JP2008521425A - 細胞の分析のための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ミクロ流体力学的細胞分析器を使用して単細胞の原形質膜を分析し、これに関する信頼性のあるデータを得る改善された方法を提供する。本発明のミクロ流体力学的細胞分析器は、単細胞トラップと、該トラップ内の細胞の外側表面を操作するように構成されたマニピュレータと、前記単細胞トラップおよび検出器と連絡している検出ゾーンとを具備する。
【選択図】 図１

Description

発明の背景

本発明は、ミクロ流体力学的細胞分析器に関する。

細胞集団の分析は重要な情報を提供してきたし、また多くの重要な医学的、臨床的および科学的な発展を導いてきた。しかし、与えられた集団内の細胞は不均一である。これは、集団で平均化された細胞調製技術の使用に伴う問題を導き、細胞を分析する別の方法についての必要性を刺激している。特に、これは単細胞分析法の開発を導いてきた。

単細胞分析方法は、集団平均分析方法に付随する欠点を克服すると思われる。特に、このような方法は、より正確な情報を得ることを可能にし、治療的介入および疾患状態に対する細胞応答のより良好な理解を可能にする。従って、単細胞分析は、個々の患者にオーダーメードされた予測的および予防的医薬の開発を補助および可能にするための、重要なツールになる可能性を有している。

ミクロ流体力学系は、単細胞分析を実施するために以前から使用されてきた。しかし、このような分析では、当該細胞の細胞内成分に焦点が当てられてきた。従って、該技術の分析方法は、分離されたチャンネル内への単細胞の配置、該細胞の溶解、細胞成分の分離、および興味ある細胞内成分のキャピラリー電気泳動による分析を必要とする。

細胞の細胞内成分の分析は興味ある生物学的情報を提供するが、細胞とその周囲環境との相互作用は、主に原形質膜によって決定される。

原形質膜は細胞の範囲を定義し、また該細胞とその外部環境との相互作用を緩和する。それは、フィルターとして作用すること、能動輸送を可能にすること、細胞に対する物質の出し入れを制御すること、細胞の内部と外部の間にイオン濃度の差を生じさせること、および外部信号を検知することを含む多くの役割を実行する。

原形質膜は多くの疾患状態の主題であり、また多くの治療的介入のための標的である。原形質膜は、多数の信号伝達経路における伝達に関与しており、全ての細胞成分のための導入および排出の経路であり、またそれによって細胞がそれらの環境と相互作用および通信するための手段である。従って、原形質膜は単細胞分析のための重要な標的である。

原形質膜は脂質二重層であり、該二重層はリン脂質、コレステロールおよび糖脂質で構成されている。加えて、原形質膜は、タンパク質、糖タンパク質等のような多くの追加の成分を含有している。従って、原形質膜は、数千のタンパク質ならびに脂質の複合混合物を含有している。原形質膜の現在の分析方法は、二つの戦略のうちの一つに広く基づいている。従来のタンパク質分析方法は、組織または培養物から細胞のアンサンブルを取り、それをホモジナイズし、次いで成分を分離する。その一例は、ＮＡＬＤＩ−ＴＯＦプロテーム的アプローチであり、これは二次元ゲルまたは液層分離を使用して個々のタンパク質を分離し、または質量スペクトル分析法を使用してそれらを同定する。しかし、２ＤゲルＮＡＬＤＩ−ＴＯＦアプローチは、低い忠実度、感度の悪さ、および単離の困難さを伴う問題のため、膜タンパク質については非常に不十分であり、有用性が限定される。原形質膜の脂質組成の分析のための別のアプローチは、電子スプレーイオン化質量スペクトル分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）であり、これはリン脂質構造の分析を可能にする。同様の技術を膜タンパク質に適用することができるが、該タンパク質は最初に、等電集中法（ＩＥＦ）およびＳＤＳ電気泳動の組合せを使用して分離されなければならず、これは困難を生じ且つ時間を浪費することが多い。

