JP2008523054A - 標識遷移金属錯体 - Google Patents
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Abstract
Description
遷移金属錯体はグアニン残基のN-7位置に非常に容易に(非共有結合で)結合する。この方法によって、DNAまたはRNA分子が、一本鎖でもそれ以外でも容易に同定され得(たとえば、検出され、分離され、精製され、単離される)、さらに、非標識DNA/RNA分子が標識プローブにハイブリダイズする、ハイブリダイゼーション技術用のプローブ生産をも可能にする。標識遷移金属錯体は、仮に妨害するとしても、ハイブリダイゼーションをほとんど妨害しない。また、この技術は、プローブの作製において、修飾されたヌクレオチドの使用を必要としない。ただし、たんぱく、ペプチドおよびその他の生物有機分子もまた、本発明に従う標識物質によって同定可能である。
XはNR、PR、OまたはSである;RはH、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、5員環もしくは6員環の、置換もしくは非置換の環のうちの1つであって、これらは、ヘテロ原子を介さずに、鎖または環の原子を介してXに結合する;YおよびZは、(CH2)nNR1R2、(CH2)nPR1R2、R3R4C=NR2、R3R4C=PR2、(CH2)nC(O)R2、(CH2)nC(O)NR2R3、(CH2)nC(O)PR2R3、(CH2)nC(O)N=R2、(CH2)nC(O)P=R2、(CH2)nC(O)OR5、(CH2)nC(S)R2、(CH2)nC(S)NR2R3、(CH2)nC(S)PR2R3、(CH2)nC(S)OR5、(CH2)nC(S)N=R2、(CH2)nC(S)P=R2、R6OR5、R6SR2、R7COO−Na+、R7CSO−Na+、R7CSS−Na+またはR8-R9から成る群から独立して選ばれ、nは1〜5、優先的には1〜3であり、R1はH、C(O)R3、C(S)R3、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、5員環もしくは6員環の、置換もしくは非置換の環のうちの1つであって、これらは、H、C、または鎖もしくは環の原子を介してN原子またはP原子に結合し、R1はXに結合しない。R2はH、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、5員環もしくは6員環の、置換もしくは非置換の環のうちの1つであって、これらは、Hまたは鎖もしくは環の原子を介してN原子またはP原子に、またはC(O)、(CH2)nC(O)R2、(CH2)nC(S)R2のCに、ならびにR5がC(O)R2およびC(S)R2であるとき、R5のC(O)R2およびC(S)R2のCに、C(O)またはC(S)のあらゆる原子の一部をも介さずに、鎖もしくは環の原子、またはR2の鎖の置換基もしくは環の置換基のヘテロ原子を介して結合する。R2はXに結合しない。R3はH、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、5員環もしくは6員環の、置換もしくは非置換の環のうちの1つであって、これらは、Hまたは鎖もしくは環の原子を介してN原子またはP原子に結合し、R1がC(O)R3およびC(S)R3の1つであるとき、C(O)またはC(S)のあらゆる原子の一部をも介さずに、鎖もしくは環の原子、または鎖の置換基もしくは環の置換基の原子を介してR1に結合し、R3はXに結合しない。R4はH、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、5員環もしくは6員環の、置換もしくは非置換の環のうちの1つであって、これらは、Hまたは鎖もしくは環の原子または鎖の置換基もしくは環の置換基の原子を介してC原子に結合する。R4はXに結合しない。R5はH、C(O)R2、C(S)R2、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、5員環もしくは6員環の、置換もしくは非置換の環のうちの1つであって、これらは、H、C、または鎖もしくは環の原子を介してO原子に結合する。R5はXに結合しない。R6は置換または非置換の脂肪族鎖であり、XとR6OR7のOとの間、およびXとR6SR2のSとの間の炭素原子数は1〜5の間で変化し、優先的には2または3である。R6はCH2基を介してXに結合する。R7は、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、5員環もしくは6員環の、置換もしくは非置換の環のうちの1つであって、XとCOO−またはR7COO−Na+のO原子との間、XとR7COS−Na+のCOS−のS原子との間、XとR7CSS−Na+のCSS−のS原子の1つとの間の炭素原子数は、1〜5の間で変化し、優先的には2または3である。R7はXに結合しない。R8は置換または非置換の脂肪族環であって、Xと、R8をR9に結合する原子との間の炭素原子数は、1〜5の間で変化し、優先的には2または3である。R9は、置換または非置換の、5または6員環の、Nおよび/またはPおよび/またはOおよび/またはS含有の、ジエンまたは非ジエンの、芳香族または非芳香族の、5員環または6員環の、置換または非置換の環であって、Xと環の配位原子との間の原子数は、2〜10の間で変化し、優先的には2または3である。R9はXに結合しない。
YとZとが同じで、X、YおよびZが、独立して、置換または非置換の、5員環または6員環の、Nおよび/またはPおよび/またはOおよび/またはS含有の、ジエンまたは非ジエン含有の、芳香族または非芳香族の環であって、Xの配位原子とYおよびZ双方との間の原子数が、1〜5、好ましくは2または3である。
XはNR、PR、OまたはSである;RはH、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、5員環もしくは6員環の、置換もしくは非置換の環のうちの1つであって、これらは、ヘテロ原子を介さずに、鎖または環の原子を介してXに結合する;Zは、H、(CH2)nNR1R2、(CH2)nPR1R2、R3R4C=NR2、R3R4C=PR2、(CH2)nC(O)R2、(CH2)nC(O)NR2R3、(CH2)nC(O)PR2R3、(CH2)nC(O)N=R2、(CH2)nC(O)P=R2、(CH2)nC(O)OR5、(CH2)nC(S)R2、(CH2)nC(S)NR2R3、(CH2)nC(S)PR2R3、(CH2)nC(S)OR5、(CH2)nC(S)N=R2、(CH2)nC(S)P=R2、R6OR5、R6SR2、R7COO−Na+、R7CSO−Na+、R7CSS−Na+、および前述中で定義された(ブロックI)R8-R9から成る群から選ばれ;YはA2N(C2H4)NA(C2H4)、A2N(C2H4)NA(C2H4)、A2P(C2H4)NA(C2H4)、A2N(C2H4)PA(C2H4)またはA2P(C2H4)PA(C2H4)であり、AはZと同じ意味を有する。
