JP2008529537A - プリオン特異的なペプチド試薬 - Google Patents

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Abstract

プリオンタンパク質のＰｒＰｓｃ型と優先的に相互作用するペプチド試薬が記載される。プリオンおよびプリオン関連疾患についての検出、診断、精製、治療および予防のために試薬またはこの試薬に対する抗体を使用する方法も記載される。これらのペプチド試薬は、病原性プリオンを単離するためか、またはサンプル中の病原性プリオンの存在を検出するためのツールとして、治療的組成物または予防的組成物の成分として、および／またはプリオン特異的抗体を作製するためなどの幅広い用途において使用することができる。例えば、ＰｒＰＣと比較して、ＰｒＰＳｃと優先的に相互作用するペプチド試薬は、生存被験体から得られたサンプル中の病原型の直接的な検出、例えば、疾患の診断または献血サンプルのスクリーニングまたは臓器提供用の臓器のスクリーニングに有用である。

Description

（発明の分野）
本発明は、プリオンタンパク質と相互作用するペプチド試薬、これらのペプチド試薬をコードするポリヌクレオチド、このようなペプチド試薬およびポリヌクレオチドを使用して抗体を作製する方法ならびにこれらの方法を使用して作製された抗体に関する。本発明は、さらに、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するためにこれらのペプチド試薬を使用する方法および治療的組成物または予防的組成物中の成分としてこれらのペプチド試薬を使用する方法に関する。
（背景）
タンパク質コンホメーション病は、伝達性海綿状脳症を含む種々の無関係な疾患を含み、それらの疾患は、後に異常タンパク質型の自己会合をもたらすタンパク質（コンホメーション病タンパク質）の異常なコンホメーション遷移に起因し、結果的に組織沈着および損傷が起きる。これらの疾患はまた、臨床像において顕著な類似点、代表的には、診断から種々の長さの潜伏期を経て死を迎えるという進行の速さを共有する。
コンホメーション病の１つの群は、「プリオン病」または「伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）」と呼ばれる。ヒトにおけるこれらの疾患としては、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、致死性家族性不眠症およびクールーが挙げられる（例えば、非特許文献１および非特許文献２を参照のこと）。動物におけるＴＳＥとしては、ヒツジスクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、伝達性ミンク脳症および捕獲されたミュールジカおよびヘラジカの慢性消耗病が挙げられる（Ｇａｊｄｕｓｅｋ，（１９９０）Ｓｕｂａｃｕｔｅ Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ：Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｅｓ Ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｐｐ．２２８９−２３２４ Ｉｎ：Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｄ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．）。伝達性海綿状脳症は、同じ特徴：霊長類、げっ歯類およびトランスジェニックマウスを含む実験動物に実験的に接種されるとき、疾患を伝染させるプリオンタンパク質の異常な（ベータリッチ、プロテイナーゼＫ耐性）コンホメーションの存在によって特徴付けられる。
近年、ウシ海綿状脳症の急速な蔓延とヒトにおける海綿状脳症の高発症率との相関が、非ヒト哺乳動物における伝達性海綿状脳症の検出についての関心を顕著に高めている。これらの疾患の偶発的な伝染の悲劇的な結果（例えば、Ｇａｊｄｕｓｅｋ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｍｙｌｏｉｄｓ，ａｎｄ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ Ｐｒｉｏｎｓ Ｉｎ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｆｉｅｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｉｎ，Ｐｕｂ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９６）；Ｂｒｏｗｎら、（１９９２）Ｌａｎｃｅｔ，３４０：２４−２７を参照のこと）、汚染除去の困難性（Ａｓｈｅｒら、（１９８６）ｐａｇｅｓ ５９−７１ Ｉｎ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓａｆｅｔｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ，Ｍｉｌｌｅｒ ｅｄ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂ．）およびウシ海綿状脳症についての近年の関心（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄ．Ｊ．（１９９５）３１１：１４１５−１４２１）から、伝達性海綿状脳症に罹患したヒトおよび動物を同定する診断テストおよび感染した被験体に対する治療法の両方が切迫して求められている。
プリオンは、海綿状脳症（プリオン病）を引き起こす伝染性病原体である。プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドとはかなり異なる。有力な仮説は、他のすべての伝染性病原体とは異なり、感染は、プリオンタンパク質の異常なコンホメーションによって引き起こされ、その異常なコンホメーションは、鋳型として作用し、そして正常なプリオンコンホメーションを異常なコンホメーションに変換するというものである。プリオンタンパク質は、１９８０年代初頭に初めて特徴付けられた（例えば、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５を参照のこと）。その後、完全なプリオンタンパク質をコードする遺伝子がクローニングされ、塩基配列の決定がなされ、そしてトランスジェニック動物において発現された。例えば、非特許文献６を参照のこと。
プリオン病の重要な特徴は、プリオンタンパク質の正常な（細胞性または非病原性）型（ＰｒＰＣ）からスクレイピータンパク質とも呼ばれる異常な形態のタンパク質（ＰｒＰＳｃ）が形成されることである。例えば、非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０を参照のこと。光学分光学および結晶学の研究から、疾患に関連したプリオンの形態は、主にアルファへリックスに折りたたまれた非疾患型と比較して、実質的にベータシート構造に富んでいることが明らかになった。例えば、非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）を参照のこと。この構造変化は、生化学的特性の変化後に起きると思われている：ＰｒＰＣは、非変性界面活性剤に可溶性であり、ＰｒＰＳｃは、不溶性である；ＰｒＰＣは、プロテアーゼによって容易に消化される一方で、ＰｒＰＳｃは、部分的に耐性であり、「ＰｒＰｒｅｓ」型（Ｂａｌｄｗｉｎら、（１９９５）；Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ（１９９５））、「ＰｒＰ２７−３０」型（２７〜３０ｋＤａ）または「ＰＫ耐性」（プロテイナーゼＫ耐性）型として知られるＮ末端で切断されたフラグメントを形成する。さらに、ＰｒＰＳｃは、ＰｒＰＣを病原性のコンホメーションに変換し得る。例えば、非特許文献１４；非特許文献１５を参照のこと。
生存被験体および生存被験体から得られるサンプルにおけるコンホメーション病タンパク質の病原性アイソフォームを検出することは、困難であると証明されている。従って、被験体が死に至る前の、これらの伝染性状態およびアミロイド含有状態についての最終的な診断および姑息的処置は、実質的に未だ対処されていない難題として残されている。脳バイオプシーの組織病理学検査は、被験体にとって危険であり、バイオプシーサンプルが採取される場所によっては、病変およびアミロイド沈着を見逃す可能性がある。しかしながら、動物、患者および医療関係者にとってバイオプシーに関する危険性は未だ存在する。さらに、動物における脳テストの結果は、その動物が食料供給に供されるまでは、通常得られない。さらに、プリオンペプチドに対して作製される抗体は、変性したＰｒＰＳｃおよびＰｒＰＣの両方を認識するが、伝染性（未変性）ＰｒＰＳｃを選択的に認識することはできない。（例えば、非特許文献１６を参照のこと）
Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒら、編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４） Ｍｅｄｏｒｉら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９２）３２６：４４４−９ Ｂｏｌｔｏｎ，ＭｃＫｉｎｌｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１８：１３０９−１３１１ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｂｏｌｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２）２１：６９４２−６９５０ ＭｃＫｉｎｌｅｙ，Ｂｏｌｔｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９８３）３５：５７−６２ Ｂａｓｌｅｒ，Ｏｅｓｃｈら、Ｃｅｌｌ（１９８６）４６：４１７−４２８ Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）３６（１２）：３５４３−３５５３ Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ、Ａｎｎ Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）６７：７９３−８１９ Ｐａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９３）９０：１０９６２−１０９６６ Ｓａｆａｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９９３）２６８：２０２７６−２０２８４ Ｗｉｌｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００１）９９：３５６３−３５６８ Ｐｅｒｅｔｚら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（１９９７）２７３：６１４−６２２ Ｃｏｈｅｎ ＆ Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｃｈａｐｔｅｒ５：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ＰＲＩＯＮ ＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ，ｅｄ．Ｓ．Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９，ｐｐ：１９１−２２８ Ｋａｎｅｋｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１１１６０−１１１６４ Ｃａｕｇｈｅｙ、Ｂｒ Ｍｅｄ Ｂｕｌｌ．（２００３）６６：１０９−２０ Ｍａｔｓｕｎａｇａら、ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２００１）４４：１１０−１１８
従って、様々なサンプル、例えば、生存被験体から得られたサンプル、輸血用血液、家畜動物ならびに他のヒト用および動物用の食品供給物における病原性プリオンタンパク質の存在を検出するための組成物および方法が必要である。さらに、プリオン関連疾患を診断し、そして処置するための方法および組成物も必要とされている。
（発明の要旨）
本発明は、プリオンタンパク質と相互作用するペプチド試薬に部分的に関する。より具体的には、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、プリオンタンパク質の病原性アイソフォームと優先的に相互作用する。これらのペプチド試薬は、病原性プリオンを単離するためか、またはサンプル中の病原性プリオンの存在を検出するためのツールとして、治療的組成物または予防的組成物の成分として、および／またはプリオン特異的抗体を作製するためなどの幅広い用途において使用することができる。例えば、ＰｒＰＣと比較して、ＰｒＰＳｃと優先的に相互作用するペプチド試薬は、生存被験体から得られたサンプル中の病原型の直接的な検出、例えば、疾患の診断または献血サンプルのスクリーニングまたは臓器提供用の臓器のスクリーニングに有用である。
より広い局面において、本発明は、コンホメーション病タンパク質の病原型と優先的に相互作用するペプチド試薬を含む。特定の実施形態において、本明細書中に記載されるペプチド試薬は、非病原型のプリオンタンパク質と比較して、病原型のプリオンタンパク質と優先的に相互作用する。本明細書中に記載されるペプチド試薬は、部分的または完全に合成され得、例えば、１個以上の以下の部分：環化された残基もしくはペプチド、ペプチドの多量体、標識および／または他の化学部分を含み得る。適当なペプチド試薬の例としては、配列番号１２〜２６０のペプチドから誘導されるもの、例えば、配列番号１３３〜２６０に示されるものなどのペプチドならびにそれらのアナログおよび誘導体が挙げられる。本明細書中に記載されるペプチド試薬は、任意のコンホメーション病タンパク質、例えば、プリオンタンパク質（例えば、病原性タンパク質ＰｒＰＳｃおよび非病原型ＰｒＰＣ）と相互作用し得る。特定の実施形態において、ペプチド試薬は、ＰｒＰＣと比較して、ＰｒＰＳｃと優先的に相互作用する。ペプチド試薬は、一般に、２種以上に由来するＰｒＰＳｃに特異的であるが、１種に由来するＰｒＰＳｃに特異的であってもよい。
別の実施形態において、本明細書中に記載される配列のいずれかに示されるペプチドから誘導されるペプチド試薬が提供される。特定の実施形態において、ペプチド試薬は、プリオンタンパク質の領域から誘導され、例えば、残基２３〜４３または８５〜１５６（例えば、配列番号２に示されるマウスプリオン配列に従って付番された２３〜３０、８６〜１１１、８９〜１１２、９７〜１０７、１１３〜１３５および１３６〜１５６）に対応するそれらの領域が使用される。便宜上、上で列挙されたアミノ酸残基番号は、配列番号２におけるマウスプリオンタンパク質配列に対応する番号である；当業者は、当該分野で公知の配列および本明細書中に提供される教示に基づいて他の種のプリオンタンパク質において対応する領域を容易に同定することができる。例示的なペプチド試薬としては、配列番号
Figure 2008529537
 を有するペプチド；または配列番号
Figure 2008529537
 を有するペプチド；または配列番号５６、５７、６５、８２、８４または１３６を有するペプチドから誘導されるものが挙げられる。
別の局面において、本発明は、本明細書中において記載されるペプチド試薬の１個以上およびプリオンタンパク質を含む複合体を含む。
別の局面において、プリオンタンパク質を認識する抗体の作製方法が提供され、その方法は、本明細書中において記載されるペプチド試薬（またはそれらのペプチド試薬をコードするポリヌクレオチド）のいずれかを被験体（例えば、動物）に投与する工程を含む。特定の実施形態において、その方法は、さらに、その動物から抗体を単離する工程を含む。本発明の関連する局面は、その方法によって作製される抗体を含む。好ましい抗体は、病原型に特異的である。
さらに別の局面において、本発明は、本明細書中において記載される抗体のいずれかおよびプリオンタンパク質を含む複合体を含む。特定の実施形態において、プリオンタンパク質は、非病原性アイソフォームであるが、他の実施形態において、プリオンタンパク質は、病原性アイソフォームである。
本明細書中において記載されるペプチド試薬および／または抗体のいずれかは、全体的または部分的に、１個以上のポリヌクレオチドによってコードされ得、それらはまた、本発明の一部を形成する。
さらに別の局面において、プリオンタンパク質の存在を検出するための方法が提供される。その検出方法は、とりわけ、（例えば、ヒト被験体または非ヒト動物被験体における）プリオン関連疾患を診断するため、実質的にＰｒＰＳｃを含まない血液供給物、血液供給物供給物または食品供給物を保証するため、移植のための器官および組織サンプルを分析するため、手術道具および手術機器の汚染除去をモニターするため、ならびに病原性プリオンの存在の有無の知見が重要である他の任意の状況のための方法と組み合わせて使用され得る。
検出方法は、病原性プリオンアイソフォームとの本発明のペプチド試薬の優先的な相互作用に依存する。特定の実施形態において、生物学的サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法が提供される。
１つの実施形態において、この方法は、病原性プリオンが存在する場合、ペプチド試薬と病原性プリオンとが相互作用し得る条件下で、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと、本明細書中において記載される１個以上のペプチド試薬とを接触させる工程；および病原性プリオンをペプチド試薬に結合することによってサンプル中の病原性プリオンの存在の有無を検出する工程を含む。ペプチド試薬と病原性プリオンとの相互作用は、溶液中において実施され得るか、または１個以上の反応物が固相内または固相上に提供され得る。本発明のペプチド試薬が、捕捉試薬、検出試薬またはその両方として使用され得るサンドイッチタイプのアッセイが、実施され得る。他のプリオン結合試薬（例えば、変性プリオンタンパク質に結合する抗体および他の結合分子）が、この局面において、本発明のペプチド試薬と組み合わせて使用され得る。
この実施形態の１つの局面において、本発明の１個以上のペプチド試薬は、固体支持体上に提供され、そして病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンがペプチド試薬に結合し得る条件下で、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと接触させる。任意の非病原性プリオンを含む未結合サンプル物質は、除去され得、そしてペプチド試薬に結合したままの状態か、またはペプチド試薬からの解離後のいずれかで、病原性プリオンが検出され得る。病原性プリオンは、検出可能に標識されたペプチド試薬（病原性プリオンを「捕捉する」ために使用される同じペプチド試薬または本発明の第２のペプチド試薬のいずれか）または検出可能に標識された抗プリオン抗体もしくは他のプリオン結合試薬を使用して検出され得る。この抗体またはプリオン結合試薬は、プリオンの病原型に特異的である必要はない。
この実施形態の別の局面において、プリオン結合試薬が、固体支持体上に提供され、そして病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンがプリオン結合試薬に結合し得る条件下で、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと接触させる。未結合サンプル物質が除去され得、そして病原性プリオンがペプチド試薬に結合したままの状態か、またはペプチド試薬からの解離後のいずれかで検出され得る。病原性プリオンは、本発明の１個以上の検出可能に標識されたペプチド試薬を使用して検出され得る。
この実施形態の別の局面において、サンプル中の病原性プリオンは、固体支持体（例えば、ＥＬＩＳＡプレート）に非特異的に結合し得、そして病原性プリオンアイソフォームと優先的に相互作用する本発明の１個以上の検出可能に標識されたペプチド試薬を結合することによって検出され得る。
さらなる実施形態において、この方法は、病原性プリオンが存在する場合、ペプチド試薬が病原性プリオンに結合し得る条件下で、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと、配列番号１２〜２６０の配列を有するペプチドならびにそれらのアナログおよび誘導体からなる群から選択される１個以上のペプチド試薬とを接触させる工程；および病原性プリオンをペプチド試薬に結合することによってサンプル中の病原性プリオンの存在の有無を検出する工程を含む。好ましい実施形態において、サンプルは、配列番号１３３〜２６０の配列を有するペプチドすべてならびにそれらのアナログおよび誘導体からなる群から選択される１個以上のペプチド試薬と接触される。
なおも他の実施形態において、サンプル中の病原性プリオンを検出するための方法が提供され、その方法は、以下の工程：第１のペプチドを含む固体支持体を提供する工程、ここで、第１のペプチドは、ＰｒＰＳｃと優先的に相互作用する本明細書中で記載されるような１個以上のペプチド試薬を含み；サンプル中に病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンが第１のペプチドに結合し得る条件下で、固体支持体とサンプルとを接触させる工程；第２のペプチドが第１のペプチドによって結合された病原性プリオンに結合し得る条件下で固体支持体と検出可能に標識された第２のペプチドとを接触させる工程、ここで、第２のペプチドは、ＰｒＰＳｃタンパク質と優先的に相互作用する、本明細書中において記載される１個以上のペプチド試薬を含み；および第１のペプチドと、サンプル由来の病原性プリオンと、第２のペプチドとの間に形成される複合体を検出することによって、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出する工程を含む。
なおも他の実施形態において、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法が本明細書中に提供され、その方法は、以下の工程：プリオン結合試薬を含む固体支持体を提供する工程、ここで、プリオン結合試薬は、プリオンタンパク質と結合し；サンプル中にプリオンタンパク質が存在する場合、プリオンタンパク質がプリオン結合試薬に結合し得る条件下で、固体支持体とサンプルとを接触させる工程；固体支持体と本発明の検出可能に標識されたペプチド試薬とを接触させる工程、ここで、ペプチド試薬は、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用し；およびプリオン結合試薬と、サンプル由来の病原性プリオンと、ペプチド試薬との間で形成される複合体を検出する工程を含む。
別の実施形態において、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法が提供され、その方法は、以下の工程：本明細書中において記載されるような第１のペプチド試薬を含む固体支持体を提供する工程、ここで、第１のペプチド試薬は、病原型と優先的に相互作用し；検出可能に標識されたペプチド試薬−リガンド複合体の形成を可能にする条件下で、固体支持体と検出可能に標識された第１のリガンド（例えば、プラスミノゲン、ラミニンレセプターおよびヘパラン硫酸）とを接触させる工程、ここで、検出可能に標識された第１のリガンドに対する第１のペプチド試薬の結合親和性は、病原性プリオンに対する第１のペプチド試薬の結合親和性よりも弱く；サンプル中に病原性プリオンが存在するとき、病原性プリオンが第１のペプチド試薬に結合し得、そして第１のリガンドを置換し得る条件下で、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと、固体支持体とを接触させる工程；および固体支持体上の検出可能に標識されたリガンドの減少によってサンプル中の病原性プリオンの存在を検出する工程を含む。
病原性プリオンの検出の上記の方法のいずれかは、プリオン関連疾患を診断するための方法において使用することができる。
本発明はまた、病原性プリオンを単離するための方法を提供し、この方法は、以下の工程：本発明の１個以上のペプチド試薬を含む固体支持体を提供する工程、病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンがペプチド試薬に結合し得る条件下で、固体支持体と、病原性プリオンを含むことが知られているサンプルまたは病原性プリオンを含むと疑われるサンプルとを接触させる工程；および任意の未結合サンプル物質を除去する工程を含む。さらなる実施形態は、結合した病原性プリオンをペプチド試薬から解離する工程および必要に応じて、解離された病原性プリオンを回収する工程をさらに含む。
本発明はまた、サンプルから病原性プリオンを除去するための方法を提供し、その方法は、以下の工程：本発明の１個以上のペプチド試薬を含む固体支持体を提供する工程、病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンがペプチド試薬に結合し得る条件下で、固体支持体と、病原性プリオンを含むことが知られているサンプルまたは病原性プリオンを含むと疑われるサンプルとを接触させる工程；および未結合サンプル物質を回収する工程を含む。
本発明の１個以上のペプチド試薬を含む固体支持体を提供する前述のすべての実施形態において、ペプチド試薬が固体支持体に結合する前にペプチド試薬がサンプルと接触されるという代替の実施形態が、企図される。これらの実施形態において、ペプチド試薬は、結合対の１つのメンバーを含み、そして固体支持体は、結合対の第２のメンバーを含む。例えば、本発明のペプチド試薬は、ビオチンを含み得るか、またはビオチンを含むように改変され得る。ビオチン化ペプチド試薬は、ペプチド試薬が病原性プリオンに結合し得る条件下で、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと接触される。次いで、アビジンまたはストレプトアビジンを含む固体支持体は、ビオチン化ペプチド試薬と接触される。他の適当な結合対は、本明細書中において記載される。
本明細書中において記載される固体支持体を使用する方法のいずれかにおいて、固体支持体は、例えば、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、ポリビニルフルオライド、ジアゾ化ペーパー、ナイロン膜、活性化ビーズおよび／または磁気的反応性ビーズ、ポリ塩化ビニル；ポリプロピレン、ポリスチレンラテックス、ポリカーボネート、ナイロン、デキストラン、キチン、砂、シリカ、軽石、アガロース、セルロース、ガラス、金属、ポリアクリルアミド、ケイ素、ゴム、多糖類；ジアゾ化ペーパー；活性化ビーズ、磁気的反応性ビーズならびに固相合成、アフィニティー分離、精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイおよび他のこのような適用に通常使用される任意の物質であり得る。支持体は、粒子状であり得るか、または連続的な表面の形態であり得、それらとしては、膜、メッシュ、プレート、小球、スライド、円板、毛細管、中空糸、針、ピン、チップ、固体繊維、ゲル（例えば、シリカゲル）およびビーズ（例えば、孔−ガラスビーズ、シリカゲル、必要に応じてジビニルベンゼンで架橋されたポリスチレンビーズ、グラフト化された共重合ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、必要に応じてＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンで架橋されたジメチルアクリルアミドビーズ、酸化鉄磁気ビーズおよび疎水性ポリマーでコートされたガラス粒子が挙げられる。
さらに、本明細書中において記載される方法のいずれかの方法において、サンプルは、生物学的サンプル、すなわち、生存生物体またはかつて生存していた生物体、例えば、器官、全血、血液画分、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋組織、骨髄、尿、涙、非神経系組織、器官および／またはバイオプシーもしくはネクロプシーから得られたサンプルまたはそれらから誘導されるサンプルであり得る。好ましい実施形態において、生物学的サンプルは、血液、血液画分または血液成分を含む。サンプルは、非生物学的サンプルであってもよい。
別の局面において、本発明は、本明細書中において記載される検出方法のいずれかによって、被験体由来の生物学的サンプル中の病原性プリオンの存在を検出することによって前記被験体におけるプリオン関連疾患を診断する方法を提供する。
別の局面において、本発明は、実質的に病原性プリオンを含まない血液供給物を調製する方法を含み、この方法は、以下の工程；本明細書中において記載される方法のいずれかによって、回収された血液サンプルから血液（例えば、全血、血漿、血小板または血清）のアリコートをスクリーニングする工程；病原性プリオンが検出された任意のサンプルを排除する工程；および病原性プリオンが検出されなかったサンプルを混合することにより、実質的に病原性プリオンを含まない血液供給物を提供する工程を含む。
さらに別の局面において、本発明は、実質的に病原性プリオンを含まない食品供給物、特に、食肉供給物（例えば、ヒトまたは動物の消費用に使用される牛肉、子羊肉、成羊肉または豚肉）を調製する方法を含み、この方法は、本明細書中において記載される検出の方法のいずれかを使用して、食品供給物に入る生存生物体もしくは死亡生物体から回収されたサンプルまたは食品供給物に投入すると意図される食物から回収されたサンプルをスクリーニングする工程；病原性プリオンが検出されるサンプルを同定する工程；および病原性プリオンが検出されたサンプル中の、任意の生存生物体もしくは死亡生物体または食品供給物に投入すると意図される食物を食品供給物から除去する工程；それによって、実質的に病原性プリオンを含まない食品供給物を提供する工程を含む。
別の局面において、本発明は、本明細書中において記載されるような１個以上のペプチド試薬を含む固体支持体を含む。固体支持体は、とりわけ、サンプル中の病原性プリオンタンパク質を検出するため、サンプルからプリオンタンパク質を単離するため、およびサンプルから病原性プリオンタンパク質を排除するための本発明の方法において使用され得る。固体支持体は、上で記載したとおりであり得る。
別の局面において、本発明は、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するため、サンプルから病原性プリオンを単離するため、サンプルから病原性プリオンを排除するための様々なキットを含み、このキットは、本明細書中において記載されるペプチド試薬の１個以上；および／または本明細書中において記載されるペプチド試薬の１個以上を含む固体支持体のいずれかならびに他に必要な試薬および必要であれば、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを備える。ペプチド試薬は、検出可能に標識され得る。
他の局面において、本明細書中において記載される、ペプチド試薬、ポリヌクレオチドおよび／または抗体の１個以上を含む組成物が、本明細書中に提供される。
さらなる局面において、プリオン病を処置するか、または予防する方法が提供され、その方法は、例えば、本明細書中において記載される１個以上の組成物を動物（例えば、非ヒト哺乳動物またはヒト哺乳動物）に投与する工程を含む。他の実施形態において、その方法は、初回刺激工程において、本明細書中において記載される組成物のいずれかを含む第１の組成物を投与する工程および本明細書中において記載される組成物のいずれかを含む第２の組成物を追加免疫として、例えば、被験体において免疫応答を誘発するのに十分な量で投与する工程を含む。その組成物は、筋肉内、粘膜内、鼻腔内、皮下、皮内、経皮的、膣内、直腸内、経口的および／または静脈内に投与され得る。
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態は、本明細書中の開示に照らして、当業者に容易に想到され得る。
