JP2008519841A - Ovr110抗体組成物および使用方法 - Google Patents
Ovr110抗体組成物および使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、抗Ovr110抗体組成物および、Ovr110を発現する卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞または乳癌細胞を死滅させる方法に関する。
卵巣癌
卵巣の癌は、米国における女性の癌死亡の4番目に一般的な原因であり、23,000件を超える新たな症例および約14,000人の死亡が2001年について予測される。Shridhar, V. et al., Cancer Res. 61(15): 5895-904 (2001); Memarzadeh, S. & Berek, J. S., J. Reprod. Med. 46(7): 621-29 (2001)。米国癌学会(ACS)は2004年において、約25,580件の新たな卵巣癌の症例と、卵巣癌が米国において約16,090人の死亡の原因となるであろうことを予測している。ACSウェブサイト:cancer with the extension .org of the world wide web。年間の女性の死亡数は、卵巣癌による死亡数の方が、その他の婦人科悪性腫瘍を全て合わせた死亡数より多い。米国における卵巣癌の発生率は、1年間に女性100,000人当たり14.2件と推定され、卵巣癌によって毎年100,000人当たり9人の女性が死亡する。2004年には、新たな診断のうち約70〜75%が、推定5年生存率が約15%であるステージIIIおよびIVの癌腫であろう。Jemal et al., Annual Report to the Nation on the Status of Cancer, 1975-2001, with a Special Feature Regarding Survival. Cancer 2004; 101: 3-27。卵巣癌の発生率は世界的に重大な関心事であり、毎年191,000件と概算される新たな症例が予測される。Runnebaum, I. B. & Stickeler, E., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 127(2): 73-79 (2001)。不都合なことに、卵巣癌を有する女性は通常、疾患が転移するまで無症候性である。卵巣癌についての有効なスクリーニングが利用可能ではないため、診断された女性の約70%が、5年生存率が約25〜30%である進行したステージの癌を有する。Memarzadeh, S. & Berek, J. S.、上記;Nunns, D. et al., Obstet. Gynecol. Surv. 55(12): 746-51。逆に、初期のステージの卵巣癌を有すると診断された女性は、顕著により高い生存率を享受している。Werness, B. A. & Eltabbakh, G. H., Int'l. J. Gynecol. Pathol. 20(1): 48-63 (2001)。本発明者らによる卵巣癌の病因論の理解は不完全であるが、この領域における大規模な研究の結果は、年齢、遺伝的特徴、生殖的および食事性/環境的要因の組み合わせを指摘している。年齢は、卵巣癌の発生における重要な危険因子である:30歳前に卵巣癌を発生するリスクは低い一方で、卵巣癌の発生率は、30〜50歳の間に直線的に上昇し、その後より遅い速度で上昇し、最高の発生率は、70歳代の女性である。Jeanne M. Schilder et al., Heriditary Ovarian Cancer: Clinical Syndromes and Management, in Ovarian Cancer 182 (Stephen C. Rubin & Gregory P. Sutton eds., 2d ed. 2001)。
従って、ある人が卵巣癌を発生しやすいかどうかを予測するため、卵巣癌の診断のため、疾患の進行のモニタリングのため、卵巣癌のステージ分類のため、卵巣癌が転移したかどうかを決定するため、および、卵巣癌の画像化のための、より感度が高く正確な方法に対する多大な必要性が存在する。卵巣癌のよりよい処置の必要性もまた存在する。
乳腺腫瘍癌とも呼ばれる乳癌は、女性の間で2番目に一般的な癌であり、米国において診断された癌の3分の1を占める。9人に1人の女性は、当該女性の生涯において乳癌を発生し、年間約192,000件の新たな乳癌の症例が診断され、死者は約42,000人である。Bevers, Primary Prevention of Breast Cancer, in Breast Cancer, 20-54 (Kelly K Hunt et al., ed., 2001);Kochanek et al., 49 Nat'l. Vital Statistics Reports 1, 14 (2001)。乳癌は、20歳未満の若い女性においては極度にまれであり、30歳未満の女性においては非常にまれである。乳癌の発生率は年齢に伴って上昇し、50歳の年齢までに顕著となる。ラテンアメリカ系ではない白人女性が乳癌について最も高い発生率を有し、韓国の女性は最も低い発生率を有する。乳癌および他の癌を促進する遺伝子的突然変異BRCA1およびBRCA2の有病率の増大は、アッシュケナージ系ユダヤ人(Ashkenazi Jews)において見出される。アフリカ系アメリカ人女性は、これらの同一の群の中で、乳癌についての最も高い死亡率を有し(100,000人あたり31人)、一方中国人女性は、100,000人あたり11人の最も低い死亡率を有する。男性も乳癌を罹患し得るが、これは極度にまれである。米国においては、2004年に、217,440件の乳癌の新しい症例および40,580人の乳癌による死亡が推定されている。(アメリカ癌協会ウェブサイト:cancer with the extension .org of the world wide web)。関連する遺伝子的要因を有する症例を除き、乳癌の正確な原因は知られていない。
I.in situでの乳管癌腫(DCIS):その正常な位置に残留する乳管上皮細胞の悪性形質変換。DCISは純粋に局所的な疾患であり、転移することはない。
II.侵襲性乳管癌腫(IDC):基底膜を突破して乳房の支持組織中に至る乳管上皮細胞の悪性腫瘍。IDCは、最終的には身体の別の場所に拡大し得る。
III.in situでの小葉癌腫(LCIS):乳房の単一の小葉において発生し、小葉壁を通して浸潤しない悪性腫瘍、これは一般に、局所的なままである。
IV.浸潤性小葉癌腫(ILC):乳房の単一の小葉において発生し、小葉壁を貫通して隣接する組織中に直接侵襲する悪性腫瘍。小葉壁を越えるこの侵襲により、ILCは、リンパ管および血管に浸入し、遠位の部位に拡大し得る。
最近まで、すべての乳癌のための一般的な処置は、乳房切除術であった。Fonseca et al., Annals of Internal Medicine 127:1013 (1997)。しかし、最近のデータは、より根治的でない手順が、初期のステージの乳癌について、生存の点において同等に有効であり得ることを示す。Fisher et al., J. of Clinical Oncology 16:441 (1998)。初期のステージの乳癌(即ちステージTis)を有する患者についての処置の選択肢は、乳房を残す手術と、続いて乳房における局所的な放射線療法であり得る。代替的に、乳房切除術を随意に放射線または乳房再構成と組み合わせて用いることができる。これらの処置方法は、乳癌の初期ステージにおいて同等に有効である。
患者により多くの処置の選択肢を提供する努力において、再発性が低く、術後の放射線処置を伴わない乳腺腫瘍摘出術での処置が可能な、初期ステージの乳癌を明確にする努力が進行中である。多くの試行が初期ステージの乳癌を分類するためになされている一方、術後の放射線処置に対する一致した提言は、これらの研究からは得られていない。Page et al., Cancer 75:1219 (1995); Fisher et al., Cancer 75:1223 (1995); Silverstein et al., Cancer 77:2267 (1996)。
膵臓癌は、世界で13番目に一般的な癌であり、癌による死亡の第8位の原因である。Donghui Li, Molecular Epidemiology, in Pancreatic Cancer 3 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。米国においては、膵臓の癌は男性と女性両方において4番目に一般的な癌であり、全体で、癌による死亡の5%およびほぼ30,000人の死亡の原因となっている。同上。膵臓癌の割合は女性より男性で高く、白人よりアフリカ系アメリカ人で高い。同上の9。膵臓癌の最も重要な予測指標は、患者の年齢である;白人の中では、膵臓癌の年齢に関連する発生率は連続して増加しており、85歳以上においても同様である。同上の3。約80%の症例が60〜80歳の年齢範囲で起きており、80代では、40代と比べて、疾患を有するリスクが40倍も高い。同上。さらに米国癌学会は、2004年に米国のみにて、31,800件の新たな膵臓癌の症例を予測している。膵臓癌は、同年に約31,200人の新たな死亡を引き起こすであろう。ACSウェブサイト:cancer with the extension .org of the world wide web。研究者および医師による膵臓癌の処置を考案するための努力にも関わらず、膵臓癌は例外なく致命的であり続けている。James R. Howe, Molecular Markers as a Tool for the Early Diagnosis of Pancreatic Cancer, in Pancreatic Cancer 29 (Douglas B. Evans et al. eds., 2002)。
ステージ0はin situでの癌腫を特徴とし(Tis)、所属リンパ節への転移はなく(N0)、遠隔転移もない(M0)。同上の113。ステージIおよびIIは、腫瘍のカテゴリーに関してのみ、ステージ0と異なる:ステージIは、膵臓のみに限定される腫瘍を含み、これは、(1)最大寸法が2cm以下であるか(T1)、または(2)最大寸法が2cmより大であり(T2)、一方ステージIIは、十二指腸、胆管または膵臓周辺組織まで直接広がった腫瘍(T3)を含む。同上。ステージIIIは、腫瘍のカテゴリーT1、T2またはT3を含む;所属リンパ節転位(N1)は、単一のリンパ節(pN1a)または複数のリンパ節(pN1b)のどちらかを含み;そして遠隔転移はない(M0)。ステージIVAは、胃、脾臓、結腸、または隣接する大きな血管まで直接広がった腫瘍を特徴とし(T4);任意のNカテゴリーであり;および、遠隔転移はない(M0)。最後に、ステージIVBは、任意のTカテゴリー、任意のNカテゴリー、および遠隔転移(M1)を特徴とする。同上。
固体腫瘍の増殖および転位はまた、血管形成に依存する。Folkman, J., 1986, Cancer Research, 46, 467-473; Folkman, J., 1989, Journal of the National Cancer Institute, 82, 4-6。例えば、2mmより大きく広がった腫瘍は、それ自身の血液供給を受けねばならず、これは新しい毛細血管の成長を誘導することにより達成される。これらの新しい血管が一旦腫瘍に埋め込まれると、それらは腫瘍細胞に対し、循環に入り、遠隔部位、例えば肝臓、肺または骨などに転位する手段を提供する。Weidner, N., et al., 1991, The New England Journal of Medicine, 324(1), 1-8。
制御されない血管形成が、広い範囲の疾患に対して責任を負うことが次第に認識されてきたが、これには、限定されることなく、癌、心臓血管疾患、関節リューマチ、乾癬および糖尿病性網膜症を含む。Folkman, 1995, Nat Med 1(1): 27-31; Isner, 1999, Circulation 99(13): 1653-5; Koch, 1998, Arthritis Rheum 41(6):951-62; Walsh, 1999, Rheumatology (Oxford) 28(2):103-12; Ware and Simons, 1997, Nat Med 3(2): 158-64。
本発明は、従来の治療法の制限を克服し、また以下の詳細な記載から明らかである付加的な利点を提供する、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を処置するための代替方法を提供する。
免疫系の細胞活性は、細胞表面相互作用の複雑なネットワークおよび関連するシグナル伝達プロセスによって制御される。細胞表面受容体がそのリガンドにより活性化されると、シグナルが該細胞へ伝達され、携わるシグナル変換経路に依存して、該シグナルは抑制的または活性化的となりえる。多くの受容体系に対して、細胞活性は活性化シグナルと抑制性シグナルとの間のバランスによって調節される。これらの幾つかにおいて、細胞表面受容体の関与に関連するそのリガンドによる正のシグナルが、異なる細胞表面受容体の関与によってそのリガンドにより伝達される負のシグナルにより、下方調節または阻害されることが知られている。
本発明は、従来の治療法の制限を克服し、また以下の詳細な記載から明らかである付加的な利点を提供する、自己免疫疾患を処置するための代替方法を提供する。