XはNR、PR、OまたはSである;RはH、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、5員環もしくは6員環の、置換もしくは非置換の環のうちの1つであって、これらは、ヘテロ原子を介さずに、鎖または環の原子を介してXに結合する;Zは、H、(CH2)nNR1R2、(CH2)nPR1R2、R3R4C=NR2、R3R4C=PR2、(CH2)nC(O)R2、(CH2)nC(O)NR2R3、(CH2)nC(O)PR2R3、(CH2)nC(O)N=R2、(CH2)nC(O)P=R2、(CH2)nC(O)OR5、(CH2)nC(S)R2、(CH2)nC(S)NR2R3、(CH2)nC(S)PR2R3、(CH2)nC(S)OR5、(CH2)nC(S)N=R2、(CH2)nC(S)P=R2、R6OR5、R6SR2、R7COO-Na+、R7CSO-Na+、R7CSS-Na+、および前述中で定義された(ブロックI)R8-R9から成る群から選ばれ;YはR2R3NC(O)CH2N(C2H4)R10、R2R3PC(O)CH2N(C2H4)R10、R5OC(O)CH2N(C2H4)R1、R1R2NC(O)CH2O(C2H4)、R1R2PC(O)CH2O(C2H4)、R5OC(O)CH2O(C2H4)、R1R2NC(O)CH2S(C2H4)、R1R2PC(O)CH2S(C2H4)、R5OC(O)CH2S(C2H4)、R2R3NC(O)CH2P(C2H4)R10、R2R3PC(O)CH2P(C2H4)R10、R5OC(O)CH2P(C2H4)R1、R1R2NCH2C(O)N(C2H4)R10、R1R2PCH2C(O)N(C2H4)R10、R5OCH2C(O)N(C2H4)R2、R2SCH2C(O)N(C2H4)R10、R1R2NCH2C(O)O(C2H4)、R1R2PCH2C(O)O(C2H4)、R5OCH2C(O)O(C2H4)、R2SCH2C(O)O(C2H4)、R1R2NCH2C(O)P(C2H4)R10、R1R2PCH2C(O)P(C2H4)R10、R5OCH2C(O)P(C2H4)R2、R2SCH2C(O)P(C2H4)R10、R1R2N(CH2)nO(CH2)nC(O)、R1R2P(CH2)nO(CH2)nC(O)、R5O(CH2)nO(CH2)nC(O)、R2S(CH2)nO(CH2)nC(O)、R1R2N(CH2)nS(CH2)nC(O)、R1R2P(CH2)nS(CH2)nC(O)、R5O(CH2)nS(CH2)nC(O)、R2S(CH2)nS(CH2)nC(O)、R1R2N(CH2)nO(CH2)n、R1R2P(CH2)nO(CH2)n、R5O(CH2)nO(CH2)n、R2S(CH2)nO(CH2)n、R1R2N(CH2)nS(CH2)n、R1R2P(CH2)nS(CH2)n、R5O(CH2)nS(CH2)n、R2S(CH2)nS(CH2)n、R1R2N(CH2)n(NR3)(CH2)nC(O)、R1R2P(CH2)n(NR3)(CH2)nC(O)、R5O(CH2)n(NR3)(CH2)nC(O)、R2S(CH2)n(NR3)(CH2)nC(O)、R1R2N(CH2)n(NR3)(CH2)nC(O)、R1R2P(CH2)n(NR3)(CH2)nC(O)、R5O(CH2)n(NR3)(CH2)nC(O)、R2S(CH2)n(NR3)(CH2)nC(O)、R1R2N(CH2)nN(CH2)nR3、R1R2P(CH2)nN(CH2)nR3、R5O(CH2)nN(CH2)nR3、R2S(CH2)nN(CH2)nR1、R1R2N(CH2)nN(CH2)nR3、R1R2P(CH2)nN(CH2)nR3、R5O(CH2)nN(CH2)nR1、R2S(CH2)nN(CH2)nR1、R1R2N(CH2)n(PR3)(CH2)nC(O)、R1R2P(CH2)n(PR3)(CH2)nC(O)、R5O(CH2)n(PR3)(CH2)nC(O)、R2S(CH2)n(PR3)(CH2)nC(O)、R1R2N(CH2)n(PR3)(CH2)nC(O)、R1R2P(CH2)n(PR3)(CH2)nC(O)、R5O(CH2)n(PR3)(CH2)nC(O)、R2S(CH2)n(PR3)(CH2)nC(O)、R1R2N(CH2)nP(CH2)nR3、R1R2P(CH2)nP(CH2)nR3、R5O(CH2)nP(CH2)nR1、R2S(CH2)nP(CH2)nR1、R1R2N(CH2)nP(CH2)nR3、R1R2P(CH2)nP(CH2)nR3、R5O(CH2)nP(CH2)nR1またはR2S(CH2)nP(CH2)nR1である。
XはNR、PR、OまたはSである;RはH、置換もしくは非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、5員環もしくは6員環の、置換もしくは非置換の環のうちの1つであって、これらは、ヘテロ原子を介さずに、鎖または環の原子を介してXに結合する;YおよびZは、独立して、ABN(CH2)nまたはABP(CH2)nであり、nは2または3であり、AおよびBは、(CH2)nNR1R2、(CH2)nPR1R2、R3R4C=NR2、R3R4C=PR2、(CH2)nC(O)R2、(CH2)nC(O)NR2R3、(CH2)nC(O)PR2R3、(CH2)nC(O)N=R2、(CH2)nC(O)P=R2、(CH2)nC(O)OR5、(CH2)nC(S)R2、(CH2)nC(S)NR2R3、(CH2)nC(S)PR2R3、(CH2)nC(S)OR5、(CH2)nC(S)N=R2、(CH2)nC(S)P=R2、R6OR5、R6SR2、R7COO−Na+、R7CSO−Na+、R7CSS−Na+、またはR8-R9から成る群から選ばれ、前述中で定義されたように(ブロックI)、nは1〜5、優先的には2または3である。
N、P、OおよびSから独立して選ばれた最小でも3つのヘテロ原子を含有するあらゆる置換大員環。大員環とは、3つ以上の原子がドナーヘテロ原子である、最小でも9つの原子を含有する環状分子として定義される。
Xは置換または非置換の、5または6員環の、Nおよび/またはPおよび/またはOおよび/またはS含有の、ジエンまたは非ジエン含有の、芳香族または非芳香族の環である。YまたはZの少なくとも1つは、Nおよび/またはPおよび/またはOおよび/またはSヘテロドナー原子を含有し、置換または非置換の脂肪族鎖、または、ジエンもしくは非ジエンの、芳香族もしくは非芳香族の、5員環もしくは6員環の、置換の環であり、環上の置換基を介してXに結合している。YまたはZの1つのみがNおよび/またはPおよび/またはOおよび/またはSヘテロドナー原子を含有している場合、この基準を満たすYとZとの間の候補は、最小でも2つのNおよび/またはPおよび/またはOおよび/またはSヘテロドナー原子を含有し、これら2つのヘテロドナー原子間の原子数、およびこれらヘテロ原子のうちXに最も近い原子と、Xに含まれる最も近いヘテロドナー原子との間の原子数は、2または3である。YおよびZの双方がヘテロドナー原子を含有している場合、YおよびZのそれぞれが最小でも1つのN、P、OまたはSヘテロドナー原子を含有し、Yのヘテロドナー原子とXのヘテロドナー原子との間の原子数、およびZのヘテロドナー原子とXのヘテロドナー原子との間の原子数は2または3である。