別の分析方法は、インビボ蛍光顕微鏡を使用するものである。この方法は単細胞に適用することができる。しかし、蛍光顕微鏡は、抗体またはトランスフェクション標識の特異性に依存する。これは、蛍光顕微鏡の主な欠点であり、この技術の適用を、同時には二つまたは三つのタンパク質だけの試験に限定してきた。

従って、当該技術においては、細胞の原形質膜、特に単細胞の原形質膜を分析し、これに関して信頼性のあるデータを得るための改善された方法が必要とされている。

本発明の第一の側面は、単細胞トラップと、該トラップにおける細胞の外側表面を操作するように構成されたマニピュレータと、前記単細胞トラップと連絡している検出ゾーンと、検出器とを具備してなるミクロ流体力学的細胞分析器を提供する。

本発明は、種々の方法で実施されてよく、本発明を例示するための例として、図面を参照して多くの具体的な実施形態が記載される。

図１は、ミクロ流体力学的細胞分析器の概略的表現を示している。

図１に示したミクロ流体力学的細胞分析器は、単細胞トラップ、例えば多次元蛍光撮像器（３）によりモニターされる光学トラップ（２）と、レーザ切開のようなマニピュレータ（図示せず）と、ミクロ流体力学的分離器（４）と、検出ゾーン（図示せず）と、検出器（５）とを具備している。

細胞サンプルの予備分離は、（１）において、制御されたミクロ流体力学的ナノ分解によって行われる。次いで、細胞は光学トラップ（２）において単離され、多次元蛍光撮像器（３）によってモニターされる。細胞の操作は、１以上のマニピュレータ（図示せず）によって行われ、分解後の生成物は、２Ｄ光学フィンガープリント法または多次元蛍光撮像法による検出（５）の前に、ミクロ流体力学的分離機（４）によって分離される。

ミクロ流体力学的細胞分析器は、細胞外側表面の分析のために、特に、細胞の原形質膜の分析のために提供される。

該分析器は、細胞の原形質膜中の、またはこれに付随した１以上のタンパク質、糖タンパク質または脂質を分析するために使用することができる。

使用において、単細胞は光学セルトラップの中に導入される。本発明の目的のために、光学トラップはレーザおよび集光レンズを具備している。光学トラップ内での細胞の操作は、集光されたレーザビームの位置、偏光、位相およびプロファイルを含んでなり、且つ上記で述べた機能を実現するために使用されるコントローラによって達成される。このコントローラはレンズの低倍率側に含めることができ、そこではレーザビームが平行化される。

光学トラップ内での細胞の位置は、細胞の状態に関する情報を提供する多次元蛍光撮像器のような撮像器によってモニターされ、該情報は前記コントローラにフィードバックされる。

「光学トラッピング」の用語は、それによって高誘電率の細胞が高電界領域、例えばレーザビームの集光において生成した最大電界の領域に自然に結合されるプロセスを意味する。或いは、光学トラッピングは、集光されたビームの中心にダークスポットを形成して、前記電界により反発される細胞（適切な誘電性を備える）をトラップすることによって行われ、ここで目的物は前記ダークセンターの中に強制的に導入される。例えば直線または曲線を形成するための前記ビーム焦点の正確な形態は、伸長されたまたは非球形の細胞をトラップするために使用することができる。

或いは、前記細胞は、静電気のような他の方法によってトラップされてもよい。

光学的トラップ内での前記細胞の操作は、例えば、集光されたレーザをコントローラとして使用して前記スポットを三次元で移動させ、前記細胞の位置を変化させることによって達成することができる。同様に、所謂「角運動量」を備えたビームプロファイルを使用して、前記細胞を回転させることができる。

前記細胞は、分析の際に該細胞が溶媒流の中で静止したまま残ることを保証するためにトラップされる。細胞が操作されるときの動的な流体環境、並びに細胞のサイズおよび特徴の変化のために、適用される制御には、該細胞およびその成分を正しい位置に維持することが要求される。本発明について、これは、近赤外レーザトラッピングビームをリアルタイムで動的に制御する、プログラム可能な回折光学系を使用して達成される。プログラム可能な回折光学系は、空間光モジュレータ（ＳＬＭ）を用いて達成され、これは外部の電気的制御または光学的制御の下で、反射光または通過光の位相、振幅または偏光を変更するための手段を提供する。当該装置は、適切なコンピュータ生成されたホログラムを用いて、また適切な外部光学部品の補助を用いてプログラムされる。前記ＳＬＭは、レーザビームに対して任意の位相、偏光および振幅分布を与えるように構成される。この方法において、前記装置は、光学トラップ中におけるレーザビームの集光されたプロファイルの動的制御を可能にする。

