本、ａ）全腸壁からなるもの、及びｂ）粘膜及び粘膜下層を除去するために切開され、そして外部筋肉（腸管筋叢及び漿膜を包含する）のみからなるもの、が使用された。
各組織標本を、それに標本の片方の端を結合された−固形状態の歪ゲージ力変換器を備えたホールダー上に固定し、そして３５℃に維持され、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２の混合物を通気されたクレブス−リンゲルバッファー（ＫＲＢ、等張の重炭酸塩バッファー塩溶液、ｐＨ７．４）中に浸漬した。０．５〜１．０ｇｍ間（標本に応じて）の静止荷重を与えるために組織を伸長させ、１５分毎に新鮮なＫＲＢに浴溶液を変えながらこれらの条件下で１時間平衡化した。各実験の開始時に、収縮反応を得るために各浴にアセチルコリン（ＡＣｈ、１μＭ）を添加し、ＡＣｈの洗浄後、単独で又はＰＫ１Ｒアンタゴニストの添加後のいずれかの浴にＰＫ１を添加した。これらの条件下のＰＫ１の反応を、ＡＣｈに対する同様な組織標本の反応と比較し、収縮（又は弛緩）をＡＣｈに対する反応のパーセントとして計算する。
モルモットのＧＩ平滑筋に対するＰＫ１の作用は以前に報告されている（Ｓｃｈｗｅｉｔｓ，Ｐａｃａｕｄ ｅｔ ａｌ．１９９９；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２００３）。ＰＫ１及びそれにより活性化されることができる受容体（ＰＫ１Ｒ及びＰＫ２Ｒ）はラットＧＩ管上で異なって発現されるので、ラットの腸及び結腸の単離切片上のペプチドの効果の特徴を調べた。ＰＫ１（１００ｎＭ）は腸組織（中間の十二指腸、空腸及び遠位回腸）からの縦の収縮を惹起し、他方同濃度のＰＫ１が近位及び遠位結腸に縦の弛緩を惹起した（図６参照）。
結果は、ＰＫ１に対する最大収縮反応は回腸組織から得られることを示唆し、従って回腸切片を使用して更なる実験を実施した。第１の研究は未処理の切片を使用し、そして後半の一連の実験は単離回腸の外部筋肉よりなる標本に基づいた。
ＰＫ１は未処理回腸標本に２相の収縮を惹起する。
単離ラット回腸に対するＰＫ１の適用は、初期の一過性収縮及び後期の強直性収縮よりなる２相反応を惹起する（図１５参照）。タンパク質の適用は矢印で起こり、記録期間中、標本との接触を維持した。
初期及び後期相のピーク収縮までの時間はそれぞれ６．４分及び５３．８分と決定された。収縮反応の初期及び後期相は双方とも濃度依存性であることが決定された（図１７Ａ及び１７Ｂ参照）。初期及び後期収縮反応のＥＣ５０はそれぞれ、８７．８及び７２．４ｎＭであると決定された。
回腸平滑筋における著明な収縮が腸平滑筋上の受容体により直接仲介されるかどうかを決定するために、テトロドキシン（ＴＴＸ、０．１μＭ）及びアトロピン（１μＭ）を器官浴に添加した。腸神経系（ＥＮＳ）により仲介される収縮をブロックするＴＴＸの効果を電界刺激（ＥＦＳ）―その添加後に収縮を惹起した―の完全な抑制により証明された。回腸平滑筋上に直接局在するムスカリン様受容体により仲介される収縮をブロックするアトロピンの効果をＴＴＸ及びアトロピン双方の添加後のアセチルコリンの適用により試験した。
ＴＴＸ及びアトロピンはＰＫ１−惹起収縮反応の初期成分を弱めるが、後期成分を弱めしない。これらの結果は、回腸の縦の筋肉に対するＰＫ１の、遅く発生する、持続性の収縮効果は神経により仲介されず、またコリン作動性でもないことを示唆する。他のインビボの結果（上記参照）が、ラット回腸に対するＰＫ１の強力な分泌効果を示したので、粘膜の受容体の刺激が、腸平滑筋を収縮するように作用する１種又は複数の物質を放出するというアイデアを、粘膜を含まない回腸標本に適用されたＰＫ１の作用を決定することにより試験した。回腸粘膜の除去は、ＰＫ１により惹起される、遅く発生する「後期」収縮反応を抑制する（図１８参照）。
ＰＫ１の刺激効果は小分子アンタゴニストにより弱められる。
ＧＩ平滑筋のＰＫ１仲介収縮を抑制するＰＫ１Ｒの小分子アンタゴニストの能力が、本システムで試験された。結果の１例は図１９に示され、ここで、ＪＮＪ−２８８４５５５７がラット回腸の縦の平滑筋のＰＫ１誘発収縮に対して濃度依存性阻害効果をもつことが認められた。反応の初期及び後期成分双方が拮抗された、しかし、該化合物は後期反応に対するその効果に比較して、初期反応の阻害においてより強度で有効であった。