本発明は、in vivoで哺乳類細胞上のOvr110に結合する、単離されたOvr110抗体に関する。本発明はさらに、in vivoで哺乳類細胞上のOvr110に結合すると内部移行する、単離されたOvr110抗体に関する。抗体は、モノクローナル抗体であってもよい。代替的に、抗体は、抗体断片またはキメラもしくはヒト化抗体である。モノクローナル抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129の下で寄託されたハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマにより産生され得る。
本発明はまた、結合した抗体に関する。これらは、増殖阻害剤または細胞毒性剤に結合することができる。細胞毒性剤は、毒素、抗生物質、放射性同位体並びに核酸分解酵素および毒素からなる群から選択され得る。毒素の例には、メイタンシン(maytansin)、メイタンシノイド類(maytansinoids)、サポリン(saporin)、ゲロニン(gelonin)、リシンまたはカリケアマイシン(calicheamicin)が含まれるが、これらには限定されない。
抗体は、細菌中で産生され得る。代替的に、抗体は、ATCC受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129を有するハイブリドーマの群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗Ovr110抗体のヒト化形態であってもよい。
好ましくは、癌は、卵巣癌、膵臓癌、肺癌および乳癌からなる群から選択される。本発明はまた、抗体を産生する方法であって、適切な細胞を培養することおよび該抗体を該細胞培養物から回収することを含む、前記方法に関する。
本発明はまた、Ovr110発現癌細胞を死滅させる方法であって、該癌細胞を、本発明の抗体と接触させ、これにより該癌細胞を死滅させることを含む、前記方法に関する。癌細胞は、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞および乳癌細胞からなる群から選択することができる。
卵巣癌または乳癌は、卵巣漿液性腺癌または乳房浸潤性乳管癌または転位癌であってもよい。乳癌は、HER−2陰性乳癌であってもよい。本発明はまた、哺乳類におけるOvr110発現癌を寛解する方法であって、抗体の治療的に有効な量を、該哺乳類に投与することを含む、前記方法に関する。
定義および一般的手法
本明細書中で用いるヒト「Ovr110」は、細胞表面上に糖タンパク質として発現された、282個のアミノ酸のタンパク質を意味し、Ovr110のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、WO 00/12758、癌特異的遺伝子(CSG)Ovr110;WO 99/63088、膜結合タンパク質PRO1291;WO00/36107、ヒト卵巣癌抗原;WO 02/02624-A2、ヒトB7様タンパク質(B7−L);WO 2004/101756、OVR110;などに開示されており、これらの開示はここに参照として明示的に組み込まれる。アミノ酸30〜282は、細胞表面上に存在すると推定されている。本明細書中で用いるOvr110には、Ovr110生物学的活性を有するタンパク質の対立遺伝子多型および同類置換変異体も含まれる。
B7H4は、共刺激性タンパク質のB7ファミリー(CD80; NIM 112203を参照)に属する。これらのタンパク質は、抗原提示細胞の表面上に発現され、Tリンパ球上のリガンド(例えば、CD28; NIM 186760)と相互作用する。[OMIMにより供給]。
本明細書において用語「抗体」(Ab)とは、それが所望の生物学的活性を示す限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体(例えば2重特異性抗体)、および抗体断片を含む。用語「免疫グロブリン」(Ig)は、本明細書中では、「抗体」と同義的に用いる。
特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の間で界面を形成すると考えられている。VHおよびVLの一緒の対形成により、単一の抗原結合部位を形成する。抗体の異なるクラスの構造および特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition、Daniel P. Stites, Abba I. Teff and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, 71頁および6章を参照。
「Fv」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この断片は、厳密な、非共有的な会合における、1つの重鎖および1つの軽鎖の可変領域ドメインの二量体からなる。これらの2つの領域の折り畳みから、6つの超可変ループ(HおよびL鎖からそれぞれ3つのループ)が放射し、これは、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変領域(または抗原に特異的な3つのみのCDRを含むFvの半分)さえも、抗原を認識し、これを結合する能力を有するが、ただし、完全な結合部位よりも低い親和性においてである。
用語「アミノ酸配列変異体」は、ある程度に天然配列のポリペプチドと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。通常、Ovr110のアミノ酸配列変異体は、天然配列のOvr110と少なくとも約70%の相同性、好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約85%、さらにより好ましくは少なくとも約90%の相同性、および最も好ましくは少なくとも約95%の相同性を有する。アミノ酸配列変異体は、天然のアミノ酸配列のアミノ酸配列内のある位置において、置換、欠失および/または挿入を有し得る。
「相同性」は、最大のパーセンテージの相同性を達成するために、配列を整列させ、所要に応じて間隙を導入した後に同一である、アミノ酸配列変異体中の残基のパーセンテージとして定義される。整列のための方法およびコンピュータープログラムは、当該分野において十分知られている。配列の類似性を、任意の一般的な配列分析アルゴリズム、例えばGAPまたはBESTFITまたは他の変法のSmith-Waterman整列により測定することができる。T. F. Smith and M. S. Waterman, J. Mol. Biol. 147:195-197 (1981)およびW.R. Pearson, Genomics 11:635-650 (1991)を参照。
「補体依存性細胞毒性」または「CDC」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。古典的な補体経路の活性化は、補体系(C1q)の第1の成分の、これらの同族の抗原に結合する抗体(適切なサブクラスの)への結合により開始される。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているCDCアッセイを行うことができる。
用語「治療的に有効な量」は、対象または哺乳類における疾患または障害を「処置する」のに有効な、抗体または薬剤の量を意味する。癌の場合において、薬剤の治療的に有効な量により、癌細胞の数が減少し;腫瘍のサイズが減少し;末梢器官中への癌細胞の浸潤が阻害され(即ち、ある程度まで遅延および好ましくは停止され);腫瘍転移が阻害され(即ち、ある程度まで遅延および好ましくは停止され);腫瘍増殖がある程度まで阻害され;かつ/または癌に関連する症状の1つまたは2つ以上が、ある程度まで寛解され得る。「処置する」の前記定義を参照。薬剤が、存在する癌細胞の増殖を防止し、かつ/またはこれを死滅させることができる程度に、これは、細胞増殖抑制性および/または細胞毒性であり得る。
「間欠性」投与は、中断なく連続的にはなされず、むしろ周期的な性質の処置である。
1種または2種以上の他の治療剤と「組み合わせて」の投与は、任意の順序での、同時の(併用)および連続的な投与を含む。
本明細書中で用いる「担体」には、用いられる投与量および濃度において曝露される細胞または哺乳類に無毒である、薬学的に許容し得る担体、添加剤または安定剤が含まれる。
用語「添付文書」は、慣例的に治療製品の市販の包装中に含まれ、このような治療製品の使用に関する適応、使用、投与量、投与、禁忌および/または注意についての情報を含む使用説明書を意味するために用いる。
「単離された核酸分子」は、核酸分子、例えばRNA、DNA、または混合ポリマーであって、これらは実質的に他のゲノムDNA配列およびタンパク質または複合体、例えばリボゾームおよびポリメラーゼから分離され、必然的にに天然配列を伴う。この用語は、この天然に存在する環境から取り除かれた核酸分子を包含し、組換えまたはクローン化DNA単離物および、化学的に合成された類似体または異種性の系により生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な核酸分子は、核酸分子の単離された形態を含む。
本発明の抗Ovr110抗体を産生する細胞には、親ハイブリドーマ細胞、例えばATCCに寄託されたハイブリドーマ、並びに抗体をコードする核酸が導入された、細菌および真核生物宿主細胞が含まれる。好適な宿主細胞を、以下に開示する。
本発明は、抗Ovr110抗体を提供する。好ましくは、抗Ovr110抗体は、哺乳類細胞上の細胞表面Ovr110に結合すると内部移行する。抗Ovr110抗体はまた、Ovr110を有する腫瘍細胞を破壊するか、またはこの破壊をもたらすことができる。
本発明の抗Ovr110抗体は、哺乳類におけるOvr110発現癌を処置するかまたは癌の1つもしくは2つ以上の症状を寛解するのに、有用である。このような癌は、卵巣、膵臓、肺もしくは乳癌、尿路の癌、肺癌、乳癌、結腸癌、膵臓癌、および卵巣癌、より具体的には前立腺腺癌、腎臓細胞癌腫、直腸結腸腺癌、肺腺癌、肺扁平細胞癌腫および胸膜中皮腫を含む。癌は、上記の任意の転移性癌、例えば卵巣癌転移、膵臓癌転移、肺癌転移および乳癌転移を包含する。この抗体は、哺乳類におけるOvr110を発現する癌細胞の少なくとも一部に結合することができ、好ましくはHAMA応答を誘発しないかまたはこれを最小化するものである。好ましくは、抗体は、in vivoまたはin vitroで、細胞上のOvr110に結合すると、Ovr110発現癌細胞を破壊または死滅させるか、またはかかる腫瘍細胞の増殖を阻害するのに、有効なものである。かかる抗体は、裸の抗Ovr110抗体(いかなる剤にも結合していないもの)を含む。in vivoでの腫瘍増殖阻害特性を有する裸の抗Ovr110抗体には、以下の実験例に記載する抗体が含まれる。細胞毒性または細胞増殖阻害特性を有する裸の抗体を、さらに細胞毒性剤と結合させて、これらを腫瘍細胞破壊において尚一層有効にすることができる。例えばこの抗体を細胞毒性剤と結合させて、以下に記載するように免疫結合体を形成することにより、抗Ovr110抗体に細胞毒性特性を付与することができる。細胞毒性剤または増殖阻害剤は、好ましくは小分子である。毒素、例えばメイタンシン(maytansin)、メイタンシノイド(maytansinoid)、サポリン、ゲロニン、リシンまたはカリケアマイシンおよびこれらの類似体または誘導体が、好ましい。
以下に、本発明において有用な抗体の産生のための例示的な手法を記載する。これらの手法のいくつかを、さらに例1に記載する。抗体の産生のために用いるべきOvr110抗原は、例えば、膜貫通配列を欠いているOvr110の可溶性形態またはタンパク質の選択された部分に対する合成ペプチドを含む、全長ポリペプチドまたはこの一部であってもよい。
種々のタグおよび融合配列に結合する抗体または結合タンパク質は、以下に詳しく述べるように入手可能である。抗体を生成するのに有用なOvr110の他の形態は、当業者に明らかである。
種々のタグポリペプチドおよびこれらのそれぞれの抗体が、当該分野においてよく知られている。例には、ポリヒスチジン(ポリ−his)またはポリヒスチジングリシン(ポリ−his−gly)タグ;インフルエンザHAタグポリペプチドおよびこの抗体12CA5(Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988));c−mycタグ並びにこれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7および9E10抗体(Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985));並びに単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグおよびこの抗体(Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990))が含まれる。FLAGペプチド(Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988))は、抗FLAG M2モノクローナル抗体により認識される(Eastman Kodak Co., New Haven, CT)。FLAGペプチドを含むタンパク質の精製は、免疫親和性クロマトグラフィーにより、アガロースに共有結合した抗FLAG M2モノクローナル抗体を含むアフィニティーマトリックスを用いて行うことができる(Eastman Kodak Co., New Haven, CT)。他のタグポリペプチドには、KT3エピトープペプチド[Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)];α−チューブリンエピトープペプチド(Skinner et al., J. Biol. Chenz., 266:15163-15166 (1991));およびT7遺伝子タンパク質ペプチドタグ(Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))が含まれる。