YXZ …(II)
さらに、本発明は以下の限定しない実施例によって説明される。
I.三座配位子の作製および遷移金属錯体形成
以下の型の配位子、それらのK2PtCl4との錯体形成、ならびにそれに続く、NHSエステルとの反応およびマーカの組み込みのための錯体のBOC-脱保護が記載される。
2(153.0mg、474.5μmol)をCH2Cl2(20ml)に溶解した。溶液を0℃で30分間攪拌した後、Et2O中のLiAlH4溶液(1M、2.9ml、2900μmol)を滴加した。混合物を0℃で90分間攪拌し、室温になるまで静置した。過剰のLiAlH4を水4mlを滴加して注意深く分解した。Li塩をろ過によって除去し、水(10ml)およびCH2Cl2(10ml)で洗浄した。水層が分離し、CH2Cl2(3×10ml)で抽出した。有機抽出物を混合し、MgSO4上で乾燥し、減圧下で乾固して、無色の油として3を得た(収量:99.3mg、63%)。1H NMR (CDCl3):δ 1.23(4H、m、NH(CH2)2(CH2)2);1.38(13H、m、NH(CH2)(CH2)CH2)2(CH2)+tBu);1.52(4H、m、(CH2)(CH2)NH2);2.32(2H、m、N(CH2)(CH2)5);2.44(4H、m、N(CH2)(CH2)2NH2);2.74(4H、m、CH2NH2);3.02(2H、m、(CH2)NHBoc);3.30(4H、ブロードピーク、NH2);4.72(1H、ブロードピーク、NHBoc)。
CH2Cl2 70ml中の塩化クロルアセチル溶液165μl(233.97mg、2.072mmol)を、秒毎5滴の速度で、室温で、N-アセチルエチレンジアミン198.50μl(211.60mg、2.071mmol)、CH2Cl2 140mlおよび1M NaOH水溶液2071.6μl(80.77mg、2.072mmol)の混合物に添加した。添加の完了後、その混合物を一夜室温で攪拌した。溶媒を減圧下で除去した。固体をMeOHで洗浄し、NaCl塩を遠心分離によって分離した。澄明なMeOH抽出物を減圧下で乾燥し、MeOHによる洗浄および遠心分離工程を、NaClが分離されなくなるまで繰返した。MeOH抽出物を減圧下で乾固し、6を得た。
MeCN中の6の溶液(17mlあたり1mmol)を、秒毎5滴の速度で、75℃で(6の溶液を添加するフラスコの上端に還流冷却器が導入されている)、(6のモル数に対して)K2CO3の3M当量、(6のモル数に対して)KIの1M当量、および(6のモル数に対して)1、つまりMeCN中のN-Boc-へキサン-1,6-ジアミン(34mlで1は1mmol)の1M当量を含む混合物に添加した。添加の完了後、混合物を一夜還流した。その後、溶媒を減圧下で除去した。固体をCH2Cl2で洗浄し、K+塩をろ過した。CH2Cl2抽出物を減圧下で乾固し、7を得た。
3の作製に関して記載した手順を、3の代わりに7を用いて繰返し、7を得た。
K2PtCl4およびLの1M当量をDMFに添加した(mlあたりのK2PtCl4は4.69×10−6mol)。ここでLは使用した三座配位子である。その後、混合物を40℃で一夜熱し、その間に、赤色K2PtCl4塩が溶解した。溶液を乾固し、K+塩を水で洗浄した。不溶性固体をろ過し、Et2Oで洗浄し、減圧下で乾燥した。
4:195Pt NMR (MeOD):δPt-2520ppm。MS (EI+): m/z 561 [M−Cl]+
[Pt(L)Cl] Cl 126μlを200mM HCl(3ml)に溶解した。その後、その溶液を50℃で一夜攪拌した。1M NaOHの添加によってpHを8に調整した。その後、5×スクシンイミド結合緩衝液(2ml)を溶液に添加した。DMF(5ml)中のNHS-スクシンイミドエステル(63μmol)を続いて滴加した。その溶液を遮光下で室温にて一夜攪拌した。その後、1mg/mlの濃度で溶解した種を、セファデックス カラム(G15)に通して精製し、減圧下で溶媒を除去して得た。
Boc脱保護後の4:195Pt NMR (MeOD):δPt-2512ppm。MS (EI+):m/z 461 [M−Cl]+
ジエチレントリアミンは市販のものが利用可能である(Aldrich、カタログ#D9,385-6)。K2PtCl4(1g)をミリQ(25ml)に溶解した。溶解しなかった小さな黄色の結晶および灰色の物質をろ過した。ジエチレントリアミン(0.5ml)をその澄明な赤色溶液に添加した。HCl水溶液(6M)を用いてpHを3に調整した。溶液を6.5時間還流した。反応の2時間後、NaOH水溶液(1および5M)を用いてpHを4に調整した。反応混合物を一夜室温にて冷却した。その後、HCl水溶液(6M)を用いてpHを1まで酸性にした。その後、反応混合物を72時間フリーザ(−20℃)内に置いた。生じた白色結晶をろ過した。ろ液のpHを6に調整し、溶媒をいくらか蒸発させて、その溶液を氷浴中で冷却した。これで2次結晶が得られ、ろ取した。
195Pt NMR (D2O):δPt-2722ppm
−4’−アミノペンチルエーテル−2,2’:6’,2”テルピリジン(2)の作製
δ 1.3 [ブロードピーク、2H、CH2]、1.9 [ブロードピーク、2H、CH2]、2.2 [ブロードピーク、2H、CH2]、2.5 [ブロードピーク、2H、CH2]、2.6 [ブロードピーク、2H、NH2]、3.6 [t、2H、CH2]、6.8 [dd、 2H、H4,4・/SUB>]、7.3 [t、2H、H5,5・/SUB>]、7.42 [s、2H、H3’,5’]、7.9 [dd、2H、H3,3・/SUB>]、8.1 [d、2H、H6,6・/SUB>]。
δ 23.5 [CH2]、29.09 [CH2]、33.4 [CH2]、42 [CH 2 -NH2]、68.4 [CH 2 -O]、107.5 [CH、C3’,5’]、121.5 [CH、C5, 5・/SUB>]、124.3 [CH、C3,3・/SUB>]、137.2 [CH、C4,4・/SUB>]、149.3 [CH、C6,6・/SUB>]、156.03 [C、C2,2・/SUB>]、157.1 [C、C2’,6’]、167.3 [C、C4’]。
λmax245nm(ε16 500M−1.cm−1)
279nm(ε16 500M−1.cm−1)
−4’-ポリエチレングリコールエーテル-2,2’:6’,2・テルピリジン(3)の作製