生物学的実施例４Ｃ
齧歯類胃腸管の組織におけるＰＫ１及びＰＫ１受容体の免疫細胞化学的位置確認
ラットに対するＰＫ１の投与は、腸内腔中への流体の分泌を刺激し、胃腸（ＧＩ）管へのマーカーの移動速度を増加することが示され、更に齧歯類（ラット、マウス及びモルモット）の腸の単離切片に対するＰＫ１の適用が、ＧＩ上皮からのＣｌ−イオンの分泌を刺激し、そしてＧＩ平滑筋の領域特異的収縮又は弛緩を惹起することが示された。外部からのＰＫ１のこれらの作用はＰＫ１受容体（ＰＫ１Ｒ）の小分子量アンタゴニストにより抑制される。ＧＩ管内のＰＫ１ペプチドの分布及びＰＫ１Ｒにおけるその作用の１つ又は複数の部位を決定するために、一連の免疫細胞化学的実験を実施した。
方法
ヒトＰＫ１ペプチドのアミノ酸配列、ＣＳＭＤＬＫＮＩＮＦ及びラットＰＫＲ１のアミノ酸配列、ＤＦＦＳＡＲＤＧＳＧＡＥＴＳＰに対する抗体をウサギに対して発現させた。齧歯類をＣＯ２による窒息により安楽死させ、以下の組織：近位の胃、遠位の胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸及び遠位結腸、を収穫した。組織をリン酸塩バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中ですすぎ、１〜４時間、０．１Ｍリン酸バッファー（ＲＴでｐＨ７．４）中４％のパラホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）中への浸漬により固定した。２種の実験を実施し、第１の実験系列において、腸の未処理切片を、４℃のＰＢＳ中３０％の蔗糖（ｗ／ｖ）中に１晩浸漬による固定後に低温保護し、次にＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ）中に包埋し、−２０℃で保存した。ＯＴＣ−包埋組織の切片（１０〜１２μｍ）を低温槽ミクロトーム上で切断し、顕微鏡スライド（ＶＷＲ“Ｐｌｕｓ”コートされた）上に解凍固定した。スライドをＰＢＳ中ですすぐことにより、ＯＣＴを切片から除去し、そして非特異的結合を、１％ウシ血清アルブミン（画分ＩＶ、ｗ／ｖ）及び０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ｖ／ｖ）を含有するＰＢＳ中４％の非免疫ヤギ血清（ｖ／ｖ）中で切片をインキュベートすることによりブロックした。一次抗体を１晩（ＲＴ）適用し、ＰＢＳ中ですすいで除去し、次に、蛍光分子（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）がそれに共役結合された二次抗体を４時間（ＲＴ）適用した。第２の実験系列において、腸及び結腸の切片を腸間膜境界に沿って縦に切開し、腸をシラスティックエラストマー（Ｓｙｌｇａｒｄ，Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｄｌａｎｄ ＭＩ）で裏打ちされた皿の底に、粘膜面を上にして平らなシートとしてピンで張り、次に固定した（上記のように）。固定後、腸の平らなセグメントを切開して、粘膜下叢（ＳＭＰ）を含有する接着性腸間筋叢（ＬＭＭＰ）又は粘膜下組織を伴なう縦の筋肉よりなる、薄い全マウント標本をもたらした。全マウント標本を免疫染色（前記）し、次にそれらをガラス顕微鏡スライド上に固定した。グリセロール基剤の抗褪色固定媒質（ＶｅｃｔａＳｈｉｅｌｄ，Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して、切片及び全マウント標本上にカバースリップを固定し、エピ蛍光顕微鏡を使用して組織を検査した。結果は図２０及び２１に示される。
結果