（詳細な説明）
本発明は、比較的小さいペプチド（５０〜１００アミノ酸長未満、好ましくは、５０アミノ酸長未満およびなおもさらに好ましくは、約３０アミノ酸長未満）が、非病原性プリオンタンパク質と病原性プリオンタンパク質とを識別するために使用され得るという驚くべき、予想外の発見に関する。すなわち、本開示は、これらのペプチドおよびそれらの誘導体（ひとまとめにして「ペプチド試薬」）が、異なる特異性および／または親和性で、病原性タンパク質および非病原性タンパク質の形態と結合し得るので、診断試薬／検出試薬として、または治療的組成物の成分としてそれ自体で使用され得るという驚くべき知見に関する。本開示より以前は、大型分子（例えば、抗体、ＰｒＰＣ、α型ｒＰｒＰおよびプラスミノゲン）だけが、病原型および非病原型を区別するために使用することができると考えられていた。同様に、以前に報告されていた抗原性ペプチドは、病原型と非病原型とを識別する能力について評価された抗体を作製するために使用されていた。しかしながら、プリオンタンパク質が比較的非免疫原性であるという性質に起因して、病原型に特異的な抗体を作製することが困難であると証明されていた。例えば、Ｒ．Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ Ｔｏｏｌｓ ｔｏ Ｐｒｏｂｅ Ｐｒｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ” ｉｎ ＰＲＩＯＮ ＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＤＩＳＥＡＳＥＳ，ｅｄ．Ｓ．Ｐｒｕｓｉｎｅｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９，ｐｐ：７１７−７４１を参照のこと。
本明細書中で記載されるような特定のペプチドが、病原性の（ＰｒＰＳｃ）プリオンタンパク質と優先的に相互作用するという発見により、とりわけ、診断、検出アッセイおよび治療のための新規試薬の開発が可能となった。従って、本発明は、ペプチド試薬に関し、さらに、これらのペプチド試薬を利用する検出アッセイおよび診断アッセイ、精製またはこれらのペプチド試薬を利用する単離方法およびこれらのペプチド試薬を含む治療的組成物に関する。これらのペプチド試薬をコードするポリヌクレオチドおよびこれらのペプチド試薬を使用して作製される抗体もまた提供される。本明細書中において記載されるペプチド試薬、ポリヌクレオチドおよび／または抗体は、例えば、生物学的サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための組成物および方法において有用である。さらに、本発明は、このようなペプチド試薬、抗体および／またはポリヌクレオチドを治療的組成物または予防的組成物中の成分として使用する方法にさらに関する。
本発明において使用されるペプチド試薬（およびこれらのペプチド試薬をコードするポリヌクレオチド）は、非病原性アイソフォームと比較して、病原性アイソフォームと優先的に相互作用するペプチドを含む。例えば、特定の実施形態において、本明細書中で記載されるようなペプチド試薬は、病原性のコンホメーション病タンパク質型に特異的に結合し、そして非病原型に結合しない（またはそれほど結合しない）。本明細書中において記載されるペプチド試薬（および同じものをコードするポリヌクレオチド）は、例えば、抗体を作製するために使用され得る。これらの抗体は、病原型、非病原型またはその両方を認識し得る。これらの分子は、診断アッセイおよび／または予防的組成物もしくは治療的組成物において単独または様々な組み合わせで有用である。
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を利用する。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ ＣＣ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，１９９９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍら、ｅｄｓ．，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）；ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ），２ｎｄ ｅｄ．（Ｎｅｗｔｏｎ ＆ Ｇｒａｈａｍ ｅｄｓ．，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；Ｐｅｔｅｒｓ ａｎｄ Ｄａｌｒｙｍｐｌｅ，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２ｄ ｅｄ），Ｆｉｅｌｄｓら、（ｅｄｓ．），Ｂ．Ｎ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照のこと。
本発明のペプチド試薬、抗体および方法は、特定の形式またはプロセスパラメータに制限されず、当然のことながら、変化し得ることが理解される。本明細書中で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を記述する目的だけのものであり、限定すると意図されないことも理解されるべきである。
本明細書中で引用されるすべての出版物、特許および特許出願は、それらの全体が、本明細書中で参考により援用される。
（Ｉ．定義）
本発明の理解を促すために、本出願において使用される、選ばれた用語について、以下に記述する。
用語「プリオン」、「プリオンタンパク質」、「ＰｒＰタンパク質」および「ＰｒＰ」は、本明細書中で交換可能に使用され、病原性タンパク質型（スクレイピータンパク質、病原性タンパク質型、病原性アイソフォーム、病原性プリオンおよびＰｒＰＳｃと様々な呼ばれ方をする）と非病原型（細胞性タンパク質型、細胞性アイソフォーム、非病原性アイソフォーム、非病原性プリオンタンパク質およびＰｒＰＣと様々な呼ばれ方をする）の両方ならびに変性型および病原性コンホメーションまたは正常な細胞性コンホメーションのいずれかを有しなくてもよいプリオンタンパク質の様々な組換え型のことをいう。病原性タンパク質型は、ヒトおよび動物における疾患状態（海綿状脳症）に関連し；非病原型は、動物細胞に通常存在し、そして適切な条件下で、病原性のＰｒＰＳｃコンホメーションに変換され得る。プリオンは、ヒト、ヒツジ、ウシおよびマウスを含む多岐にわたる哺乳動物種において天然に産生される。ヒトプリオンタンパク質の代表的なアミノ酸配列を、配列番号１として示す。マウスプリオンタンパク質の代表的なアミノ酸配列を配列番号２として示す。他の代表的な配列を、図２に示す。
本明細書中で使用されるとき、用語「病原性」とは、そのタンパク質が、疾患を実際に引き起こすことを意味し得るか、またはそのタンパク質が、疾患に関連するがゆえに、疾患が存在するときに存在することを単純に意味し得る。従って、本開示に関連して使用されるような病原性タンパク質は、必ずしも、疾患の特異的な原因物質であるタンパク質ではない。病原型は、伝染性であってもよいし、伝染性でなくてもよい。用語「病原性プリオン型」は、より具体的には、哺乳動物、鳥類または組換えのプリオンタンパク質のコンホメーションおよび／またはベータシートリッチなコンホメーションのことをいうために使用される。一般に、ベータシートリッチなコンホメーションは、プロテイナーゼＫ耐性である。コンホメーション病タンパク質型に関して使用されるとき、用語「非病原性」および「細胞性」は、交換可能に使用され、その存在が疾患に関連しないタンパク質の正常アイソフォームのことをいう。
さらに、「プリオンタンパク質」または「コンホメーション病タンパク質」は、本明細書中で使用されるとき、本明細書中において記載されるものに対して正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。これらの用語が、同定された種もしくは未同定の種または同定された疾患もしくは未同定の疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病など）のいずれかに由来するコンホメーション病タンパク質を包含することは、容易に明らかとなる。本開示および当該分野の教示を考慮して当業者は、例えば、配列比較プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴおよび本明細書中において記載される他のもの）または構造的な特徴またはモチーフの同定およびアラインメントを使用して、他の任意のプリオンタンパク質における、図に示された配列に対応する領域を決定することができる。
用語「ＰｒＰ遺伝子」は、既知の多型および病原性の変異を含むプリオンタンパク質を発現する任意の遺伝物質を記述するために本明細書中において使用される。用語「ＰｒＰ遺伝子」とは、一般に、ＰｒＰタンパク質の任意の形態をコードする任意の種の任意の遺伝子のことをいう。通常知られているいくつかのＰｒＰ配列は、Ｇａｂｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９０９７−９１０１（１９９２）ならびにこのような配列を開示および記載するために本明細書中において参考により援用される、米国特許第５，５６５，１８６号；同第５，７６３，７４０号；同第５，７９２，９０１号；およびＷＯ９７／０４８１４に記載されている。ＰｒＰ遺伝子は、本明細書中において記載される「宿主」動物および「試験」動物を含む任意の動物由来であり得、そして任意の多型およびすべての多型ならびにそれらの変異であり得、これらの用語は、まだ発見されていない他のこのようなＰｒＰ遺伝子を含むと認識される。このような遺伝子によって発現されるタンパク質は、ＰｒＰＣ（非疾患）型またはＰｒＰＳｃ（疾患）型のいずれかを仮定し得る。
「プリオン関連疾患」とは、本明細書中で使用されるとき、病原性プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）によって全体的または部分的に引き起こされる疾患のことをいう。プリオン関連疾患としては、スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、狂牛病、ネコ海綿状脳症、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、新変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｎｖＣＪＤ）、慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。
用語「ペプチド試薬」とは、本明細書中で使用されるとき、一般に、アミノ酸またはアミノ酸様分子の天然に存在するポリマーまたは合成ポリマーを含む任意の化合物のことをいい、それらとしては、アミノ分子および／またはイミノ分子のみを含む化合物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のペプチド試薬は、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用し、代表的には、プリオンタンパク質のフラグメントから誘導される。用語「ペプチド」は、「オリゴペプチド」または「ポリペプチド」と交換可能に使用され、そしてこれらの用語の使用によって、特定の大きさを意味しない。例えば、アミノ酸（例えば、天然でないアミノ酸、ペプトイドなどを含む）の１個以上のアナログを含むペプチド、置換された結合を含むペプチドおよび当該分野で公知の他の改変（天然に存在する改変および天然に存在しない改変（例えば、合成）の両方）が、この定義内に含まれる。従って、合成ペプチド、二量体、多量体（例えば、タンデム反復、複数の抗原性ペプチド（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＭＡＰ）型、直鎖的に連結されたペプチド）、環化分子、分枝分子などが、この定義内に含まれる。これらの用語はまた、１個以上のＮ置換グリシン残基（「ペプトイド」）および他の合成アミノ酸またはペプチドを含む分子を含む。（例えば、ペプトイドの説明について、米国特許５，８３１，００５号；同第５，８７７，２７８号；および同第５，９７７，３０１号；Ｎｇｕｙｅｎら、（２０００）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．７（７）：４６３−４７３；およびＳｉｍｏｎら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９（２０）：９３６７−９３７１を参照のこと）。本発明における使用に適したペプチドの非限定的な長さとしては、３〜５残基長、６〜１０残基長（またはそれらの間の任意の整数）、１１〜２０残基長（またはそれらの間の任意の整数）、２１〜７５残基長（またはそれらの間の任意の整数）、７５〜１００（またはそれらの間の任意の整数）のペプチドまたは１００残基長より長いポリペプチドが挙げられる。代表的には、本発明において有用なペプチドは、意図される用途に適した最大の長さを有し得る。好ましくは、そのペプチドは、約３残基長〜約１００残基長である。一般に、当業者は、本明細書中の定義を考慮して、最大の長さを容易に選択することができる。さらに、本明細書中において記載されるようなペプチド試薬、例えば、合成ペプチドは、付加的な分子（例えば、標識、リンカーまたは他の化学部分（例えば、ビオチン、アミロイド特異的色素（例えば、Ｃｏｎｔｒｏｌ ＲｅｄまたはＴｈｉｏｆｌａｖｉｎ））を含み得る。このような部分は、さらに、ペプチドとプリオンタンパク質との相互作用および／またはプリオンタンパク質のさらなる検出を促進し得る。
ペプチド試薬はまた、１個以上の天然に存在しないアミノ酸を含む、１個以上の置換、付加および／または欠失を有する本発明のアミノ酸配列の誘導体を含む。好ましくは、誘導体は、任意の野生型配列または参照配列と少なくとも約５０％の同一性を示し、好ましくは、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは、本明細書中において記載される任意の野生型配列または参照配列と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％の配列同一性を示す。配列（またはパーセント）同一性は、以下に記載するように決定することができる。このような誘導体は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などを含み得る。
ペプチド誘導体はまた、ポリペプチドが、所望の活性を維持する限り、天然の配列に対する改変、例えば、欠失、付加および置換（通常、本来は保存的である）を含み得る。これらの改変は、部位特異的な突然変異生成を介するような意図的なものであってもよいし、タンパク質を産生する宿主の変異またはＰＣＲ増幅による誤りを介するような偶発的なものであってもよい。さらに、改変は、以下の効果：毒性の低下；プリオンタンパク質に対する親和性および／または特異性の増大；細胞プロセシング（例えば、分泌、抗原提示など）の促進；ならびにＢ細胞および／またはＴ細胞に対する提示の促進の１個以上を有するようになされ得る。本明細書中に記載されるポリペプチドは、組換えで作製され得、合成で作製され得、天然源からか、または組織培養において精製され得る。
「フラグメント」とは、本明細書中で使用されるとき、天然に見られるような無処置の全長タンパク質および構造の部分のみからなるペプチドのことをいう。例えば、フラグメントは、タンパク質のＣ末端欠失および／またはＮ末端欠失を含み得る。代表的には、フラグメントは、そのフラグメントが誘導される全長ポリペプチド配列の機能の１つ、いくつかまたはすべてを保持する。代表的には、フラグメントは、天然タンパク質の少なくとも５個連続したアミノ酸残基；好ましくは、天然タンパク質の少なくとも約８個連続したアミノ酸残基；より好ましくは、天然タンパク質の少なくとも約１０個、約１１個、約１２個、約１３個、約１４個、約１５個、約１６個、約１７個、約１８個、約１９個、約２０個、約２１個、約２２個、約２３個、約２４個、約２５個、約２６個、約２７個、約２８個、約２９個または約３０個連続したアミノ酸残基を含み得る。
用語「ポリヌクレオチド」とは、当該分野で公知であるように、一般に核酸分子のことをいう。「ポリヌクレオチド」は、二本鎖配列および一本鎖配列の両方を含み得、そして原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡ、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ、ウイルス（例えば、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスならびにレトロウイルス）由来のゲノムＲＮＡ配列およびゲノムＤＮＡ配列、原核生物のＤＮＡまたは真核生物の（例えば、哺乳動物の）ＤＮＡならびに特に合成ＤＮＡ配列のことをいうが、これらに限定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列を示し、そして天然配列に対する欠失、付加および置換（通常、本来は保存的である）などの改変を含む。これらの改変は、部位特異的な突然変異生成を介するような意図的なものであってもよいし、プリオンをコードするポリヌクレオチドを含む宿主の変異を介するような偶発的なものであってもよい。ポリヌクレオチドの改変は、例えば、宿主細胞におけるポリペプチド産生の発現を促進する効果を含む、いくらかの効果を有し得る。
ポリヌクレオチドは、生物学的に活性な（例えば、免疫原性であるかまたは治療的な）タンパク質またはポリペプチドをコードし得る。ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの性質に依存して、ポリヌクレオチドは、例えば、そのポリヌクレオチドが抗原またはエピトープをコードする場合、１０ヌクレオチド程度に小さいポリヌクレオチドを含み得る。代表的には、ポリヌクレオチドは、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０アミノ酸またはそれ以上のアミノ酸のペプチドをコードする。
「ポリヌクレオチドコード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な制御配列（または「調節領域」）の支配下に置かれているとき、（ＤＮＡの場合）転写される核酸分子および（ｍＲＮＡの場合）インビボにおいてポリペプチドに翻訳される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列に対して３’に位置され得る。代表的な「調節領域」としては、転写制御因子（例えば、プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結シグナルおよびポリアデニル化配列）；および翻訳制御因子（例えば、翻訳の開始を最適化するための配列、例えば、シャイン‐ダルガルノ（リボソーム結合部位）配列、コザック配列（すなわち、コード配列に対して例えば、５’に位置する、翻訳を最適化するための配列）、リーダー配列（異種または天然）、翻訳開始コドン（例えば、ＡＴＧ）および翻訳終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターとしては、誘導性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、コファクター、調節タンパク質などによって誘導される場合）、抑制性プロモーター（プロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、コファクター、調節タンパク質などによって誘導される場合）および構成的プロモーターが挙げられ得る。
「作動可能に連結された」とは、そのように記載される構成要素がそれらの通常の機能を果たすように配列されるエレメントの配列のことをいう。すなわち、コード配列に作動可能に連結された所与のプロモーターは、適切な酵素が存在するとき、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる。プロモーターは、コード配列の発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続的である必要はない。すなわち、例えば、翻訳されないが、転写される介在配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてそのプロモーター配列は、なおもコード配列に「作動可能に連結された」と考えられ得る。
「組換え」核酸分子は、本明細書中で核酸分子のことを記述するために使用されるとき、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のポリヌクレオチドを意味し、それらは、その起源または操作に基づき：（１）天然に会合するポリヌクレオチドの全部または一部と会合しないポリヌクレオチド；および／または（２）天然に連結するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結しているポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関連して使用されるとき、用語「組換え」は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」および原核生物の微生物または単細胞の実態として培養される真核細胞株を意味する他の同様の用語は、交換可能に使用され、組換えベクターまたは他の転移ＤＮＡのためのレシピエントとして使用され得るか、または使用され得た細胞のことをいい、そしてトランスフェクトされたもとの細胞の子孫を含む。単一の親細胞の子孫は、偶発的または意図的な変異に起因して、形態学においてか、またはもとの親に相補的なゲノムＤＮＡもしくは全ＤＮＡにおいて、必ずしも完全に同一である必要はないことが理解される。関連する特性（例えば、所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）によって特徴付けられ、親と十分に似ている親細胞の子孫は、この定義によって意図される子孫に含まれ、また、上記の用語によって網羅される。
「単離された」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのことをいうとき、天然に見られる示された分子が、生物体全てから分離し、孤立していることまたは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然に見られないとき、それらが、他の生物学的高分子を十分に含まないことを意味し、その結果、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その意図された目的に使用することができる。
「抗体」は、当該分野で公知であるように、化学的または物理的な手段を介して、目的のポリペプチドのエピトープに結合し得るか、またはそれに会合し得る１個以上の生物学的部分を含む。例えば、本発明の抗体は、病原性プリオンコンホメーションと優先的に相互作用し得る（例えば、特異的に結合し得る）。用語「抗体」は、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方ならびに以下のものから得られる抗体を含む：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有結合性ヘテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒら、（１９７２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈら、（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１−４０９６を参照のこと）；一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８９７−５８８３を参照のこと）；二量体および三量体の抗体フラグメント構築物；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、Ｐａｃｋら、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら、（１９９２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４９Ｂ：１２０−１２６を参照のこと）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６；および１９９４年９月２１日に公開された英国特許出願番号ＧＢ２，２７６，１６９を参照のこと）；ならびにこのような分子から得られる任意の機能的フラグメント（ここで、このようなフラグメントは、親抗体分子の免疫学的結合特性を保持する）。用語「抗体」は、さらに、ファージディスプレイなどの非従来的なプロセスを介して得られる抗体を含む。
本明細書中で使用されるとき、用語「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体集団を有する抗体組成物のことをいう。この用語は、抗体の種または起源に関して制限せず、また、抗体が作製される様式によって制限されると意図されない。すなわち、この用語は、マウスのハイブリドーマから得られる抗体ならびにマウスのハイブリドーマだけでなく、ヒトを使用して得られるヒトモノクローナル抗体を包含する。例えば、Ｃｏｔｅ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，１９８５，ｐ７７を参照のこと。
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択される哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）は、一般に免疫原性の組成物（例えば、本明細書中において記載されるようなペプチド試薬）で免疫される。免疫された動物から血清を回収し、公知の手順に従って処理する。選択されたペプチド試薬に対するポリクローナル抗体を含む血清が、他の抗原に対する抗体を含んでいる場合、ポリクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製され得る。ポリクローナル抗血清を作製するためおよび処理するための技術は、当該分野で公知であり、例えば、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）を参照のこと。
当業者はまた、本明細書中において記載されるペプチド試薬に対して特異的なモノクローナル抗体を容易に作製することができる。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法論が周知である。不死化された抗体産生細胞株は、細胞融合および他の技術（例えば、癌化ＤＮＡによるＢリンパ球の直接的な形質転換またはエプスタイン・バーウイルスによるトランスフェクション）によって作製され得る。例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、（１９８０）ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、（１９８１），ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＡＮＤ Ｔ−ＣＥＬＬ ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ；Ｋｅｎｎｅｔｔら、（１９８０）ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳを参照のこと；また、米国特許第４，３４１，７６１号；同第４，３９９，１２１号；同第４，４２７，７８３号；同第４，４４４，８８７号；同第４，４６６，９１７号；同第４，４７２，５００号；同第４，４９１，６３２号；および同第４，４９３，８９０号を参照のこと。
本明細書中で使用されるとき、「単一ドメイン抗体」（ｄＡｂ）は、指摘された抗原に特異的に結合するＶＨドメインから構成される抗体である。ｄＡｂは、ＶＬドメインを含まないが、抗体に存在すると知られている他の抗原結合ドメイン、例えば、カッパードメインおよびラムダドメインを含み得る。ｄａｂを調製するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４（１９８９）を参照のこと。
抗体はまた、ＶＨドメインおよびＶＬドメインならびに他の公知の抗原結合ドメインから構成され得る。これらのタイプの抗体およびそれらの調製方法の例は、当該分野で公知であり（例えば、本明細書中において参考として援用される米国特許第４，８１６，４６７号を参照のこと）、そして以下のものが挙げられる。例えば、「脊椎動物抗体」とは、通常「Ｙ」形に凝集され、そしてそれらの鎖の間に共有結合を有し得るか、または有し得ない、軽鎖および重鎖を含む、四量体であるか、またはそれらの凝集物である抗体のことをいう。脊椎動物抗体において、鎖のアミノ酸配列は、脊椎動物において、インサイチュまたはインビトロのいずれかで（例えば、ハイブリドーマにおいて）産生される抗体に見られるそれらの配列と相同である。脊椎動物抗体としては、例えば、精製されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が挙げられ、それらの調製方法は、下に記載される。
「ハイブリッド抗体」は、鎖が哺乳動物の抗体鎖に関して別個に相同であり、そしてそれらの新規の集合物を代表する抗体であり、これにより、２つの異なる抗原が四量体または凝集物によって沈殿可能である。ハイブリッド抗体において、一対の重鎖および軽鎖は、第１の抗原に対して産生される抗体に見られるものと相同であり、第２の対の鎖は、第２の抗体に対して産生される抗体に見られるものと相同である。これにより、「二価性」、すなわち、同時に２つの抗原と結合する能力という特性が生じる。このようなハイブリッドはまた、以下に示されるように、キメラ鎖を使用して形成され得る。
「キメラ抗体」とは、重鎖および／または軽鎖が融合タンパク質である抗体のことをいう。代表的には、鎖のアミノ酸配列の一部分が、特定の種または特定のクラスに由来する抗体における対応配列と相同であり、鎖の残りのセグメントが、別の種および／またはクラスに由来する配列と相同である。通常、軽鎖と重鎖の両方の可変領域は、脊椎動物の１つの種に由来する可変領域または抗体を模倣するが、定常部分は、脊椎動物の別の種に由来する抗体における配列に相同である。しかしながら、この定義は、この特定の例に限定されない。重鎖または軽鎖のいずれかまたはその両方が様々な起源の抗体における配列を模倣する配列の組み合わせから構成される任意の抗体もまた含まれ、これらの起源は、起源の異なるクラスまたは異なる種由来であってもよく、そして融合点が、可変／定常の境界であっても、なくてもよい。すなわち、定常領域も可変領域も、公知の抗体配列を模倣しない抗体を産生することが可能である。次いで、例えば、その可変領域が特定の抗原に対して高い特異的な親和性を有するか、もしくはその定常領域が高い補体結合を誘発し得る抗体を構築すること、または特定の定常領域によって保有される特性を他に改善することができるようになる。
別の例は、「改変抗体」であり、脊椎動物抗体に天然に存在するアミノ酸配列が変更されている抗体のことをいう。組換えＤＮＡ技術を利用して、抗体は、所望の特性を得るために再設計され得る。可能な改変は、多く、１個以上のアミノ酸の変更から、領域、例えば、定常領域の完全な再設計までにわたる。一般に、所望の細胞内プロセス特性を獲得するための定常領域における変更は、例えば、補体結合の変更、膜との相互作用の変更および他のエフェクター機能の変更である。可変領域における変更は、抗原結合特性を変更するためになされ得る。その抗体はまた、特定の細胞または組織部位に分子または物質を特異的に送達することを促進するように操作され得る。所望の変更は、分子生物学における公知の技術、例えば、組換え技術、部位特異的な突然変異生成などによってなされ得る。