ポリクローナル抗体は、好ましくは、動物、好ましくは非ヒト動物において、関連する抗原およびアジュバントの複数の皮下(sc)または腹腔内(ip)注射により生じる。関連する抗原を、免疫化すべき種において免疫原性であるタンパク質に結合させることが(特に合成ペプチドを用いる場合)、有用であり得る。例えば、抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清、ウシチログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、二官能化または誘導化剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による結合)、N−ヒドロキシスクシンイミド(リシン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、SOCl2またはR1N=C=NR(式中、RおよびR1は異なるアルキル基である)を用いて結合させることができる。結合体はまた、タンパク質融合として組換え細胞培養物中に作製することができる。
モノクローナル抗体は、最初にKohler et al., Nature, 256:495 (1975)により記載されたハイブリドーマ方法を用いて作製するか、または組換えDNA方法(米国特許第4,816,567号)により、作製することができる。ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切なホスト動物、例えばハムスターを、上記のように免疫化して、免疫化のために用いられるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生することができるリンパ球を顕在化させる。代替的に、リンパ球を、in vitroで免疫化することができる。免疫化の後、リンパ球を単離し、次に「融合パートナー」、例えば骨髄腫細胞系と、好適な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies. Principles and Practice, pp 103 (Academic Press, 1986))。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、培養培地、腹水流体または血清から、慣用の抗体精製手順、例えばアフィニティークロマトグラフィー(例えばプロテインAまたはプロテインG−セファロースを用いて)またはイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などにより好適に分離する。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において記載されている。好ましくは、ヒト化抗体は、この中に非ヒトである供給源から導入された1つまたは2つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「移入」残基と呼ばれ、これは、典型的には、「移入」可変領域から採取される。ヒト化は、本質的に、Winterおよび共同研究者らの方法に従って(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列で置換することにより行うことができる。従って、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり(米国特許第4,816,567号)、ここで、無傷のヒト可変領域より顕著に小さいものが、非ヒト種からの対応する配列により置換されている。実際にヒト化抗体は、典型的には、いくつかの超可変領域残基および場合によってはいくつかのFR残基が、げっ歯類抗体における同様の部位からの残基により置換されている、ヒト抗体である。
ヒト化抗Ovr110抗体の種々の形態が意図される。例えば、ヒト化抗体は、随意に1種または2種以上の細胞毒性剤と結合して免疫結合体を生じる抗体断片、例えばFabであってもよい。代替的に、ヒト化抗体は、無傷の抗体、例えば無傷のIgG1抗体であってもよい。
ヒト化の代替として、ヒト抗体を生成することができる。例えば現在では、免疫化にされると、内因性免疫グロブリン産生の不存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができる遺伝子組換え動物(例えばマウス)を作製することが可能である。例えば、キメラの生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖接合領域(JH)遺伝子のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記述された。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを、かかる生殖系列突然変異マウスに移した結果、抗原チャレンジによりヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993);Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993);米国特許第5,545,806号、5,569,825号、5,591,669号(すべてGenPharm);5,545,807号を参照;および、代替的に、ファージ提示手法(McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990))を用いて、ヒト抗体および抗体断片を、in vitroで、免疫化していない供与者からの免疫グロブリン可変(V)領域遺伝子レパートリーから産生することができる。この手法によれば、抗体V領域遺伝子を、インフレームで、糸状バクテリオファージ、例えばMl3またはfdの主要な、または主要でない被覆タンパク質遺伝子のいずれかの中にクローニングし、ファージ粒子の表面上の機能的抗体断片として提示する。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含むため、抗体の機能的な特性に基づく選択によっても、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がもたらされる。従って、このファージは、B細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージ提示法を、種々の様式で行うことができ、これは例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)中に概説されている。V遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージ提示法のために用いることができる。Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)は、抗オキサゾロン抗体の種々のアレイを、免疫化したマウスの脾臓に由来するV遺伝子の小さい無秩序な組み合わせライブラリから単離した。免疫化していないヒト供与者からのV遺伝子のレパートリーを構成することができ、抗原(自己抗原を含む)の種々のアレイに対する抗体を、本質的にMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)またはGriffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)により記載された手法に従って単離することができる。また米国特許第5,565,332号および5,573,905号も参照。上記したように、ヒト抗体もまた、in vitro活性化B細胞により生成することができる(米国特許第5,567,610号および5,229,275号を参照)。
ある状況においては、完全抗体よりむしろ抗体断片を用いる方に利点がある。断片のより小さいサイズにより、迅速なクリアランスが可能になり、固体腫瘍へのアクセスの改善がもたらされ得る。種々の手法が、抗体断片の産生のために開発された。伝統的に、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク質分解消化に由来した(例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992);およびBrennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照)。しかしこれらの断片は、現在では、組換え宿主細胞により直接産生することができる。Fab、FvおよびScFv抗体断片はすべて、大腸菌において発現され、これから分泌されることができ、従って大量のこれら断片の容易な産生が可能になる。抗体断片を、上記した抗体ファージライブラリから単離することができる。代替的に、Fab’−SH断片を、大腸菌から直接回収し、化学的に結合させて、F(ab)2断片を形成することができる(Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992))。他の方法において、F(ab)2断片を、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、増大したin vivoでの半減期を有するFabおよびF(ab)2断片は、米国特許第5,869,046号に記載されている。抗体断片の産生のための他の手法は、技術のある実行者に明らかである。選択された抗体はまた、一本鎖Fv断片(scFv)であってもよい。WO 93/16185;米国特許第5,571,894号および米国特許第5,587,458号を参照。FvおよびsFvは、定常領域を欠いている無傷の組み合わせ部位を有する唯一の種である;従って、これらは、in vivoで用いる間に低下した非特異的結合に適する。sFv融合タンパク質を構成して、sFvのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかにおいてエフェクタータンパク質の融合を得ることができる。Antibody Engineering, ed. Borrebaeck、上記を参照。抗体断片はまた、例えば米国特許第5,641,870号に記載されているように、「直線状抗体」であってもよい。かかる直線状抗体断片は、単一特異的または二重特異的であってもよい。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、Ovr110タンパク質の2つの異なるエピトープに結合することができる。他のかかる抗体は、Ovr110結合部位を、他のタンパク質についての結合部位と組み合わせることができる。代替的に、抗Ovr110アームを、白血球上のトリガー分子、例えばT細胞受容体分子(例えばC133)またはIgGについてのFc受容体(FcγR)、例えばFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)上のトリガー分子に結合するアームと組み合わせて、細胞防御機構をOvr110発現細胞に集中させ、局在化させることができる。二重特異性抗体はまた、細胞毒性剤をOvr110を発現する細胞に局在化させるために用いることもできる。これらの抗体は、Ovr110結合アームおよび細胞毒性剤(例えばサポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンA鎖、メトトレキセートまたは放射性同位体ハプテン)を結合するアームを有する。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片(例えばF(ab)2二重特異性抗体)として調製することができる。WO 96/16673には、二重特異性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体が記載されており、米国特許第5,837,234号には、二重特異性抗ErbB2/抗FcγRI抗体が開示されている。二重特異性抗ErbB2/Fcα抗体は、WO98/02463中に示されている。米国特許第5,821,337号には、二重特異性抗ErbB2/抗CD3抗体が教示されている。
2よりも大きい価数を有する抗体が、意図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)。