ＰＫ１免疫反応性（ＩＲ）をＧＩ組織の粘膜で検出した。ＰＫ１−ＩＲは胃粘膜で特に著明であった（図２０）。ＰＫ１−ＩＲは粘膜下（図２１Ａ）及び腸間筋（図２１Ｂ）神経節双方のニューロンで認められた。一次抗体を省くと蛍光のほとんど全喪失をもたらすので、免疫反応性は特異的であるように見える。（図２１Ｂ及び２１Ｃを参照されたい）。これらのデータは、腸がＰＫ１の生成源であり、そしてペプチドの受容体が腸内ニューロンに局在することを示唆する。従って、ＰＫ１の分泌促進及び運動促進効果は一部は腸内ニューロン経路により媒介される可能性がある。
ネズミのＤＳＳ−誘発大腸炎におけるＰＫ１及びＰＫ１受容体の発現
ＰＫ１受容体のｍＲＮＡはマウスにおけるＤＳＳ−誘発大腸炎の７日目の遠位結腸で増加しない（図２２参照）。
ネズミのからし油誘発大腸炎
ＰＫ１ＲのｍＲＮＡは、からし油の１回の結腸内投与の２時間後に遠位結腸に、小さいが統計的に有意な増加を有する（図２３参照）。レベルは６時間までに対照のレベルに復帰する。これは、からし油に対する結腸の早急な反応にはＰＫ１Ｒの役目があることを示唆する。
からし油の結腸内投与の６時間後に、マウスの遠位結腸内のＰＫ１のｍＲＮＡに、大きい、統計的に有意な増加がある。レベルは２４時間までに対照レベルに復帰し、それはＰＫ１が、からし油に対する結腸の早急な反応において役目を果たすことを示唆する（図２４参照）。
正常ラットＧＩ組織
ＰＫ１のＲｍＲＮＡの最高レベルは、回腸（筋肉及び粘膜双方）にあり、最低レベルは十二指腸及び胃内にあり、中間レベルは遠位結腸（レーン標識した生理食塩水）、空腸及び肝臓にある（図２５参照）。ＰＫ１ＲのｍＲＮＡレベルは、遠位結腸にＴＮＢＳ導入の３日後に、遠位結腸（レーン標識されたＴＮＢＳ）中で変化しない。同様にＰＫ１ＲのｍＲＮＡレベルはＵｓｓｉｎｇチェンバーに固定して、ベヒクル（レーン標識ＵＣ対照）又はコレラ毒素（ＵＣコレラ毒素）で処理すると、遠位結腸で変化しない。ＰＫ１のｍＲＮＡの最高レベルは胃において認められ、最低レベルは十二指腸、空腸及び肝臓で、そして中間レベルは回腸（筋肉及び粘膜双方）及び結腸で認められる。これらのデータは、ＧＩ管が、ｍＲＮＡレベルの領域による安定状態の差異を伴なって、ＰＫ１Ｒ及びＰＫ１双方を生成することを示す。胃内のＰＫ１の最高レベルは、胃がバルクのＰＫ１を生成し、それが次に、残りのＧＩ管に利用可能であろうことを示唆する。回腸中のリガンド及び受容体双方に対するｍＲＮＡの存在は、局所的パラクリン相互作用が起る可能性を示唆している。
ＰＫ１Ｒノックアウトマウス
ＰＫ１Ｒノックアウトマウス（−／−）は回腸でＰＫ１ＲのｍＲＮＡを発現しないが、野生型マウス（＋／＋）はＰＫ１ＲのｍＲＮＡを発現する（図２６参照）。ＫＯマウスの回腸のＰＫ１のｍＲＮＡには、小さいが統計的に有意な減少が存在する（図２７参照）。これらのデータは、ＰＫ１Ｒの遺伝的ＫＯの信頼性を確証し、そしてＰＫ１Ｒの喪失は回腸のＰＫ１の安定状態レベルを僅かに減少する可能性があることを示唆している。
ＲＮＡ単離（Ｑｉａｇｅｎ Ｒｎｅａｓｙ ９６プレート）
ＲＮＡは販売会社から入手し、組織は社内動物モデルから入手した。組織サンプルは処理することができるまでＲＮＡ Ｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）中で−８０℃又は４℃で保存した。ＲＮＡ Ｌａｔｅｒを外し、クイアゾル（Ｑｉａｇｅｎ）並びにステンレス鋼の組織粉砕ビーズ（４．０ｍｍ ｃｏｎのボールベアリング−Ｍｏｎｔｒｅａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ Ｑｕｅ）と置き換えた。サンプルをＲｅｔｓｃｈ ＭＭ ３００ホモジナイザー（Ｑｉａｇｅｎ）中に通した。クロロホルムの添加及び遠心分離後に、水相を回収し、７０％エタノールと混合し、Ｑｉａｇｅｎ Ｒｎｅａｓｙ ９６プレートの濾過カラム中に注入した。製造業者の指示書に従い、サンプルを最後にＲＮａｓｅ非含有水中で溶離した。次にＲＮＡ調製物をＤｎａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｄｎａｓｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）の製造業者の指示書に従いＤＮａｓｅに対して処理した。ＲＮＡの量を紫外線分光分析により測定した。ＲＮＡ完全性を、サンプルをＴｏｔａｌ Ｎａｎｏ ＲＮＡ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ法を通して、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）により測定した。