本発明の目的のためにレーザビームを制御する他の方法には、ミラーまたは音波／光デフレクターを走査することが含まれる。これらは、複数の位置の間でビームを一時的に多重化（走査）することができる。

プログラム可能な回折光学系は、走査プロセスが進行するに伴って細胞の全体およびその内容物を効果的にトラップするために、複雑なビームパターンの使用を可能にする。この構成は、流動する細胞培地の光学的特性における変化を補償できるように、本来的に適合されており、また前記プログラム可能な性質は、前記細胞が移動または回転されることを可能にする。この特徴は、前記流れダイナミクスの能動制御と相互作用して、前記細胞膜上の特定の特徴物を選択的にターゲッティングすることを可能にする。当該システムのオペレータとの対話的使用が細胞の動的操作を可能にする結果、前記選択的特徴物は、トラップされた細胞を流体流れの中で適切に回転または並進させることによって位置決めされる。

単細胞のトラッピングおよび操作は、細胞を操作およびモニターする対話システムを提供するために、オンラインの多次元蛍光撮像装置（ＭＤＦＩ：２または３の空間的次元、並びに寿命、波長および偏光の幾つかもしくは全部に関して蛍光を解像する）のような撮像器と組み合わされてもよい。これは対話的フィードバックを提供して、細胞膜における特定の構造物の選択的ターゲッティングを向上させる。前記オンライン多次元蛍光撮像は、内因性の自己蛍光または適切な蛍光標識を使用して、前記細胞を操作およびモニターするための対話システムを提供することができる。その代わりに、またはそれに加えて、該オンライン多次元蛍光撮像は、原形質膜の選択的溶解に結合され得る対話システムを提供することができる。更に、該オンライン多重パラメータ蛍光撮像は、当該プロセスをモニターするために、また前記ミクロ流体力学システムによってスペルトされた（sperted）アナライトの読み出しを支援するために使用することができる。

細胞は、入力容器を通してミクロ流体力学的細胞アナライザの中に導入することができる。それらは、例えば水力学的力および／または電気力学的力のような適切な力を使用して、該分析器を通して移動させることができ、前記分析器の中の微小チャンネルネットワークを通して適切な位置へと移動され、そこで光学的にトラップされることができる。該微小チャンネルは、微小チャンネル表面および壁との相互作用を伴うことなく、該チャンネルを通して細胞の容易な通過を可能にするような寸法（チャンネル幅およびチャンネル高さ）を有している。

単細胞は、微小マニピュレータと共に吸引アセンブリーを使用して、トラップの中に導入することができる。これは、細胞がその増殖培地からミクロ流体力学的装置へと移動されるのを可能にし、次いで、該装置においては層流が細胞を光学トラップへと送達するであろう。

ミクロ流体力学的細胞分析器は、更に、単細胞トラップと検出ゾーンの間に配置されたミクロ流体力学的分離機を含むことができる。操作後の成分の分離は、サイズ、等電点電気泳動、質量および／または質量／電荷によって行うことができる。或いは、細胞は光学トラップの中で分析することができる。

トラップされた細胞の外側表面は、マニピュレータによる操作を受ける。特に、原形質膜がマニピュレータによって操作される。操作は、物理的または化学的手段によって行うことができる。特に、該操作は、細胞の外側表面を酵素（例えばリパーゼ)、脂質、洗剤、超音波処理、および／または物理的撹拌（例えばレーザ解体）に露出させることができる。化学的薬剤は、前記微小チャンネル内の複数の層流を使用して、膜表面の定義された位置（細胞の微小ドメイン）に送達することができる。試薬流に対する細胞の位置および角方位の両方を制御することによって、原形質膜の全体またはその標的亜細胞微小ドメインを分解し、それによって原形質膜内における化学的部分の分布に関する空間的情報を提供することが可能である。当該膜から放出された物質は、連続的な流れの中に回収され、分離および分析のために下流に向けられる。或いは、適切な化学試薬の送達によって原形質膜内のストレス領域を促進する（即ち、エキソサイトーシスの開始を介して）ために、細胞の生物学を操作してもよい。更に、細胞は１以上のホルモン、タンパク質等と共にインキュベートされてもよい。