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、2価の抗体よりも迅速に内部移行する(および/または異化する)ことができる。本発明の抗体は、3つまたは4つ以上の抗原結合部位を有する(IgMクラス以外である)多価の抗体(例えば4価の抗体)であってもよく、これは、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により、容易に産生され得る。多価の抗体は、二量体化領域および3つまたは4つ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化領域は、Fc領域またはヒンジ領域を含む(またはこれからなる)。この筋書きにおいて、抗体は、Fc領域および、Fc領域に対する3つまたは4つ以上の抗原結合部位アミノ末端を含む。本明細書中で好ましい多価抗体は、3個〜約8個、しかし好ましくは4個の、抗原結合部位を含む(またはこれからなる)。多価抗体は、少なくとも1つのポリペプチド鎖(および好ましくは2つのポリペプチド鎖)を含み、ここで、1つまたは2つ以上のポリペプチド鎖は、2つまたは3つ以上の可変領域を含む。例えば、1つまたは2つ以上のポリペプチド鎖は、VDl(X1n−VD2−(X2)n−Fcを含むことができ、ここで、VD1は、最初の可変領域であり、VD2は、2番目の可変領域であり、Fcは、Fc領域の1つのポリペプチド鎖であり、X1およびX2は、アミノ酸またはポリペプチドを表し、nは、0または1である。例えば、1つまたは2つ以上のポリペプチド鎖は、以下のものを含むことができる:VH−CHI−柔軟リンカー−VH−CHI−Fc領域鎖;またはVH−CHI−VH−CHI−Fc領域鎖。本明細書中の多価抗体は、好ましくは、さらに、少なくとも2つ(および好ましくは4つ)の軽鎖可変領域ポリペプチドを含む。本明細書中の多価抗体は、例えば、約2個〜約8個の軽鎖可変領域ポリペプチドを含むことができる。本明細書中で意図する軽鎖可変領域ポリペプチドは、軽鎖可変領域を含み、随意にさらにCL領域を含む。
本明細書中に記載した抗Ovr110抗体の1または2以上のアミノ酸配列修飾が、意図される。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的特性を改善するのが望ましい場合がある。抗Ovr110抗体のアミノ酸配列変異体を、適切なヌクレオチド変化を抗Ovr110抗体核酸中に導入することにより、またはペプチド合成により調製する。
かかる修飾には、例えば、抗Ovr110抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および/またはこの中への挿入および/またはこの置換が含まれる。最終的な構成物が、所望の特徴を有する場合には、欠失、挿入および置換の任意の組み合わせを行って、最終的な構成物に到達する。アミノ酸変化はまた、抗Ovr110抗体の翻訳後プロセスを変えることができ、例えばグリコシル化部位の数または位置を変化させる。
次に、置換に対する機能的な感受性を示すアミノ酸の位置を、置換の部位において、またはこの部位についてさらなる、または他の変種を導入することにより精巧にする。従って、アミノ酸配列の変更を導入するための部位が予め決定されている一方、突然変異の性質それ自体を予め決定する必要はない。例えば、所定の部位における突然変異の性能を分析するために、ala走査または無秩序な変異原性を、標的コドンまたは領域において行い、発現された抗Ovr110抗体変異体を、所望の活性についてスクリーニングする。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;(2)中性の親水性:cys、ser、thr;(3)酸性:asp、glu;(4)塩基性:asn、gin、his、lys、arg;(5)鎖配向に影響する残基:gly、pro;および(6)芳香族:trp、tyr、phe。
抗体を生成するための手法は、上に記載した。さらに、所望により、ある生物学的特性を有する抗体を選択することができる。
本発明の抗Ovr110抗体の増殖阻害効果を、当該分野において知られている方法により、例えばOvr110を発現する細胞を、内因的に、またはOvr110遺伝子の形質移入に続いて用いて、評価することができる。例えば、以下の例1に提供する腫瘍細胞系およびOvr110形質移入細胞を、本発明の抗Ovr110モノクローナル抗体で、種々の濃度において、数日(例えば2〜7日)にわたり処理し、クリスタルバイオレットもしくはMTTで染色し、またはある他の比色アッセイにより分析することができる。増殖を測定する他の方法は、本発明の抗Ovr110抗体の存在下で、または不在下で処理した細胞による3H−チミジン取り込みを比較することによる。抗体処理の後、細胞を収穫し、DNA中に導入された放射能の量を、シンチレーションカウンターにおいて定量する。適切な陽性対照には、選択された細胞系の、当該細胞系の増殖を阻害することが知られている増殖阻害抗体による処理が含まれる。in vivoでの腫瘍細胞の増殖阻害を、以下の実験例の節において記載するように、種々の方法により決定することができる。好ましくは、腫瘍細胞は、Ovr110を過剰発現するものである。好ましくは、抗Ovr110抗体は、in vitroまたはin vivoでOvr110発現腫瘍細胞の細胞増殖を、約0.5〜30μg/mlの抗体濃度において、未処理の腫瘍細胞と比較して、約25〜100%、さらに好ましくは約30〜100%、およびさらにより好ましくは約50〜100%または70〜100%、阻害する。増殖阻害は、細胞培養物中で、約0.5〜30μg/mlまたは約0.5nM〜200nMの抗体濃度において測定することができ、ここで、増殖阻害を、腫瘍細胞を抗体に曝露した1〜10日後に決定する。抗体は、約1μg/体重1kg〜約100mg/体重1kgにおける抗Ovr110抗体の投与により、抗体の最初の投与から約5日〜3ヶ月以内、好ましくは約5〜30日以内に腫瘍の大きさまたは腫瘍細胞増殖の減少がもたらされた場合に、in vivoで増殖阻害的である。
本発明はまた、抗癌剤、例えば細胞毒性剤または増殖阻害剤に結合した抗体を含む免疫結合体を用いる療法に関する。
このような免疫結合体の生成において有用な化学療法剤は、前に記載した。抗体および1種または2種以上の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド類、トリコテンおよびCC1065の結合体並びに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体もまた、本明細書において意図される。
好ましくは、本発明の抗Ovr110抗体(全長または断片)を、1または2以上のメイタンシノイド分子に結合させる。
メイタンシノイド類は、チューブリン重合を阻害することにより作用する、有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、キャストアフリカ低木Maytenus serrataから最初に単離された(米国特許第3,896,111号)。その後、ある微生物もまた、メイタンシノイド類、例えばメイタンシノールおよびC−3メイタンシノールエステルを産生することが見出された(米国特許第4,151,042号)。合成メイタンシノール並びにこの誘導体および類似体は、例えば、米国特許第4,137,230号;4,248,870号;4,256,746号;4,260,608号;4,265,814号;4,294,757号;4,307,016号;4,308,268号;4,308,269号;4,309,428号;4,313,946号;4,315,929号;4,317,821号;4,322,348号;4,331,598号;4,361,650号;4,364,866号;4,424,219号;4,450,254号;4,362,663号;および4,371,533号に開示されており、これらの開示を本明細書中に参照として明確に導入する。
これらの治療指数を改善する試行において、メイタンシンおよびメイタンシノイドを、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体に結合させた。メイタンシノイドを含む免疫結合体およびこれらの治療的使用は、例えば、米国特許第5,208,020号、5,416,064号および欧州特許EP 0 425 235 B1に開示されており、これらの開示を本明細書中に参照として明確に導入する。Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996)には、ヒト直腸結腸癌に指向されたモノクローナル抗体C242に結合した、DMIと表示されるメイタンシノイドを含む免疫結合体が記載されている。この結合体は、培養した結腸癌細胞に対して高度に細胞毒性であることが見出され、in vivoでの腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。Chari et al. Cancer Research 52:127-131 (1992)には、ヒト結腸癌細胞系における抗原に結合するマウス抗体A7、またはHER−2/neu発癌遺伝子に結合する他のマウスモノクローナル抗体TA.1に、メイタンシノイドがジスルフィドリンカーを介して結合している免疫結合体が記載されている。TA.1−メイタンシノイド結合体の細胞毒性が、細胞あたり3×105のHER−2表面抗原を発現するヒト乳癌細胞系SK−BR−3に対してin vitroで試験された。薬剤結合体は、遊離のメイタンシノイド薬剤と同様の程度の細胞毒性を達成し、これは、抗体分子あたりのメイタンシノイド分子の数を増大させることにより増大し得る。A7−メイタンシノイド結合体は、マウスにおいて低い全身的細胞毒性を示した。
抗Ovr110抗体−メイタンシノイド結合体を、抗Ovr110抗体をメイタンシノイド分子に、抗体またはメイタンシノイド分子のいずれかの生物学的活性を顕著に低下させずに化学的に結合させることにより調製する。抗体分子あたり結合した平均3〜4個のメイタンシノイド分子が、抗体の機能または溶解性に悪影響を与えずに標的細胞の細胞毒性を増強させることにおいて効能を示したが、1個の毒素分子/抗体さえも、裸の抗体の使用にまさって細胞毒性を増強すると予測される。メイタンシノイド類は、当該分野において十分知られており、既知の手法により合成するかまたは自然の供給源から単離され得る。好適なメイタンシノイド類は、例えば、米国特許第5,208,020号並びに上記で言及した他の特許および非特許刊行物中に開示されている。好ましいメイタンシノイド類は、メイタンシノールおよび、芳香環またはメイタンシノール分子の他の位置において修飾されているメイタンシノール類似体、例えば種々のメイタンシノールエステルである。
関連する他の免疫結合体は、1または2以上のカリケアマイシン分子に結合した抗Ovr110抗体を含む。カリケアマイシンファミリーの抗生物質は、ピコモル以下の濃度において二本鎖DNA破壊を発生させることができる。カリケアマイシンファミリーの結合体の調製について、米国特許第5,712,374号、5,714,586号、5,739,116号、5,767,285号、5,770,701号、5,770,710号、5,773,001号、5,877,296号(すべてAmerican Cyanamid Company)を参照。用いることができるカリケアマイシンの構造的類似体には、γ1 I、α2 I、α3 I、N−アセチル−γ1 I、PSAGおよびθ1 I(Hinman et al. Cancer Research 53: 3336 (1993), Lode et al. Cancer Research 5 8: 2925-2928 (1998)およびAmerican Cyanamidの前述の米国特許明細書)が含まれるが、これらには限定されない。抗体を結合させることができる他の抗腫瘍薬剤は、葉酸代謝拮抗薬であるQFAである。カリケアマイシンおよびQFAは共に、作用の細胞内部位を有し、原形質膜を容易に横断しない。従って、抗体媒介内部移行によるこれらの剤の細胞への取り込みにより、これらの細胞毒性効果が大幅に増大する。
本発明の抗Ovr110抗体に結合することができる他の抗腫瘍剤には、BCNU、ストレプトゾイシン(streptozoicin)、ビンクリスチンおよび5−フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号および5,770,710号に記載されている、集合的にLL−E33288複合体と知られている剤のファミリー並びにエスペラマイシン(esperamicin)類(米国特許第5,877,296号)が含まれる。用いることができる酵素的に活性な毒素およびこの断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の1 5非結合活性断片、エクソトキシンA鎖(Pseudomonas aeruginosaから)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデッシンA鎖、アルファ−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、Phytolaca americanaタンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP−S)、momordica charantia阻害剤、カルシン(curcin)、クロチン(crotin)、sapaonaria officinalis阻害剤、ゲロニン(gelonin)、マイトジェリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)およびトリコテセン(tricothecene)類が含まれる。例えば1993年10月28日に刊行されたWO 93/21232を参照。本発明は、さらに、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼまたはDNAエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ;DNase)との間に形成される免疫結合体を意図する。
さらに、腫瘍の前標的化において用いるために、抗体を「受容体」(例えばストレプトアビジン)に結合させることができ、ここで、抗体−受容体結合体を患者に投与し、続いて結合していない結合体を循環から清澄剤を用いて除去し、次に、細胞毒性剤(例えばラジオヌクレオチド)に結合する「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、WO81/01145を参照)を活性抗癌薬剤に変換するプロドラッグ活性化酵素に、抗体を結合させることにより、本発明の抗体をADEPTにおいても用いることができる。例えば、WO 88/07378および米国特許第4,975,278号を参照。