ＬｉＣｌ沈殿法
ＤＳＳ−処理サンプルに対しては以下の方法を使用した。この方法はＣａｔｈａｌａ等（１９８３）の方法から改変した。２．５ＭのＬｉＣｌ最終濃度を得るために、ＲＮＡ調製物を、ＲＮａｓｅ非含有水中に溶解したＲＮａｓｅ非含有塩化リチウム（ＬｉＣｌ、Ａｍｂｉｏｎ）のストック溶液と混合した。この混合物を−２０℃で３０分間インキュベートし、その後、室温に戻した。サンプルが融解直後、１８０００ｒｃｆ、４℃で１５分間遠心分離した。流体を吸引し、ペレットを１ｍｌの氷冷７０％エタノールで洗浄した。サンプルをもう一度１８０００ｒｃｆ、４℃で１５分間遠心分離した。サンプルを洗浄し、もう一度遠心分離し、次に約１５分間空気乾燥した。ペレットをＲＮａｓｅ非含有水に再懸濁させた。次に光学密度測定値を採ってＲＮＡ量を計算し、各サンプルを三重に読み取った。
ＴａｑＭａｎ即時ＲＴ−ＰＣＲ
高容量ｃＤＮＡ Ａｒｃｈｉｖｅ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｃｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）の１：１（ｖ／ｖ）添加物を最初に２５０ｎｇ／ｕｌに希釈された各ＲＮＡサンプルに添加した。この混合物を３７℃で２時間インキュベートした。次にサンプルを１５．６２５Ｘの係数で希釈して、８ｎｇ／ｕｌのｃＤＮＡが３８４ウエルの光学読み取りプレート中に５ｕｌ／ウエルを充填するのに利用可能であった。プライマー／プローブを２×ＲＴ−ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で生成し、７ｕｌのこの溶液を各ウエルに添加し、次にプレートを７９００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で処理した。Ｔａｑｍａｎプライマー／プローブをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより開発された市販のストックから購入した。サンプルを試験された各プローブにつき３重に処理した。
以上の明細は、図示の目的で提供された実施例を伴なって、本発明の原理を教示しているが、本発明の実施は当業者により理解されると考えられる通常の変更物、翻案物及び／又は改変物すべてを包含することは理解されるであろう。

Claims (33)

  1. ＰＫ１受容体の活性を修飾することを含んでなる腸上皮の機能を修飾する方法。
  2. 腸上皮の機能が粘膜のイオン分泌である、請求項１の方法。
  3. 粘膜のイオン分泌がＣｌ−イオンの輸送である、請求項１の方法。
  4. 腸上皮の機能が流体の輸送である、請求項１の方法。
  5. 腸上皮の機能が前記ＰＫ１受容体を阻害することにより抑制される、請求項１の方法。
  6. 腸上皮の機能が前記ＰＫ１受容体を活性化することにより活性化される、請求項１の方法。
  7. ＰＫ１受容体を含んでなる標本を１種又は複数の候補化合物と接触させ、そして該ＰＫ１受容体の活性を修飾する化合物を特定することを含んでなる、ＰＫ１受容体モジュレーターを特定する方法。
  8. 標本が腸粘膜の標本である、請求項７の方法。
  9. ＰＫ１受容体のシグナリングを修飾する化合物の能力が決定される、請求項７の方法。
  10. ＰＫ１受容体のシグナリングが短絡電流（Ｉｓｃ）をモニターすることにより決定される、請求項９の方法。
  11. ＰＫ１受容体のシグナリングがＣｌ−イオンの輸送をモニターすることにより決定される、請求項９の方法。
  12. ａ）回腸粘膜にバッファー溶液中の試験化合物を投与し、
    ｂ）ＰＫ１受容体の活性を測定し、