なおも別の例は、第２の重鎖のＦｃ（すなわち、幹）領域に結合する重鎖／軽鎖二量体から構成される凝集物である、「一価の抗体」である。このタイプの抗体は、抗原変調を免れる。例えば、Ｇｌｅｎｎｉｅら、Ｎａｔｕｒｅ ２９５：７１２（１９８２）を参照のこと。抗体の「Ｆａｂ」フラグメントは、抗体のこの定義内に含まれる。「Ｆａｂ」領域とは、重鎖および軽鎖の分枝部分を含む配列とおよそ等価であるか、または類似であり、そして特定された抗原に対して免疫学的な結合を示すことが証明されているが、エフェクターであるＦｃ部分を欠く、重鎖および軽鎖の部分のことをいう。「Ｆａｂ」は、１本の重鎖および１本の軽鎖（通常Ｆａｂ’として知られる）の凝集物ならびに２Ｈ鎖および２Ｌ鎖を含む四量体（Ｆ（ａｂ）２とよばれる）を含み、それは、指摘された抗原または抗原ファミリーと選択的に反応することができる。Ｆａｂ抗体は、上で記載されたもの、すなわち、「脊椎動物Ｆａｂ」、「ハイブリッドＦａｂ」、「キメラＦａｂ」および「改変Ｆａｂ」と類似のサブセットに分けられ得る。抗体のＦａｂフラグメントを作製する方法は、当該分野で公知であり、それらとしては、例えば、タンパク質分解および組換え技術による合成が挙げられる。
「抗原−抗体複合体」とは、抗原上のエピトープに特異的に結合した抗体によって形成される複合体のことをいう。
ペプチド（またはペプチド試薬）は、そのペプチドが特異的、非特異的に結合する場合、または特異的および非特異的な結合のいくつかの組み合わせにおいて、別のペプチドまたはタンパク質と「相互作用する」といわれる。ペプチド（またはペプチド試薬）が、非病原性アイソフォームよりも病原型に対して高い親和性および／または高い特異性によって結合する場合、病原性プリオンタンパク質と「優先的に相互作用する」といわれる。病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用するペプチド試薬はまた、病原性プリオンに特異的なペプチド試薬と本明細書中で呼ばれる。優先的な相互作用が各ペプチドの特定のアミノ酸残基間および／またはモチーフ間の相互作用を必ずしも必要としないことが理解されるべきである。例えば、特定の実施形態において、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、病原性アイソフォームと優先的に相互作用するが、それでもなお、弱いが、なお検出可能なレベル（例えば、目的のポリペプチドに対して示される結合の１０％以下）で非病原性アイソフォームと結合することができる場合がある。代表的には、弱い結合またはバックグラウンド結合は、例えば、適切なコントロールを使用することによって、目的の化合物またはポリペプチドとの優先的な相互作用と容易に識別可能である。一般に、本発明のペプチドは、１０６倍過剰の非病原型の存在下で病原性プリオンと結合する。
用語「親和性」とは、結合の強度のことをいい、解離定数（Ｋｄ）として量的に表すことができる。好ましくは、病原性アイソフォームと優先的に相互作用するペプチド（またはペプチド試薬）は、好ましくは、非病原性アイソフォームと相互作用する場合よりも、少なくとも２倍高い親和性、より好ましくは、少なくとも１０倍高い親和性、およびなおもより好ましくは、少なくとも１００倍高い親和性で病原性アイソフォームと相互作用する。結合親和性（すなわち、Ｋｄ）は、標準的な技術を使用して決定され得る。
アミノ酸配列の「類似性」または「同一性パーセント」を決定するための技術は、当該分野で周知である。一般に、「類似性」とは、アミノ酸が、同一であるか、または電荷もしくは疎水性などの類似の化学的および／または物理的特性を有している場合の適切な位置における２個以上のポリペプチドのアミノ酸とアミノ酸との比較を意味する。いわゆる「同一性パーセント」は、比較されるポリペプチド配列間において決定され得る。核酸配列およびアミノ酸配列の同一性を決定するための技術もまた、当該分野で周知であり、その遺伝子に対するｍＲＮＡ（通常、ｃＤＮＡ中間体を介して）のヌクレオチド配列を決定することおよびそれによってコードされるアミノ酸配列を決定することおよび第２のアミノ酸配列とこの配列を比較することを含む。一般に、「同一性」とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチド配列または２つのポリペプチド配列の、正確なヌクレオチドとヌクレオチドとの対応または正確なアミノ酸とアミノ酸との対応のことをいう。
２つ以上のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列は、それらの「同一性パーセント」を決定することによって比較され得る。同一性パーセントは、２つの配列（参照配列および参照配列に対する未知の％同一性を有する配列）をアラインメントし、アラインメントされた２つの配列間のマッチの正確な数を数え、参照配列の長さで割り、そしてその結果に１００を掛けることによって、それら２つの分子間の配列情報を直接比較することによって決定され得る。容易に入手可能なコンピュータプログラム、例えば、ペプチド解析のためにＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９，１９８１の局所的な相同性アルゴリズムを採用したＡＬＩＧＮ（Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｄ．，５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）は、その解析を促進するために使用され得る。ヌクレオチド配列同一性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム（これらもまた、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに基づく）として入手可能である。これらのプログラムは、製造者によって推奨され、上で述べたＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに基づいて記述されているデフォルトパラメータをすぐに利用する。例えば、特定のヌクレオチド配列と参照配列との同一性パーセントは、デフォルトのスコア表および６ヌクレオチド位置のギャップペナルティを用いて、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
本発明に関して、同一性パーセントを確立する別の方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈによって著作権保護されているＭＰＳＲＣＨＴＭパッケージプログラムを使用することであり、また、数多くの情報源、例えば、インターネット上から入手可能である。この一連のパッケージから、デフォルトパラメータをスコア表（例えば、ギャップオープンペナルティ＝１２、ギャップ伸長ペナルティ＝１およびギャップ＝６）に対して使用する場合に、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用することができる。これらのデータから、生成される「マッチ」値は、「配列同一性」を反映する。配列間の同一性パーセントまたは類似性を算出するための他の適当なプログラムは、一般に当該分野で公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いて使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータ：遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ディスクリプション＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲを用いて使用され得る。これらのプログラムの詳細は、容易に入手可能である。
「免疫原性の組成物」とは、本明細書中で使用されるとき、被験体への組成物の投与が、被験体における体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答を発生させる場合の任意の組成物（例えば、ペプチド、抗体および／またはポリヌクレオチド）のことをいう。免疫原性の組成物は、レシピエント被験体に直接的な投与経路（例えば、注入、吸入、経口、鼻腔内または他の任意の非経口的または粘膜（例えば、直腸内にまたは膣内））によって導入され得る。
「エピトープ」とは、特定のＢ細胞および／またはＴ細胞が反応する抗原上の部位を意味し、このようなエピトープを含む分子は、免疫学的反応を誘発することができるか、または生物学的サンプル中に存在する抗体と反応することができる。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定基部位」と交換可能に使用される。エピトープは、エピトープに特有の空間的なコンホメーションにおいて３以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５個のこのようなアミノ酸からなり、より一般には、少なくとも８〜１０個のこのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的なコンホメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、それらとしては、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴が挙げられる。さらに、所与のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して（例えば、疎水性の研究の使用および部位特異的血清学によって）容易に達成される。Ｇｅｙｓｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８４）８１：３９９８−４００２（所与の抗原における免疫原性のエピトープの位置を決定するための迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定するためおよび化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８６）２３：７０９−７１５（所与の抗体に対して親和性の高いペプチドを同定するための技術）も参照のこと。同じエピトープを認識する抗体は、一方の抗体が、他方の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力を示すという単純なイムノアッセイにおいて同定され得る。
「免疫学的応答」または「免疫応答」は、本明細書中で使用されるとき、ポリペプチドが、ワクチン組成物中に存在する場合、被験体において、本明細書中で記載されるようなペプチドに対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答が発生することである。これらの抗体はまた、感染性を中和し、そして／または抗体−補体細胞傷害性または抗体依存性細胞傷害性を媒介することにより、免疫された宿主を保護し得る。免疫学的応答性は、当該分野で周知の競合アッセイなどの標準的なイムノアッセイにおいて測定され得る
「遺伝子導入」または「遺伝子送達」とは、宿主細胞に目的のＤＮＡを確かに挿入するための方法またはシステムのことをいう。このような方法は、組み込まれていない導入されたＤＮＡの一過性の発現、染色体外の複製および導入されたレプリコン（例えば、エピソーム）の発現または導入された遺伝物質の宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組み込みをもたらし得る。遺伝子送達発現ベクターとしては、アルファウイルス、ポックスウイルスおよびワクシニアウイルス由来のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。免疫するために使用されるとき、このような遺伝子送達発現ベクターは、ワクチンまたはワクチンベクターと呼ばれることがある。
用語「サンプル」とは、生物学的サンプルおよび非生物学的サンプルを含む。生物学的サンプルは、生存生物体またはかつて生存していた生物体から得られたものまたはそれら由来のものである。非生物学的サンプルは、生存生物体またはかつて生存していた生物体に由来しない。生物学的サンプルとしては、動物（生存しているか、または死亡している）に由来するサンプル、例えば、器官（例えば、脳、肝臓、腎臓など）、全血、血液画分、血漿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、涙、組織、器官、バイオプシーが挙げられるが、これらに限定されない。非生物学的サンプルの例としては、医薬品、食品、化粧品などが挙げられる。
用語「標識」および「検出可能な標識」とは、検出できる分子のことをいい、それらとしては、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、化学発光物質、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチンまたはハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。用語「蛍光物質」とは、検出可能な範囲において蛍光を示すことができる物質またはその一部のことをいう。本発明で使用され得る標識の特定の例としては、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、アクラジマムエステル（ａｃｒａｄｉｍｕｍ ｅｓｔｅｒ）、ＮＡＤＰＨ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびウレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。標識はまた、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ−Ｈｉｓタグ）、抗体または増幅可能なオリゴヌクレオチドもしくは他の方法で検出可能なオリゴヌクレオチドであり得る。
（ＩＩ．一般的な概要）
ペプチド試薬（および／またはこれらのペプチド試薬をコードするポリヌクレオチド）を含む組成物が本明細書中に記載され、そのペプチド試薬は、例えば、一方の型と優先的に相互作用するが、他方とは相互作用しないことによって、プリオンタンパク質の病原性アイソフォームと非病原性アイソフォームとを識別することができる。これらのペプチド試薬を使用して作製される抗体だけでなくこれらのペプチド試薬および／または抗体を含む組成物ならびに（例えば、病原性プリオンタンパク質の単離および／または検出のために）これらのペプチド試薬および／または抗体を作製する方法および使用する方法がまた提供される。
本発明は、プリオンタンパク質の比較的小さいフラグメントが、プリオンの病原型と優先的に相互作用し得るという本発明者らによる発見に部分的に依存する。病原性プリオンアイソフォームと優先的に相互作用するために、これらのフラグメントは、大型のタンパク質構造または他のタイプの骨格分子の部分である必要がない。任意の特定の理論に適用するつもりはないが、おそらく、非病原性アイソフォームに存在するコンホメーションを模倣することによって、ペプチドフラグメントは、病原性プリオンアイソフォームに結合し得るが、非病原性プリオンアイソフォームとは結合し得ないコンホメーションを自然にとるようだ。コンホメーション病タンパク質の特定のフラグメントが、コンホメーション病タンパク質の病原型と優先的に相互作用するという、本明細書中ではプリオンについて証明されるこの一般的原理を、他のコンホメーション病タンパク質に容易に適用することにより、病原型と優先的に相互作用するペプチド試薬を作製することができる。フラグメントは、出発点（例えば、大きさまたは配列特性に関して）を提供するが、より望ましい特性（例えば、より高い親和性、よりよい安定性、よりよい溶解性、より低いプロテアーゼ感度、よりよい特異性、より合成しやすいなど）を備えるペプチド試薬を作製するために、そのフラグメントに多くの改変がなされ得ることは、当業者には明らかであろう。
一般に、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、プリオンタンパク質の病原型と優先的に相互作用することができる。すなわち、これらのペプチド試薬は、病原性プリオンタンパク質の存在の容易な検出を可能にし、それゆえ、実質的にいかなる生物学的サンプルまたは非生物学的サンプル（生存しているかまたは死亡後の脳、脊髄または他の神経系組織ならびに血液を含む）におけるプリオン関連疾患の診断が可能になる。
さらに、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、診断的組成物または治療的組成物および診断的方法または治療的方法に使用され得る抗体を作製するために使用され得る。特に、ペプチド試薬および／または抗体が、病原性タンパク質と優先的に相互作用する場合、それらは、例えば、秩序化、凝集または他の方法で、疾患型タンパク質を後に検出され得る状態に誘導することによって、病原性アイソフォームの存在を検出するために使用され得る。本明細書中において記載されるペプチド試薬は、血液含有サンプル中の病原型を検出することを含む種々の診断アッセイにおいて有用である。抗体および／またはペプチド試薬（またはそれらの構成要素部分の１個以上）は、検出を促進および／またはプリオンタンパク質との相互作用を増強するために標識され得るか、またはマークされ得る。
さらに、任意の適当なシグナル増幅システムを使用することにより、さらに検出を促進することができる。そのシステムとしては、シグナル増幅用の分枝ＤＮＡの使用（例えば、米国特許第５，６８１，６９７号；同第５，４２４，４１３号；同第５，４５１，５０３号；同第５，４５４７，０２５号；および同第６，２３５，４８３号を参照のこと）；ＰＣＲのような標的増幅技術の適用、ローリングサークル増幅であるＴｈｉｒｄ Ｗａｖｅ’ｓ ｉｎｖａｄｅｒ（Ａｒｒｕｄａら、２００２ Ｅｘｐｅｒｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２：４８７；米国特許第６０９０６０６号、同第５８４３６６９号、同第５９８５５５７号、同第６０９０５４３号、同第５８４６７１７号）、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡなど（米国特許第６，５１１，８０９号；ＥＰ０５４４２１２Ａ１）；および／またはイムノＰＣＲ技術（例えば、米国特許第５，６６５，５３９号：国際特許出願ＷＯ９８／２３９６２；ＷＯ００／７５６６３；およびＷＯ０１／３１０５６を参照のこと）が挙げられるがこれらに限定されない。
さらに、本明細書中において記載されるペプチド試薬および抗体は、疾患を処置または予防するために、単独または任意の組み合わせで使用され得る。
（ＩＩＩ．Ａ．ペプチド試薬）
コンホメーション病タンパク質の病原型と相互作用するペプチド試薬が本明細書中に記載される。コンホメーション病タンパク質は、本明細書中においてプリオンタンパク質によって代表される。
以下は、２個以上の異なるコンホメーションを想定する関連タンパク質を伴う疾患の非限定的なリストである。
Figure 2008529537
 さらに、上で列挙された各コンホメーション病タンパク質は、本発明によってすべて包含される様々な系統を生じる多くの改変体または変異を含む。マウスプリオンタンパク質の様々な領域および配列の機能的解析が、以下に提供される。Ｐｒｉｏｌａ（２００１）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．５７：１−２７もまた参照のこと。マウス（Ｍｏ）、ハムスター（Ｈａ）、ヒト（Ｈｕ）、トリ（Ａ）およびヒツジ（Ｓｈ）について以下に示されるものに対応する領域および残基は、標準的な手順および本明細書中の教示に従って他の種について容易に決定され得る。
Figure 2008529537
Figure 2008529537
Figure 2008529537
 プリオンタンパク質（および他のコンホメーション病タンパク質）が、同じアミノ酸配列で２つの異なる３次元コンホメーションを有することに注目すべきである。一方のコンホメーションは、疾患特性に関連し、一般に不溶性であるが、他方のコンホメーションは、疾患特性に関連せず、可溶性である。例えば、Ｗｉｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｒａｐｉｅ Ｐｒｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（６）：３５６３−３５６８（２００２）を参照のこと。プリオンタンパク質に関して例示されたが、本発明は、列挙された疾患、タンパク質および系統に限定されない。
従って、特定の局面において、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、天然に存在するタンパク質、例えば、コンホメーション病タンパク質（例えば、プリオンタンパク質）またはプリオンタンパク質に対して相同性を示すモチーフまたは配列を含むタンパク質から誘導されるアミノ酸配列を含む。特に、本発明のペプチド試薬は、代表的には、天然に存在するプリオンタンパク質から誘導される。ペプチド試薬は、好ましくは、プリオンタンパク質の特定の領域由来のアミノ酸配列から誘導される。これらの好ましい領域は、アミノ酸残基２３〜４３および８５〜１５６およびそれらの小領域からの領域におけるマウスプリオン配列（配列番号２）に関して例示される。本発明は、マウス配列から誘導されるペプチド試薬に限定されないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、シカ、ヘラジカ、ハムスターを含む任意の種のプリオン配列から本明細書中において記載されるのと類似の様式において誘導されるペプチド試薬を含む。プリオンタンパク質から誘導されるとき、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、ポリプロリンＩＩ型ヘリックスモチーフを含み得る。このモチーフは、代表的には、一般的な配列ＰｘｘＰ（例えば、配列番号１の残基１０２〜１０５）を含むが、他の配列、特にアラニンテトラペプチドが、同様にポリプロリンＩＩ型へリックスを形成すると示唆されている（例えば、Ｎｇｕｙｅｎら、Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０００ ７：４６３；Ｎｇｕｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８ ２８２：２０８８；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ−Ｓｔｅｎｎｅｒら、Ｊ，Ａｍ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００４ １２６：２７６８を参照のこと）。ＰｘｘＰ配列において、「ｘ」は、任意のアミノ酸であり得、そして「Ｐ」は、天然に存在する配列におけるプロリンであるが、本発明のペプチド試薬においては、プロリン代替物によって置換されてもよい。このようなプロリン代替物としては、通常ペプトイドと呼ばれるＮ置換グリシンが挙げられる。従って、ＰｘｘＰ配列に基づくポリプロリンＩＩ型ヘリックスを含む本発明のペプチド試薬において、「Ｐ」は、プロリン残基またはＮ置換グリシン残基を示し、そして「ｘ」は、任意のアミノ酸またはアミノ酸アナログを示す。特に好ましいＮ置換グリシンは、本明細書中において記載される。
さらに、ヒト、マウス、ヒツジおよびウシを含む多くの様々な種から産生されるプリオンタンパク質に対するポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列が知られている。これらの配列に対する改変体もまた、各種内に存在する。すなわち、本発明において使用されるペプチド試薬は、任意の種または改変体のアミノ酸配列のフラグメントまたは誘導体を含み得る。例えば、特定の実施形態において、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、図２に示される配列（配列番号３〜１１）のいずれかから誘導される。本明細書中において特に開示されるペプチド試薬の配列は、一般にマウスプリオン配列に基づくが、しかしながら、当業者は、適切である場合には、他の種から対応する配列を容易に置換し得る。例えば、ヒトの診断または治療が所望される場合、マウス配列を対応するヒト配列に置換することが容易に行える。特定の実施例において、残基約８５〜残基約１１２（例えば、配列番号３５、３６、３７、４０）の領域から誘導されるペプチド試薬において、残基１０９に対応する位置のロイシンは、メチオニンで置換され得、残基１１２に対応する位置のバリンは、メチオニンで置換され得、そして９７に対応する位置のアスパラギンは、セリンで置換され得る。同様に、ウシの診断が所望される場合、ウシのプリオン配列を反映するように、開示されたペプチド配列において適切な置換を、行ってもよい。すなわち、残基約８５〜残基約１１２の領域から誘導されるペプチド試薬についての上記の例を用いて、残基１０９に対応する位置のロイシンは、メチオニンで置換され得、そして９７に対応する位置のアスパラギンは、グリシンで置換され得る。これらの配列に対するアミノ酸の置換、欠失、付加および他の変異を含むプリオンタンパク質の誘導体もまた使用され得る。好ましくは、プリオンタンパク質配列と比較するとき、任意のアミノ酸の置換、付加および欠失は、病原型と相互作用するペプチド試薬の能力に影響しない。
たとえどんな起源が本明細書中において記載されるペプチド試薬に使用されても、これらのペプチド試薬は、公知のプリオンタンパク質に対して配列同一性を必ずしも示さないことが理解されるべきである。すなわち、本明細書中において記載されるペプチド試薬が、コンホメーション病タンパク質の病原型と優先的に相互作用する能力を保持するかぎり、それらは、天然に存在するプリオンタンパク質または本明細書中に開示される配列と比較して、１個以上のアミノ酸の置換、付加および欠失を含んでもよい。特定の実施形態において、保存的アミノ酸置換が、好ましい。保存的アミノ酸置換は、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で起きるものである。遺伝的にコードされるアミノ酸は、一般に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性＝アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時折、芳香族アミノ酸として共に分類される。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの分離した置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の分離した置換、セリンによるトレオニンの分離した置換、または構造的に関連したアミノ酸によるアミノ酸の同様の保存的置換が、生物学的活性に対する大きな影響を有しないことが、合理的に予測可能である。
天然のアミノ酸および天然でないアミノ酸アナログの任意の組み合わせが、本明細書中において記載されるペプチド試薬を作製するために使用され得ることもまた明らかであろう。遺伝子にコードされない一般に遭遇するアミノ酸アナログとしては、オルニチン（Ｏｒｎ）；アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ベンゾチオフェニルアラニン（ＢｔＰｈｅ）；アルビッジイン（Ａｂｚ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｔｌｅ）；フェニルグリシン（ＰｈＧ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；２−ナフチルアラニン（２−Ｎａｌ）；１−ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）；２−チエニルアラニン（２−Ｔｈｉ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−ＭｅＩｌｅ）；ホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｎα−メチルアルギニン（Ｎ−ＭｅＡｒｇ）；ホスホチロシン（ｐＴｙｒまたはｐＹ）；ピペコリン酸（Ｐｉｐ）；４−クロロフェニルアラニン（４−ＣｌＰｈｅ）；４−フルオロフェニルアラニン（４−ＦＰｈｅ）；１−アミノシクロプロパンカルボン酸（１−ＮＣＰＣ）；およびサルコシン（Ｓａｒ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のペプチド試薬において使用されるアミノ酸のいずれかは、Ｄ−異性体であり得るか、または、より代表的には、Ｌ−異性体であり得る。
本明細書中において記載されるペプチド試薬を形成するために使用され得るアミノ酸の他の天然に存在しないアナログとしては、ペプトイドおよび／またはペプチド模倣物化合物が挙げられ、生物学的に等しい機能を有するアミノ酸のスルホン酸アナログおよびボロン酸アナログはまた、本発明の化合物において有用であり、必要に応じて同配体によって置換されていてもよい１個以上のアミド結合を有する化合物を含む。本発明に関して、例えば、−−ＣＯＮＨ−−は、−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＮＨＣＯ−−、−−ＳＯ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｏ−−、−−ＣＨ２ＣＨ２−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２ＳＯ−−、−−ＣＨ−ＣＨ−−（シスまたはトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および１，５−二置換テトラゾールによって置換されてもよく、これらの同配体によって連結されるラジカルは、−−ＣＯＮＨ−−によって連結されるラジカルに対して同様の配向内に保持され得る。本明細書中において記載されるペプチド試薬における１個以上の残基は、ペプトイドを含み得る。
従って、ペプチド試薬はまた、１個以上のＮ置換グリシン残基を含み得る（１個以上のＮ置換グリシン残基を有するペプチドは、「ペプトイド」と呼ばれることがある）。例えば、特定の実施形態において、本明細書中において記載されるペプチド試薬のいずれかの１個以上のプロリン残基は、Ｎ置換グリシン残基で置換されている。これに関して適当である特定のＮ置換グリシンとしては、Ｎ−（Ｓ）−（１−フェニルエチル）グリシン；Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）グリシン；Ｎ−（シクロプロピルメチル）グリシン；Ｎ−（イソプロピル）グリシン；Ｎ−（３，５−ジメトキシベンジル）グリシン；およびＮ−アミノ−ブチルグリシンが挙げられるが、これらに限定されない。（例えば、図３）。他のＮ置換グリシンはまた、本明細書中において記載されるペプチド試薬配列において１個以上のアミノ酸残基を置換することが適当であり得る。これらのアミノ酸アナログおよび他のアミノ酸アナログならびにペプチド模倣物の一般的な概説として、Ｎｇｕｙｅｎら、（２０００）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．７（７）：４６３−４７３；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６７（１９８３）を参照のこと。また、Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（一般的な概説），Ｖｅｇａ Ｄａｔａ，Ｖｏｌ．１ ，Ｉｓｓｕｅ ３，．（Ｍａｒｃｈ １９８３）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ（一般的な概説），ｐｐ．４６３−４６８（１９８０）；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔ Ｒｅｓ，１４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−，ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａ．ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ，３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ，２３：１３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，２３：２５３３（１９８２）（−−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ．ＥＰ４５６６５ ＣＡ：９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ，２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；およびＨｒｕｂｙ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ，３１：１８９−１９９（１９８２）（−−ＣＨ２−−Ｓ−−）も参照のこと；これらの各々は、本明細書中において参考により援用される。Ｃ末端のカルボン酸は、ボロン酸−−Ｂ（ＯＨ）２またはボロン酸エステル−−Ｂ（ＯＲ）２もしくは本明細書中において参考により援用される米国特許第５，２８８，７０７号に開示されているような他のこのようなボロン酸誘導体によって置換され得る。