δ 3 [ブロードピーク、1H、OH]、3.67 [2H、CH2]、3.60 [m、6H、CH2]、3.86 [t、2H、CH2]、4.33 [t、2H、CH2]、7.24 [t、2H、H5,5”]、7.74 [dd、2H、H4,4”]、7.95 [s、2H、 H3’,5’]、8.5 [dd、2H、H3,3”]、8.6 [d、2H、H6,6”]。
δ 62.2 [CH 2 -O]、68.5 [CH 2 -O]、71.3 [CH 2 -O]、71.6 [CH 2 -O]、73.5 [CH 2 -O]、108.2 [CH、C3’,5’]、122.06 [CH、C5,5”]、124.60 [CH、C3,3”]、137.54 [CH、C4,4”]、149.73 [CH、C6,6”]、156.7 [C、C2,2”]、157.7 [C、C2’,6’]、167.7 [C、C4’]。
−蛍光色素(またはハプテン)のAPET(6a〜d)との結合
収量:
>DEAC(6a):
δ 1.24 [t、6H、CH3]、1.66 [クインテット、2H、CH2]、1.73 [クインテット、2H、CH2]、1.87 [クインテット、2H、CH2]、3.47 [m、6H、CH2]、4.27 [t、2H、CH 2 -O]、6.48 [d、1H、J=6.48Hz、CH]、6.63 [dd、IH、JP=2.41およびJo=8.95Hz、CH]、7.33 [m、2H、H5,5”]、7.43 [d、1H、Jo=8.95Hz、CH]、7.84 [td、2H、J=1.77およびJ=7.71Hz、H4,4”]、7.97 [s、2H、H3’,5’]、8.58 [dd、2H、H3,3”]、8.69 [dd、2H、H6,6”]、8.71 [s、1H、CH]、8.86 [t、1H、アミド]。
δ 1.24 [t、6H、CH3]、1.66 [クインテット、2H、CH2]、1.73 [クインテット、2H、CH2]、1.87 [クインテット、2H、CH2]、3.47 [m、6H、CH2]、4.27 [t、2H、CH 2 -O]、6.48 [d、1H、J=6.48Hz、CH]、6.63 [dd、IH、JP=2.41およびJo=8.95Hz、CH]、7.33 [m、2H、H5,5”]、7.43 [d、1H、Jo=8.95Hz、CH]、7.84 [td、2H、J=1.77およびJ=7.71Hz、H4,4”]、7.97 [s、2H、H3’,5’]、8.58 [dd、2H、H3,3”]、8.69 [dd、2H、H6,6”]、8.71 [s、1H、CH]、8.86 [t、1H、アミド]。
δ 1.29 [s、6H、CH3]、1.32 [s、6H、CH3]、1.57 [クインテット、2H、CH2]、1.66 [クインテット、2H、CH2]、1.87 [クインテット、2H、CH2]、4.22 [t、2H、CH 2 -O]、3.42 [m、2H、CH 2 -NH]、6.38 [m、1H、CH]、6.40 [m、1H、CH]、6.47 [s、1H、CH]、6.48 [s、1H、CH]、6.58 [m、1H、CH]、6.61 [m、1H、CH]、7.31 [t、2H、J=6.78Hz、H5,5”]、7.49 [s、1H、CH]、7.85 [t、2H、J=7.71Hz、H4,4”]、7.99 [s、2H、H3’,5’]、8.04 [d、1H、CH]、8.07 [d、1H、CH]、8.61 [d、2H、J=7.95Hz、H3,3”]、8.67 [d、2H、J=4.50Hz、H6,6”]。
δ 1.54 [m、4H、CH2]、1.62 [m、12H、CH2]、1.92 [クインテット、2H、CH2]、2.20 [t、4H、CH2]、3.18 [t、4H、CH 2 -NH]、3.34 [m、3H、CH-NHおよびCH 2 -NH]、3.38 [m、2H、CH 2 -S]、4.32 [m、4H、NH]、4.53 [m、2H、CH-S]、7.55 [t、2H、J=1.55および5.08、H5,5”]、7.75 [s、2H、H3’,5’]、8.05 [td、2H、J=1.60および7.78Hz、H4,4”]、8.57 [d、2H、J=7.96Hz、H3,3”]、8.69 [d、2H、J=4.26Hz、H6,6”]。
DNP(6d):
δ 1.20 [m、4H、CH2]、1.50 [m、2H、CH2]、1.60 [m、2H、CH2]、1.76 [m、2H、CH2]、1.89 [m、2H、CH2]、2.22 [m、4H、CH2]、3.33 [m、2H、CH2-O]、3.37 [m、2H、 CH 2 -NH]、4.27 [ブロードピーク、1H、NH]、5.57 [m、1H、NH]、7.37 [t、2H、J=4.68Hz、H5,5”]、7.88 [t、2H、J=7.02Hz、H4,4”]、7.98 [s、2H、H3’,5’]、8.18 [dd、1H、Jm=2.61およびJo=9.48Hz、CH]、8.47 [m、1H、CH]、8.60 [d、2H、J=7.83Hz、H3,3”]、8.67 [d、2H、H6,6”]、9.06 [d、1H、Jm=2.64Hz、CH]。
13C NMR (CDCl3)
δ 13.20 [CH3、CH 3 -CH2]、24.29 [CH2、CH2-CH 2 -CH2]、26.16 [CH2、CH2-CH 2 -CH2]、29.54 [CH2、CH2-CH 2 -CH2]、30.11 [CH2、CH 2 -NH]、40.33 [CH2、CH 2 -CH3]、45.83 [CH2、CH 2 -CH3]、68.84 [CH2、O-CH 2 ]、108.33 [CH、C3’,5’]、110.68 [CH]、122.20 [CH、C5,5”]、124.52 [CH、C3,3”]、131.91 [CH]、137.50 [CH、C4,4”]、148.88 [CH]、149.76 [CH、C6,6”]、157.00 [C、C2,2”]、157.76 [C、C2’,6’]、168.00 [C、C4’]、173.00 [C、C=Oアミド]。
UV/可視吸収 (CHCl3)
K2PtCl4(6.0mg)をN,N’-ジメチルホルムアミド(1ml)に溶解した。その溶液をN,N’-ジメチルホルムアミド(2ml)中のDNP APET(8.3mg)溶液にゆっくり添加した。その溶液が遮光下で40℃にて一夜加熱した。その後、混合物を減圧化で乾固した。
195Pt NMR (D2O):δPt -2701, -2954および -2951ppm。
K2PtCl4(6.0mg)をN,N’-ジメチルホルムアミド(1ml)に溶解した。その溶液をプロパノール(1ml)およびN,N’-ジメチルホルムアミド(2ml)中のDNP APET(9.3mg)溶液にゆっくり添加した。その溶液を遮光下で40℃にて一夜加熱した。その後、混合物を減圧化で乾固した。
195Pt NMR (D2O):δPt -2686および -3442ppm。