抗体の他の修飾が本明細書で意図される。例えば、抗体は、種々の非タンパク質ポリマーの1種、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーの1種に結合させることができる。抗体はまた、例えばコアセルベーション手法によりまたは界面重合により調製したマイクロカプセル中に(例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ(メチルメタシレート)マイクロカプセル)、コロイド状薬剤送達系(例えばリポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)において、またはマクロエマルジョンにおいて、捕獲することができる。このような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示されている。
本発明はまた、ヒト化抗Ovr110抗体、ベクター、および核酸を含む宿主細胞をコードする、単離された核酸分子、並びに抗体を産生するための組換え手法を提供する。抗体の組換え産生のために、これをコードする核酸分子を単離し、さらなるクローニング(DNAの増幅)のために複製可能なベクター中に挿入するか、または発現のためのプロモーターを有する作動可能な(operable)結合においてベクター中に挿入する。モノクローナル抗体をコードするDNAは、慣用の手順を用いて(例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸分子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には一般に以下の1種または2種以上が含まれるが、これらには限定されない:シグナル配列、複製の起点、1種または2種以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列。
本発明の抗Ovr110抗体は、直接、組換え的に産生するだけでなく、異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換え的に産生することができ、ここで該異種性ポリペプチドは、好ましくは、成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端において特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである。選択された異種性シグナル配列は、好ましくは、宿主細胞により認識され、加工される(即ちシグナルペプチダーゼにより切断される)ものである。天然の抗Ovr110抗体シグナル配列を認識および加工しない原核宿主細胞に対しては、シグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppまたは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核シグナル配列により置換する。酵母分泌のために、天然のシグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、oc因子リーダー(SaccharomycesおよびKluyveromycescc因子リーダーを含む)または酸ホスファターゼリーダー、C albicansグルコアミラーゼリーダー、またはWO 90/13646に記載されているシグナルにより置換することができる。哺乳類細胞発現において、哺乳類シグナル配列およびウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。かかる前駆体領域についてのDNAは、抗Ovr110抗体をコードするDNAにリーディング・フレームにおいて連結する。
発現およびクローニングベクターは、共に、ベクターが、1または2以上の選択された宿主細胞中で複製されるのを可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが、ホスト染色体DNAとは独立して複製されるのを可能にするものであり、複製の起点または自己複製配列を含む。かかる配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについてよく知られている。プラスミドpBR322からの複製の起点はほとんどのグラム陰性細菌に適し、2μプラスミド起点は酵母に適し、種々のウイルス起点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSVまたはBPV)は、哺乳類細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製成分の起点は、哺乳類発現ベクターについては必要ではない(SV40起点は、典型的には、これが早期のプロモーターを含むとの理由のみにより用いることができる)。
発現およびクローニングベクターは、選択可能なマーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことができる。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、(b)栄養要求性欠乏を補完し、または(c)天然培地から入手可能ではない臨界的に重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードし、例えば、これは、桿菌についてのD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。選択スキームの1つの例では、宿主細胞の増殖を停止する薬剤を用いる。異種性遺伝子で成功に形質転換されたこれらの細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を産生し、従って選択計画を生き延びる。このような優性の選択の例では、薬剤であるネオマイシン、マイコフェノール酸およびヒグロマイシンを用いる。
さらに、1.6pm環状プラスミドpKDIに由来するベクターを、Kluyveromyces酵母の形質転換のために用いることができる。代替的に、組換え子ウシキモシンの大規模な産生のための発現系が、K. lactisについて報告された。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。Kluyveromycesの工業的な菌株による、成熟組換えヒト血清アルブミンの分泌のための安定な多コピー発現ベクターも開示されている。Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)。
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識されるプロモーターを含み、抗Ovr110抗体核酸に作動的に結合している。原核宿主と共に用いるのに適するプロモーターには、phoAプロモーター、P−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン(trp)プロモーター系およびハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーターが含まれる。しかし、他の既知の細菌性プロモーターが好適である。細菌系において用いるためのプロモーターはまた、抗Ovr110抗体をコードするDNAに作動的に結合したShine-Dalgarno(S.D.)配列を含む。
SV40ウイルスの初期の、および後期のプロモーターは、SV40ウイルスの複製起点も含むSV40制限断片として好都合に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの即座の早期のプロモーターは、HindIll E制限断片として好都合に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを用いる哺乳類宿主においてDNAを発現するための系は、米国特許第4,419,446号に開示されている。この系の変更は、米国特許第4,601,978号に記載されている。また単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御の下での、マウス細胞におけるヒトP−インターフェロンcDNAの発現について、Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982)を参照。代替的に、ラウス肉腫ウイルスの長い末端繰り返しを、プロモーターとして用いることができる。
本発明の抗Ovr110抗体をコードするDNAの,高等真核生物による転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することにより多くの場合増強される。多数のエンハンサー配列が、現在、哺乳類遺伝子(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン)から知られている。しかし、典型的には、真核細胞ウイルスからのエンハンサーを用いる。例には、複製起点の後期の側上のSV40エンハンサー(bp100〜270)、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期の側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核プロモーターの活性化のためのエンハンシング要素については、Yaniv, Nature 297:17-18 (1982)も参照。エンハンサーは、ベクター中に、抗Ovr110抗体コード配列に5’または3’の位置においてスプライシングすることができるが、好ましくは、プロモーターから5’部位に位置させる。
真核宿主細胞(酵母、真菌類、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの有核細胞)において用いられる発現ベクターはまた、転写を終結させるのに、およびmRNAを安定化させるのに必要な配列を含む。かかる配列は、真核またはウイルスDNAまたはcDNAの5’、および場合によっては3’未翻訳領域から一般的に入手できる。これらの領域は、抗Ovr110抗体をコードするmRNAの未翻訳部分中のポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。1つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO 94/11026およびこの中に開示されている発現ベクターを参照。
本明細書において、ベクター中でDNAをクローニングするかまたは発現するのに適する宿主細胞は、上記した原核、酵母または高等真核細胞である。この目的に適する原核生物には、真性細菌、例えばグラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、例えばEscherichiaなどの腸内細菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、Erwinia、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属、例えばSalmonella typhimurium、セラチア属、例えばSerratia marcescans、および赤痢菌属、並びに桿菌、例えばB. subtilisおよびB. licheniformis(例えばDD 266,710、1989年4月12日刊行中に開示されているB. licheniformis 41P)、シュードモナス属、例えばP. aeruginosa、並びにストレプトマイセス属が含まれる。1つの好ましい大腸菌クローニング宿主は、大腸菌294(ATCC 31,446)であるが、他の菌株、例えば大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC 31,537)および大腸菌W31 10(ATCC 27,325)が好適である。これらの例は、限定的であるよりむしろ例示的である。
宿主細胞を、上記の発現ベクターまたはクローニングベクターを用いて抗Ovr110抗体産生のために形質転換し、プロモーターを誘発するか、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように改変した、慣用の栄養素培地中で培養する。
本発明の抗Ovr110抗体を産生するために用いられる宿主細胞は、種々の培地中で培養することができる。商業的に入手できる培地、例えばハムのFIO(Sigma)、基礎培地(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)およびダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Sigma)は、宿主細胞を培養するのに適する。さらに、Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)、Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980)、米国特許第4,767,704号;4,657,866号;4,927,762号;4,560,655号;もしくは5,122,469号;WO 90/03430;WO 87/00195;または米国特許Re. 30,985号に記載されている培地のいずれかを、宿主細胞のための培養培地として用いることができる。これらの培地のすべてに、必要に応じて、ホルモンおよび/または他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリンもしくは上皮細胞成長因子)、塩類(例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩)、緩衝液(例えばHEPES)、ヌクレオチド類(例えばアデノシンおよびチミジン)、抗生物質(例えばGENTAMYCIN(登録商標)薬剤)、微量元素(通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される)、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を補足することができる。すべての他の必要な補足物もまた、当業者に知られている適切な濃度で含有することができる。培養条件、例えば温度、pHなどは、発現のために選択された宿主細胞について前に用いられているものであり、通常の当業者には明らかである。