本明細書中において記載されるペプチド試薬は、モノマー、多量体、環化分子、分枝分子、リンカーなどを含み得る。本明細書中において記載される配列のいずれかの多量体（すなわち、二量体、三量体など）またはそれらの生物学的に機能的な等価物もまた企図される。多量体は、ホモ多量体であり得、すなわち、同一のモノマーから構成され得る。例えば、各モノマーが、同じペプチド配列である。あるいは、多量体は、ヘテロ多量体であり得、これは、多量体を構成するすべてのモノマーが同一ではないことを意味する。
多量体は、互いのモノマーの直接的な結合または支持体との直接的な結合によって形成され得る。それらとしては、例えば、複数の抗原性ペプチド（ＭＡＰＳ）（例えば、対称性ＭＡＰＳ）、ポリマー骨格（例えば、ＰＥＧ骨格）に結合したペプチド、および／またはスペーサー単位ありまたはなしで、タンデムに連結されたペプチドが挙げられる。
あるいは、連結基は、モノマーの配列に加えられることにより、共にモノマーを結合し、そして多量体を形成することができる。連結基を使用した多量体の非限定的な例としては、グリシンリンカーを使用したタンデム反復；支持体にリンカーを介して結合したＭＡＰＳおよび／または骨格にリンカーを介して結合した、直鎖的に連結したペプチドが挙げられる。当業者に公知であるように、連結基は、二官能性のスペーサー単位（ホモ二官能性またはヘテロ二官能性のいずれか）の使用に関連し得る。例としては、これらに限定されないが、試薬（例えば、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートなど）を使用してペプチドを共に連結する際にこのようなスペーサー単位を組み込むための多くの方法は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｉｌｌ．）に記載されており、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）およびＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）から入手可能であり、そして“Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ”，ＶＣＫ−Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ／Ｇｅｒｍａｎｙ，（１９８９）に記載されている。モノマーの配列にともに連結するために使用され得る連結基の１つの例は、−−Ｙ１−−Ｆ−−Ｙ２であり、ここで、Ｙ１およびＹ２は、同一であるか、または異なり、そして０〜２０個、好ましくは、０〜８個、より好ましくは、０〜３個の炭素原子のアルキレン基であり、そしてＦは、１個以上の官能基（例えば、−−Ｏ−−、−−Ｓ−−、−−Ｓ−−Ｓ−−、−−Ｃ（Ｏ）−−Ｏ−−、−−ＮＲ−−、−−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｏ）−−Ｏ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｏ）−−ＮＲ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｓ）−−ＮＲ−−、−−ＮＲ−−Ｃ（Ｓ）−−Ｏ−−）である。Ｙ１およびＹ２は、必要に応じて、ヒドロキシ、アルコキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アミノ、カルボキシル、カルボキシアルキルなどで置換されていてもよい。モノマーの任意の適切な原子が、連結基に結合され得ることが理解され得る。
さらに、本発明のペプチド試薬は、直鎖状、分枝状または環状であり得る。モノマー単位は、環化されるか、または共に連結されて、直鎖状または分枝状の形態、環状（例えば、大環状）、星状（デンドリマー）または球状（例えば、フラーレン）の形態の多量体を提供し得る。当業者は、本明細書中に開示されたモノマーの配列から形成され得る多くのポリマーを容易に認識し得る。特定の実施形態において、多量体は、環状二量体である。上と同じ用語の定義を使用して、二量体は、ホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。
モノマーまたは多量体のいずれに関わらず、環状形態は、上で記載した任意の結合によって形成され得、それらとしては、例えば：（１）窒素とＣ末端のカルボニルとの間で直接的なアミド結合を形成することによってか、またはスペーサー基の仲介によって（例えば、ε−アミノカルボン酸による縮合によって）のいずれかによって、Ｎ末端のアミンとＣ末端のカルボン酸とが環化したもの；（２）２つの残基の側鎖の間で結合を形成することによって環化したもの、例えば、アスパラギン酸側鎖またはグルタミン酸側鎖とリシン側鎖との間でアミド結合を形成することによってか、または２つのシステイン側鎖間またはペニシラミン側鎖とシステイン側鎖との間または２つのペニシラミン側鎖間でジスルフィド結合を形成することによって環化したもの；（３）側鎖（例えば、アスパラギン酸またはリシン）とそれぞれＮ末端のアミンまたはＣ末端のカルボキシルのいずれかとの間でアミド結合を形成することによって環化したもの；および／または（４）短い炭素スペーサー基の仲介によって２つの側鎖を連結したものが挙げられるが、これらに限定されない。
好ましくは、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、病原性ではなく、そして／または感染性でない。
本発明のペプチド試薬は、概して、３〜約１００残基長（またはそれらの間の任意の値）またはそれ以上、好ましくは、約４〜７５残基長（またはそれらの間の任意の値）、好ましくは、約５〜約６３残基長（またはそれらの間の任意の値）およびなおもより好ましくは、約８〜約３０残基長（またはそれらの間の任意の値）であり得、そして最も好ましくは、ペプチド試薬は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０残基であり得る。
本明細書中において記載される組成物および方法において有用なペプチド試薬の非限定的な例は、表１および表４に示される配列から誘導される。それらの表中のペプチド試薬は、従来の１文字のアミノ酸コードによって表され、左側がＮ末端、右側がＣ末端を示す。角括弧内のアミノ酸は、異なるペプチド試薬におけるその位置で使用され得る別の残基を示す。丸括弧は、残基が存在し得るか、またはペプチド試薬に存在しないことを示す。「２」の前の二重丸括弧（例えば、配列番号１３３）は、この配列が、二重括弧の間のペプチドを２コピー含むことを示す。コピー数を指示する数字の後の残基（例えば、配列番号１３３における「Ｋ」）は、二重括弧の間のペプチドの各コピーが伸びている残基を示す。すなわち、配列番号１３３（図６）は、リシンのａ−アミノ官能基およびｅ−アミノ官能基を介して各々のＣ末端がリシン（Ｋ）残基に連結した、ＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮペプチド配列の二量体である。「ＭＡＰＳ」を含む配列は、本明細書中においてさらに詳細に記載されるように、複数の抗原性部位を含むペプチドを示す。用語「分枝」の前の数字は、コピー数を示す。すなわち、配列番号１３４は、４コピーのＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＧを含み、配列番号１３５は、８コピーのＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＧを含む。任意のプロリン残基は、ペプトイドを形成するＮ置換グリシン残基で置換され得る。これらの表中の任意の配列は、必要に応じてＮ末端および／またはＣ末端にＧｌｙリンカー（Ｇｎ、ここで、ｎ＝１、２、３または４）を含んでもよい。表１のすべてのペプチドにおいて、（Ｘ）は、「Ｇ」またはその位置にアミノ酸残基が存在しないことのいずれかを示す。
Figure 2008529537
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 １つの局面において、本発明のペプチド試薬は、本明細書中に開示されるペプチドの各々およびそれらの（本明細書中において記載されるような）誘導体を含む。すなわち、本発明は、配列番号
Figure 2008529537
 に示される配列のいずれかのペプチドならびにそれらのアナログ（例えば、Ｎ置換グリシンによる１個以上のプロリンの置換）および誘導体から誘導されるペプチド試薬を含む。
本発明は、好ましくは、配列番号
Figure 2008529537
 のペプチドならびにそれらのアナログ（例えば、Ｎ置換グリシンによる１個以上のプロリンの置換）および誘導体から誘導されるペプチド試薬を含む。
特定の好ましい実施形態において、ペプチド試薬、例えば、配列番号
Figure 2008529537
 のペプチドならびにそれらのアナログ（例えば、Ｎ置換グリシンによる１個以上のプロリンの置換）および誘導体から誘導されるペプチド試薬は、病原性プリオンに特異的に結合する。
上で記載したように、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、１個以上の置換、付加および／または変異を含み得る。例えば、１個以上の残基は、ペプトイドを作製するために、ペプチド試薬において他の残基、例えば、アラニン残基またはアミノ酸アナログもしくはＮ置換グリシン残基で置換され得る（例えば、Ｎｇｕｙｅｎら、（２０００）Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．７（７）：４６３−４７３を参照のこと）。
さらに、本明細書中において記載されるペプチド試薬はまた、付加的なペプチド成分または非ペプチド成分を含み得る。付加的なペプチド成分の非限定的な例としては、スペーサー残基、例えば、２個以上のグリシン（天然または誘導体化された）残基または一方の末端もしくは両方の末端におけるアミノヘキサン酸リンカーまたはペプチド試薬の可溶化を助け得る残基、例えば、配列番号８３または８６に示されるようなアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）などの酸性残基が挙げられる。特定の実施形態において、例えば、ペプチド試薬は、複数の抗原性ペプチド（ＭＡＰ）として合成される。例えば、配列番号１３４、（４−分枝ＭＡＰＳ−ＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＧ）（これは、４コピーのペプチドＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＧを含む）；配列番号２５９（４−分枝ＭＡＰＳ−ＧＧＧＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮＧＧＧ）（これは、４コピーのペプチドＧＧＧＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮＧＧＧを含む）；配列番号１３５（８−分枝ＭＡＰＳ−ＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＧ）（これは、８コピーのペプチドＧＧＧＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧＧを含む）；および配列番号２６０（８−分枝ＭＡＰＳＧＧＧＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮＧＧＧ）（これは、８コピーのペプチドＧＧＧＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮＧＧＧを含む）を参照のこと。代表的には、多コピーのペプチド試薬（例えば、２〜１０コピー）は、分枝リシンまたは他のＭＡＰキャリアコアなどのＭＡＰキャリア上に直接合成される。例えば、Ｗｕら、（２００１）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００１ １２３（２８）：６７７８−８４；Ｓｐｅｔｚｌｅｒら、（１９９５）Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４５（１）：７８−８５；Ｔａｍ（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５４０９−５４１３を参照のこと。
本明細書中において記載されるペプチド試薬に含まれ得る非ペプチド成分（例えば、化学部分）の非限定的な例としては、ペプチド試薬の末端または内部のいずれかに存在する、１個以上の検出可能な標識、タグ（例えば、ビオチン、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、オリゴヌクレオチド）、色素、結合対のメンバーなどが挙げられる。非ペプチド成分はまた、定量的な構造−活性データおよび／または分子モデリングによって干渉しないと予測される化合物上の位置に、直接的またはスペーサー（例えば、アミド基）を介して（例えば、１個以上の標識の共有結合を介して）、結合され得る。本明細書中で記載されるようなペプチド試薬はまた、プリオン特異的な化学部分（例えば、アミロイド特異的色素（例えば、Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ、Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎなど））を含み得る。化合物の誘導体化（例えば、標識、環化、化学部分の結合など）は、ペプチド試薬の結合特性、生物学的機能および／または薬理学的活性を実質的に干渉するべきでない（そしてなおも増強し得る）。
本発明のペプチド試薬は、代表的には、プリオンタンパク質フラグメントまたは本明細書中に示されるペプチド配列と少なくとも約５０％の配列同一性を有し得る。好ましくは、ペプチド試薬は、プリオンタンパク質フラグメントまたは本明細書中に示されるペプチド配列と、少なくとも７０％の配列同一性を有し得：より好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る。
本明細書中で記載されるようなペプチド試薬は、病原型と優先的に相互作用し、従って、単離、精製、検出、診断的および治療的な用途にわたって有用である。例えば、ペプチド試薬が病原型と優先的に相互作用する実施形態において、ペプチド試薬自体は、サンプル（例えば、血液、神経系組織（脳、脊髄、ＣＳＦなど）または他の組織もしくは器官サンプル）中の病原型を検出するために使用され得る。ペプチド試薬はまた、病原型に関連する疾患の存在を診断するため、病原型を単離するため、および病原型を除去することによりサンプルを汚染除去するために有用である。
ペプチド試薬とプリオンタンパク質との相互作用は、公知の任意の結合アッセイ、例えば、標準的なイムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなど）を用いて試験され得る。
本発明のペプチド試薬の特異性を試験する１つの簡便な方法は、病原性プリオンと非病原性プリオンの両方を含むサンプルを選択することである。代表的なこのようなサンプルとしては、疾患動物由来の脳組織または脊髄組織が挙げられる。病原型に特異的に結合する本明細書中で記載されるようなペプチド試薬は、（当該分野で周知の方法によって、そして以下にさらに記載されるように）固体支持体に結合され、そして他のサンプル成分から病原性プリオンを分離（「プルダウン」）するため、および固体支持体上におけるペプチドとプリオンとの結合の相互作用の数に直接関連する定量的な値を得るために使用される。変法および当該分野で公知の他のアッセイもまた、本発明のペプチド試薬の特異性を証明するために使用され得る。例えば、実施例を参照のこと。
本明細書中において記載されるペプチド試薬を使用するときに必要とされないが、これらのアッセイは、病原性コンホメーションを有するプリオンが一般にプロテイナーゼＫなどの特定のプロテアーゼに耐性であるという事実を利用し得る。同じプロテアーゼは、非病原性のコンホメーションのプリオンを分解することができる。それゆえ、プロテアーゼを使用するとき、サンプルは、２つの等容積に分離され得る。プロテアーゼは、第２のサンプルに加えられ、そして同じ試験が実施され得る。第２のサンプル中のプロテアーゼが任意の非病原性プリオンを分解するので、第２のサンプル中のどのペプチド−プリオン結合相互作用も、病原性プリオンに起因し得る。
従って、本明細書中において記載されるペプチド試薬の結合の特異性および／または親和性を評価する方法の非限定的な例としては、標準的なウエスタンブロッティング法およびファーウエスタンブロッティング法；ペプチドの標識；ＥＬＩＳＡ様アッセイ；および／または細胞ベースのアッセイが挙げられる。例えば、ウエスタンブロットは、代表的には、「プルダウン」アッセイ（本明細書中において記載されるように）から得られたサンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロースまたはＰＶＤＦにエレクトロブロットされた変性プリオンタンパク質を検出するタグ化された１次抗体を使用する。変性プリオンタンパク質を認識する抗体は、報告されており（とりわけ、Ｐｅｒｅｔｚら、１９９７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：６１４；Ｐｅｒｅｔｚら、２００１ Ｎａｔｕｒｅ ４１２：７３９；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９９８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４１３；米国特許第６，７６５，０８８号；米国特許第６，５３７，５４８号に説明されている）、一部は、市販されている。他のプリオン結合分子、例えば、モチーフグラフト化ハイブリッドポリペプチド（ＷＯ０３／０８５０８６を参照のこと）、特定の陽イオン性または陰イオン性のポリマー（ＷＯ０３／０７３１０６を参照のこと）、「増殖触媒（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｓｔ）」である特定のペプチド（ＷＯ０２／０９７４４４４を参照のこと）およびプラスミノゲンが報告されている。次いで１次抗体が、タグに対するプローブ（例えば、ストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼ、ストレプトアビジン結合体化西洋ワサビペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン結合体化ＥＣＬ試薬および／またはストレプトアビジンと結合体化された増幅可能なオリゴヌクレオチド）を用いて検出される（そして／または増幅される）。結合はまた、検出試薬（例えば、親和性タグに対するプローブ（例えば、ストレプトアビジン結合体化アルカリホスファターゼ、ストレプトアビジン結合体化西洋ワサビペルオキシダーゼ、ストレプトアビジン結合体化ＥＣＬ試薬またはストレプトアビジンと結合体化された増幅可能なオリゴヌクレオチド）で標識および増幅される親和性タグ（例えば、ビオチン）を有するペプチド）を使用して評価され得る。さらに、サンドイッチＥＬＩＳＡに類似したマイクロタイタープレート法が使用され得、例えば、本明細書中で記載されるようなプリオン特異的ペプチド試薬は、プリオンタンパク質およびさらなる検出試薬（親和性標識および／または検出標識（例えば、結合体化アルカリホスファターゼ、結合体化西洋ワサビペルオキシダーゼ、結合体化ＥＣＬ試薬または結合体化された増幅可能なオリゴヌクレオチド）を有する別のプリオン特異的ペプチド試薬が挙げられ得るが、これらに限定されない）を固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル、ビーズなど）に固定するために使用される。例えば、プリオンタンパク質が、個々の細胞上で直接検出されるとき（例えば、蛍光ベースの細胞の選別、カウントまたは特異的に標識された細胞の検出が可能な、蛍光で標識されたプリオン特異的ペプチド試薬を使用して）、細胞ベースのアッセイを使用することもできる。
（ＩＩＩ．Ｂ．ペプチド試薬作製）
本発明のペプチド試薬は、すべてが当該分野で周知であるいかなる方法においても作製することができる。このような方法は、米国特許出願番号１０／９１７，６４６（開示の全体が、本明細書中で参考により援用される）に記載されている。
１つの実施形態において、ペプチド試薬が、全部または部分的に遺伝的にコードされるペプチドであるペプチドを、当該分野で周知の組換え技術を用いて作製することができる。当業者は、標準的な方法論および本明細書中の教示を用いて所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列を容易に決定し得る。一旦単離されると、組換えペプチドは、必要に応じて、本明細書中において記載され、そして当該分野で周知であるような遺伝的にコードされない成分（例えば、検出可能な標識、結合対メンバーなど）を含むように改変されることにより、ペプチド試薬が作製され得る。
オリゴヌクレオチドプローブは、既知配列に基づいて考案され得、そしてゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを探索するために使用され得る。次いでそれらの配列は、標準的な技術および例えば、全長配列の所望の部分で遺伝子を切断するために使用される制限酵素を用いてさらに単離され得る。同様に、目的の配列は、フェノール抽出などの公知の技術を用いて、同じものを含む細胞および組織から直接単離され得、そしてその配列を、さらに操作することにより所望の切断を行う。ＤＮＡを得て、単離するために使用される技術の説明として、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、、前出を参照のこと。
ペプチドをコードする配列はまた、合成的に、例えば、既知配列に基づいて作製され得る。ヌクレオチド配列は、所望の特定のアミノ酸配列に対して適切なコドンを用いて設計され得る。完全な配列は、一般に、標準的な方法によって調製される重複オリゴヌクレオチドから構築され、そして完全なコード配列に構築される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９；Ｊａｙら、（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１；Ｓｔｅｍｍｅｒら、（１９９５）Ｇｅｎｅ １６４：４９−５３を参照のこと。
組換え技術は、特許請求されるペプチド試薬において有用なポリペプチドをコードする配列をクローニングするために容易に使用され、その配列は、インビトロにおいて適切な塩基対を置換することによって変異誘発され得、それにより、所望のアミノ酸用のコドンがもたらされる。このような変更は、１アミノ酸の変化に影響するわずか１塩基対を含み得るか、または数塩基対の変化を含み得る。あるいは、変異は、ミスマッチの二重鎖の融解温度より低い温度で親ヌクレオチド配列（一般に、ＲＮＡ配列に対応するｃＤＮＡ）とハイブリダイズするミスマッチのプライマーを使用してもたらされ得る。プライマーの長さおよび塩基組成を比較的狭い範囲内に維持しておくことおよび変異塩基を中央に位置させておくことによって、このプライマーを特異的なものとすることができる。例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ，（１９９０）ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８３）１００：４６８を参照のこと。ＤＮＡポリメラーゼを使用してプライマーを伸長し、その産物をクローニングし、そして変異されたＤＮＡを含むクローンをプライマー伸長された鎖の分離によって得て、選択する。選択を、変異プライマーをハイブリダイゼーションプローブとして使用して達成することができる。この技術は、複数の点変異を生成するために適用することもできる。例えば、Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８２）７９：６４０９を参照のこと。
一旦コード配列が単離および／または合成されると、それらは、発現に向けて、任意の適当なベクターまたはレプリコンにクローニングされ得る。（例えば、実施例も参照のこと）。本明細書中の教示から明らかであるように、改変ポリペプチドをコードする多岐にわたるベクターは、様々な組み合わせで、それらの中に欠失または変異を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと作動可能に連結する発現構築物を作製することによって生成され得る。
数多くのクローニングベクターは、当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択には、選択の余地がある。クローニング用の組換えＤＮＡベクターおよびそれらを形質転換することができる宿主細胞の例としては、バクテリオファージλ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＢＲ３２２（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ｐＫＴ２３０（グラム陰性菌）、ｐＧＶｌ１０６（グラム陰性菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性菌）、ｐＭＥ２９０（Ｅ．ｃｏｌｉでないグラム陰性菌）、ｐＨＶ１４（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ｐＢＤ９（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ｐＩＪ６１（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ｐＵＣ６（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ＹＩｐ５（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ＹＣｐ１９（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびウシパピローマウイルス（哺乳動物細胞）が挙げられる。一般には、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｖｏｌｓ．Ｉ ＆ ＩＩ，前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，前出；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，前出を参照のこと。
バキュロウイルス系などの昆虫細胞発現系も使用することができ、それらは、当業者に公知であり、例えば、Ｓｕｍｍｅｒｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｓｔａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ．１５５５（１９８７）に記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、キットの形態で、とりわけ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡから（「ＭａｘＢａｃ」キットとして）市販されている。
植物発現系もまた、本明細書中において記載されるペプチド試薬を作製するために使用することができる。一般に、このような系は、ウイルスベースのベクターを使用することにより、異種性遺伝子で植物細胞にトランスフェクションする。このような系についての説明としては、例えば、Ｐｏｒｔａら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９６）５：２０９−２２１；およびＨａｃｋｌａｎｄら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）１３９：１−２２を参照のこと。
ウイルス系（例えば、Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６およびＳｅｌｂｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：１１０３−１１１３に記載されているようなワクシニアベースの感染／トランスフェクション系）もまた、本発明において使用され得る。この系において、細胞は、はじめに、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルス組換え体でインビトロにおいてトランスフェクションされる。このポリメラーゼは、Ｔ７プロモーターを有する鋳型だけを転写するという優れた特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターによって作動される、目的のＤＮＡでトランフェクションされる。ワクシニアウイルス組換え体から細胞質で発現されるポリメラーゼが、トランスフェクションされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、その後、宿主の翻訳機構によってタンパク質に翻訳される。この方法は、高レベルで、一過性で、細胞質における大量のＲＮＡの産生およびその翻訳産物を提供する。
遺伝子は、プロモーター、（細菌発現用の）リボソーム結合部位および必要に応じて、オペレーター（本明細書中で「調節」領域と集合的に呼ばれる）の支配下に配置され得るので、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、この発現構築物を含むベクターによって形質転換される宿主細胞においてＲＮＡに転写される。コード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。本発明では、天然に存在するシグナルペプチドまたは異種性配列の両方が使用され得る。リーダー配列は、翻訳後プロセシングにおいて宿主によって除去され得る。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３９７号を参照のこと。このような配列としては、ＴＰＡリーダー配列ならびにミツバチメリチンシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。
宿主細胞の生育に対してタンパク質配列の発現の制御を可能にする他の制御配列がまた、望ましい場合がある。このような制御配列は、当業者に公知であり、例としては、制御化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現のオンまたはオフを引き起こす配列が挙げられる。他のタイプの制御領域はまた、ベクター内に存在し得、例えば、エンハンサー配列である。
制御配列および他の制御配列は、ベクターへの挿入の前に、コード配列に連結され得る。あるいは、コード配列は、制御配列および適切な制限酵素認識部位をすでに含む発現ベクターに直接クローニングされ得る。