4’-クロロ2,2’:6’,2’’ルピリジンおよび5-アミノペンタノールをAldrichから購入した。K2PtCl4をSigmaから購入した。EZ Link NHS LCビオチンをPierceから購入した。6 TAMRA-SE、DNP-SE、DEACをMolecular Probesから得た。配位子に関してカラムクロマトグラフィをFlukaのシリカゲル60上で実行した。錯体をIGN Biomedical GmbHのAlumina N上で精製した。全溶媒をMerckから得て、精製せずに使用した。使用した水は、脱塩されたミリQ水であった(R=18.2MΩ/cm)。RP HPLCによる全分析ランに使用した溶離液は:
> A:10% CH3CN/90% 0.1M TEAA pH 5
> B:70% CH3CN/30% 0.1M TEAA pH 5、であった。
白金(Pt)、パラジウム(Pd)、ルテニウム(Ru)およびコバルト(Co)を含む様々な金属をAPETスペーサに導入した。初めに、蛍光色素またはハプテンをAPETに付着させ、その後様々な金属を標識APET分子に導入した。化学分析をH-NMRによって行った。RP-HPLC精製試薬の純度は80〜99%間で変化させた。
ビオチン-APETスペーサをCd2+、Co2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Pd2+、Pt2+、Ru2+およびZn2+と錯体形成させた。DMFまたはDMSOに可溶であるPt、PdおよびRu錯体を除いて、全錯体が水溶性であった。これら試薬の純度は82〜99%で、80%を超える収量であった。Bio-APET-Pd錯体はあまり安定ではなかった(考えられる解釈:Pdの、別のBio-APET-Pd分子のビオチンのチオエーテルとの結合を介した鎖の形成があり、これはHPLCクロマトグラムにおいて見られた)。標識錯体を、異なる比、温度、インキュベーション時間およびpHにてたんぱくおよびDNAとインキュベートした。Pt、PdおよびRu含有Bio-APET-錯体はたんぱくおよびDNAの双方を標識し、Bio-APET-CoはDNAを標識しないがたんぱくを標識し(pH8.0にて)、他の金属はあまり反応しないか、安定した結合を形成しないことがわかった。
Pt、PdおよびRu含有DNP-APET錯体はDNAおよびたんぱくに対してよく反応する(表1参照)。図2に示すように、40℃を超える温度でのDNAに対する反応は、基準となる二座配位子のDNP-BOC-Ptと同程度である。DNP-APET-Pdは、60℃を超える温度では標識がほとんど観察されないので、あまり安定してDNAに結合しなかった。
DNA標識は、Cy3-APET-Pt、Cy5-APET-PdおよびCy5-APET-Ruによって行った。全ヒト血清のターゲット標識を、基準となるCy5-BOC-Pt、Cy5-APET-RuおよびCy5-APET-Pdを用いて実行した。IgA キャプチャ ELISA分析を展開した。Cy5はハプテンとして機能した(HRP共役MoAb抗-Cy5によって検出された)。図3は、すべての場合において、Cy5標識IgAが検出されることを示す。最良の結果は対照のCy5-BOC-Pt錯体で得られた。
V.ペプチドマーカ-三座配位子-Pt錯体の合成
ペプチドは16個のアミノ酸長であって、細胞の原形質膜を超えて生体分子を移送するシャトル分子として機能する。このペプチドは固体支持として一端および他端に末端NH2基を有する。アミンを、溶液mlあたりアミン 0.02mgの濃度となるように、ミリQおよびエタノールの50:50混合物中に溶解した。アクリロニトリルの1000倍モル当量を溶液に添加した。溶液を一夜還流した(65℃の加熱)(水冷却機に連結された丸底フラスコの上端に還流冷却器が取り付けられている)。混合物をロータリー蒸発下で乾燥し、固化物を乾燥エタノール(3〜5ml)で洗浄し、再び乾固するまで蒸発させた。ニトリル化合物を、1:1のモル比で乾燥エタノール(ニトリル 20mmolについて20ml)中で塩化ニッケル(II)と混合した。新しく調製した水素化ホウ素ナトリウム溶液(ニトリル 1mmolあたり1mmol)を、かなり慎重に(少しずつ)添加した(2mmol)。溶液を室温で2時間攪拌した。次に、溶液をミリQでろ過し、金属ニッケルを磁石を用いて除去した。ろ液をDMF 2mlに溶解した。テトラクロロ白金(II)酸カリウム 5当量(100μmol)を添加し(粉末)、混合物を40℃に一夜保った。次に、混合物をろ過し、DMF(ジメチルホルムアミド)、ミリQおよびDCM(ジクロロメタン)で洗浄した。溶液をロータリー蒸発下で乾固した。固体支持は、ペプチドを固体支持に結合させるのに用いた化学反応型に応じて、基準的な化学反応によって除去することが可能である。この場合は、TFA化学反応を使用した。最終的に、遷移金属―三座配位子―(ペプチド)マーカから成る、単機能的なPt錯体が合成された。
ジエチレントリアミン Pt錯体(Pt[ジエン Cl−] Cl−; 5μM溶液を使用した)は、本化合物がMS中で安定し、PtおよびNの模擬同位体分布の同位体パターン特性を有することを明らかにした。光標識化合物に関して得られた最も多く存在する分子イオン(図4)は、m/z=334に分子イオン[M1+]を有する。本化合物の合成からの夾雑ピークは観察されなかった。他の唯一の可視ピークは、標識反応中に観察されたm/z=315のOH-基と置換されたCl−の損失であった。
1の作製−アクリロニトリルのマイケル付加:
N-Boc-ヘキサン-1,6-ジアミン(140.5mg、649.5μmol)をH2O/EtOH 1/1の混合物(20ml)中に溶解した。アクリロニトリル(425.5μl、6.495mmol)をその溶液に添加した。混合物を一夜60℃で還流し、乾固して、純粋な油性の薄茶色の物質を得た。残さをCH2Cl2に溶解し、MgSO4上で乾燥した。続くろ過および減圧下での溶媒の除去によって、1を得た。(収量:166.8 mg、95%)
1H NMR (CDCl3):δ 1.35 (4H、m、NH(CH2)2(CH2)2);1.43 (13H、m、NH(CH2)(CH2)CH2)2(CH2)+tBu);2.60 (6H、m、NH(CH2)(CH2)5+(CH2)(CH2)CN);2.94 (4H、m、CH2CN);3.1 (2H、m、(CH2)NHBoc);4.55 (1H、ブロードピーク、NHBoc)。
1(151.0mg、5.129×10−4mol)をジクロロメタン(20ml)中に溶解した。その溶液を20分間氷浴(0℃)中で攪拌した。その後、水素化リチウムアルミニウム(ジエチルエーテル中の1M 溶液 5ml、5mmol)を添加した。白色固体が沈殿するのが直ちに観察された。その混合物を30分間0℃(氷浴)で攪拌し、その間に温度は室温と平衡になった。その後、ミリQ 7.5mlを慎重に添加して、過剰の水素化リチウムアルミニウムを中和した。ミリQの添加はより重要な量の白色固体の沈殿をもたらした。その後、混合物をろ過した。有機抽出物を水性抽出物から分離し、減圧下で乾燥して、無色の油を得た。(収量:23.5 mg、15.1%)。