組換え手法を用いる場合、抗体は、細胞内で、細胞膜周辺腔で産生するか、または培地に直接分泌することができる。抗体が細胞内で産生される場合は、第1のステップとして粒子状残骸、宿主細胞または溶解した断片のいずれかを、例えば遠心分離または限外濾過により除去する。Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)には、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。簡単に述べると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム(pH3.5)、EDTAおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)の存在下で、約30分にわたり融解させる。細胞残骸は遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合は、このような発現系からの上清は一般に、先ず、商業的に入手できるタンパク質濃縮フィルター、例えばAmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて濃縮する。例えばPMSFなどのプロテアーゼ阻害剤は、前述のステージのいずれかにおいて導入して、タンパク質分解を阻害することができ、抗生物質を導入して、外来性の汚染物の増殖を防止することができる。
本発明に従って用いる抗体の医薬製剤を、保管のために所望の程度の純度を有する抗体を随意の薬学的に許容し得る担体、賦形剤または安定剤と混合し(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))、凍結乾燥した製剤または水性溶液の形態において調製する。許容し得る担体、賦形剤または安定剤は、用いられる用量および濃度において受容者に対して無毒性であり、そして以下を含む:緩衝液、例えば酢酸塩、トリス、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸類;アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤;保存剤(例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール;アルキルパラベン類、例えばメチルもしくはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノールおよびm−クレゾール);低分子量(約10個の残基よりも小さい)ポリペプチド類;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン類;親水性ポリマー類、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸類、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン;グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物;キレート剤、例えばEDTA;トニシファイヤー(tonicifier)、例えばトレハロースおよび塩化ナトリウム;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール;界面活性剤、例えばポリソルベート;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属複合体類(例えばZn−タンパク質複合体類);および/または非イオン系界面活性剤、例えばTWEEN(登録商標)、PLURONICS(登録商標)もしくはポリエチレングリコール(PEG)。抗体は、好ましくは、5〜200mg/ml、好ましくは10〜100mg/mlの濃度での抗体を含む。
in vivoでの投与のために用いるべき製剤は、無菌でなければならない。これは、無菌濾過膜を通しての濾過により容易に達成される。
本発明によれば、細胞表面上のOvr110に結合すると内部移行する抗Ovr110抗体を用いて、Ovr110発現癌細胞を特徴とする癌、特に卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌、例えば卵巣漿液性腺癌または乳房浸潤性乳管癌、および関連する転移を有する、これを必要としている対象を処置する。
前記の癌は一般にOvr110発現細胞を含み、従って抗Ovr110抗体はこれに結合することができる。前記の癌はOvr110分子の過剰発現により特徴付けることができるが、本出願はさらに、Ovr110過剰発現癌であるとは考えられない癌を処置するための方法も提供する。
スコア0 染色は観察されないか、または腫瘍細胞の10%未満において膜染色が観察される。
スコア1+ わずかな/辛うじて知覚可能な膜染色が、腫瘍細胞の10%を超える比率において検出される。細胞は、それらの膜の一部において染色されているに過ぎない。
スコア2+ 弱い、ないし中程度の完全な膜染色が、腫瘍細胞の10%を超える比率において観察される。
Ovr110発現についての0または1+のスコアを有する腫瘍を、Ovr110を過剰発現しないとして特徴付けることができ、一方2+または3+のスコアを有する腫瘍を、Ovr110を過剰発現するとして特徴付けることができる。
代替的に、または付加的に、FISHアッセイ、例えばINFORM(登録商標)(Ventana, Arizonaにより販売されている)またはPATHVISION(登録商標)(VySiS, Illinois)を、ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織において行って、腫瘍におけるOvr110過剰発現の程度(存在する場合には)を決定することができる。Ovr110過剰発現または増幅を、in vivo診断アッセイを用いて評価することができ、例えばOvr110を結合する、検出可能な標識(例えば放射性同位体または蛍光標識)で標識した分子(例えば本発明の抗体)を投与し、患者を該標識の局在について外部から走査することにより、評価することができる。
組み合わされた投与には、個別の製剤または単一の医薬製剤を用いた同時投与、およびいずれかの順序での連続的投与が含まれ、ここで、両方(またはすべて)の活性剤が、その生物学的活性を同時に奏する期間があるのが好ましい。好ましくは、かかる組み合わされた療法の結果、相乗的な治療効果がもたらされる。
時々、心臓保護剤(療法に付随する心筋機能障害を予防するかまたは低減させるために)または1種もしくは2種以上のサイトカインを患者に同時投与することも、有益であり得る。前述の療法計画に加えて、患者に対して、癌細胞の手術的除去および/または放射線療法を、抗体療法の前、これと同時に、またはこの後に施すことができる。前述の同時投与される任意の剤に適する投与量は、ここで用いられたものであり、剤および抗Ovr110抗体の組み合わされた作用(相乗作用)のために低減することもできる。
本発明はまた、Ovr110過剰発現細胞の検出および/またはOvr110発現癌、特に卵巣癌、膵臓癌、肺癌および乳癌の処置に有用な物質を含む、製造品に関する。製造品は、容器およびこの中に含まれた組成物を含み、該組成物は本発明の抗体を含む。該組成物はさらに、担体を含むことができる。製造品はまた、容器上またはこれに付随するラベルまたは添付文書を含むことができる。好適な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、種々の材料、例えばガラスまたはプラスチックから形成することができる。容器は、Ovr110発現細胞を検出し、および/または癌状態を処置するのに有効な組成物を保持し、また無菌のアクセス口を有することができる(例えば、この容器は、静脈内溶液袋または皮下組織注射針により貫通可能な栓を有するバイアルであってもよい)。組成物中の少なくとも1種の活性な剤は、本発明の抗Ovr110抗体である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、Ovr110発現細胞を検出し、および/または卵巣癌、膵臓癌、肺癌および乳癌、またはさらに具体的に卵巣漿液性腺癌、乳房浸潤性乳管癌を、これを必要としている患者において処置するのに用いられることを示す。ラベルまたは添付文書は、さらに、抗体組成物を癌患者に投与するための指示を含むことができる。さらに、製造品は、本発明の抗体を検出する物質、例えば本発明の抗体に結合する第2の抗体を含む第2の容器をさらに含むことができる。この物質は、検出可能な標識、例えば本明細書中に開示したもので標識することができる。第2の容器は、例えば、薬学的に許容し得る緩衝液、例えば注射用の静菌性水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含むことができる。製造品はさらに、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を含むことができ、これらには他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針およびシリンジが含まれる。
例1:モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの産生および単離
本発明の次のMAb/ハイブリドーマについて、以下に記載する:
Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1(前にOvr110 A22.1として同定されたもの), Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89, Ovr110.A 99.1, Ovr110.A102.1, Ovr110.A107, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.1., Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1, Ovr110.C17.1, Ovr110.D9.1, Ovr110.I1, Ovr110.I2, Ovr110.I3, Ovr110.I4, Ovr110.I6, Ovr110.I7, Ovr110.I8, Ovr110.I9, Ovr110.I10, Ovr110.I11, Ovr110.I13, Ovr110.I14, Ovr110.15, Ovr110.I16, Ovr110.I17, Ovr110.I18, Ovr110.I20, Ovr110.I21, Ovr110.I22, Ovr110.J1, Ovr110.J2およびOvr110.J3。
MAbがクローニングされている場合、これは、「X.1」の命名を得る。例えば、A7の最初のクローンをA7.1と呼び、A7の第2のクローンをA7.2と呼ぶなどである。本発明のために、A7についての言及は、すべてのクローン、例えばA7.1、A7.2などを含む。
以下に記載するOvr110構成物(construct)のために、Ovr110の領域をコードする核酸分子を種々の発現ベクターに挿入して、組換えタンパク質を産生した。これらの核酸配列は、その設計が当業者にはルーチンであるプライマーを用いて単離した。幾つかの場合においては、用いたプライマーは各構成物の以下の説明に含められている。
説明のために、各構成物によりコードされる予想されるアミノ酸配列も含める。しかし、構成物は、プライマーにより単離されたOvr110領域内に天然に存在する変異体(例えば対立遺伝子変異体、SNP)も含むことができる。これらの変異体配列、およびこれに結合する抗体は、本明細書に記載したように、本発明の一部であると考えられる。
Met1〜Lys282の未成熟Ovr110タンパク質配列全体(配列番号:1)をコードする完全長DNAを、ヒト・スタニオカルシン(STC)からの17アミノ酸分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列および6Hisタグをコードする配列を含む修飾ベクター中に挿入して、Ovr110タンパク質のN末端に融合する分泌シグナルとC末端に融合する6Hisタグとを有する組換えOvr110融合タンパク質をコードするベクターを生成した。得られたベクターは、標準手法を用いて組換えタンパク質を産生するために用いた。簡単に述べると、得られたベクターにより形質転換された細胞を、組換えOvr110タンパク質の産生に適した条件下で培養した。形質転換した細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で洗浄し、0.8M塩化ナトリウム、0.3%両性洗浄剤(Zwittergent)3〜14および0.1%オクチルホスホグルコシドを含む5容量(5ml/細胞1g)の50mMリン酸ナトリウム、pH8.0に、超音波処理により溶解させた。不溶解性の物質は沈殿物として分離し、抽出を2回繰り返した。分離した沈殿物は、6M塩酸グアニジオン(3ml/細胞1g)を含む50mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.8に溶解し、Akta−100システム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)上の同じ緩衝液で平衡化した10−ml−Ni−NTA(Qiagen, Alameda, CA)カラムを通して、約40カラム容量(CV)について5ml/分の流量で循環させた。カラムは次に、上記リン酸−グアニジン緩衝液中で、2CVの同じリン酸−グアニジン緩衝液、2CVの20mMイミダゾール、2CVの50mMイミダゾール、および4CVの100mMイミダゾールを用いて洗浄した。