いくつかの場合において、コード配列を改変する必要がある場合があり、適切な向きで制御配列が結合され得る；すなわち、適切な読み枠を維持するため。変異体またはアナログは、タンパク質をコードする配列の一部の欠失、配列の挿入および／または配列内における１個以上のヌクレオチドの置換によって調製され得る。部位特異的突然変異生成などのヌクレオチド配列を改変するための技術は、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，前出；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ａｎｄ ＩＩ，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前出を参照のこと。
そして発現ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。数多くの哺乳動物細胞株が、当該分野で公知であり、それらとしては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能である不死化細胞株が挙げられ、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ｖｅｒｏ２９３細胞ならびに他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、細菌の宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）は、本発現構築物において使用され得る。本発明において有用な酵母宿主としては、とりわけ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターとともに使用するための昆虫細胞としては、とりわけ、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉが挙げられる。
発現系および選択された宿主に依存して、本発明のタンパク質は、目的のタンパク質が発現する条件下で、上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を生育することによって産生される。適切な生育条件の選択は、当該分野の技術の範囲内である。
１つの実施形態において、形質転換された細胞は、周囲の培地にポリペプチド産物を分泌する。例えば、組織プラスミノゲンアクチベーター（ＴＰＡ）リーダー配列、インターフェロン（γまたはα）シグナル配列または公知の分泌タンパク質由来の他のシグナルペプチド配列を使用して、タンパク質産物の分泌を促進する特定の制御配列が、ベクター内に含まれ得る。次いで、分泌されたポリペプチド産物は、本明細書中において記載される様々な技術、例えば、標準的な精製技術（例えば、ヒドロキシアパタイト樹脂、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着技術、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降などがこれらに限定されない）を使用して、単離され得る。
あるいは、形質転換された細胞を、化学的、物理的または機械的手段を使用して破砕して、細胞を溶解するが、組換えポリペプチドは実質的に破壊されていない状態にする。細胞内タンパク質はまた、例えば、界面活性剤または有機溶媒を使用することにより、細胞壁または細胞膜由来の成分を除去し、ポリペプチドが漏出することにより得られる。このような方法は、当業者に公知であり、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，（Ｅ．Ｌ．Ｖ．Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ｓ．Ａｎｇａｌ，Ｅｄｓ．，１９９０）に記載されている。
例えば、本発明において使用するための細胞を破砕する方法としては：音波処理または超音波処理；振動；液体押出または固体押出；熱処理；凍結融解；乾燥；爆発的減圧；浸透圧ショック；プロテアーゼ（例えば、トリプシン、ノイラミニダーゼおよびリゾチーム）を含む溶解性酵素による処理；アルカリ処理；ならびに界面活性剤および溶媒（例えば、胆汁酸塩、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０およびＣＨＡＰＳ）の使用が挙げられるが、これらに限定されない。細胞を破砕するために使用される特定の技術は、選択の余地が大いにあり、また、ポリペプチドが発現される細胞タイプ、培養条件および使用される任意の前処理に依存する。
細胞を破砕した後、通常、遠心分離によって細胞の残骸を除去し、そして、標準的な精製技術（例えば、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、ＨＰＬＣ、免疫吸着技術、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降などが挙げられるが、これらに限定されない）を使用して細胞内で産生されたポリペプチドをさらに精製する。
例えば、本発明の細胞内のポリペプチドを得るための１つの方法は、抗体（例えば、以前に作製された抗体）を使用したイムノアフィニティークロマトグラフィーまたはレクチンアフィニティークロマトグラフィーなどによる、親和性精製を含む。特に好ましいレクチン樹脂は、マンノース部分を認識する樹脂であり、例えば、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓ凝集素（ＧＮＡ）、Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ凝集素（ＬＣＡまたはレンチルレクチン）、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ凝集素（ＰＳＡまたはエンドウマメレクチン）、Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ凝集素（ＮＰＡ）およびＡｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍ凝集素（ＡＵＡ）に由来する樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。適当な親和性樹脂の選択は、当該分野の技術の範囲内である。親和性精製後、ポリペプチドは、当該分野で周知の従来技術、例えば、上で記載した技術のいずれかによって、さらに精製され得る。
ペプチド試薬は、化学的に、例えば、ペプチド分野の当業者に公知のいくつかの技術のいずれかによって、簡便に合成され得る。一般に、これらの方法は、伸長しているペプチド鎖に１個以上のアミノ酸を連続的に付加することを使用する。通常、１番目のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかを、適当な保護基で保護する。次いで、保護されたアミノ酸または誘導体化されたアミノ酸は、アミド結合の形成を可能にする条件下で、適当な保護された相補的な基（アミノ基またはカルボキシル基）を有する配列において次のアミノ酸を付加する間、不活性な固体支持体に結合され得るか、または溶液中で使用され得る。次いで、保護基を、新たに付加されたアミノ酸残基から除去し、そして次の（適当に保護された）アミノ酸の付加などを行う。所望のアミノ酸が、適切な配列に連結された後、残存している任意の保護基（および固相合成技術を使用した場合は、任意の固体支持体）を次々とまたは同時に除去することにより、最終的なポリペプチドが得られる。この一般的な手順の簡単な改変により、伸長している鎖に同時に２個以上のアミノ酸を付加することが可能である。例えば、（キラル中心をラセミ化しない条件下で）保護されたトリペプチドと、適切に保護されたジペプチドとを結合することにより、脱保護の後、ペンタペプチドが形成される。例えば、固相ペプチド合成技術については、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ １９８４）およびＧ．Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｏｒｓ Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｖｏｌ．２，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０），ｐｐ．３−２５４；ならびに、従来の溶液中の合成については、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ １９８４）およびＥ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：．Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．１を参照のこと。これらの方法は、代表的には、比較的小さいポリペプチド、すなわち、約５０〜１００アミノ酸長までのポリペプチドに使用するが、それよりも大きいポリペプチドにも適用可能である。
代表的な保護基としては、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）；ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｘ）；２，４−ジニトロフェニル；ベンジル（Ｂｚｌ）；ビフェニルイソプロピルオキシカルボキシ−カルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、シクロヘキシル、イソプロピル、アセチル、ｏ−ニトロフェニルスルホニルなどが挙げられる。
代表的な固体支持体は、架橋された多量体の支持体である。これらとしては、ジビニルベンゼン架橋スチレンベースのポリマー、例えば、ジビニルベンゼン−ヒドロキシメチルスチレン共重合体、ジビニルベンゼン−クロロメチルスチレン共重合体およびジビニルベンゼン−ベンズヒドリルアミノポリスチレン共重合体が挙げられ得る。
ペプトイド含有ポリマーの合成は、例えば、米国特許第５，８７７，２７８号；同第６，０３３，６３１号；Ｓｉｍｏｎら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９３６７に従って実施され得る。
本発明のペプチド試薬はまた、同時に複数のペプチド合成を行う方法などの他の方法によって、化学的に調製され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８５）８２：５１３１−５１３５；米国特許第４，６３１，２１１号を参照のこと。
（ＩＶ．抗体）
さらに、本発明において使用される、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、米国特許出願公開第１０／９１７，６４６号に記載されているような抗体を作製するために使用され得る。この開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
特定の実施形態において、これらのペプチド試薬に対して産生される抗体は、病原性プリオンに特異的である。他の実施形態において、これらの抗体は、病原型と非病原型の両方に結合する。なおもさらなる実施形態において、これらの抗体は、非病原性アイソフォームに特異的である。必要に応じて、本明細書中において記載される抗体は、非病原型を病原性のコンホメーションへ変換することを阻害する。代表的には、本発明の抗体は、本明細書中で記載されるようなペプチド試薬（またはこのようなペプチド試薬をコードするポリヌクレオチド）を動物に投与することによって作製される。その方法は、動物から抗体を単離する工程も含む。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体調製物またはモノクローナル抗体調製物、単一特異性の抗血清、ヒト抗体であり得るか、またはハイブリッド抗体またはキメラ抗体（例えば、ヒト化抗体、改変抗体、（Ｆａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体、二量体もしくは三量体の抗体フラグメントもしくは構築物、ミニボディまたは問題の抗原に結合するそれらの機能的フラグメント）であり得る。
抗体は、当業者に周知の技術を使用して作製され、例えば、米国特許第４，０１１，３０８号；同第４，７２２，８９０号；同第４，０１６，０４３号；同第３，８７６，５０４号；同第３，７７０，３８０号；および同第４，３７２，７４５号に開示されている。例えば、ポリクローナル抗体は、適当な動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）を目的の抗原（例えば、本明細書中において記載されるペプチド試薬）で免疫することによって作製される。免疫原性を増強するために、その抗原は、免疫の前にキャリアに結合され得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。免疫は、一般に、抗原を食塩水、好ましくは、フロイント完全アジュバントなどのアジュバント中に混合または乳化し、そしてその混合物またはエマルジョンを非経口的に（通常、皮下または筋肉内に）注入することによって実施される。動物を通常、２〜６週間後に、食塩水、好ましくは、フロイント不完全アジュバント中の抗原を１回以上の注入することによって追加免疫する。抗体は、当該分野で公知の方法を使用して、インビトロにおける免疫によっても作製され得る。次いで、ポリクローナル抗血清を、免疫された動物から得る。
モノクローナル抗体は、通常、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７の方法またはその変法を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットを、上で記載したように免疫する。しかしながら、血清を抽出するためにその動物から採血するのではなく、脾臓（および必要に応じて、いくつかの大きなリンパ節）を取り出し、単一細胞に分離する。所望であれば、細胞懸濁液を、抗原がコートされたプレートまたはウェルに加えることによって、（非特異的に接着する細胞を除去した後）脾臓細胞をスクリーニングしてもよい。抗原に特異的な膜結合性免疫グロブリンを発現するＢ細胞は、そのプレートに結合し、懸濁液の残りの液で洗い流されない。次いで、得られたＢ細胞または分離されたすべての脾臓細胞を、ハイブリドーマを形成するためにミエローマ細胞と融合するように誘導し、選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）中で培養する。得られたハイブリドーマを限界希釈するためにプレートにまき、そして免疫する抗原に特異的に結合する抗体（かつ無関係の抗原に結合しない抗体）の産生についてアッセイする。次いで、選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマは、インビトロ（例えば、組織培養瓶または中空糸反応器の中で）またはインビボ（例えば、マウスの腹水として）のいずれかで培養される。
ヒト化抗体およびキメラ抗体もまた、本発明に有用である。ハイブリッド（キメラ）抗体分子は、一般に、Ｗｉｎｔｅｒら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−２９９および米国特許第４，８１６，５６７号に記述されている。ヒト化抗体分子は、一般に、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６；および１９９４年９月２１日に公開された英国特許出願公開第ＧＢ２，２７６，１６９号）に記述されている。ヒト化抗体を操作するための１つのアプローチは、マウス−ヒト抗体、すなわち、ヒト化抗体を作製するために、マウス抗体遺伝子由来のプロモーター、リーダー配列および可変領域配列ならびにヒト抗体遺伝子由来の定常領域エキソンを含む組換えＤＮＡをクローニングする工程を含む。一般に、Ｋｕｂｙ，“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）の１３６頁を参照のこと。
本明細書中で記載されるようなペプチド試薬に特異的な、モノクローナル抗体とポリクローナル抗体の両方は、診断的および治療的な用途に特に有用であり、例えば、これらの中和抗体は、受動免疫療法に有用である。モノクローナル抗体は、特に、抗イディオタイプ抗体を産生するために使用され得る。
抗イディオタイプ抗体は、保護が望まれる物質の抗原の「内部イメージ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｉｍａｇｅ）」を保持する免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を産生するための技術は、当該分野で公知である。例えば、Ｇｒｚｙｃｈ（１９８５），Ｎａｔｕｒｅ ３１６：７４；ＭａｃＮａｍａｒａら、（１９８４），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６：１３２５，Ｕｙｔｄｅｈａａｇ ｅｔ ａｌ（１９８５），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：１２２５を参照のこと。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、コンホメーション病の処置および／または診断に有用であり得る。
抗体フラグメントはまた、本発明の範囲内に含まれる。無処置の抗体分子の免疫学的結合特性を示すことができる抗原結合部位を含む数多くの抗体フラグメントが、当該分野で公知である。例えば、機能的抗体フラグメントは、例えば、ペプシンを使用して抗体分子から抗原結合に関与しない定常領域を切断することによって作製され得、その結果、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。これらのフラグメントは、２つの抗原結合部位を含むが、各重鎖の定常領域の一部を欠く。同様に、所望であれば、例えば、パパインによるポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の消化によって、単一の抗原結合部位を含むＦａｂフラグメントを作製することができる。重鎖および軽鎖の可変領域のみを含む機能的フラグメントはまた、標準的な技術（例えば、組換え生成または免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解性切断）を使用して作製され得る。これらのフラグメントは、Ｆｖとして知られている。例えば、Ｉｎｂａｒら、（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら、（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら、（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１−４０９６を参照のこと。
一本鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を含む遺伝子融合から発現される、共有結合したＶＨ−ＶＬヘテロ二量体である。Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８５：５８７９−５８８３。天然に凝集しているが、化学的に分離される、抗体のＶ領域由来の軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドを、抗原結合部位の構造に実質的に類似した３次元構造に折りたたむｓＦｖ分子に変換するための化学構造（リンカー）を識別し、開発するための数多くの方法が報告されている。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号；同第５，１３２，４０５号；および同第４，９４６，７７８号を参照のこと。ｓＦｖ分子は、当該分野で報告されている方法を使用して作製され得る。例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：５８７９−５３３８；米国特許第５，０９１，５１３号；同第５，１３２，４０５号および同第４，９４６，７７８号を参照のこと。設計の基準は、一方の鎖のＣ末端と他方の鎖のＮ末端との間の適切な長さを決定することを含み、ここで、リンカーは、渦巻状に巻かないか、または二次構造を形成しない小さい親水性アミノ酸残基から一般に形成される。このような方法は、当該分野で報告されている。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号；同第５，１３２，４０５号および同第４，９４６，７７８号を参照のこと。適当なリンカーは、一般に、グリシン残基およびセリン残基の交互のセットのポリペプチド鎖を含み、そして溶解性を増大させるために挿入されるグルタミン酸残基およびリシン残基を含み得る。
「ミニ抗体」または「ミニボディ」はまた、本発明において使用され得る。ミニボディは、Ｃ末端にオリゴマー形成ドメインを含むｓＦｖポリペプチド鎖であり、そのオリゴマー形成ドメインは、ヒンジ領域によってｓＦｖから分離される。Ｐａｃｋら、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１：１５７９−１５８４。オリゴマー形成ドメインは、さらなるジスルフィド結合により、さらに安定化され得る自己会合α−へリックス、例えば、ロイシンジッパーを含む。オリゴマー形成ドメインは、膜を横断した折りたたみの方向に適合するように設計され、そのプロセスは、インビボにおけるポリペプチドの折りたたみを機能的結合タンパク質に促進すると考えられている。一般に、ミニボディは、当該分野で周知の組換え方法を使用して作製される。例えば、Ｐａｃｋら、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら、（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４９Ｂ：１２０−１２６を参照のこと。
非従来的な手段もまた、抗体を作製および同定するために使用され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリーは、非病原型よりも病原型に結合する抗体またはその反対の抗体について、スクリーニングされ得る。一般に、Ｓｉｅｇｅｌ，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｔｒａｎｓｆｕｓ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．（２００２）９（１）：１５−２２；Ｓｉｄｈｕ，“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０００）１１（６）：６１０−６１６；Ｓｈａｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ”，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ（２０００）３（３）：１８５−１９６；およびＳｃｈｍｉｔｚら、“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｒｅｖｉｅｗ”，Ｐｌａｃｅｎｔａ，（２０００）２１ ＳｕｐｐｌＡ：Ｓ １０６−１２を参照のこと。
上で述べたように、抗体は、本明細書中で記載されるようなペプチド試薬をコードするポリヌクレオチド配列を動物に投与することによって作製することもできる。そのペプチドがインビボにおいて発現されるとき、抗体は、インビボにおいて産生される。ポリヌクレオチド送達のための方法を、以下に記述する。
本発明の抗体の特異性は、上で記載したようにペプチド試薬について試験され得る。上で述べたように、病原性のコンホメーションを有するプリオンは、一般に、プロテイナーゼＫなどの特定のプロテアーゼに耐性である。同じプロテアーゼは、非病原性のコンホメーションのプリオンを分解することができる。本発明の抗体の特異性を試験する１つの方法は、病原性プリオンと非病原性プリオンの両方を含む生物学的サンプルを選択することである。そのサンプルは、２等量に分離され得る。本発明の抗体は、（下でさらに説明するように）固体支持体上に加えられて、吸着され得、そして固体支持体上の抗体−プリオン結合相互作用の数に直接関連する定量的な値を得るために使用され得る。プロテアーゼが、第２のサンプルに加えられ得、そして同じ試験が実施され得る。第２のサンプル中のプロテアーゼが任意の非病原性プリオンを分解するので、第２のサンプル中の任意の抗体−プリオン結合相互作用は、病原性プリオンに起因し得る。変法および当該分野で公知の他のアッセイもまた、本発明の抗体の特異性を証明するために使用され得る。
（Ｖ．アッセイ）
本発明のペプチド試薬は、サンプル（例えば、生物学的サンプル（例えば、血液、脳、脊髄、ＣＳＦまたは器官サンプル）をスクリーニングするため、例えば、これらのサンプル中のコンホメーション病タンパク質の病原型の存在の有無を検出するための種々のアッセイにおいて使用され得る。多くの現在のプリオン診断試薬とは異なり、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、血液サンプル、血液供給物またはバイオプシーサンプルを含む、実質的にどんなタイプの生物学的サンプルまたは非生物学的サンプルにおいても検出が可能である。
従って、本発明は、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法を提供し、その方法は：病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと、本発明のペプチド試薬とを、病原性プリオンタンパク質が存在する場合、ペプチド試薬が病原性プリオンタンパク質に結合し得る条件下で接触させる工程；および病原性プリオンタンパク質が存在する場合、病原性プリオンをペプチド試薬に結合することによって、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出する工程を含む。
本発明の方法において使用するために、サンプルは、病原性プリオンタンパク質を含んでいることが知られているか、または含むと疑われるものであり得る。サンプルは、生物学的サンプル（すなわち、生存生物体またはかつて生存していた生物体から調製されたサンプル）または非生物学的サンプルであり得る。適当な生物学的サンプルとしては、器官、全血、血液画分、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋組織、骨髄、尿、涙、非神経系組織、器官および／またはバイオプシーもしくはネクロプシーが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい生物学的サンプルとしては、全血、血液画分、血液成分、血漿、血小板および血清が挙げられる。
サンプルは、病原性プリオンタンパク質がサンプル中に存在する場合、ペプチド試薬が病原性プリオンタンパク質に結合し得る条件下で本発明の１個以上のペプチド試薬と接触させる。本明細書中の開示に基づく特定の条件を決定することは、当業者の能力の範囲内に十分入る。代表的には、サンプルおよびペプチド試薬は、およそ中性のｐＨの適当な緩衝液（例えば、ｐＨ７．５のＴＢＳ緩衝液）中で、適当な温度（例えば、約４℃）で、適当な期間（例えば、約１時間から一晩）、一緒にインキュベートされることによって、結合が起きる。
サンプル中の病原性プリオンタンパク質の存在は、病原性プリオンタンパク質をペプチド試薬と結合することによって検出される。病原性プリオンタンパク質を本発明のペプチド試薬に結合することによって病原性プリオンタンパク質の存在を検出することは、数多くの方法により達成され得る。例えば、本発明のペプチド試薬は、ペプチド試薬と病原性プリオンタンパク質との間に第１の複合体を形成することによって病原性プリオンタンパク質を特異的に「捕捉」するために使用され得、第１の複合体は、サンプル中に存在する任意の非病原性プリオンタンパク質を含む未結合サンプル物質から分離され得る。次いで、病原性プリオンタンパク質は、本発明の１個以上のペプチド試薬の付加および結合によって検出され得る。ここで、そのペプチド試薬は、検出可能に標識されている（すなわち、標識されたペプチド試薬である）。病原性プリオンタンパク質は、第１の複合体において検出され得るか、または本発明の標識されたペプチド試薬の付加の前および本発明の標識されたペプチド試薬への結合の前に、病原性プリオンタンパク質は、第１の複合体から解離され得る。
あるいは、本発明のペプチド試薬が、上記のような病原性プリオンタンパク質を捕捉するために使用する場合および第１の複合体が、未結合サンプル物質から分離される場合、病原性プリオンタンパク質が第１の複合体内に存在する間か、または第１の複合体から病原性プリオンタンパク質を解離した後に、検出可能に標識されたプリオン結合試薬は、病原性プリオンタンパク質を検出するために使用され得る。「プリオン結合試薬」は、いかなるコンホメーションのプリオンタンパク質にも結合する試薬である。代表的には、プリオン結合試薬は、プリオンタンパク質の変性型に結合する。このような試薬は、報告されており、それらとしては、例えば、抗プリオン抗体（とりわけ、Ｐｅｒｅｔｚら、１９９７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：６１４；Ｐｅｒｅｔｚら、２００１ Ｎａｔｕｒｅ ４１２：７３９；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９９８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４１３；米国特許第６，７６５，０８８号；米国特許第６，５３７，５４８号に記載されている）、モチーフグラフト化ハイブリッドポリペプチド（ＷＯ０３／０８５０８６を参照のこと）、特定の陽イオン性ポリマーまたは陰イオン性ポリマー（ＷＯ０３／０７３１０６を参照のこと）、「増殖触媒」である特定のペプチド（ＷＯ０２／０９７４４４４を参照のこと）およびプラスミノゲンが挙げられる。使用される特定のプリオン結合試薬が、プリオンの変性型に結合する場合、「捕捉された」病原性プリオンタンパク質がプリオン結合試薬で検出する前に変性されるべきであることは明らかである。
別の代替例において、プリオン結合試薬は、第１の複合体を形成するために、サンプル中に存在する任意のプリオン（病原性または非病原性）を捕捉するために使用され得る。そして、本発明の１個以上の検出可能に標識されたペプチド試薬は、第１の複合体中または第１の複合体からの解離後の病原性プリオンを検出するために使用され得る。
さらなる代替例において、サンプルは、固体支持体上に直接捕捉され得（すなわち、いかなるプリオン結合試薬なしで）、そして、病原性プリオンタンパク質が存在する場合、病原性プリオンタンパク質は、本発明の１個以上の検出可能に標識されたペプチド試薬を使用して検出され得る。
上記の捕捉工程および検出工程は、溶液中で実施可能であるか、または固体支持体中、もしくは固体支持体上で実施可能であるか、または溶液と固相のいくつかの組み合わせにおいて実施可能である。いくつかの適当な溶液相の形式としては、例えば、蛍光相関分光法（Ｇｉｅｓｅら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．２０００ １６：１６１；Ｂｉｅｓｃｈｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２０００ ９７：５５４６８を参照のこと）および蛍光共鳴エネルギー転移が挙げられる。代表的には、本発明のペプチド試薬は、これらの溶液相形式中で検出可能に標識される。好ましくは、ペプチド試薬は、２個以上の識別可能で検出可能な標識で標識される。病原性プリオンタンパク質の存在は、第１の複合体における２個以上の検出可能な標識の一致により検出され得る。適当な固相アッセイ形式は、本明細書中において記載される。一般に、固相形式のために、（１個以上の本発明のペプチド試薬または１個以上のプリオン結合試薬であり得る）捕捉試薬は、固体支持体に結合されているか、または結合するように適用されている。捕捉試薬は、当該分野で公知の任意の手段によって固体支持体に結合するように適用され得る。例えば、捕捉試薬および固体支持体は、それぞれ結合対の一方のメンバーを含み得るので、捕捉試薬が固体支持体と混合されるとき、捕捉試薬は、結合対のメンバーの結合を介して固体支持体に結合される。例えば、捕捉試薬が、ビオチンを含み得、そして、支持体が、アビジンまたはストレプトアビジンを含み得る。ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジンに加えて、この実施形態に適した他の結合対としては、例えば、抗原−抗体、ハプテン−抗体、ミメトープ−抗体、レセプター−ホルモン、レセプター−リガンド、アゴニスト−アンタゴニスト、レクチン−炭水化物、プロテインＡ−抗体Ｆｃが挙げられる。このような結合対は、周知であり（例えば、米国特許第６，５５１，８４３号および同第６，５８６，１９３号）、当業者は、適当な結合対を選択し、そしてそれらを本発明において使用するために適用する能力を有する。捕捉試薬が、上記のように支持体に結合するために適用されるとき、捕捉試薬が支持体に結合する前または後に、サンプルは捕捉試薬と接触し得る。