    ｃ）工程ａ）及びｂ）を反復し、しかしバッファー溶液から試験化合物を省き、そして
    ｄ）工程ｂ）から得た結果を工程ｃ）からの結果と比較する、
    工程を含んでなる、ＰＫ１受容体の活性を修飾する化合物を特定する方法。
  13. 活性がＣｌ−イオンの輸送を測定することにより決定される、請求項１２の方法。
  14. 活性が短絡電流（Ｉｓｃ）を測定することにより決定される、請求項１２の方法。
  15. ａ）回腸粘膜にバッファー溶液中の試験化合物を投与し、
    ｂ）細胞培養物にＰＫ１又はその機能的同等物を投与し、
    ｃ）ＰＫ１受容体の活性を測定し、
    ｄ）バッファー溶液から試験化合物を省いて、工程ａ）、ｂ）及びｃ）を反復し、そし
    て
    ｅ）工程ｃ）で得た結果を工程ｄ）からの結果と比較する、
    工程を含んでなる、ＰＫ１受容体の活性を減少する化合物を特定する方法。
  16. 短絡電流（Ｉｓｃ）を測定する工程を含んでなる、ＰＫ１受容体の活性の機能アッセイ。
  17. Ｃｌ−イオン輸送を測定する工程を含んでなる、ＰＫ１受容体の活性の機能アッセイ。
  18. ＰＫ１アンタゴニストを哺乳動物に投与する工程を含んでなり、腸内炎症が軽減される、腸内の炎症を軽減させそして又は処置することを必要とする哺乳動物の腸内の炎症を軽減させそして／又は処置する方法。
  19. アンタゴニストが式（Ｉ）：
    Figure 2008537548
     ［式中：
    Ａ１は水素、アリール、ヘテロアリール、Ｃ５−８シクロアルキル又はヘテロシクリルであり、但しＡ１はピペリジン−４−イル、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−ピペリジン−４−イル又はＮ−メチル−ピペリジン−３−イル以外であることとし、そしてここで、水素以外のＡ１の置換基は、場合により、独立してＣ１−６アルキル、ヒドロキシ（Ｃ１−６）アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、シアノ、ヒドロキシ、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルアミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルキルチオカルボニル、ホルミル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルアミノスルホニル及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノスルホニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、
    Ｌ１は、場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル及びハロゲンよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよい−（ＣＨ２）ｒ−又は−ＣＨ２ＣＨ２Ｘ（ＣＨ２）ｓ−であり、但しＡ１が水素である時は、ｒは４以上であることとし、
    ｒは１〜５の整数であり、
    ｓは１〜３の整数であり、
    ＸはＯ又はＳであり、
    Ｄは−Ｐ−Ａ２であり、
    Ａ２は水素、フェニル、未置換ピリジン−２−イル以外のヘテロアリール、又はＣ３−８シクロアルキルであり、ここでフェニルは場合によりメタ又はパラ位で置換されていてもよく、そして水素及びフェニル以外のＡ２の置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、ハロゲン化Ｃ１−６アルキル、ハロゲン化Ｃ１−６アルコキシ、アリール（Ｃ１−６）アルコキシ、フェニル、Ｃ１−６アルキルチオ、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、シアノ、ヒドロキシ、ニトロ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルキルチオカルボニル、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルカルボニルアミノ及び非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、但しＡ２上の２個を超えない置換基はアリール（Ｃ１−６）アルコキシ、フェニル又は非縮合Ｃ３−６シクロアルキルオキシであることとし、