マウスの免疫化のために、分子の予想された細胞外部のみを構成するOvr110の組換えタンパク質断片を作製して、細胞の外部表面に結合するモノクローナル抗体(MAb)を選択した。シグナルペプチドを含む、未成熟なタンパク質のGly30(下の配列において下線で示す)からLys282(開始コドン位置におけるMetを加える)までのOvr110配列をコードするDNA断片を、修飾ベクターに挿入し、ここで該修飾ベクターは、ヒト・スタニオカルシン(STC)からの17アミノ酸分泌シグナル配列をコードするヌクレオチド配列および6Hisタグをコードするヌクレオチド配列を含み、Ovr110タンパク質のN末端に融合するヒト・スタニオカルシン(STC)からの17アミノ酸分泌シグナルとC末端に融合する6Hisタグとを有する組換えOvr110融合タンパク質をコードするベクターである(Ovr110B)。
組換えHi5細胞からの培養培地を、感染の48時間後に収穫した。培地は10倍に濃縮し、pH7.9のPBS30容量でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションした物質を次に10mlのNi−NTA急速ゲル(Qiagen)で4℃で一晩、プロテアーゼ阻害剤カクテルの存在下でインキュベートした。ゲルをSKカラムに注ぎ、0.5M塩化ナトリウムを含む2CVの50mMリン酸ナトリウム、pH7.8で洗浄した。Ovr110Bを、同じリン酸−塩化ナトリウム緩衝液中の段階的に増加させたイミダゾール(20mMを4CV、50mMを4CV、100mMを4CV、500mMを4CVおよび1000mMを2CV)で溶離した。採集した断片からの試料にSDS−PAGEおよびウェスタンブロット分析を行って、Ovr110Bの純度を評価した。精製した断片は、プールして濃縮した。最終生成物はPBS中で透析した。
Gly30からLys282までのOvr110をコードする核酸分子を、完全長Ovr110のcDNA(pDONR201_Ovr110)を含むシャトルベクターから、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR断片を産生することにより、生成した:
培養培地は、形質移入の48時間後に収穫した。培地は10倍に濃縮し、100mMのリン酸ナトリウム、400mMのNaCl、10%グリセロール、pH8.0でダイアフィルトレーションした。Ovr110を含有する濃縮した培地は、100mMのリン酸ナトリウム、400mMのNaCl、10%グリセロール、pH8.0で予め平衡化した5mLニッケル金属キレートカラム(Ni−NTA急速、Qiagen Inc.)上を通した。次にカラムを6カラム容量(CV)の100mMリン酸ナトリウム、400mMのNaCl、2mMのイミダゾール、10%グリセロール、pH8.0で洗浄した。Ovr110を、カラムから、それぞれ5mMイミダゾールおよび500mMイミダゾールを含む22CVの100mMリン酸ナトリウム、400mMNaCl、10%グリセロール、pH8.0を用いて溶離した。Ovr110を含む断片をプールし、100mMリン酸ナトリウム、400mMのNaCl、5%グリセロール、pH7.5で透析した。
Met1からSer289の完全長ヒトBTLA(hBTLA)をコードする核酸分子を、下垂体およびリンパ節cDNAライブラリから以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、PCRによりクローニングした:
ATN551: (上記配列参照)配列番号6および
ATN554: 5'-CG GCT AGC GGG TCT GCT TGC CAC TTC GTC (配列番号8)。
膜透過領域を欠いた、Met1〜Ser241のhBTLAの完全長分泌形態をコードする核酸分子を、リンパ節cDNAライブラリからオリゴヌクレオチドプライマーATN551およびATN552を用いて、PCRによりクローニングした。PCR断片はPmeIおよびNheIで消化し、同一の酵素で切断されたpCMV5HIS2またはpCMV5Fc1のどちらかに結紮して、それぞれC末端伸長AS−HHHHHHHHHHまたはAS−マウスFc領域(mFc)を有するタンパク質構成物を生成した。DNA配列分析を、PE Applied Biosystems(Foster City, CA)からのABI Prism BigDye終了サイクルシーケンシング簡易反応キットを用いて行った。
組換えOvr107タンパク質を用いて、多反応性ハイブリドーマクローンをスクリーニングして選択した。Ovr107は複数の癌において広く上方制御され、本明細書で用いる組換えOvr107は、潜在的に交差反応性のヘキサヒスチジンタグを含む。従って、組換えOvr107は多反応性抗体の同定に有用である。
Met1からIle596までのOvr107配列(WO01/37864ヒトOvr107卵巣癌マーカー)をコードする完全長cDNAをPCRによりクローニングし、ベクターに挿入した。次にOvr107コーディング領域を、組換えにより、6Hisタグをコードするヌクレオチド配列を含むベクターに移送して、C末端に融合した6Hisタグを有するOvr107融合タンパク質を生成した。
C末端HAタグ化Ovr110をコードする哺乳類ベクターを、マウスLMTK細胞に形質移入した。安定な形質移入体を、10ug/mlのブラストシジン(blastocidin)を用いてダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)/10%FBS中で7〜10日間選択し、続いて蛍光に基づく単一細胞分類(Coulter Elite, Beckmann Coulter, Sunnyvale, CA)を、96ウェルプレート中で1細胞/ウェルで行った。形質移入したLMTK細胞は、96ウェルプレート中で増殖させ(VWR, Brisbane, CA)、24ウェルプレートに拡大し、次に6ウェルプレートに拡大した細胞である。1週間の培養の後、個々のクローンを、Ovr110の発現についてウェスタンブロットにより抗HA抗体(Covance, Richmond, CA)を用いてアッセイした。Ovr110−HAの最高レベルを発現する2個のLMTK細胞クローンを、75cm2のフラスコ(VWR)中に拡大してハイブリドーマのスクリーニングを行い、10%DMSOを含むウシ胎仔血清(FBS)中で凍結保存し、−196℃の液体窒素中に貯蔵して、生存可能なクローン培養物の維持を確実にした。ベクターによりコードされるタンパク質は、以下にHA−タグに下線をつけて表示した。
HAタグを持たない、Ovr110(配列番号:13)をコードする核酸分子を、哺乳類発現ベクター、PCDNA3.1にクローニングし、組換えベクターを用いてヒト293F細胞(Invitrogen)を形質移入した。106細胞/mlでフリースタイル培地(GIBCO)中で培養した50mlの293F細胞を、293フェクチン形質移入試薬(Invitrogen)を用いて、製造業者の指針に従い、形質移入した。DNA、細胞および293フェクチンをOPTI−MEM培地(GIBCO)中に混合した。細胞は、形質移入の48時間後に分析に用いた。
AシリーズMAb融合のために、可溶性の大腸菌発現Ovr110B組換えタンパク質でマウスを免疫化した。CシリーズMAb融合のために、Ovr110の哺乳類発現細胞外領域でマウスを免疫化した。IシリーズMAb融合のために、上記の昆虫由来のHisタグ化Ovr110タンパク質で、週に2回マウスを免疫化した。
8匹のBALB/cマウスの群を、両方の後ろ足蹠において皮内免疫化した。全ての注射は、1つの足当たり25uLであった。1匹のマウス当たり10ugの抗原の最初の注射(1日目)は、等しい容積対容積比でTitermax gold アジュバント(Sigma, Saint Louis, MS)と混合したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)において行った。マウス当たり10ugの抗原のその後の注射は、5、9、12、16、19、23、26、29、30日目に行い、これはマウス当たり、20uLのDPBSと5uLのAdju-phosアジュバント(Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY)中の抗原からなっていた。33日目の最後の追加免疫注射は、DPBSのみで希釈した抗原からなっていた。融合は、37日目に生じた。
マウスを、免疫化プロトコルの完了時に絶命させ、排出するリンパ節(膝窩)組織を、無菌の解剖により採集した。リンパ節細胞は、無菌のふるいを通してDMEM中に押圧し、抗CD90(Thy1.2)で被覆した磁性ビーズ(Miltenyl Biotech, Baraisch-Gladbach, Germany)を介してT細胞を除去することにより、分散させた。
次に、これらの一次B細胞が豊富なリンパ節細胞を、連続的な骨髄腫細胞系P3x63Ag8.653(Kearney, J.F. et al., J. Immunology 123: 1548-1550, 1979)との電子−細胞融合(BTX, San Diego, CA)により不死化した。成功に融合した細胞を、標準的なヒポキサンチン、アザセリン(HA)(Sigma)含有選択培地(DMEM/10%FBS)中で培養することにより選択した。これらの融合培養物を、直ちにプレートあたり1000万個の細胞で、96ウェル培養プレートのウェル中に分散させた。融合後直ちに培養物を96ウェル培養プレート中に分散させることにより、単一の特異的な抗体を産生するより広範囲の種類のハイブリドーマクローンの選択が容易になった。ウェルからの上清液を、ELISAにより、Ovr110B、Ovr110Aに対する反応性について、および、無関係のタンパク質(Ovr117)との交差反応性の不在について、スクリーニングした。
ハイブリドーマ細胞系を、Ovr110特異的抗体の産生について、酵素結合固相イムノアッセイ(ELISA)により選択した。Ovr110BまたはOvr107タンパク質を、96ウェルポリスチレンEIAプレート(VWR)のウェルに非特異的に吸着させた。(DPBS)中で0.91mg/mLにおいて、50uLのOvr110Bタンパク質またはペプチドBSA結合体を、96ウェルポリスチレンEIAプレートのウェル中で、4℃で一晩インキュベートした。プレートを、0.05%のTween 20、pH7.4を含むトリス緩衝生理食塩水(TBST)で2回洗浄した。次に、プレートウェルを排出し、非特異的結合能力を、ウェルをTBST/0.5%ウシ血清アルブミン(TBST/BSA)で完全に満たし、室温(RT)で30分間インキュベートすることにより遮断した。次に、プレートウェルを排出し、50uLのハイブリドーマ培養培地試料をウェルに加え、1時間RTでインキュベートした。次に、ウェルを、(TBST)で3回洗浄した。次に、TBST/BSAで1:5000に希釈した100uLのアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスIgG(Fc)(Pierce Chemical Co., Rockford, IL)を、各々のウェルに加え、1時間RTでインキュベートした。次に、ウェルを、TBSTで3回洗浄した。次に、1Mのジエタノールアミン緩衝液、pH8.9(Sigma)中の100uLのアルカリホスファターゼ基質パラニトロフェニルホスフェート(pNPP)(Sigma)、1mg/mLを、各々のウェルに加え、20分間RTでインキュベートした。結合したアルカリホスファターゼ活性を、視覚可能な黄色の発色により示した。酵素反応を、溶液の吸光度を405nmの波長において測定することにより定量した。最高の吸光度の値を生じる培養物を、拡大およびさらなる評価のために選択した。
2週間の培養の後、Ovr110Bについて1.0より大きい、およびOvr107について0.2より小さいELISA吸光度値を生じる上清を有するハイブリドーマを、25個の96ウェル培養プレートから新しい96ウェル培養プレート中へ再配置し、さらに1週間培養した。
さらに1週間培養した後、Ovr110Bについて1.0より大きい(表1Aおよび1B)、およびOvr107について0.2より小さいELISA吸光度値を生じる上清を有するハイブリドーマを、Aシリーズから12個、およびCシリーズから15個、96ウェル培養プレート中の単一細胞クローニング用に、細胞分類により選択した(Coulter Elite)。