2(829.2 mg、2.509mmol)をN,N’-ジメチルホルムアミド(535.4ml)中に溶解した。その後、固体の状態でテトラクロロ白金酸カリウム(1041.4mg、2.509mmol)を添加した。その混合物を40℃で一夜加熱した。加熱によって赤色白金塩が溶解するのが観察された。その後、混合物をろ過して、白色塩化カリウム固体を分離した。ろ液を減圧下での加熱によって乾固した。その後、ミリQ(約30ml)を添加して、残留塩化カリウム塩を除去した。水性抽出物をろ過した。茶色固体をジエチルエーテル(10ml)で洗浄し、減圧下で乾燥した。(収量:853.00mg、57.0%)。
3(7.3mg、1.2×10−5mol)を200mM 塩酸(4ml)と混合した。その混合物を50℃で一夜加熱した。加熱中に茶色固体が溶解するのが観察された。ミリQ中の水酸化ナトリウム溶液(1M)および塩酸(200mM)を用いて、pHを約8.0に調整した。
195Pt NMR (DMF-d7):δPt -3129および -2519ppm。MS (ESI+) m/z: 800 [M]+。
たんぱく 50μgを含むHELA細胞溶解物を、標識バッファ 50μl中の化合物4aで、3時間37℃にて標識した。4aの量はそれぞれ0.5,1,2,4または16μgであった。標識反応を還元サンプルバッファの添加によって停止した。BIO-APを検出抗体として使用した(1:1000)。ウェスタンブロットの結果を図10に示す。
3(2.15mg、3.6×10−5mol)を200mM 塩酸(366.46μl)と混合した。その後、メタノール(パスツールピペットから3滴の滴下)およびN,N’-ジメチルホルムアミドを、総容積が約1mlになるよう添加した。
4b 1,2,4,6,7.5,10,12.5および25μgを、異なる分子量の6つのたんぱく混合物(ラクトアルブミン、トリプシンインヒビタ、カルボニックアンヒドラーゼ、オボアルブミン、BSA、ホスホリラーゼB) 50μgを標識するのに使用した。この標識(1時間50℃)を、抗FLU-APで検出されるブロット上で12.5μgにて、FLU- ULSの基準となる標識量と比較した(図11)。
DNA [第1染色体のセントロメア周辺(1q12)に位置するヒト反復サテライトIII DNA配列を乗せる1.77kbインサートを有するpUC19プラスミド] を、4b 10μgを100μlの容積中のDNA 3μgに添加することで、4bによって標識した。混合物を85℃1時間でインキュベートし、非結合4bを標準的なエタノール沈殿によって除去した。DNA沈殿物は、UV光で照射されたとき、緑色蛍光発光を示した。精製4b標識DNAをin situハイブリダイゼーション分析においてプローブとして用いた。プローブを、60% ホルムアミド、1×SSCおよび10% 硫酸デキストランを含むハイブリゼーションバッファに溶解し、最終濃度 4ng/μlとした。10μlを、基準となる前処理ヒト中期分裂標本に適用し、ターゲットおよびプローブの双方が変性し得るように、80℃で5分間インキュベートした。次に、スライドを37℃で一夜インキュベートし、非結合または不完全な結合のプローブを、65℃の1×SSC/0.1% SDS中で洗浄して除去した。再水和後、標本をDAPIを含む抗退色試薬中に埋め込んだ。フルオレセイン画像を、デジタルカメラを備えたLeica蛍光顕微鏡を用いて記録した。
3(2.15mg、3.6×10−5mol)を200mM 塩酸(163.62μl)と混合した。その後、メタノール(パスツールピペットから3滴の滴下)およびN,N’-ジメチルホルムアミドを、総容積が約1mlになるように添加した。
1の作製−塩化クロロアセチルとの反応:
N-Boc-1,6-ジアミノヘキサン(175.6mg、8.12×10−4mol)をジクロロメタン(15.4ml)、ミリQ(3883μl)および1M 水酸化ナトリウム水溶液(811.5μl、8.12×10−4mol)に溶解した。その混合物を20分間0℃(氷浴)で攪拌した。
1の1H NMR (CDCl3):δH 1.35 (m、4H、ヘキサンジアミンスペーサ由来CH2)、1.44 (s、9H、tBuプロトン)、1.53 (m、4H、ヘキサンジアミンスペーサ由来残留CH2)、3.10 (m、2H、CH2NHBoc)、3.26 (m、2H、CH2C(O)NHCH2)、4.04 (s、2H、CH2C(O))、4.52 (ブロードs、1H、NHBoc)、6.61 (ブロードs、2H、ClCH2NHC(O))ppm。
エチレンジアミン(147.4mg、2.452mmol)をアセトニトリル(25ml)中に溶解した。1(161.4mg、5.51×10−4mol)をアセトニトリル(25ml)中に溶解した。その溶液を75℃でエチレンジアミン溶液に、5秒あたり約1滴の速度で滴加した。添加の完了後、その混合物を75℃で一夜加熱した。
2の1H NMR (CDCl3):δH 1.09 (m、4H、ヘキサンジアミンスペーサ由来CH2)、1.35 (s、9H、tBuプロトン)、1.39 (m、4H、ヘキサンジアミンスペーサ由来残留CH2)、2.62 (t、2H、J= 7.14Hz、NH2CH2)、2.91 (t、2H、J=5.41Hz、C(O)NHCH2)、3.01 (m、2H、CH2NHBoc)、3.14 (ブロードs、1H、NH、NHCH2C(O))、3.26 (t、J=5.36Hz、2H、NH2CH2CH2)、3.40 (m、2H、CH2C(O))、4.79 (ブロードs、1H、NHBoc)、7.14 (ブロードs、1H、CH2C(O)NH)ppm。
2(41.3mg、1.61×10−4mol)をジクロロメタン(5ml)中に溶解した。その溶液を20分間氷浴(0℃)中で攪拌した。その後、水素化アルミニウムリチウム(ジエチルエーテル中の1M 溶液 1ml、1mmol)を添加した。白色個体が沈殿するのが直ちに観察された。その混合物を30分間0℃(氷浴)で攪拌し、その間に温度は室温と平衡になった。その後、ミリQ 1.5mlを慎重に添加して、過剰の水素化リチウムアルミニウムを中和した。ミリQの添加はより重要な量の白色固体の沈殿をもたらした。その後、混合物をろ過した。有機抽出物を水性抽出物から分離し、減圧下で乾燥し、無色の油を得た。(収量:33.8mg、69.4%)。
3(33.8mg、1.12×10−4mol)をN,N’-ジメチルホルムアミド(17.1ml)中に溶解した。固体のテトラクロロ白金酸カリウム(46.1mg、1.11×10−4mol)を添加した。その混合物を40℃で週末をまたいで加熱した。加熱中に赤色テトラクロロ白金酸カリウム固体が溶解するのが観察され、N,N’-ジメチルホルムアミド溶液が薄い茶色に変わるのが観察された。その後、溶媒を加圧下で除去し、茶色の固体を得た。固体をミリQ(20ml)で洗浄した。再度、茶色の固体をN,N’-ジメチルホルムアミド(17.1ml)中に溶解し、その溶液を40℃で一夜加熱した。その後、溶媒を減圧下で除去した。最後に、茶色の固体をメタノール 47.2ml中に溶解し、その溶液を60℃で週末をまたいで加熱した。(収量:34.3mg、59.8%)。