    但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）２−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２は未置換フェニル、アリール（Ｃ１−６）アルコキシ又はフェニルで置換されたフェニル、あるいはシアノによりメタ位で置換されたフェニル、以外であることとし、そして更に
    但しＡ１が未置換フェニルでありそしてＬ２が−Ｘ１（ＣＨ２）３−（ここで、Ｘ１はＮＨである）である時は、Ａ２はメトキシで置換されたフェニル以外であることとし、そして
    但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルでありそしてＰが−ＣＨ２−である時は、Ａ２はトリフルオロメチル又はトリフルオロメトキシによりメタ位で置換されたフェニル以外であることとし、そして更に
    但しＡ１が３，４−ジクロ−フェニルでありそしてＰが−（ＣＨ２）２−である時は、Ａ２は４−メトキシ−フェニル以外であることとし、
    更に、Ａ２が水素である時は、Ｐは−（ＣＨ２）４−６−であり、そしてＡ２が水素以外である時は、Ｐは−（ＣＨ２）１−２−又は−ＣＨ２Ｘ２−であることとし、
    ＷはＮ又はＣＨであり、
    Ｌ２は、
    式（Ｉ）のトリアジン環にその窒素原子を介して結合されたピロリジニル又はピペリジニル（ここで該ピロリジニル又はピペリジニルは−（ＣＨ２）０−２−により炭素原子上で置換されている）、
    −ＮＨ−Ｃ５−７シクロアルキル−（ＣＨ２）０−２−（但しＣ５−７シクロアルキルがシクロヘキシルである時は、Ｑは−ＮＨ−の位置に対して２−又はシス−４−位のいずれかで結合されていることとする）、
    −Ｘ１−Ｃ２−６アルキル−、
    −Ｘ１−（ＣＨ２）１−３−Ｘ２−（ＣＨ２）１−３−、
    −Ｘ２−（ＣＨ２）０−４−、
    −Ｘ１−（ＣＨ２）２−３−Ｘ３−（ＣＨ２）２−３−、
    −ＮＨ（ＣＨ２）１−４Ｃ（＝Ｏ）−（但し、Ｒｂ、Ｒｃ又はＲｄの少なくとも１個は水素ではなくそしてｍは０であることとする）、
    −ＮＨＣ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）１−４−及び
    −Ｘ１−ＣＨ（Ｒｘ）−（ＣＲｘＲｙ）１−５−、
    よりなる群から選択される２価の基であり、
    ここでＸ１は−ＮＨ−又は直接結合であり、Ｘ２は−ＣＨ＝ＣＨ−であり、Ｘ３はＯ、Ｓ、ＮＨ又はＣ＝Ｏであり、Ｒｘ及びＲｙは独立してＨ又はＣ１−４アルキルであり、そして但しＬ２はどんな場合にも７原子の長さを超えないこととし、
    Ｑは−（Ｏ）ｍＮ（Ｒａ）−Ｇでありそしてｍは０又は１であり、
    Ｇは−Ｃ（＝ＮＲｂ）ＮＲｃＲｄであり、
    Ｒａ及びＲｄは独立して水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル又はＣ３−６アルキニルであり、ここで水素以外のＲａ及びＲｄの置換基は、場合により、独立してヒドロキシ、Ｃ１−４アルコキシ、フルオロ、アミノ、Ｃ１−４アルキルアミノ、ジＣ１−４アルキルアミノ及びＣ１−４アルキルカルボニルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲａ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成し、