特に、例えば電気力学的制御および／または「ティー注入器」を使用して、前記光学トラップの上流で、当該膜を分解できる物質の小さいプラグ（１０ｐＬ〜１０ｎＬ）を分析器の中に導入することができる。該プラグが細胞に接触すると、該細胞は回転されて、分解された物質を放出させ、ミクロ流体力学的分離器に向けて下流へと駆動される。

原形質膜は、外部細胞表面の孔の全体に亘って操作されてよい。或いは、原形質膜の一部が操作されてもよい。特に、操作は、原形質膜を構成する脂質および／またはタンパク質に向けられてよい。

本発明の第一の側面の分析装置は、外側細胞表面、より詳細には原形質膜の分析に向けられる。原形質膜の操作は細胞の溶解をもたらさない。原形質膜の局在化した領域の破壊は、弱体化領域の形成または細胞膜の破壊をもたらし、細胞内容物の幾らかが当該部分を通過する可能性がある。しかし、このような膜透過性の増大は、細胞の完全な溶解を直接導くものではない。

細胞の操作が完了したら、該細胞は引き続き溶解され、細胞の内容物が原形質膜内容物から分離される。次いで、分離された原形質膜は必要に応じて更に分解することができる。或いは、該細胞は完全な形態で保持することができ、該細胞は全ての分解産物から分離される。

分析器は、単細胞の外側表面、または単細胞の外側表面の成分を検出するための検出器を具備している。細胞は、好ましくは多重パラメータ蛍光撮像法および／または光学フィンガープリント法によって検出される。

特に、原形質膜および／またはその成分は、多重パラメータ蛍光撮像法（ＭＤＦＩ）を使用して分析することができる。ＭＤＦＩは、励起および発光スペクトルのプロファイル、並びに蛍光寿命データを迅速に獲得する能力と共に、迅速な光学的断片化を提供するように、高速準広視野多重光子顕微鏡を使用して実現される。ＭＤＦＩは、少なくとも三つの重要な能力を提供する。第一に、適切な蛍光標識（遺伝子的に発現され、または付着されたもの）を使用することにより、細胞膜における特異的成分の直接的観察、およびミクロ流体力学的分離系を介してのそれらの追跡を可能にする。第二に、スペクトル的に解像されたＦＬＩＭと組み合わせた多重光子励起の使用は、前例のない自己蛍光コントラストを与え、幾つかのサンプルを損なう可能性のある外因性蛍光標識を使用せずに、全体のプロセスを制御およびモニターすることを可能にする。最後に、ＭＤＦＩは、ミクロ流体力学的分離の光学的読み取り、異なるタンパク質の識別等を達成するための一つの方法を提供する。

或いは、または上記に加えて、光学的読み取りは、多次元蛍光撮像および／または光学的フィンガープリント法技術を使用する単分子感度を用いて得ることができる。ＭＤＦＩは、本質的には電子エネルギーレベル構造に付随するスペクトルをプローブするが、光学的フィンガープリント法の技術は、分子における個々の結合パターンを直接解像できる振動スペクトルツールである。