195Pt NMR (CD3OD):δPt -2523ppm。
4(34.3mg、6.69×10−5mol)を200mM 塩酸(980.88μl)と混合した。その混合物を50℃で一夜加熱した。加熱中に茶色固体が溶解するのが観察された。ミリQ中の水酸化ナトリウム溶液(1M)および塩酸(200mM)を用いてpHを約8.0に調整した。その混合物を1時間室温で静置した。不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたN,N’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。
195Pt NMR (CD3OD):δPt -2630ppm。
標識化合物としてのN3 シス-Bio ULS (5)の使用
6つのたんぱく混合物(前記参照) 25μgを、標識バッファ 50μl中で16時間37℃にて標識した。5の量は、それぞれ5、10、12.5、15または20μgであった。標識反応を還元サンプルバッファの添加によって停止した。検出抗体:BIO-AP 1:1000。
標識の結果を図14に示す。
6c(5.8mg、8.6×10−6mol)をN,N’-ジメチルホルムアミド(11.2ml)中に溶解した。固体のテトラクロロ白金酸カリウム(3.6mg、8.8×10−6mol)を添加した。その混合物を40℃で一夜加熱した。加熱中に赤色テトラクロロ白金酸カリウム固体が溶解するのが観察され、N,N’-ジメチルホルムアミド溶液がオレンジ色に変わるのが観察された。その後、溶媒を加圧下で除去し、茶色の固体を得た。(収量:12.4mg、37.4%)
1の1H NMR (DMF-d7):δH 1.27 (m、4H、脂肪族CH2)、1.57 (m、8H、脂肪族CH2)、1.88 (m、4H、脂肪族CH2)、2.11 (m、4H、C(O)CH2)、3.11 (m、4H、CH2NHC(O))、4.29 (m、2H、CH2NHC(O)NH)、4.61 (m、2H、OCH2)、7.50 (m、2H、芳香族H)、7.80 (m、2H、芳香族H)、8.69 (m、 4H、芳香族H)ppm。195Pt NMR (DMF-d7):δPt -2707ppm。MS (ESI+) m/z: 867 [M]+。
図15はスキーム7の合成−テトラクロロ白金酸カリウムとの錯体形成−を示す。
1の作製−クロロアセトニトリルの付加:
N-Boc-1,6-ジアミノヘキサン(67.98mg、3.142×10−4mol)をジクロロメタンの最小量(1ml)中に溶解した。その後、アセトニトリルを添加した(25ml)。炭酸カリウム(224.1mg、1.621mmol)およびヨウ化カリウム(122.3mg、7.367×10−4mol)も、固体の状態で添加した。その後、クロロアセトニトリル(1.0ml、16mmol)を添加した。その混合物を75℃で一夜加熱した。加熱中溶液が黒色に変わるのが観察された。その後、固体をろ過した。ろ液を乾固した。不溶性の物質をジクロロメタン(3×3ml)中に抽出した。有機抽出物を混合し、ろ過し、減圧下で乾燥した。オレンジ色の固体が単離された。
1(151.0mg、5.129×10−4mol)をジクロロメタン(20ml)中に溶解した。その溶液を20分間氷浴(0℃)中で攪拌した。その後、水素化アルミニウムリチウム(ジエチルエーテル中の1M 溶液 5ml、5mmol)を添加した。白色個体が沈殿するのが直ちに観察された。その混合物を30分間0℃(氷浴)で攪拌し、その間に温度は室温と平衡になった。その後、ミリQ 7.5mlを慎重に添加して、過剰の水素化リチウムアルミニウムを中和した。ミリQの添加はより重要な量の白色固体の沈殿をもたらした。その後、混合物をろ過した。有機抽出物を水性抽出物から分離し、減圧下で乾燥し、無色の油を得た。(収量:23.5mg、15.1%)。
2(23.5mg、7.77×10−5mol)をN,N’-ジメチルホルムアミド(12.5ml)中に溶解した。固体のテトラクロロ白金酸カリウム(32.4mg、7.80×10−5mol)を添加した。その混合物を40℃で一夜加熱した。加熱中に赤色テトラクロロ白金酸カリウム固体が溶解するのが観察され、N,N’-ジメチルホルムアミド溶液が薄い茶色に変わるのが観察された。その後、溶媒を加圧下で除去し、茶色の固体を得た。
195Pt NMR (DMF-d7):δPt -2586ppm。(収量:27mg、61.1%)。
3(13.5mg、4.13×10−5mol)を200mM 塩酸(670.03μl)と混合した。その混合物を50℃で一夜加熱した。加熱中に茶色固体が溶解するのが観察された。ミリQ中の水酸化ナトリウム溶液(1M)および塩酸(200mM)を用いてpHを約8.0に調整した。不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたN,N’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。代わりに、N,N’-ジメチルホルムアミド中にスクシンイミジルエステルを添加して、茶色の残さを可溶化することもできる。N,N’-ジメチルホルムアミド(ml)中のEZ-link-LC-ビオチン スクシンイミジルエステル(18.76mg、4.13×10−5mol)を滴加した。pHが8.0前後であると確認した。トリエチルアミンをこのpH調整のために添加してもよい。その混合物を5分間遮光下にて室温で攪拌した後、pHが8.0前後であることを確認した。ここでも、トリエチルアミンをpH調整のために使用してもよい。その後、混合物を遮光下加熱中に室温で一夜攪拌した。その後、不溶性物質をろ過した。
195Pt NMR (DMF-d7):δPt -2707ppm。 MS (ESI+) m/z: 772 [M]+。
1の作製−2-クロロエチルメチルエーテルの付加:
N-Boc-1,6-ジアミノヘキサン(101.3mg、4.688×10−4mol)をジクロロメタンの最小量(1ml)中に溶解した。その後、アセトニトリルを添加した(30ml)。炭酸カリウム(327.1mg、2.367mmol)およびヨウ化カリウム(157.1mg、9.463×10−4mol)も、固体の状態で添加した。その後、2-クロロエチルメチルエーテル(93.3μl、9.35×10−4mol)を添加した。その混合物を75℃で一夜加熱した。その後、固体をろ過した。ろ液を乾燥した。残さをジクロロメタン(3×3ml)で抽出した。有機抽出物を混合し、ろ過し、減圧下で乾燥し、白色個体を得た。(収量:19.2mg、11.2%)。
MS (ESI+) m/z: 365 [M+H]+。