従って、本発明は、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと第１のペプチド試薬とを、病原性プリオンタンパク質が存在する場合、第１のペプチド試薬が病原性プリオンタンパク質に結合し得る条件下で接触させ、第１の複合体を形成する工程；および（ｂ）病原性プリオンタンパク質が存在する場合、病原性プリオンを第１のペプチド試薬に結合することによって、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出する工程を含む。ペプチド試薬は、本明細書中において記載されるとおりであり、好ましくは、ペプチド試薬は、配列番号
Figure 2008529537
 の配列を有するペプチドから誘導され、より好ましくは、配列番号
Figure 2008529537
 のうちの１つの配列を有するペプチド；または配列番号
Figure 2008529537
 を有するペプチドまたは配列番号５６、５７、６５、８２、８４もしくは１３６を有するペプチドから誘導される。ペプチド試薬は、ビオチン化することができる。ペプチド試薬は、固体支持体に結合することができる。いくつかの実施形態において、ペプチド試薬は、検出可能に標識され得る。
本発明はまた、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法を提供し、この方法は：（ａ）病原性プリオンが存在する場合、第１のペプチド試薬が病原性プリオンに結合し得る条件下で、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと、第１のペプチド試薬とを接触させて、第１の複合体を形成する工程；（ｂ）第２のペプチド試薬が前記第１の複合体における病原性プリオンに結合し得る条件下で、前記第１の複合体と第２のペプチド試薬とを接触させる工程、ここで、前記第２のペプチド試薬は、検出可能な標識を含み；および（ｃ）病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンを第２のペプチド試薬に結合することによって、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出する工程を含む。
その方法において、第１のペプチド試薬および第２のペプチド試薬を使用するとき、第１および第２のペプチド試薬は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。「同じ」とは、第１および第２のペプチド試薬が、第２のペプチド試薬における検出可能な標識を含むという点のみが異なるということを意味する。
第１のペプチド試薬および第２のペプチド試薬は、プリオンタンパク質の同じ領域由来のペプチドフラグメントまたはプリオンタンパク質の異なる領域由来のペプチドフラグメントから誘導され得る。第１のペプチド試薬および第２のペプチド試薬は配列番号
Figure 2008529537
 のいずれかを有するペプチドから誘導されるペプチド試薬から、それぞれ独立して選択され得る。
第１のペプチド試薬および第２のペプチド試薬は、配列番号
Figure 2008529537
 を有するペプチドから誘導されるペプチド試薬からそれぞれ独立して選択され得る。
第１のペプチド試薬は、配列番号
Figure 2008529537
 を有するペプチドから誘導されるペプチド試薬から選択され得、そして第２のペプチド試薬は、配列番号１４、３５、３６、３７、
Figure 2008529537
 を有するペプチドから誘導されるペプチド試薬から選択され得るか、またはその逆もあり得る。第１のペプチド試薬は、
Figure 2008529537
 を有するペプチドから誘導されるペプチド試薬から選択され得、そして第２のペプチド試薬は、配列番号５６、５７、６５、８２、８４および１３６を有するペプチドから誘導されるペプチド試薬から選択され得るか、またはその逆もあり得る。第１のペプチド試薬は、配列番号
Figure 2008529537
 を有するペプチドから誘導されるペプチド試薬から選択され得、そして第２のペプチド試薬は、配列番号５６、５７、６５、８２、８４および１３６を有するペプチドから誘導されるペプチド試薬から選択され得るか、またはその逆もあり得る。
第１のペプチド試薬は、ビオチン化され得、そして固体支持体に結合され得る。
本発明はまた、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）病原性プリオンが存在する場合、第１のペプチド試薬が病原性プリオンに結合し得る条件下で、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと第１のペプチド試薬とを接触させて、第１の複合体を形成する工程；（ｂ）未結合サンプル物質を除去する工程；（ｃ）前記第１の複合体から前記病原性プリオンを解離する工程；（ｄ）第２のペプチド試薬が病原性プリオンに結合し得る条件下で、前記解離された病原性プリオンと第２のペプチド試薬とを接触させる工程、ここで、前記第２のペプチド試薬は、検出可能な標識を含み；および（ｅ）病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンを第２のペプチド試薬に結合することによって、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出する工程を含む。第１および第２のペプチド試薬は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。
本発明はまた、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法を提供し、この方法は：（ａ）病原性プリオンが存在する場合、第１のペプチド試薬が病原性プリオンに結合し得る条件下で、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと第１のペプチド試薬とを接触させて、第１の複合体を形成する工程；（ｂ）未結合サンプル物質を除去する工程；（ｃ）前記病原性プリオンを前記第１の複合体から解離する工程；（ｄ）プリオン結合試薬が病原性プリオンに結合し得る条件下で、前記解離された病原性プリオンとプリオン結合試薬とを接触させる工程、ここで、前記プリオン結合試薬は、検出可能な標識を含み；および（ｅ）病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンをプリオン結合試薬に結合することによって、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出する工程を含む。プリオン結合試薬は、抗プリオン抗体、モチーフグラフト化ハイブリッドポリペプチド、陽イオン性ポリマーまたは陰イオン性ポリマー、増殖触媒およびプラスミノゲンまたはプリオンタンパク質に結合すると知られている他の任意の部分であり得る。
本発明はまた、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）病原性プリオンが存在する場合、プリオン結合試薬が病原性プリオンに結合し得る条件下で、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルとプリオン結合試薬とを接触させて、第１の複合体を形成する工程；（ｂ）未結合サンプル物質を除去する工程；（ｃ）ペプチド試薬が病原性プリオンに結合し得る条件下で、前記第１の複合体とペプチド試薬とを接触させる工程、ここで、前記ペプチド試薬は、検出可能な標識を含み；および（ｄ）病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンをペプチド試薬に結合することによって、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出する工程を含む。
本発明はまた、サンプル中の病原性プリオンを検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）第１のペプチド試薬を含む固体支持体を提供する工程；（ｂ）サンプル中に病原性プリオンが存在するとき、病原性プリオンが第１のペプチド試薬に結合し得る条件下で、固体支持体とサンプルとを接触させる工程；（ｃ）第２のペプチド試薬が第１のペプチド試薬に結合した病原性プリオンに結合し得る条件下で、固体支持体と、検出可能に標識された第２のペプチド試薬とを接触させる工程；および（ｄ）第１のペプチド試薬と、サンプル由来の病原性プリオンと、第２のペプチド試薬との間に形成された複合体を検出することによって、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出する工程を含む。
あるいは、プリオン結合試薬は、固体支持体上に提供され得る。従って、本発明は、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）プリオン結合試薬を含む固体支持体を提供する工程；（ｂ）サンプル中にプリオンタンパク質が存在する場合、プリオンタンパク質がプリオン結合試薬に結合し得る条件下で、固体支持体とサンプルとを接触させる工程；（ｃ）固体支持体と検出可能に標識された第２のペプチド試薬とを接触させる工程；および（ｄ）プリオン結合試薬と、生物学的サンプル由来の病原性プリオンと、第２のペプチド試薬との間に形成される複合体を検出する工程を含む。
アッセイは、競合的形式で提供され得る；すなわち、本発明は、サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法を提供し、その方法は：（ａ）第１のペプチド試薬を含む固体支持体を提供する工程；（ｂ）固体支持体と検出可能に標識された第１のリガンドとを混合する工程、ここで、検出可能に標識された第１のリガンドに対する第１のペプチド試薬の結合親和性は、病原性プリオンに対する第１のペプチド試薬の結合親和性よりも低く；（ｃ）サンプル中に病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンが第１のペプチド試薬に結合し得、そして第１のリガンドを置換し得る条件下で、サンプルと固体支持体とを混合する工程；（ｄ）第１のペプチド試薬とサンプル由来の病原性プリオンとの間で形成された複合体を検出する工程を含む。
一般に、本明細書中で記載されるようなペプチド試薬は、サンプル中のプリオンタンパク質に結合するために（例えば、捕捉試薬として）および／またはプリオンタンパク質の存在を検出するために（例えば、検出試薬として）使用される。捕捉試薬および検出試薬は、別個の分子であり得るか、または１つの分子が、捕捉および検出の両方の機能を果たし得る。特定の実施形態において、捕捉試薬および／または検出試薬は、病原性プリオンと優先的に相互作用する（すなわち、病原性プリオンに特異的である）、本明細書中において記載されるペプチド試薬である。他の実施形態において、捕捉試薬は、病原性プリオンに特異的であり、そして検出試薬は、病原型と非病原型の両方に結合し、例えば、プリオンタンパク質に結合する抗体である。このようなプリオン結合試薬は、本明細書中の上で記載してきた。あるいは、他の実施形態において、捕捉試薬は、病原性プリオンに特異的ではなく、検出試薬が、病原性プリオンに特異的である。
次いで、適当な任意の検出の手段は、本明細書中において記載されるようなペプチド試薬とプリオンタンパク質との間の結合を同定するために使用され得る。例えば、本明細書中で記載されるようなアッセイは、標識されたペプチド試薬または抗体の使用に関し得る。本発明における使用に適した検出可能な標識は、検出することができる任意の分子を含み、それらとしては、放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質、発色団、蛍光性半導体ナノ結晶、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素インヒビター、発色団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、ストレプトアビジンまたはハプテン）などが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる標識としては、検出可能な範囲において蛍光を示すことができる物質またはその部分を含む、蛍光を使用したものが挙げられるが、これらに限定されない。本発明において使用され得る標識の特定の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、テキサスレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびβ−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、検出可能な標識は、オリゴヌクレオチドタグを含み得る。そのタグは、ＰＣＲ、ＴＭＡ、ｂ−ＤＮＡ、ＮＡＳＢＡなどを含む核酸検出の任意の公知の方法によって検出され得る。
標識された検出試薬の使用に加えて（上記）、免疫沈降が、プリオンタンパク質（例えば、病原性プリオン）に結合しているペプチド試薬を分離するために使用され得る。好ましくは、免疫沈降は、沈降促進剤の添加によって、促進される。沈降促進剤は、病原性プリオンに結合しているペプチド試薬の沈降を促進または増大し得る部分を含む。このような沈降促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、プロテインＧ、プロテインＡなどが挙げられる。プロテインＧまたはプロテインＡが、沈降促進剤として使用される場合、そのタンパク質は、必要に応じてビーズ、好ましくは、磁気ビーズに結合され得る。沈降は、遠心分離の使用または磁力の使用によってさらに促進され得る。このような沈降促進剤の使用は、当該分野で公知である。
検出試薬からシグナルを増幅するアッセイもまた知られている。このようなアッセイの例は、ビオチンおよびアビジンならびに酵素標識されたものを利用するアッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイなどのイムノアッセイを媒介したアッセイである。
本明細書中において記載されるアッセイの１つ以上の工程は、溶液（例えば、液体の媒質）中または固体支持体上で実施され得る。本発明の目的で、固体支持体は、目的の分子（例えば、本発明のペプチド試薬、プリオンタンパク質、抗体など）が連結され得るか、または結合され得る、不溶性マトリックスであり、かつ強固な表面または半剛体の表面を有し得る任意の材料であり得る。例示的な固体支持体としては、基材、例えば、ニトロセルロース、ポリ塩化ビニル；ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックス、ポリカーボネート、ナイロン、デキストラン、キチン、砂、シリカ、軽石、アガロース、セルロース、ガラス、金属、ポリアクリルアミド、ケイ素、ゴム、多糖類、ポリビニルフルオライド；ジアゾ化ペーパー；活性化ビーズ、磁気的反応性ビーズならびに固相合成、アフィニティー分離、精製、ハイブリダイゼーション反応、イムノアッセイおよび他のそのような用途に通常使用される任意の材料が挙げられるが、これらに限定されない。支持体は、粒子状であり得るか、または連続した表面の形態であり得、それらとしては、膜、メッシュ、プレート、小球、スライド、円板、毛細管、中空糸、針、ピン、チップ、固体繊維、ゲル（例えば、シリカゲル）およびビーズ（例えば、孔−ガラスビーズ、シリカゲル、必要に応じてジビニルベンゼンで架橋されたポリスチレンビーズ、グラフト化された共重合ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、必要に応じてＮ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンで架橋されたジメチルアクリルアミドビーズ、酸化鉄磁気ビーズおよび疎水性ポリマーでコートされたガラス粒子が挙げられる。
本明細書中で記載されるようなペプチド試薬は、標準的な技術を使用して固体支持体に容易に結合され得る。支持体への固定は、ペプチド試薬をタンパク質に第１の結合をすることによって促進され得る（例えば、タンパク質がよりよい固相結合特性を有する場合）。適当な結合タンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎｅ）、オバルブミンおよび当業者に周知の他のタンパク質を含む血清アルブミンなどの高分子が挙げられるが、これらに限定されない。支持体に分子を結合するために使用され得る他の試薬としては、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体のアミノ酸、アミノ酸共重合体などが挙げられる。このような分子およびこれらの分子をタンパク質に結合する方法は、当業者に周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．Ａ．，（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，３：２−１３；Ｈａｓｈｉｄａら、（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６：５６−６３；およびＡｎｊａｎｅｙｕｌｕ ａｎｄ Ｓｔａｒｏｓ（１９８７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊ．ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３０：１１７−１２４を参照のこと。
所望であれば、固体支持体に加えられるべき分子は、スチレン部分またはアクリレート部分を生成するために容易に官能性を持たせられ得る。従って、ポリスチレン、ポリアクリレートまたは他のポリマー（例えば、ポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、多糖、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエーテル、エポキシ、シリカガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリホスフェート、ヒドロゲル、アガロース、セルロースなど）に分子を組み込むことができる。
ペプチド試薬は、分子の結合対の相互作用を介して固体支持体に結合され得る。このような結合対は、周知であり、例は、本明細書中の別の箇所に記載されている。結合対の一方のメンバーは、上記の技術によって固体支持体に結合され、そして結合対の他方のメンバーは、ペプチド試薬に結合される（合成前、合成中、合成後）。すなわち、改変されたペプチド試薬は、サンプルと接触され得、そして病原性プリオンが存在する場合、固体支持体がペプチド試薬（またはペプチド−プリオン複合体）と接触された後、病原性プリオンとの相互作用が、溶液中で起き得る。この実施形態についての好ましい結合対としては、ビオチンとアビジンおよびビオチンとストレプトアビジンが挙げられる。
適当なコントロールもまた、本発明のアッセイにおいて使用され得る。例えば、ＰｒＰＣのネガティブコントロールが、アッセイにおいて使用され得る。ＰｒＰＳｃ（またはＰｒＰｒｅｓ）のポジティブコントロールもまたアッセイにおいて使用され得る。このようなコントロールは、必要に応じて検出可能に標識されていてもよい。
本発明のペプチド試薬を使用するいくつかの変法および組み合わせが、本発明のアッセイに適用され得る。以下の非限定的な例が、例示のために記載される。
特定の実施形態において、アッセイは、生物学的サンプル中の病原性プリオンを検出するために説明される。このような方法において、本発明のペプチド試薬は、生物学的サンプルまたは非生物学的サンプル中の病原性プリオンについての捕捉試薬として使用され得る。このような実施形態において、固体支持体（例えば、磁気ビーズ）は、まず、病原性プリオンと優先的に相互作用する、本明細書中で記載されるようなペプチド試薬と反応する。ここで、ペプチド試薬は、その支持体に十分固定されている。次いで、固体支持体を、ペプチド試薬が病原性プリオンに結合し得る条件下で、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと接触させる。未結合サンプル物質を除去した後、結合している病原性プリオンを、ペプチド試薬から解離し、公知の任意の検出メカニズムを使用して検出し得る。その検出メカニズムとしては、例えば、以下の実施例および本明細書中で引用された参考文献に記載されているようなウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、結合している病原性プリオンは、ペプチド試薬から解離せずに検出され得る。
あるいは、本発明のペプチド試薬は、固体支持体に結合する前に、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと接触され得、その後、ペプチド試薬を固体支持体に結合する（例えば、ペプチド試薬は、ビオチン化され得、固体支持体は、アビジンまたはストレプトアビジンを含む）。未結合サンプル物質を除去した後、病原性プリオンは、ペプチド試薬から解離され、そして任意の公知の検出メカニズムを使用して検出され得る。その検出メカニズムとしては、以下の実施例および本明細書中で引用された参考文献に記載されているようなウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、病原性プリオンは、検出の前にペプチド試薬から解離される必要がない。
サンプル中の病原性プリオンの検出は、病原型と優先的に相互作用する、本明細書中において記載されるようなペプチド試薬を使用することによって達成され得る。あるいは、病原性プリオンは、非特異的な検出試薬（例えば、一般にＰｒＰに結合するペプチドまたは抗体）によって検出され得る。特定の実施形態において、固体支持体からの解離後、捕捉された病原性プリオンは、検出の前に変性される。これにより、非特異的な検出試薬を使用することによって検出が促進され得る。あるいは、例えば、ペプチド試薬が、ペプチド試薬と病原性プリオンとを共有結合するために使用され得る活性化可能な反応基（例えば、光反応基）を含むように改変される場合、捕捉された病原性プリオンは、ペプチド試薬からの解離なしで変性され得る。
Ｒｙｏｕら、（２００３）Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．８３（６）：８３７−４３に記載されているようなＥＬＩＳＡのプロトコールは、固体支持体から溶出される病原性プリオンの量を定量するために実施され得る。（実施例を参照のこと）。簡潔には、マイクロタイタープレートのウェルを、固体支持体から解離（溶出）された、捕捉された病原性プリオンでコートする。そのプレートを洗浄することにより、未結合部分を除去し得、そして検出可能に標識された結合分子（例えば、抗プリオン抗体または本発明のペプチド試薬（捕捉のために使用されるのと同じものまたは異なるもの））を加える。この結合分子を、任意の捕捉されたサンプルプリオンと反応させ、そのプレートを洗浄し、標識された抗体および／または標識されたペプチド試薬の存在を当該分野で周知の方法を使用して検出する。結合分子は、捕捉試薬が病原性プリオン型に特異的であるかぎり、病原性プリオン型に特異的である必要はないが、アイソフォームまたは変性されたＰｒＰの両方に結合し得る。
他の例示的なアッセイにおいて、捕捉試薬およびプリオンは、検出の前に解離されない。例えば、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）を第１の病原性プリオン特異的分子（ペプチド試薬）と結合する。次いで、病原性プリオンを含むかまたは含むと疑われる生物学的サンプルを固体支持体に加える。病原性プリオンが第１の分子に十分結合し得るインキュベーション時間が経過した後、その固体支持体を洗浄することにより未結合部分を除去し得、そして上記のような検出可能に標識された第２の結合分子（例えば、第２の抗ＰｒＰ抗体またはプリオン特異的ペプチド試薬）を加える。あるいは、病原型および非病原型に結合する分子（例えば、非特異的捕捉試薬）を固体支持体に結合し得る（例えば、マイクロタイタープレートのウェル上にコートし得る）。そして病原性プリオン特異的検出試薬（例えば、本明細書中において記載されるペプチド試薬）を使用して検出が達成され得る。
別の例示的なアッセイである、「２ペプチドサンドイッチ」アッセイは、プリオン（例えば、病原性プリオン）を検出するために使用され得る。この技術において、固体支持体を、本明細書中において記載されるような本発明の１個以上の第１のペプチド試薬と反応させて、洗浄することにより未反応の第１のペプチド試薬を除去し、次いで第１のペプチド試薬とサンプル中に存在する任意の病原性プリオンタンパク質との間で相互作用し得る条件下で、病原性プリオンタンパク質を含むと疑われる試験サンプル（例えば、生物学的サンプル）に曝露する。未反応のサンプル成分を除去し、そして存在する任意の病原性プリオンタンパク質と相互作用する第２のペプチド試薬が相互作用し得る条件下で、本発明の１個以上の第２のペプチド試薬を加える。第１のペプチド−プリオンタンパク質−第２のペプチドの相互作用は、当該分野で公知である任意の手段によって検出され得る。代表的には、第２のペプチド試薬は、検出可能な標識を含む。このアッセイにおいて、第１のペプチド試薬および／または第２のペプチド試薬は、病原性プリオンタンパク質と優先的に相互作用する。
特定の実施形態において、抗ＰｒＰ抗体を、プリオンタンパク質を検出するために使用する。プリオン、特にＰｒＰＣまたは変性ＰｒＰに結合する抗体、改変抗体および他の試薬については、報告されており、これらのいくつかは、市販されている（例えば、Ｐｅｒｅｔｚら、１９９７ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：６１４；Ｐｅｒｅｔｚら、２００１ Ｎａｔｕｒｅ ４１２：７３９；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら、１９９８ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９４１３；米国特許第６，７６５，０８８号に記載されている抗プリオン抗体）。これらのいくつかおよび他のものは、とりわけ、ＩｎＰｒｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ ＭＩ；Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈから市販されている；改変抗体の説明については、ＷＯ０３／０８５０８６も参照のこと）。
本発明のペプチド試薬はまた、競合アッセイにおいて使用され得る。検出の手段を使用して、ＰｒＰＳｃに弱く結合しているリガンドが、本明細書中において記載されるＰｒＰＳｃに特異的なペプチド試薬によって置換されるとき同定し得る。例えば、ＰｒＰＳｃを含むと疑われるサンプルが、固体支持体上に吸着され得る。続いて、その固体支持体を、検出可能に標識されたリガンドがＰｒＰＳｃに結合するような条件下で、ＰｒＰＳｃに結合する検出可能に標識されたリガンド（例えば、プラスミノゲン、ラミニンレセプターおよびヘパラン硫酸）と混合される。リガンド−ＰｒＰＳｃ複合体を検出する。次いで、本明細書中で記載されるようなＰｒＰＳｃ結合ペプチド試薬を加える。病原性プリオンに対する検出可能に標識されたリガンドの結合親和性は、ペプチド試薬の結合親和性よりも弱い。従って、ＰｒＰＳｃ結合ペプチド試薬は、標識されたリガンドを置換し得、標識されたリガンドの検出量の減少は、ペプチド試薬と生物学的サンプル由来の病原性プリオンとの間で形成された複合体が検出され得ることを示す。
本明細書中において記載されるペプチド試薬を含む上記のアッセイ試薬は、上記のような検出アッセイを実施するために、適当な指示書および他に必要な試薬を備えるキットとして提供され得る。ペプチド試薬が、固体支持体上に吸着されている場合、そのキットは、１個以上の固体支持体上に吸着されたそのようなペプチド試薬をさらに備え得るか、または代わりに備え得る。そのキットは、上記のような、適当なポジティブコントロールおよびネガティブコントロールをさらに備え得る。そのキットはまた、使用される特定の検出アッセイに依存して、適当な標識および他のパッケージ化された試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）を備え得る。
なおもさらなる実施形態において、本発明は、病原性プリオン特異的ペプチド試薬を含む固体支持体に関する。これらの固体支持体を作製する方法がまた提供され、その方法は、例えば、（ａ）固体支持体を提供する工程；および（ｂ）それに１個以上の病原性プリオン特異的ペプチド試薬を結合する工程を含む。
プリオン特異的ペプチド試薬は、親和性支持体を使用して病原性プリオンタンパク質を単離するためにさらに使用され得る。そのペプチド試薬は、例えば、吸着、共有結合などによって固体支持体に結合され得、そのペプチド試薬は、それらのプリオン選択的結合活性を保持する。例えば、ペプチド試薬の結合部位を露出させたままにするために、必要に応じて、スペーサー基を含み得る。次いで、固定された分子は、生物学的サンプル（例えば、血液、血漿、脳、脊髄、他の組織）由来の病原性プリオンタンパク質を結合するために使用され得る。結合したペプチド試薬または複合体は、例えば、ｐＨを変化させることによって支持体から回収されるか、または病原性プリオンが、複合体から解離され得る。
本発明に従って試験され得るサンプルとしては、生存被験体または死亡被験体由来の神経系組織（例えば、脳、脊髄、ＣＳＦなど）由来のサンプル、血液および／または他の組織サンプルを含む、抗体アッセイに反応する任意のサンプルが挙げられる。上で述べたように、好ましい実施形態において、サンプルは、血液、血液供給物または生存被験体から得られた組織サンプルである。
（ＶＩ．さらなる用途）
（Ａ．検出）
上で記載したように、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、被験体のプリオン病を診断するために使用され得る。さらに、上記のペプチド試薬はまた、任意のサンプル、例えば、血液および／または食品供給物中の病原性プリオンの汚染を検出するために使用され得る。本発明は、サンプルの供給物、例えば、血液供給物または食品供給物からサンプルを選択する方法を提供し、この方法は、病原性プリオンタンパク質を含まないサンプルを選択する工程を含む。すなわち、実質的に病原性プリオンを含まない血液供給物を、本明細書中において記載される検出アッセイのいずれかを使用して、個々の回収されたサンプルまたは貯蔵されたサンプル由来のアリコートをスクリーニングすることにより調製し得る。病原性プリオンで汚染されたサンプルまたは貯蔵されたサンプルは、それらが混合される前に排除され得る。このようにして、実質的に病原性プリオン汚染がない血液供給物が提供され得る。「実質的に病原性プリオンを含まない」とは、本明細書中において記載されるアッセイのいずれを使用しても、病原性プリオンの存在が検出されないことを意味する。重要なことには、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、希釈した脳組織中の病原性タンパク質型を、正常組織と比較して１０６倍検出することがすでに示されており、本明細書中において記載されるペプチド試薬は、血液中の病原性プリオンを検出することが可能であり得る唯一の証明された試薬である。