光学的フィンガープリント法は、２Ｄ・ＮＭＲの光学的アナログを使用して達成される。この光学的アナログは、二つの赤外レーザビームを使用して二つの振動を励起させ、次いで、種々の方法で振動カップリングをモニターすることができる。本発明の好ましい特徴において、検出は二重に振動的に増強された（ＤＯＶＥ）スペクトル分析を使用して得られる。ＤＯＶＥは、第三のレーザパルスを使用して振動カップリングを読み取る。本発明はまた、三つの振動を励起させるための三つの赤外パルス、およびカップリングを読み取るための第四のパルスを使用するＴＲＩＶＥのような、ＤＯＶＥの拡張法をも包含するものである。カップリングのこの測定は、ＮＯＥＳＹまたはＣＯＥＳＹ、即ち、スピン−スピンカップリングを測定するＮＭＲ法に類似している。振動カップリングスペクトルは多次元スペクトル空間上に投影され、一つは各ＩＲレーザビームについてのものであり、また一つは各ＩＲパルス間のタイミングについての時間次元である。この方法において、密度が高く且つ密集したＩＲスペクトルは、２Ｄ・ＮＭＲの場合のように、カップリングだけを見ることによって、またより高次元空間上に投影されることによって薄められる。

当該ミクロ流体力学分析器は、２以上の単細胞トラップおよび／または２以上の検出ゾーンを含んでいる。これは、単細胞分析への高スループットのアプローチを可能にする。特に、一つの検出器（例えば多重パラメータ蛍光装置）を、２以上の単細胞トラップおよび／または２以上の検出ゾーンを追跡するために使用することができる。複数の検出ゾーンの出力を組み合わせて、光学的フィンガープリント法を介しての高スループットの読み出しを可能にすることができる。このアプローチは、１以上の原形質膜成分の迅速で且つ大量の分析を可能にする。

単細胞方法は、二以上のミクロ流体力学的細胞分析器を提供することによって、スケールアウトすることができる。本発明の第一の側面は、従って、２以上のミクロ流体力学的細胞分析器を含んでなるミクロ流体力学的細胞分析器のアレイを包含する。該分析器は、並列または直列に設けられる。

当業者は、本発明の目的のために如何なる適切な部品でも使用できることを理解するであろう。特に、単細胞トラップ、マニピュレータ、検出ゾーンまたは検出器は、如何なる適切な部品であることもできる。第一の側面の目的のための単細胞は、主として不均一または均一な細胞集団から得られる。このような細胞には、植物細胞または動物細胞を含む哺乳類または非哺乳類細胞が含まれる。該細胞は、植物もしくは動物から単離することができ、またはインビトロで製造することができる。該細胞は天然の細胞であってよく、または遺伝子的、化学的もしくは生物学的に操作されてもよい。このような細胞には、樹状細胞、粘膜細胞および上皮細胞が含まれる。

本発明の第二の側面は、単細胞分析の方法であって、単細胞をトラップすることと、該細胞の外側表面を操作することと、該操作された細胞表面を分析することとを含んでなる方法を提供する。この外側細胞表面は、好ましくは原形質膜である。

細胞の外側表面は、１以上のホルモン、タンパク質、酵素、脂質、洗浄剤、超音波処理、および／または物理的撹拌に露出することによって操作することができる。オンラインの多次元蛍光撮像法は、細胞の外側表面の操作の程度および位置を決定することを可能にできる。次いで、該操作は２Ｄ光学フィンガープリント法または多次元蛍光撮像法によって分析することができる。

特に、この第二の側面は、制御されたミクロ流体力学的ナノ分解による細胞サンプルの予備分離と、光学トラップの中に細胞をトラップすることと、多次元蛍光撮像法によって細胞をモニタリングすることと、マニピュレータによって細胞を操作することと、ミクロ流体力学的分離によって細胞の得られた成分を分離することと、２Ｄ光学フィンガープリント法または多次元蛍光撮像法を介して検出することとを含んでなる、単細胞分析方法に関するものである。

本発明の上記側面の全ての好ましい特徴は、必要な変更を加えた上で、他の全ての側面にも適用されるものである。

図１は、ミクロ流体力学細胞分析器の概略的表現を示している。

Claims (25)