1(19.2mg、5.26×10−5mol)をN,N’-ジメチルホルムアミド(11.2ml)中に溶解した。固体のテトラクロロ白金酸カリウム(21.7mg、5.23×10−5mol)を添加した。その混合物を40℃で一夜加熱した。加熱中に赤色テトラクロロ白金酸カリウム固体が溶解するのが観察され、N,N’-ジメチルホルムアミド溶液がオレンジ色に変わるのが観察された。その後、溶媒を加圧下で除去し、茶色の固体を得た。(収量:12.4mg、37.4%)。
3の作製および4のin-situ作製−Boc-保護基の除去およびEZ-link-LC-ビオチン スクシンイミジルエステルとの反応:
2(12.4mg、1.97×10−5mol)を200mM 塩酸(1336.39μl)と混合した。その混合物を50℃で一夜加熱した。加熱中に茶色固体が溶解するのが観察された。ミリQ中の水酸化ナトリウム溶液(1M;240μl)および塩酸(200mM;10μl)を用いてpHを約8.0に調整した。不溶性の茶色の物質はすべて、パスツールピペットを用いたN,N’-ジメチルホルムアミドの最小量の滴加によって溶解することが可能である。代わりに、N,N’-ジメチルホルムアミド中にスクシンイミジルエステルを添加して茶色の残さを可溶化することもできる。
分取用HPLC分析法の詳細:
分析用HPLC分析は、容積が88.247ml(250×21.2μl)の逆相Luna3 C18カラムで、NaCl (100mM; バッファA中で90%およびバッファB中で70%)/2-プロパノール (バッファA中で10%およびバッファB中で90%)によって実行した。総計で(およそ)803.0mlを5.0ml/min.の速度でカラムを通して溶出した。この方法では、30%濃度に達する94.25〜182.49ml(1.0 カラム容積)のB、80%濃度に達する182.49〜403.21ml(2.5 カラム容積)のB、100%濃度に達する403.21〜447.33ml(0.5 カラム容積)のB、および、再度、溶出する579.91〜624.03ml(0.5 カラム容積)の純粋なA、の直線勾配を組み込んだ。447.33〜579.81mlで、純粋なBが溶出された。
Claims (22)
- 遷移金属原子と、化学的または生物学的物質が遷移金属原子に付着することを可能とするための反応性部分と、安定化架橋としての不活性三座配位子部分と、マーカとを含むことを特徴とする標識遷移金属錯体。
- 遷移金属がバナジウム、クロム、鉄、ニッケル、銅、ルテニウム、パラジウム、白金、モリブデン、タングステン、コバルト、マンガン、オスミウム、ロジウム、イリジウム、亜鉛、およびカドミウムから成る群から選ばれることを特徴とする請求項1記載の錯体。
- 遷移金属が鉄、ニッケル、ルテニウム、パラジウム、白金、モリブデン、タングステン、およびコバルトから成る群から選ばれることを特徴とする請求項2記載の錯体。
- 遷移金属が白金、コバルト、またはルテニウムであることを特徴とする請求項3記載の錯体。
- マーカが三座配位子部分に含まれるか、または三座配位子部分に付着されており、任意であるが、スペーサを用いることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の錯体。
- 遷移金属原子が、3つのドナー原子を介して三座配位子部分に付着し、3つのドナー原子はそれぞれ窒素、酸素、硫黄、およびリン原子の群から独立して選ばれ、三座配位子部分に存在することを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の錯体。
- 遷移金属原子が3つの窒素原子を介して三座配位子部分に付着することを特徴とする請求項6記載の錯体。
- 三座配位子部分のドナー原子は、1〜5、好ましくは1〜3の原子によって互いに分離されることを特徴とする請求項6または7記載の錯体。
- マーカが蛍光標識であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載の錯体。
- 反応性部分がCl−、NO3 −、HCO3 −、CO3 2−、SO3 2−、ZSO3 −、I−、Br−、F−、酢酸イオン、炭酸イオン、リン酸イオン、硝酸エチルイオン、シュウ酸イオン、クエン酸イオン、ホスホン酸イオン、ZO−、および水から成る群から選ばれることを特徴とする請求項1〜9のいずれか1項に記載の錯体。
- 請求項1〜10のいずれか1項に記載の遷移金属錯体に付着した化学的または生物学的物質を含み、化学的または生物学的物質が反応性部分を置換していることを特徴とする標識化学的または生物学的物質。
- 物質が、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、たんぱく、免疫グロブリン、酵素、人工酵素、リン脂質、糖たんぱく、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸、ペプチド核酸オリゴマ、ペプチド核酸ポリマ、アミンおよびアミノグリコシドから成る群から選ばれることを特徴とする請求項11記載の標識化学的または生物学的物質。
- 反応性部分が化学的または生物学的物質によって置換される条件下で、化学的または生物学的物質が請求項1〜10のいずれか1項に記載の遷移金属錯体に接触させられることを特徴とする請求項11または12記載の標識化学的または生物学的物質の作製方法。
- 物質または物質を含有するサンプルの質量分析を容易にするために、化学的または生物学的物質の分子量に規定シフトを作出するための、請求項1〜10のいずれか1項で定義される遷移金属錯体の使用。
- 質量分析による化学的または生物学的物質の区別を可能にする方法であって、請求項1〜10のいずれか1項に記載の少なくとも1つの遷移金属錯体による物質の特異的標識工程を含むことを特徴とする方法。
- 化学的または生物学的物質の質量分析方法であって、請求項1〜10のいずれか1項に記載の少なくとも1つの遷移金属錯体による物質の特異的標識工程と、質量分析によって物質を分析する工程とを含むことを特徴とする方法。
- 少なくとも2つの物質が標識され、物質が異なるサンプルに由来することを特徴とする請求項15または16に記載の方法。
- 物質を特異的に標識する工程が請求項1〜9のいずれか1項に記載の少なくとも2つの遷移金属錯体によって実行され、遷移金属錯体が異なる分子量であり、分子量差が1Da以上であることを特徴とする請求項17記載の方法。
- 少なくとも2つの異なる分子量の遷移金属錯体のセットであって、各遷移金属錯体が請求項1〜10のいずれか1項に記載の遷移金属錯体であることを特徴とするセット。
- 請求項19に記載の少なくとも2つの異なる分子量の遷移金属錯体のセットを含むことを特徴とする部品のキット。
- さらに反応取扱説明書、試験サンプル、試験管または試験紙、バッファ、マーカ調製品およびイオン強度を調整する調製品から成る群から選ばれる少なくとも1つの品目を含むことを特徴とする請求項20記載の部品のキット。
- 請求項15〜18のいずれか1項に記載の方法を採用する部品のキット。
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