    Ｒｂは水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６アルキニル、Ｃ２−６アルコキシカルボニル又はシアノであるか、あるいはＲｂ及びＲｃが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成し、
    Ｒｃは水素、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル、Ｃ３−１０アルキニル、Ｃ３−７シクロアルキル、アダマンチル、アミノ、Ｃ１−６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アリ
    ールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリルであり、ここでＣ１−１０アルキル、Ｃ２−１０アルケニル及びＣ２−１０アルキニル場合により、独立してヒドロキシ、Ｃ１−６アルコキシ、トリフルオロメチル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクリルよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよく、そしてここで、Ｒｃのいずれかのアリール−又はヘテロアリール−含有置換基は場合により、独立してＣ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシ、ハロゲン、フッ化Ｃ１−６アルキル、フッ化Ｃ１−６アルコキシ、Ｃ１−６アルキルカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニルアミノ、ホルミル、Ｃ１−６アルキルスルホニル、Ｃ１−６アルキルスルホニルアミノ、アミノスルホニル、Ｃ１−６アルキルアミノスルホニル及びジ（Ｃ１−６アルキル）アミノスルホニル、ニトロ、メチルチオ、ヒドロキシ及びシアノよりなる群から選択される１〜３個の置換基で置換されていてもよいか、あるいはＲｃ及びＲｄが、それらが結合されている原子と一緒になって、場合により環内に１〜２個のＯ又はＳヘテロ原子を包含してもよく、そして場合によりオキソで置換されていてもよい５〜８員の単環式環を形成し、
    但し、いずれの場合にも、唯一の環は場合により、ＲａとＲｂ、ＲｂとＲｃ又はＲｃとＲｄの間に存在してもよいこととする］
    の化合物及びそのエナンチオマー、ジアステレオマー、互変異性体、溶媒和及び製薬学的に許容できる塩である、
    ＰＫ１アンタゴニストを哺乳動物に投与する方法を含んでなり、腸内炎症が軽減される、腸内の炎症を軽減させそして／又は処置することを必要とする哺乳動物の腸内の炎症を軽減させそして／又は処置する方法。
  20. 炎症が慢性である、請求項１９記載の方法。
  21. 炎症が散発性である、請求項１９記載の方法。
  22. 炎症が過敏性大腸症候群の症状である、請求項１９の方法。
  23. 炎症が炎症性大腸疾患の症状である、請求項１９の方法。
  24. 炎症性大腸疾患が潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項２３記載の方法。
  25. ＰＫ１を投与する方法を含んでなる、腸腔内の流体分泌を刺激する方法。
  26. ＰＫ１受容体アゴニストを投与する方法を含んでなる、腸腔内の流体分泌を刺激する方法。
  27. ＰＫ１アンタゴニストを投与する方法を含んでなる、腸腔内の流体分泌を抑制する方法。
  28. ＰＫ１を投与する方法を含んでなる、腸内の前方推進（ｐｒｏｐｕｌｓｉｏｎ）を刺激する方法。
  29. ＰＫ１受容体アゴニストを投与する方法を含んでなる、腸内の前方推進を刺激する方法。
  30. ＰＫ１アンタゴニストを投与する方法を含んでなる、腸内前方推進を抑制する方法。
  31. ＰＫ１を投与する方法を含んでなる、ＣＯＸを刺激する方法。
  32. ＰＫ１受容体アゴニストを投与する方法を含んでなる、ＣＯＸを刺激する方法。
  33. ＰＫ１受容体アンタゴニストを投与する方法を含んでなる、ＣＯＸを抑制する方法。
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