1. ミクロ流体力学的細胞分析器であって、単細胞トラップと、該トラップにおける細胞の外側表面を操作するように構成されたマニピュレータと、前記単細胞トラップと連絡している検出ゾーンと、検出器とを具備してなるミクロ流体力学的細胞分析器
2. 請求項１に記載のミクロ流体力学的細胞分析器であって、更に、前記単細胞トラップと前記検出ゾーンとの間にミクロ流体力学的分離機を具備してなる細胞分析器。
3. 請求項１または２に記載のミクロ流体力学的細胞分析器であって、前記トラップが光学トラップである細胞分析器。
4. 請求項１〜３の何れか１項に記載のミクロ流体力学的細胞分析器であって、前記トラップがオンライン多次元蛍光撮像法によってモニターされる細胞分析器。
5. 請求項１〜４の何れか１項に記載のミクロ流体力学的細胞分析器であって、前記検出器が多重パラメータ蛍光撮像法および／または光学的フィンガープリント法を提供する細胞分析器。
6. 請求項１〜５の何れか１項に記載のミクロ流体力学的細胞分析器であって、前記検出器が、高速準広視野多重光子顕微鏡である細胞分析器。
7. 請求項１〜６の何れか１項に記載のミクロ流体力学的細胞分析器であって、前記検出器が、二重に振動的に増強された（ＤＯＶＥ）スペクトル分析を提供する細胞分析器。
8. 請求項１〜７の何れか１項に記載のミクロ流体力学的細胞分析器であって、２以上の単細胞トラップを具備する細胞分析器。
9. 請求項１〜８の何れか１項に記載のミクロ流体力学的細胞分析器であって、２以上の検出器を具備する細胞分析器。
10. 請求項１〜９の何れか１項に記載の２以上のミクロ流体力学的細胞分析器を具備する、ミクロ流体力学的細胞分析器のアレイ。
11. 単細胞を分析する方法であって、単細胞をトラップすることと、該細胞の外側表面を操作することと、該操作された細胞表面を分析することとを含んでなる方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、前記トラップされた細胞が、オンラインの多次元蛍光撮像法によってモニターされる方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、前記オンラインの多次元蛍光撮像法が、内因性の自己蛍光または蛍光標識を使用する方法。
14. 請求項１１または１２に記載の方法であって、前記トラップされた細胞のモニタリングが、前記細胞を操作およびモニタリングするためのフィードバックシステムを提供する方法。
15. 請求項１４に記載の方法であって、前記フィードバックシステムが、前記原形質膜の選択的溶解にカップリングされる方法。
16. 請求項１１〜１６の何れか１項に記載の方法であって、前記細胞の外側表面が、１以上のホルモン、タンパク質、酵素、脂質、洗浄剤、超音波処理、および／または物理的撹拌への露出によって操作される方法。
17. 請求項１１〜１６の何れか１項に記載の方法であって、前記細胞が、不均一または均一な細胞集団から得られる方法。
18. 請求項１１〜１７の何れか１項に記載の方法であって、前記細胞が、哺乳類細胞または非哺乳類細胞である方法。
19. 請求項１１〜１８の何れか１項に記載の方法であって、前記細胞が、光学トラップの中にトラップされる方法。
20. 請求項１１〜１９の何れか１項に記載の方法であって、前記操作された細胞表面が、２Ｄ光学フィンガープリント法または多次元蛍光撮像法により分析される方法。
21. 請求項１１〜２０の何れか１項に記載の方法であって、細胞サンプルは前記細胞のトラッピングに先立って、制御されたミクロ流体力学的ナノ分解により予め分離される方法。
22. 請求項１１〜２１の何れか１項に記載の方法であって、前記細胞の成分が、前記分析に先立って、ミクロ流体力学的分離により予め分離される方法。
23. 請求項１１〜２２の何れか１項に記載の方法であって、制御されたミクロ流体力学的ナノ分解により前記細胞サンプルを予め分離することと、前記細胞を光学トラップの中にトラップすることと、多次元蛍光撮像法により前記細胞をモニタリングすることと、マニピュレータにより前記細胞を操作することと、ミクロ流体分離により前記得られた細胞の成分を分離することと、２Ｄ光学フィンガープリント法または多次元蛍光撮像法を介して検出することとを含んでなる方法。
24. 実施例および図面を参照してここに実質的に記載した通りの、ミクロ流体力学的細胞分析器。
25. 実施例および図面を参照してここに実質的に記載した通りの方法。

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