従って、本発明は、本明細書中において記載される１個以上のペプチド試薬と優先的に相互作用する病原性プリオンタンパク質を含まないサンプルを選択する工程を含む、サンプルの供給物からサンプルを選択する方法を提供する。あるいは、本発明は、本明細書中において記載される１個以上のペプチド試薬と優先的に相互作用する病原性プリオンタンパク質を含むサンプルを選択する工程を含む、サンプルの供給物からサンプルを選択する方法を提供する。本明細書中において記載される方法を使用すると、どのサンプルが記載されたペプチド試薬と相互作用する病原性プリオンタンパク質を含むか、また、どのサンプルがそのようなタンパク質を含まないかが、容易に決定され得る。さらなる実施形態において、本発明は、実質的に病原性プリオンを含まない血液供給物を調製する方法を提供し、前記血液供給物は、全血、赤血球、血漿、血小板または血清を含み、前記方法は：（ａ）病原性プリオンを検出するための本明細書中に提供される検出方法のいずれかによって、回収された血液サンプル由来の全血、赤血球、血漿、血小板または血清のアリコートをスクリーニングする工程；（ｂ）病原性プリオンが検出されたサンプルを排除する工程；および必要に応じて（ｃ）病原性プリオンが検出されなかったサンプルを混合することにより、実質的に病原性プリオンを含まない血液供給物を提供する工程を含む。
同様に、実質的に病原性プリオンを含まない食物を提供するために、病原性プリオンの存在について食品供給物をスクリーニングし得る。従って、本明細書中において記載される方法のいずれかを使用して、ヒトまたは動物の消費のための食物として意図される生存生物体由来のサンプルが病原性プリオンの存在についてスクリーニングされ得る。食品供給物に投入することを意図される食品から得られるサンプルもまたスクリーニングされ得る。病原性プリオンが検出されたサンプルが同定され、そして病原性プリオンが検出されたサンプル由来の、食品供給物に投入することを意図された生存生物体または食物が、食品供給物から除去される。このようにして、実質的に病原性プリオンを含まない食品供給物が提供され得る。
従って、本発明は、実質的に病原性プリオンを含まない食品供給物を調製する方法を提供し、前記方法は：（ａ）食品供給物に投入し得る生存生物体から回収されたサンプルまたは食品供給物に投入することを意図された食物から回収されたサンプルを、病原性プリオンを検出するための本明細書中に提供された検出方法のいずれかによってスクリーニングする工程（ｂ）病原性プリオンが検出されたサンプルを排除する工程；および必要に応じて（ｃ）病原性プリオンが検出されなかったサンプルを混合することにより、実質的に病原性プリオンを含まない食品供給物を提供する工程を含む。
（Ｂ．精製）
本発明のペプチドはまた、病原性プリオンを単離する目的（例えば、検出前にプリオンタンパク質を濃縮するため）およびサンプルから病原性プリオンを排除する目的（例えば、実質的に病原性プリオンを含まないサンプルを提供する手段として）の両方のために、サンプルから病原性プリオンを除去するために使用され得る。これらの方法において、ペプチド試薬は、代表的には、固体支持体上に提供される。ペプチド試薬を含む固体支持体を、プリオンがペプチド試薬と結合する条件下で、病原性プリオンを含むサンプルと接触させる。目的が、病原性プリオンを単離することである場合、未結合サンプルは、除去され、そしてプリオンを含む固体支持体が回収される；目的が、サンプルからプリオンを排除することである場合、未結合サンプルが回収される。
従って、本発明は、サンプルから病原性プリオンタンパク質を単離するための方法を提供し、この方法は：（ａ）本発明に従って、ペプチド試薬を含む固体支持体を提供する工程；（ｂ）前記サンプル中に病原性プリオンタンパク質が存在する場合、病原性プリオンタンパク質が前記第１のペプチド試薬に結合し得る条件下で、前記サンプルと前記固体支持体とを接触させて、第１の複合体を形成する工程および（ｃ）未結合サンプル物質を除去する工程を含む。
さらなる実施形態において、前記病原性プリオンタンパク質は、前記第１の複合体から解離され得る。この解離工程は、タンパク質精製分野において周知の技術によって達成され得る。
本発明はまた、サンプルから病原性プリオンタンパク質を排除するための方法を提供し、この方法は；（ａ）本発明に従って、ペプチド試薬を含む固体支持体を提供する工程；（ｂ）病原性プリオンタンパク質が存在する場合、病原性プリオンタンパク質がペプチド試薬に結合し得る条件下で、前記固体支持体と、病原性プリオンタンパク質を含むと疑われるサンプルとを接触させる工程；および（ｃ）未結合のサンプル物質を回収する工程を含む。
（Ｃ．組成物）
本発明は、さらに、本明細書中において記載されるペプチド試薬および／または抗体（ならびにこれらのペプチド試薬および／または抗体をコードするポリヌクレオチド）を含む組成物ならびにプリオン関連疾患の処置または予防のために治療的組成物および予防的組成物においてこれらの組成物を使用する方法に関する。さらに、抗体、ペプチド試薬（ならびにこれらの抗体および／またはペプチド試薬をコードするポリヌクレオチド）はまた、予防的な目的（すなわち、発病を予防するため）または治療的な目的（感染後の疾患を処置するため）のために個別に、または組み合わせて組成物中で使用され得る。
本明細書中において記載される組成物が疾患を処置または予防するために作用する正確なメカニズムは、重要ではない。１つの理論に拘束されずに、本明細書中において記載される組成物は、以下のメカニズム：被験体における免疫応答の誘導によって、疾患状態を処置または予防すること；非病原型と相互作用（例えば、結合）して、非病原型への変換を予防し得ること；病原型に結合して、病原性の結果を予防し得ること；および／または病原型に結合して、病原型が非病原型を疾患型にさらに変換することを妨げ得ることの１個以上によってコンホメーション疾患を処置または予防するために作用し得る。（例えば、特定のＦａｂがプリオンの伝播を阻害する能力のアッセイについては、Ｐｅｒｅｔｚら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４１２：７３９−７４３を参照のこと）。
それらの組成物は、ペプチド試薬、抗体および／またはポリヌクレオチドの１個以上の混合物を含み得る。これらの分子は、種々の起源、例えば、組換えで産生されたタンパク質、合成的に生成されたタンパク質などから得られる場合がある。組成物はまた、他の分子、例えば、抗原および免疫調節物質（例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、リンフォカインおよびケモカイン（それらとしては、ＩＬ−２、改変ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５−ｓｅｒ１２５）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、α−インターフェロンまたはγ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰ１およびＲＡＮＴＥＳが挙げられるがこれらに限定されない）と併せて投与され得る。それらの組成物は、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクター）または非ウイルスベクター（例えば、リポソーム、核酸またはタンパク質でコートされた粒子）を使用して、ポリペプチドまたは裸の核酸（例えば、ＤＮＡ）として投与され得る。
それらの組成物はまた、ペプチド試薬と核酸の混合物を含み得、同じかまたは異なる様式および／またはビヒクルを使用して送達され得る。同じかまたは異なる組成物を、１回以上投与し得る（例えば、「初回」投与に続いて１回以上の「追加免疫」）ことにより、所望の効果が達成される。同じ組成物が、初回および１回以上の追加免疫として投与され得る。あるいは、異なる組成物が初回および追加免疫のために使用され得る。
本発明の組成物は、好ましくは、薬学的に許容可能であり、かつ薬理学的に許容可能である。特に、組成物は、好ましくは、生物学的または他の面で、望ましくないものでなく、すなわち、その材料は、いかなる望ましくない生物学的作用も引き起こさずに、または含まれる組成物のどの成分とも有害な様式で相互作用せずに、処方物または組成物として個体に投与され得る。
本明細書中で記載されるような組成物は、代表的には、治療有効量の分子（ペプチド試薬）または同じものをコードするヌクレオチド配列、これらの分子に特異的な抗体および必要に応じて他の任意の上記の成分を含み得る。「治療有効量」とは、組成物を投与される、感染していない被験体、感染している被験体または曝露されていない被験体において、保護的および／または治療的な応答を誘導する量を意味する。「治療有効量」は、慣習的な試験によって決定され得る比較的広い範囲に入る。必要とされる正確な量は、処置される被験体；処置される個体の年齢および全身の状態；その個体が抗体を合成する免疫系の能力；望む保護の程度；処置される状態の重症度；選択される特定の組成物およびその投与の様式などの他の因子に依存して変化する。
特定の実施形態において、ペプチド試薬は、免疫原性であり、本発明の方法は、本明細書中において記載されるようなペプチド試薬、病原性プリオンに特異的な抗体および／またはこれらのペプチド試薬もしくは抗体をコードするポリヌクレオチドを含む免疫原性の組成物を動物に投与する工程を含む。本発明において使用される免疫原性の組成物は、好ましくは、免疫学的有効量のこれらの成分を含む。「免疫学的有効量」とは、プリオンタンパク質、好ましくは、病原性プリオンに対して哺乳動物が免疫応答を惹起し得るのに十分な量のことである。免疫応答は、一般に、被験体において、分泌、細胞および／または抗体媒介性の免疫応答を発生させる。通常、このような応答としては、以下の作用の１つ以上；任意の免疫学的分類（例えば、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭ）由来の抗体の産生；Ｂリンパ球およびＴリンパ球の増殖；免疫学的細胞への活性化シグナル、増殖シグナルおよび分化シグナルの提示；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の増殖が挙げられるが、これらに限定されない。産生される抗体の量は、使用する動物、アジュバントの存在などを含むいくつかの因子によって変化し得る。
本発明の組成物は、さらに、１個以上のアジュバントを含み得る。本発明の使用に適するアジュバントとしては、米国特許出願第１０／９１７，６４６号（その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されているアジュバントの１個以上が挙げられる。
本発明の使用に適するアジュバントとしては、以下：Ｅ．ｃｏｌｉ易熱性エンテロトキシン（「ＬＴ」）または解毒されたその変異体（例えば、Ｋ６３またはＲ７２変異体）；コレラ毒素（「ＣＴ」）または解毒されたその変異体；生分解性および非毒性である物質（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された微小粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍの粒子、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍおよび最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜約１０μｍ）；ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（国際特許出願ＷＯ９９／５２５４９を参照のこと）；オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（国際特許出願ＷＯ０１／２１２０７を参照のこと）または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（オクトキシノールなど）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（国際特許出願ＷＯ０１／２１１５２を参照のこと）；キトサン（例えば、国際特許出願ＷＯ９９／２７９６０）；免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン（国際特許出願ＷＯ００／６２８００を参照のこと）；免疫賦活性二本鎖ＲＮＡ；アルミニウム化合物（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム、オキシ水酸化物、オルトホスフェート、スルフェートなど（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５（ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘ）（以後、「Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ」）の８および９章を参照のこと）または任意の適当な形態の化合物（例えば、ゲル、結晶、非結晶など）と様々なアルミニウム化合物との混合物および吸着に好ましい様々なアルミニウム化合物の混合物；ＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０および０．５％Ｓｐａｎ８５を、ミクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を使用してサブミクロン粒子に処方したもの）（Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎの１０章を参照のこと；国際特許出願ＷＯ９０／１４８３７も参照のこと）；リポソーム（Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎの１３および１４章を参照のこと）；ＩＳＣＯＭ（Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎの２３章を参照のこと）；１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ、サブミクロンエマルジョンにミクロ流動化したものまたはより大きい粒径のエマルジョンを生成するためにボルテックスしたもの（Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎの１２章を参照のこと）；２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０ならびに、モノホスホリルリピド（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースダイマイコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１個以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）；ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとしても知られる、ＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１などのサポニンアジュバント（Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎの２２章を参照のこと）；さらなる界面活性剤を含まないＩＳＣＯＭ（国際特許出願ＷＯ００／０７６２１）；フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子など）（Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎの２７および２８章を参照のこと）；モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎの２１章）；３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ（欧州特許出願０８３５３１８、０７３５８９８および０７６１２３１）；ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド（Ｋｒｉｅｇ（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ，１９：６１８−６２２；Ｋｒｉｅｇ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３：１５−２４；ＷＯ９６／０２５５５，ＷＯ９８／１６２４７，ＷＯ９８／１８８１０，ＷＯ９８／４０１００，ＷＯ９８／５５４９５，ＷＯ９８／３７９１９およびＷＯ９８／５２５８１などを参照のこと）、すなわち少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド；ポリオキシエチレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル（国際特許出願ＷＯ９９／５２５４９）；オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（国際特許出願ＷＯ０１／２１２０７）または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（オクトキシノールなど）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（国際特許出願ＷＯ０１／２１１５２）；免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン（国際特許出願ＷＯ００／６２８００）；免疫賦活薬および金属塩の粒子（国際特許出願ＷＯ００／２３１０５）；サポニンおよび水中油型エマルジョン（国際特許出願ＷＯ９９／１１２４１）；ならびにサポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）（国際特許出願ＷＯ９８／５７６５９）の１個以上が挙げられる。
ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル（ａｃｔｅｙｌ）−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
粘膜投与または非経口投与に適した他のアジュバントも、利用可能である（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５（ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘ）の７章を参照のこと。
免疫応答が増強されるので、ＬＴの変異体、特に「Ｋ６３」および「Ｒ７２」変異体（例えば、国際特許出願ＷＯ９８／１８９２８を参照のこと）は、好ましいアジュバント（例えば、粘膜アジュバント）である。
微小粒子もまた、有用であり、好ましくは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特に、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）、Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドまたはグリコール酸との共重合体（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとの共重合体から誘導される。それらの微小粒子は、種々の分子量およびＰＬＧなどの共重合体の場合、種々のラクチド：グリコリド比を有する様々な重合体出発物質のいずれかから誘導され得、それらの選択は、大いに選択の余地がある。本発明のプリオン、抗体および／またはポリヌクレオチドは、微小粒子内に封入され得るか、またはそれらに吸着され得る。ＰＬＧ微小粒子内への封入が好ましい。ＰＬＧ微小粒子については、Ｍｏｒｒｉｓら、（１９９４），Ｖａｃｃｉｎｅ，１２：５−１１，Ｍｕｃｏｓａｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｅｄｓ．Ｋｉｙｏｎｏら、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９６（ＩＳＢＮ０１２４１０５８７）の１３章およびＶａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ：ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ，ｅｄｓ．Ｐｏｗｅｌｌ ＆ Ｎｅｗｍａｎ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ １９９５（ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘ）の１６および１８章にさらに詳細に記述されている。
ＬＴ変異体は、微小粒子を封入した抗原と組み合わせて好都合に使用され得、その結果、顕著な免疫応答の増強が見られる。
アルミニウム化合物およびＭＦ５９は、非経口に使用するための好ましいアジュバントである。
代表的には、組成物は、液体の溶液または懸濁液のいずれかとして、注入可能に調製される；液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適する固体の形態が注射前に調製され得る。その調製物もまた、上で記載したように、アジュバントの効果を増強するために、乳化され得るか、またはリポソーム内に封入され得る。
薬学的に許容可能な塩もまた、本発明の組成物中に使用され得る。その塩としては、例えば、無機塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩）ならびに有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩（ｐｒｏｐｒｉｏｎａｔｅ）、マロン酸塩または安息香酸塩）が挙げられる。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オバルブミン、破傷風トキソイドおよび当業者に周知の他のタンパク質である。
本発明の組成物はまた、液体または賦形剤（例えば、水、食塩水、グリセロール、デキストロース、エタノールなど）ならびに薬剤（例えば、湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤）を、単独でまたは組み合わせて含み得る。必要に応じて、それ自体で組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘導しない分子であるキャリアが、存在する。適当なキャリアは、代表的には、大型の、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸の重合体、アミノ酸の共重合体、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）および不活性なウイルス粒子）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。さらに、組成物中の１個以上のポリペプチドは、細菌のトキソイド（例えば、ジフテリア、破傷風、コレラなど由来のトキソイド）に結合体化され得る。
（Ｄ．送達）
本発明の組成物は、単回用量または投与レジメンの一部として投与され得る。核酸および／またはペプチドが、任意の適当な様式によって投与され得る。その様式としては、筋肉内、粘膜内、皮下、皮内、経皮的、膣内、直腸内、経口的および／または静脈内が挙げられるがこれらに限定されない。投与レジメンは、初回投薬および追加免疫投薬を含み得、経粘膜的、非経口的またはそれらの様々な組み合わせで投与され得る。
特定の実施形態において、組成物の１個以上の成分は、非経口的または経粘膜的に投与される。非経口投与の適当な経路としては、筋肉内（ＩＭ）、皮下、静脈内、腹腔内、皮内、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）および経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）（例えば、国際特許出願ＷＯ９８／２０７３４を参照のこと）な経路ならびに組織の間質腔への送達が挙げられる。粘膜投与の適当な経路としては、経口、鼻腔内、胃内、肺内、腸管、直腸、眼球および膣の経路が挙げられる。組成物は、粘膜投与に適合され得る。例えば、組成物が、経口投与用である場合、組成物は、錠剤またはカプセルの形態、必要に応じて、腸溶コーティング、液体、トランスジェニック植物などの形態であり得る。組成物が鼻腔内投与用である場合、組成物は、点鼻薬、点鼻液、ゲルまたは散剤の形態であり得る。投薬処置は、単回投与スケジュールまたは反復投与スケジュールであり得る。
組成物（またはそれらの成分）はまた、カプセル化され得るか、粒子状のキャリアに吸着され得るか、または粒子状のキャリアに会合され得る。このようなキャリアは、多コピーの選択された抗原を免疫系に提示し、そして局所的なリンパ節において、抗原の捕捉および保持を促進する。これらの粒子は、マクロファージによって貪食され得、そしてサイトカイン放出を介して抗原提示を促進し得る。粒子状のキャリアの例としては、ポリメタクリル酸メチルポリマーから誘導されるものならびにＰＬＧとして知られるポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から誘導される微小粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ ＪＰ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ．１４（２）：１９７−２１０，１９９７；Ｏ’Ｈａｇａｎ ＤＴ，ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ １１（２）：１４９−５４，１９９３を参照のこと。適当な微小粒子はまた、荷電界面活性剤（例えば、陰イオン性界面活性剤または陽イオン性界面活性剤）の存在下で作製され、正味の負の電荷または正味の正の電荷を有する表面を有する微小粒子が得られる。例えば、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などの陰イオン性界面活性剤を用いて作製された微小粒子、すなわち、ＣＴＡＢ−ＰＬＧ微小粒子は、ＤＮＡなどの負に帯電した高分子を吸着する（例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３０８を参照のこと）。
さらに、他の粒子系およびポリマーが、インビボ送達またはエキソビボ送達に使用され得る。例えば、ポリマー（例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジンならびにこれらの分子の結合体）が、目的の核酸の移送に有用である。同様に、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降または他の不溶性無機塩（例えば、リン酸ストロンチウム、ベントナイトおよびカオリンを含むケイ酸アルミニウム、酸化第二クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクなど）を使用した沈降が、本方法において使用され得る。遺伝子導入に有用な送達系の概説として、例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。ペプトイド（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，１９９８年１１月３日に発行された米国特許第５，８３１，００５号、本明細書中に参考として援用される）はまた、本発明の構築物の送達に使用され得る。
上で述べたように、ペプチド（または抗体）は、これらの分子をコードする核酸としても送達され得る。所望の配列が、選択された調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を含む、一シストロン性（ｕｎｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクターまたは多シストロン性（ｍｕｌｔｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクターに挿入される。一旦、完成すると、構築物は、標準的な遺伝子送達プロトコールを使用して送達され得る。それらとしては、例えば、従来の注射器；（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号）またはＡｃｃｅｌｌ（登録商標）遺伝子送達系（ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）などの遺伝子ガンのいずれかを使用した注入；ウイルスベースの系（例えば、（米国特許第５，２１９，７４０号）に記載されているようなレトロウイルス系、アデノウイルス系（Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；およびＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系（米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号）、ポックスウイルス系、ワクシニアウイルス送達系（例えば、国際公開番号ＷＯ９４／２６９１１を参照のこと）、アビポックスウイルス系（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）、アルファウイルス送達系（米国特許第５，８４３，７２３号；同第５，７８９，２４５号；同第６，３４２，３７２号；同第６，３２９，２０１号）ならびに他のウイルス系）；非ウイルス系（例えば、電荷リポソームまたは非電荷リポソーム（例えば、Ｈｕｇ ａｎｄ Ｓｌｅｉｇｈｔ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７：Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３），Ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．５１２−５２７；Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６）を参照のこと）；および／またはＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１に記載されているものと類似した渦巻形脂質組成物を使用した注入が挙げられる。米国特許第４，６６３，１６１号および同第４，８７１，４８８号も参照のこと。ポリヌクレオチドは、脊椎動物被験体に直接送達され得るか、またはエキソビボで被験体由来の細胞に送達され得、そしてその細胞を被験体に再移植され得る。
本発明の方法は、さらに、有効量の本発明の抗体を含む組成物を動物に投与することによって、プリオン関連疾患を処置または予防する工程を含む。
処置の方法は、本明細書中において記載される組成物のいずれかを組み合わせてもよい。例えば、ペプチド含有組成物および／または抗体組成物。様々な成分が一緒かまたは別々に投与され得る。
本発明の方法における使用に適した動物としては、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種）を含む他の霊長類；家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、家庭内の動物（例えば、イヌおよびネコ）；げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット）を含む実験動物；家禽、野生鳥および猟鳥（例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類の鳥、アヒル、ガチョウなど）を含む鳥類が挙げられる。本発明における使用に適した動物は、成体（または成人）および新生仔（または新生児）の両方を含むいずれの年齢でもよい。トランスジェニック動物もまた、本発明において使用され得る。プリオン関連疾患を研究するために最近使用されるトランスジェニック動物についての記述については、一般に、Ｐｒｕｓｉｎｅｒ“Ｐｒｉｏｎｓ”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９９８）９５：１３３６３−１３３８３を参照のこと。
本発明の組成物は、プリオン関連疾患を処置または予防するために使用され得る。このようなプリオン関連疾患は、病原性プリオンタンパク質（ＰｒＰＳｃ）によって全部または一部引き起こされる疾患を含む。プリオン関連疾患としては、スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、狂牛病、ネコ海綿状脳症、クールー、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）および致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）が挙げられる。
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。これらの実施例は、例示的な目的のみとして提供され、また、決して本発明の範囲を限定すると意図されない。
使用される数値（例えば、量、温度など）に関して、正確性を確実にするような努力がなされたが、当然のことながら、いくらかの実験誤差および偏差を考慮に入れるべきである。
（実施例１：ペプチド試薬作製）
プリオンタンパク質のペプチドフラグメントを、本質的に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６９）Ａｄｖａｎ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２：２２１およびＨｏｌｍ ａｎｄ Ｍｅｄａｌ（１９８９），Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｌｕｍｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐ．２０８Ｅ，Ｂａｙｅｒ ａｎｄ Ｇ．Ｊｕｎｇ（ｅｄ．），Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９８８，Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ ＆ Ｃｏ．Ｂｅｒｌｉｎ−Ｎ．Ｙ．に記載されているような標準的なペプチド合成技術を使用して化学的に合成した。ペプチドをＨＰＬＣで精製し、配列を質量分析によって確認した。
特定の場合において、合成されたペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端に、付加的な残基、例えば、ＧＧＧ残基を含み、そして／または野生型配列と比較して、１個以上のアミノ酸置換を含んだ。
（Ａ．ペプトイド置換）
配列番号１４（ＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮ、配列番号２の残基９７〜１０７に対応）、配列番号６７（ＫＫＲＰＫＰＧＧＷＮＴＧＧ、配列番号２の残基２３〜３６に対応）および配列番号６８（ＫＫＲＰＫＰＧＧ、配列番号２の残基２３〜３０に対応）に示されるペプチドにおいて、ペプトイド置換を行った。特に、これらのペプチドの１個以上のプロリン残基を様々なＮ置換ペプトイドで置換した。任意のプロリンの代わりに使用され得るペプトイドについては、図３を参照のこと。ペプトイドを、米国特許第５，８７７，２７８号および同第６，０３３，６３１号（これら両方の全体が、本明細書中において参考として援用される）；Ｓｉｍｏｎら、（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７に記載されているように調製および合成した。
（Ｂ．多量体化）
特定のペプチド試薬を、例えば、タンデム反復（多コピーのペプチドをＧＧＧなどのリンカーを介して連結する）、複数の抗原性ペプチド（ＭＡＰＳ）および／または直鎖的に連結されたペプチドを調製することによって多量体として調製した。
特に、ＭＡＰＳは、本質的に、Ｗｕら、（２００１）Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００１ １２３（２８）：６７７８−８４；Ｓｐｅｔｚｌｅｒら、（１９９５）Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４５（１）：７８−８５に記載されているような標準的な技術を使用して調製した。
直鎖ペプチドおよび分枝ペプチド（例えば、ＰＥＧリンカー多量体化）もまた、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを使用して、標準的な技術を用いて調製した。特に、分枝状マルチペプチドＰＥＧ骨格を、以下の構造で作製した：ビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ペプチドコントロールではない）およびビオチン−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ペプチド）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ペプチド）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ペプチド）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ペプチド）−ＰＥＧ−Ｌｙｓ（ペプチド）。さらに、Ｌｙｓに連結したペプチドを調製した：Ｌｙｓ−ε−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）３−Ｍａｌ−Ｓ−Ｃｙｓ−ペプチド。図５を参照のこと。
（Ｃ．ビオチン化）
ペプチドを、合成および精製の後に標準的な技術を使用してビオチン化した。ビオチンを、ペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加した。
（実施例２：結合アッセイ）
（Ａ．プルダウン）
本明細書中で記載されるようなペプチド試薬を、磁気ビーズプルダウンアッセイを使用して、プリオンタンパク質に特異的に結合する能力について試験した。このアッセイに向けて、ペプチド試薬をビオチンで標識し、これにより、ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズへの結合が可能となった。
脳ホモジネートをＲＭＬ ＰｒＰＳｃ＋およびＰｒＰＣ＋Ｂａｌｂ−ｃマウスから調製した。簡潔には、１％ＴＷ２０および１％トリトン１００を含む５ｍｌのＴＢＳ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５および３７．５ｍＭのＮａＣｌ）を約０．５ｇの脳に加え、１０％ホモジネートとした。脳スラリーを大きな粒子が消えるまで処理した。２００μｌのアリコートを緩衝液で１：１に希釈し、予冷したエッペンドルフチューブに加え、そのサンプルを、各々数秒間、音波処理し、それを数回繰り返した。サンプルを５００×で１０〜１５分遠心し、そしてその上清を取り出した。
プロテイナーゼＫ消化の作用を試験するために、一定の上清を２サンプルに分け、そして４μｌのプロテイナーゼＫを一方のサンプルに加え、３７℃で１時間回転した。８マイクロリットルのＰＭＳＦをそのプロテイナーゼＫチューブに加えて消化を停止し、そのチューブを４℃で少なくとも１時間インキュベートした。
ホモジネートを、さらに使用するまで４℃で保存し、必要であれば、上記のように再度音波処理した。脳ホモジネートの１０％ｗ／ｖのＰｒＰＣ＋調製物またはＰｒＰＳｃ＋調製物を、ビオチン標識されたペプチド試薬とともに４℃で一晩インキュベートし、その後、４００μｌの緩衝液、５０μｌの抽出物および５μｌのビオチン標識されたペプチド試薬（１０ｍＭ原液）を含むチューブを調製した。そのチューブを、室温で少なくとも２時間または４℃で一晩、固定台付き揺り器具（ｐｌａｔｆｏｒｍ ｒｏｃｋｅｒ）上でインキュベートした。
インキュベート後、５０μｌのＳＡ−ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｍ２８０ストレプトアビジン１１２．０６）を加え、そしてそのチューブをボルテックスにより混合した。そのチューブを振盪しながら（ＶＷＲ，Ｒｏｃｋｉｎｇ ｐｌａｔｆｏｒｍ，モデル１００）室温で１時間または４℃で一晩インキュベートした。
サンプルを振盪機から取り出し、磁場に置くことにより、ペプチド試薬およびプリオンが結合している磁気ビーズを回収し、５〜６回、１ｍｌのアッセイ緩衝液を用いて洗浄した。サンプルは、すぐに使用するか、または以下に記載されるウエスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡまで−２０℃で保存した。
（Ｂ．ウエスタンブロッティング）
ウエスタンブロッティング解析を以下のとおり実施した。上記のように沈降したビーズ−ペプチド−プリオン複合体を、各チューブに加えられる２５〜３０μｌのＳＤＳ緩衝液（Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−サンプル緩衝液２×）を加えることによる最終的な洗浄のあと、変性した。そのチューブを、すべてのビーズが懸濁するまでボルテックスにより混合した。そのチューブを、その蓋が開くまで煮沸し、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、そしてＷＢ解析に向けて固体メンブレンに転写した。
そのメンブレンを５％乳／ＴＢＳ−Ｔ［５０ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５；３７．５ｍｌの４Ｍ ＮａＣｌ、１〜１０ｍＬのＴｗｅｅｎ、乳で容量を１Ｌとする］中、室温にて３０分間、ブロッキングした。２００３年９月３０日に出願された「Ｐｒｉｏｎ Ｃｈｉｍｅｒａｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」という表題の国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／３１０５７に記載されているように１０〜１５ｍｌの抗プリオンポリクローナル抗体を１：５０倍希釈でメンブレンに加え、室温で１時間インキュベートした。そのメンブレンをＴＢＳ−Ｔで複数回洗浄した。洗浄後、二次抗体（アルカリホスファターゼ（ＡＰ）結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を１：１０００希釈（ＴＢＳ−Ｔ中）で加え、室温で２０分間インキュベートした。メンブレンをＴＢＳ−Ｔで複数回洗浄した。アルカリホスファターゼ誘発試薬（１−ステップＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、そしてバックグラウンドが現れるまでか、またはシグナルが現れるまで反応した。
（Ｃ．ＥＬＩＳＡ）
最後の洗浄後、上記のビーズ−ペプチド複合体をチオシアン酸グアニジンで変性し、以前にＲｙｏｕら、（２００３）Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．８３（６）：８３７−４３に記載されたような変性タンパク質を用いてＥＬＩＳＡを実施した。ブランクコントロール（．１７２〜．２５９の範囲）よりも高いＯ．Ｄ．値を陽性とみなした。
（Ｄ．結果）
ウエスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を表２にまとめた。簡潔には、ＰｒＰＳｃに結合する、本明細書中で記載されるようなペプチド試薬の特異的な結合を検出するために、脳ホモジネートのプロテイナーゼＫ消化は、必要ではなかった。図４に示すように、野生型脳ホモジネートへの結合は観察されなかったことから、ペプチド試薬がＰｒＰＳｃに特異的に結合したことが示唆される。さらに、上記のウエスタンブロッティング解析では、４対数希釈以上でＰｒＰＳｃが検出されたが、ＥＬＩＳＡはウエスタンブロッティングよりも少なくとも１０倍以上感度が高かった。
Figure 2008529537
Figure 2008529537
 １：相対的なシグナル強度を視覚的に評価した
２：環化
３：示された位置でＧＧＧＧ残基を付加／挿入した
４：示された位置でＧＧＧ残基を付加／挿入した
５：示された位置でＧＧ残基を付加／挿入した
６：示された位置でＫＫＫ残基を付加／挿入した
ＮＤ＝試験せず
結合に関連する残基を同定するために、アラニンスキャニングも実施した。結果を表３に示す。
Figure 2008529537
 さらに、表４に示すように、配列番号１４、配列番号６７および配列番号６８を有するペプチド試薬によるＰｒＰＳｃへの結合を、プロリン残基における多くのＮ置換グリシン（ペプトイド）による置換によってさらに促進した。
Figure 2008529537
Figure 2008529537
 １任意のＧＧＧリンカーは、この表に示される実験においてペプチド試薬中に存在しなかった。
さらに、ＰｒＰＳｃ結合ペプチド試薬の多量体化によってもまた、ＰｒＰＳｃに対する親和性が改善された。特に、タンデム反復によって、１コピーよりも強力なシグナル（ウエスタンブロッティングによって測定されるように）が得られた。ビーズ上で予め誘導体化されたＭＡＰ型は、特定の場合において、２倍まで結合が増強した。しかしながら、ＭＡＰ型は、溶液中のペプチドの沈殿を引き起こした。直鎖的に連結されたペプチドはまた、沈殿を引き起こすことなく、結合を増強する能力について試験された。
（実施例３：抗体作製）
以下において、本発明のペプチド試薬に対する抗体を作製するために使用され得るプロトコールの実施例を提供する。
マウスを、ＩＭ（筋肉内）またはＩＰ（腹腔内）のいずれかで第０日目に、本明細書中で記載されるようなペプチド試薬（例えば、配列番号１２〜２６０のいずれか１つ、好ましくは、配列番号１４、３５、５０、５１、５６、５７、６５、６６、６７、６８、７２、７３、７７、８１、８２またはそれらのアナログもしくは誘導体のいずれか１つ）を含む組成物で免疫し、その後、２週間ごとよりも高くない頻度の間隔で２〜５回追加免疫する。最初の免疫の前および各追加免疫の７日後に採血することにより、抗原に対する体液性応答をモニターする。１出血あたり約０．２ｍｌ以下の６つの眼窩出血を各動物（各眼から３つ）から得た。最後の追加免疫を、ＩＶ（静脈内）注入により送達する。最後の追加免疫の３日後に、マウスをＣＯ２またはイソフルオランへの曝露によって安楽死させ、その後、頸椎脱臼を行った。ハイブリドーマ産生のために脾臓を回収した。
最初の注入用のアジュバントとしてフロイント完全アジュバントを使用し、その後、ＩＶ感染以外の残りの感染にはフロイント不完全アジュバントを使用する。ＩＶ注射を、食塩水中に調製する。
本発明の好ましい実施形態をいくらか詳細に記載したが、本明細書中で定義されるような本発明の精神および範囲から逸脱することなく、明らかな改変がなされ得ると理解される。
図１は、ヒト（配列番号１）およびマウス（配列番号２）のプリオンタンパク質のアミノ酸配列を示す。 図２は、ヒト（配列番号３）、シリアンハムスター（ハムスター）（配列番号４）、ウシ（配列番号５）、ヒツジ（配列番号６）、マウス（配列番号７）、ヘラジカ（配列番号８）、ファロージカ（ファロー）（配列番号９）、ミュールジカ（ミュール）（配列番号１０）およびオジロジカ（オジロ）（配列番号１１）由来のプリオンタンパク質のアラインメントを示す。ヘラジカ、ファロージカ、ミュールジカおよびオジロジカだけは、Ｓ／Ｎ１２８およびＱ／Ｅ２２６（太字で示す）の２残基で互いに異なっている。 図３のパネルＡ〜Ｆは、本明細書中に記載されるペプチド試薬のいずれかを精製するためになされ得る例示的なペプトイド置換を示す。これらのペプトイドは、各パネルにおいて円で囲まれており、プロリン残基（配列番号１４の残基８）が、Ｎ置換グリシン（ペプトイド）残基で置換されている、本明細書中で記載されるような例示的なペプチド試薬（配列番号１４、ＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮＧ）で示される。パネルＡは、プロリン残基がペプトイド残基：Ｎ−（Ｓ）−（１−フェニルエチル）グリシンで置換されているペプチド試薬を示す；パネルＢは、プロリン残基がペプトイド残基：Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）グリシンで置換されているペプチド試薬を示す；パネルＣは、プロリン残基がペプトイド残基：Ｎ−（シクロプロピルメチル）グリシンで置換されているペプチド試薬を示す；パネルＤは、プロリン残基がペプトイド残基：Ｎ−（イソプロピル）グリシンで置換されているペプチド試薬を示す；パネルＥは、プロリン残基がペプトイド残基：Ｎ−（３，５−ジメトキシベンジル）グリシンで置換されているペプチド試薬を示す；そしてパネルＦは、プロリン残基がペプトイド残基：Ｎ−アミノ−ブチルグリシンで置換されているペプチド試薬を示す。 図４は、実施例２に記載されるようなウエスタンブロッティング実験の結果を示す。レーン１および２は、正常マウス脳ホモジネート（レーン１、「Ｃ」と標識）および変性された感染マウス脳ホモジネート（レーン２、「Ｓｃ」と標識）におけるプリオンタンパク質の存在を示す。レーン３、４および５は、ヒト血漿の存在下で、本明細書中で記載されるようなペプチド試薬（配列番号６８）の病原性プリオン型への特異的な結合を示す。特に、レーン３は、ヒト血漿コントロールであり、レーン４は、正常マウス脳ホモジネートサンプルである。レーン５は、感染マウス脳ホモジネートサンプルにおけるペプチド試薬のＰｒＰＳｃへの強い結合を示す。 図５は、本明細書中に記載されるような例示的なＰＥＧ結合ペプチド試薬の構造を示す。 図６は、（ＱＷＮＫＰＳＫＰＫＴＮ）２Ｋ（配列番号１３３）の構造を示す。

Claims (49)

  1. ＰｒＰＣと比較して、優先的にＰｒＰＳｃと相互作用する単離されたペプチド試薬であって、該ペプチド試薬は、配列番号
    Figure 2008529537
     を有するペプチドから誘導される、ペプチド試薬。
  2. ＰｒＰＣと比較して、優先的にＰｒＰＳｃと相互作用する単離されたペプチド試薬であって、該ペプチド試薬は、配列番号
    Figure 2008529537
     を有するペプチドから誘導される、ペプチド試薬。
  3. 配列番号
    Figure 2008529537
     を有するペプチドから誘導される、請求項２に記載のペプチド試薬。
  4. 請求項３に記載のペプチド試薬であって、該ペプチド試薬は、Ｎ末端および／またはＣ末端に、ｎ＝１、２、３または４であるアミノ酸配列（Ｇ）ｎを含む、ペプチド試薬。
  5. ビオチン化されている、請求項３または４に記載のペプチド試薬。
  6. 配列番号
    Figure 2008529537
     を有するペプチドから誘導される、請求項２に記載のペプチド試薬。
  7. Ｎ末端および／またはＣ末端に、ｎ＝１、２、３または４であるアミノ酸配列（Ｇ）ｎを含む、請求項６に記載のペプチド試薬。
  8. ビオチン化された、請求項６または７に記載のペプチド試薬。
  9. 配列番号１３６を有するペプチドから誘導される、請求項２に記載のペプチド試薬。
  10. ビオチン化されている、請求項９に記載のペプチド試薬。
  11. １個以上のプロリン残基が存在する場合、該１個以上のプロリン残基は、Ｎ置換グリシンで置換されている、請求項１に記載のペプチド試薬。
  12. 請求項１に記載のペプチド試薬をコードするポリヌクレオチド。
  13. 請求項１に記載のペプチド試薬および病原性プリオンタンパク質を含む複合体。
  14. サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は以下の工程：
    （ａ）病原性プリオンが存在する場合に、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと、請求項１に記載の第１のペプチド試薬とを、該第１のペプチド試薬が該病原性プリオンタンパク質に結合し得る条件下で接触させ、第１の複合体を形成する工程；および
    （ｂ）該病原性プリオンが存在する場合に、該第１のペプチド試薬への該病原性プリオンの結合によってサンプル中の該病原性プリオンの存在を検出する工程
    を含む、方法。
  15. 前記第１のペプチド試薬が、検出可能に標識されている、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記第１のペプチド試薬が、ビオチン化されている、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記第１のペプチド試薬が、固体支持体に結合している、請求項１４に記載の方法。
  18. サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと、請求項１に記載の第１のペプチド試薬とを、該第１のペプチド試薬が該病原性プリオンに結合し得る条件下で接触させ、第１の複合体を形成する工程；
    （ｂ）該第１の複合体と、請求項１に記載の第２のペプチド試薬とを、該第２のペプチド試薬が該第１の複合体中の該病原性プリオンに結合し得る条件下で接触させる工程であって、ここで、該第２のペプチド試薬は、検出可能な標識を含む、工程；および
    （ｃ）病原性プリオンが存在する場合、該第２のペプチド試薬への該病原性プリオンの結合によって該サンプル中の該病原性プリオンの存在を検出する工程
    を含む、方法。
  19. 前記第１のペプチド試薬と前記第２のペプチド試薬とが、異なっている、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記第１のペプチド試薬と前記第２のペプチド試薬とが、同じである、請求項１８に記載の方法。
  21. 前記第１のペプチド試薬が、固体支持体に結合している、請求項１８に記載の方法。
  22. 前記第１のペプチド試薬が、ビオチン化されている、請求項１８に記載の方法。
  23. サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと、請求項１に記載の第１のペプチド試薬とを、該第１のペプチド試薬が該病原性プリオンに結合し得る条件下で接触させ、第１の複合体を形成する工程；
    （ｂ）未結合サンプル物質を除去する工程；
    （ｃ）該第１の複合体から該病原性プリオンを解離する工程；
    （ｄ）該解離された病原性プリオンと、請求項１に記載の第２のペプチド試薬とを、該第２のペプチド試薬が該病原性プリオンに結合し得る条件下で接触させる工程であって、ここで、該第２のペプチド試薬は、検出可能な標識を含む、工程；および
    （ｅ）該病原性プリオンが存在する場合、該第２のペプチド試薬への該病原性プリオンの結合によって該サンプル中の該病原性プリオンの存在を検出する工程
    を含む、方法。
  24. サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと、請求項１に記載の第１のペプチド試薬とを、該第１のペプチド試薬が該病原性プリオンに結合し得る条件下で接触させ、第１の複合体を形成する工程；
    （ｂ）未結合サンプル物質を除去する工程；
    （ｃ）該第１の複合体から該病原性プリオンを解離する工程；
    （ｄ）該解離された病原性プリオンと、プリオン結合試薬とを、該プリオン結合試薬が該病原性プリオンに結合し得る条件下で接触させる工程であって、ここで、該プリオン結合試薬は、検出可能な標識を含む、工程；および
    （ｅ）該病原性プリオンが存在する場合、該プリオン結合試薬への該病原性プリオンの結合によって該サンプル中の該病原性プリオンの存在を検出する工程
    を含む、方法。
  25. 前記プリオン結合試薬が、抗プリオン抗体、モチーフグラフト化ハイブリッドポリペプチド、陽イオン性または陰イオン性のポリマー、増殖触媒およびプラスミノゲンからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）病原性プリオンが存在する場合、病原性プリオンを含むと疑われるサンプルと、プリオン結合試薬とを、該プリオン結合試薬が該病原性プリオンを結合し得る条件下で接触させ、第１の複合体を形成する工程；
    （ｂ）未結合サンプル物質を除去する工程；
    （ｃ）該第１の複合体と、請求項１に記載のペプチド試薬とを、該ペプチド試薬が該病原性プリオンに結合し得る条件下で接触させる工程であって、ここで、該ペプチド試薬は、検出可能な標識を含む、工程；および
    （ｄ）該病原性プリオンが存在する場合、該ペプチド試薬への該病原性プリオンの結合によって、該サンプル中の該病原性プリオンの存在を検出する工程
    を含む、方法。
  27. サンプル中の病原性プリオンを検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）請求項１に記載の第１のペプチド試薬を含む固体支持体を提供する工程；
    （ｂ）サンプル中に病原性プリオンが存在するとき、該固体支持体と該サンプルとを、該病原性プリオンが該第１のペプチド試薬に結合し得る条件下で接触させる工程であって；
    該固体支持体と、請求項１に記載の検出可能に標識された第２のペプチド試薬とを、該第２のペプチド試薬が該第１のペプチド試薬によって結合された病原性プリオンに結合し得る条件下で接触させる工程；および
    （ｃ）該第１のペプチド試薬と、該サンプルに由来する病原性プリオンと、該第２のペプチド試薬との間に形成された複合体を検出することによって、該サンプル中の該病原性プリオンの存在を検出する工程
    を含む、方法。
  28. サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）プリオン結合試薬を含む固体支持体を提供する工程；
    （ｂ）プリオンタンパク質がサンプル中に存在するとき、該固体支持体と該サンプルとを、該プリオンタンパク質が該プリオン結合試薬に結合し得る条件下で接触させる工程；
    （ｃ）該固体支持体と請求項１に記載の検出可能に標識された第２のペプチド試薬とを接触させる工程；および
    （ｄ）該プリオン結合試薬と、該生物学的サンプル由来の病原性プリオンと、該第２のペプチド試薬との間に形成された複合体を検出する工程
    を含む、方法。
  29. サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）請求項１に記載の第１のペプチド試薬を含む固体支持体を提供する工程；
    （ｂ）該固体支持体と、検出可能に標識された第１のリガンドとを混合する工程であって、ここで、該検出可能に標識された第１のリガンドに対する該第１のペプチド試薬の結合親和性は、病原性プリオンに対する該第１のペプチド試薬の結合親和性よりも弱い、工程；
    （ｃ）病原性プリオンがサンプル中に存在するとき、該病原性プリオンが該第１のペプチド試薬に結合し、そして該第１のリガンドを置換し得る条件下で該サンプルと該固体支持体とを混合する工程；
    （ｄ）該第１のペプチド試薬と該サンプル由来の該病原性プリオンとの間に形成された複合体を検出する工程
    を含む、方法。
  30. 前記固体支持体が、ニトロセルロース、ポリスチレンラテックス、ポリビニルフルオライド、ジアゾ化ペーパー、ナイロン膜、活性化ビーズおよび磁気的反応性ビーズからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  31. 前記サンプルが、生物学的サンプルである、請求項１４に記載の方法。
  32. 前記生物学的サンプルが、器官、全血、血液画分、血液成分、血漿、血小板、血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、脳組織、神経系組織、筋組織、骨髄、尿、涙、非神経系組織、器官および／またはバイオプシーもしくはネクロプシーからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記生物学的サンプルが、全血、血漿、血小板、血液画分または血清である、請求項３２に記載の方法。
  34. 請求項１に記載の少なくとも１つのペプチド試薬を含む、固体支持体。
  35. サンプル中の病原性プリオンの存在を検出するためのキットであって：
    （ａ）請求項３４に記載の固体支持体；および
    他に必要な試薬ならびに必要であれば、ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールを備える、キット。
  36. 請求項１に記載のペプチド試薬を含む組成物。
  37. 請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
  38. 請求項３６に記載の１個以上の組成物を動物に投与する工程を含む、プリオン病を処置または予防する方法。
  39. 前記被験体が、哺乳動物である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記哺乳動物が、ヒトである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記組成物が、筋肉内、粘膜内、鼻腔内、皮下、皮内、経皮的、膣内、直腸内、経口的または静脈内に投与される、請求項３８に記載の方法。
  42. プリオン病を処置または予防する方法であって、該方法は、以下の工程
    （ａ）初回刺激工程において請求項３６に記載の組成物を含む第１の組成物を投与する工程および
    （ｂ）追加免疫として、被験体において免疫応答を誘発するのに十分な量の請求項３６に記載の組成物を含む第２の組成物を投与する工程
    を含む、方法。
  43. サンプルから病原性プリオンタンパク質を単離するための方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）請求項３４に記載のペプチド試薬を含む固体支持体を提供する工程；
    （ｂ）該サンプルと該固体支持体とを、該サンプル中に病原性プリオンタンパク質が存在する場合、該病原性プリオンタンパク質が前記第１のペプチド試薬に結合し得る条件下で接触させ、第１の複合体を形成する工程および
    （ｃ）未結合サンプル物質を除去する工程
    を含む、方法。
  44. 前記第１の複合体から前記病原性プリオンタンパク質を解離する工程をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
  45. サンプルから病原性プリオンタンパク質を排除するための方法であって、該方法は、以下の工程；
    （ａ）請求項３４に記載のペプチド試薬を含む固体支持体を提供する工程；
    （ｂ）該固体支持体と、病原性プリオンタンパク質を含むと疑われるサンプルとを、病原性プリオンタンパク質が存在する場合、該病原性プリオンタンパク質が該ペプチド試薬に結合し得る条件下で、接触させる工程；および
    （ｃ）未結合サンプル物質を回収する工程
    を含む、方法。
  46. サンプルの供給物からサンプルを選択するための方法であって、請求項１に記載のペプチド試薬と優先的に相互作用する病原性プリオンタンパク質を含まないサンプルを選択する工程を含む、方法。
  47. サンプルの供給物からサンプルを選択するための方法であって、請求項１に記載のペプチド試薬と優先的に相互作用する病原性プリオンタンパク質を含むサンプルを選択する工程を含む、方法。
  48. 実質的に病原性プリオンを含まない血液供給物を調製する方法であって、該血液供給物は、全血、血漿、血小板または血清を含み、該方法は、以下の工程：
    （ａ）回収された血液サンプルから、全血、血漿、血小板または血清のアリコートを、請求項１４に記載の方法によってスクリーニングする工程；
    （ｂ）病原性プリオンが検出されたサンプルを排除する工程；および
    （ｃ）病原性プリオンが検出されなかったサンプルを混合し、実質的に病原性プリオンを含まない血液供給物を提供する工程
    を含む、方法。
  49. 実質的に病原性プリオンを含まない食品供給物を調製する方法であって、該方法は、以下の工程：
    （ａ）該食品供給物に入る生存生物体から回収されたサンプルまたは該食品供給物に入ることが意図された食物から回収されたサンプルを、請求項１４に記載の方法によってスクリーニングする工程；
    （ｂ）病原性プリオンが検出されたサンプルを排除する工程；および
    （ｃ）病原性プリオンが検出されなかったサンプルを混合し、実質的に病原性プリオンを含まない食品供給物を提供する工程
    を含む、方法。
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