2週間の培養の後、各親ハイブリドーマからの2つのハイブリドーマクローンからの上清を、Ovr110B(表1Aおよび1B)またはOvr110ペプチドについて1.5より大きい、またはOvr107について0.2より小さい、ELISA吸光度値の生成について試験した。次のクローン:Ovr110.A7.1, Ovr110.A10.1, Ovr110.A13.1, Ovr110.A31.1, Ovr110.A57.1, Ovr110.A72.1, Ovr110.A77.1, Ovr110.A87.1, Ovr110.A89.1, Ovr110.A 99.1, Ovr110.A102.1, Ovr110.A107.1, Ovr110.C1, Ovr110.C2, Ovr110.C3.2, Ovr110.C4, Ovr110.C5.3, Ovr110.C6.3, Ovr110.C7.1, Ovr110.C8, Ovr110.C9.1, Ovr110.C10.1, Ovr110.C11.1, Ovr110.C12.1, Ovr110.C13, Ovr110.C14, Ovr110.C15, Ovr110.C16.1 & Ovr110.C17.1、は全て、免疫組織化学法、免疫蛍光法および機能試験についてスケールアップのために選択された。
LMTK−Ovr110−HA安定形質移入体およびOvr110mRNA陽性(SKBR3)およびmRNA陰性(HT29)腫瘍細胞系を、DMEM/10%FBS+P/S中で増殖させた。染色の1日前に、LMTK−Ovr110−HA安定形質移入細胞を、酪酸ナトリウムを5mMの最終濃度となるように加えて刺激した。FACS分析のために、LMTK−Ovr110−HA細胞または腫瘍細胞系を、10mlのCa+2/Mg+2非含有DPBSで1回洗浄し、次に7mlの温かい(37℃)Cellstripper(Mediatech, Herndon, VA)を150cm2のフラスコにつき加えた。次に、細胞を、37℃で5分間、フラスコを軽くたたいてしっかり付着した細胞を除去しながらインキュベートした。細胞を除去し、数回ピペットで採取して凝集体を破壊し、次に直ちにDMEM/10%FBS/5mM酪酸ナトリウム中に配置した。次に、細胞を、5分間1300rpmで遠心分離し、DMEM/10%FBS/5mM酪酸ナトリウム中に再懸濁させた。細胞を、37℃で30分の回収時間にわたりインキュベートした。染色の前に、細胞の生存可能性をGuava Viacount (Guava Cytometers, City, CA)を用いて測定し、>90%生存可能である場合には、これらを96ウェルv底プレート(VWR)中に分散させて、MAbで染色した。
MAbのアイソタイプは、市場で入手可能なマウスモノクローナル抗体アイソタイプ決定用免疫測定試験キット(IsoStrip, Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN)を用いて決定した。アイソタイプ決定結果を表3に示す。IgG2b/κアイソタイプであるOvr110MabA10.1を除き、全てのMAbは、IgG1/κアイソタイプであった。
結合動力学および親和性定数を、表面プラスモン共鳴測定から、BIACORE 3000機器(Biacore, Piscataway, NJ)を用いて計算した。実験を設計して、Ovr110MAbについてのオンレート、オフレートおよび親和性値を同時に発生させた。
ウェスタンブロット分析のためのタンパク質抽出物を、細胞溶解緩衝液(1%NP−40;10mMのリン酸ナトリウム、pH7.2;150mMの塩化ナトリウム)中に、Ovr110−293T形質移入体および哺乳類腺癌細胞系から調製した。タンパク質は、NuPAGE4〜12%ビス−トリスゲル(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)上での電気泳動により、変性条件下で、Novex-XCell II Minicellゲル装置(Invitrogen, Life Tech)において分離し、その後PVDF膜に、XCell II Blot Module (Invitrogen Life Technologies)を用いて移送した。タンパク質の移送に続いて、膜を、1%遮断試薬(Roche Diagnostic Corp., Indianapolis, IN)中で遮断し、精製した一次抗体(Ovr110モノクローナル抗体:A10.2、A13.1、A31.1、A57.1、A72.1、A77.1、A89、A107、C3.2、C5.1、C5.3、C6.3、C7.1、C9.1、C11.1、C12.1またはC17.1)と共に、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG二次抗体(Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc.)と共に4℃で一晩インキュベートし、最後に化学発光により、ECLアドバンスウェスタンブロッティング検出キット(Amersham Biosiences, Piscataway, NJ)を用いて視覚化した。
以下の癌細胞系をこの試験で用いた:卵巣OvCar−3、卵巣CaOV−3および乳房SKBr−3。OvCAR−3およびSKBR−3細胞はOvr110を発現するが、対照CaOV−3細胞はOvr110を発現しない。
細胞は、18mmガラス製カバースリップ上に播種し、10%ウシ胎仔血清およびペニシリンおよびストレプトマイシンを含むDMEM中で、37℃にて48時間培養し、その後抗Ovr110MAbで処理した。
試験した11個のMAb(Ovr110.A7.1、Ovr110.A13.1、Ovr110.A72.1、Ovr110.A31.1、Ovr110.A57.1、Ovr110.A77.1、Ovr110.A87.1、Ovr110.A89.1、Ovr110.A99.1、Ovr110.A102.1およびOvr110.A107.1)のうち、10個の抗体は、Ovr110発現細胞の少なくとも一部に結合することができた。図2は、Ovr110.A57.1の、OvCAR−3卵巣癌細胞(図Aの矢印)およびSKBR−3乳癌細胞(図Bの矢印)の細胞膜への結合を示す。Ovr110を発現しない対照細胞系であるCaOV−3細胞の細胞膜は、細胞が同じ抗体でインキュベートされても、標識されなかった(図2C)。
この試験は、蛍光抗体を用いて行った。蛍光色素Cy3で抗体を標識することにより、抗体の結合および内部移行を、蛍光顕微鏡観察により視覚化することができる。この手法は当分野で十分に確立されている。Ovr110を発現しないOvCAR−3細胞を、陰性対照として用いた。
Ovr110.A7.1、Ovr110.A13.1、Ovr110.A72.1、Ovr110.A57.1、およびOvr110.A87.1をCy−3で標識した。Cy3結合は、標準的な手順および製造者のガイドラインに従って行った。簡単に述べると、1mgの抗体を、0.1M重炭酸塩緩衝液(pH9.3)に対して60分間透析し、Cy3染料と混合し、RTで2時間インキュベートし、次にPierceのSlide-A Lyzer透析カセット中に移送して、2リットルのPBS中で6時間、4℃で透析した。この操作を6回繰り返した。Cy3結合抗体を回収し、濃度を分光計で280nmで測定した。
次にOvr110.A7.1、Ovr110.A13.1、Ovr110.A72.1、Ovr110.A57.1およびOvr110.A87.1MAbを、10ug/mlの濃度で、細胞と共に37℃で、水チャンバー中で60分間インキュベートし、PBS中で洗浄し、PBS中の3%ホルムアルデヒドで10分間固定した。固定に続いて、細胞とカバースリップを、DAPIを含む培地(Vectastain)中に載置して細胞核を視覚化し、細胞を適切な蛍光フィルターを備えたZeiss蛍光顕微鏡Axiophotを用いて観察した。顕微鏡写真をカラーCCDカメラにより得た。
Cy3−Ovr110.A7.1、Ovr110.A13.1、Ovr110.A72.1、Ovr110.A57.1およびOvr110.A87.1で処理した癌細胞の免疫蛍光顕微鏡観察により、Ovr110を発現する癌細胞が、異なる程度において蛍光抗体に結合し、これを内部移行することが示された。図3A(矢印)は、結合後にCy3−Ovr110.A57.1が、SKOV−3細胞により、またより少ない程度においてSKBr−3細胞により(図3B)内部移行されることを示す。CaOV−3対照細胞においては、Cy3−Ovr110.A57.1の結合は全く観察されないか、または低い程度の結合が観察された(図3C)。SKOV−3細胞における内部移行パターンの染色の特徴は、ゴルジ体に近接して位置するエンドソームに相当する可能性の高い、核周囲小胞の存在である(図3Aおよび3B)。
Ovr110MAbは、 in vitroでOvr110発現癌細胞の細胞表面上でOvr110に結合すると、内部移行される。
免疫組織化学法により評価した腫瘍および正常組織におけるOvr110分布
組織
乳癌、卵巣癌および正常な隣接組織のホルマリン固定パラフィン包埋ブロックをNational Disease Research Interchange (Philadelphia, PA)から得た。正常な器官のOCT包埋ブロックをZoion (Hawthorne, NY)から得た。
ホルマリン固定パラフィン包埋ブロックから切断した厚さ6μmの切片を、45℃で加熱し、Histoclear中で脱パラフィン化し、PBSまで一連のエタノールにより再水和した。抗原検索を、切片スライドを10mMのクエン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中で120℃、15〜17PSIにおいて、デクローキング(decloaking)チャンバー(Biocare, Walnut Creek, CA)内で10分間沸騰することにより、実施した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、3%過酸化水素溶液で15分間切片を処理することにより停止させた。スライドを1%BSAと共にインキュベートして非特異的抗体結合を遮断し、次に、6種類の異なる一次Ovr110MAbを1ug/mlの濃度で用いて、1時間、室温でDAKOオートステイナー(autostainer)(Dako Co., Carpinteria, CA)中で反応させた。0.5%のTween-20を含むトリス緩衝生理食塩水(TBS)中で洗浄した後に、スライドを、二次抗体としてホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)に結合している抗マウスIgGと共に、インキュベートした。0.5%のTween-20を含むTBS中で洗浄した後に、切片を、3,3’−ジアミノベンジジン色素原(Immunovision Technologies, Co. Daly City, CA)により2〜5分間処理して視覚化し、ヘマトキシリンで対比染色し、脱水後にPermount培地中に載置した。一次抗体と同一の濃度の正常なマウスIgGを、陰性対照とした。
スライドを、クリオチャンバー(cryochamber)内で、適切な温度において5〜8umに切断し、少なくとも30分間室温で風乾した。IHCはImmunovision Powervision Kit (Immunovision Technologies, Co. Daly City, CA)を用いて行った。簡単に述べると、スライドをTBS中で洗浄してOCTを除去し、一次抗体Ovr110.A13.1およびOvr110.A57.1と共に室温で1時間インキュベートした。これらは次に、4%パラホルムアルデヒド固定液中で10分間後固定し、上記のようにして処理した。
Ovr110.A7.1、Ovr110.A10.1、Ovr110.A13.1、Ovr110.A57.1およびOvr110.A87.1を用いて、卵巣漿液性腺癌の臨床試料切片を免疫標識した。図4は、IHCによりOvr110.A57.1を用いて評価した、卵巣腫瘍におけるOvr110の分布を示す。
15個の臨床試料のうち13個(87%)は、Ovr110.A57.1を用いて陽性免疫標識を示し、一方、15個のうち14個(93%)は、Ovr110.A13.1を用いて陽性であった(表6A)。特異的免疫染色は、腫瘍における上皮細胞に限定されており、陽性細胞の数は、50%から殆ど全ての腫瘍細胞にいたるまでの範囲で変化した。図4Aおよび4Bから、腫瘍の上皮細胞が、強い膜染色(矢印)とそれより弱い細胞質染色を示し、間質には背景染色がないことがわかる。図4Cは、一次抗体がマウスIgG断片で置き換えられている対照実験において、特異的標識がないことを示す。
結果は、Ovr110の発現が、卵巣の漿液性腺癌および乳房浸潤性乳管癌に対する、高感度で特異的な指標として用いることができることを示すが、ただし、Ovr110は幾つかの膵臓癌および肺癌においても発現され、また幾つかの抗Ovr110MAbは明らかに、マウス乳房組織における関連する分子とも反応した。細胞膜染色パターンは、Ovr110が理想的な治療標的となることを示す。
実験を次にようにして行った:Ovr110を形質移入したCHO細胞(Ovr110−CHO)を、Mab−zapヤギ抗マウスIgサポリン結合体(Advanced Targeting Systems, San Diego, CA)と予め混合したOvr110Mabと共にインキュベートし、細胞の生存を72および96時間後に測定して、これらOvr110発現細胞に対する潜在的な死滅効果を検出した。1日目、Ovr110−CHO細胞を96ウェル平底無菌細胞培養プレート(Corning)に、トリプリケートのウェルで、2000細胞/75uL/ウェルにて、10%FBS、P/Sを含むF12培地中に載置した。プレートは37℃、5%CO2中で一晩インキュベートした。デュプリケートのプレートは、72時間後および96時間後での読取りのために設定された。2日目(0時間)、25uLの4×最終MAb濃度のみ、または25uLの4×MAbを25uLの4×MabZapと予め混合したもの、または25uLの4×MabZapのみ、または25uLの培地のみを、96ウェルプレートのウェルにトリプリケートで加えて、最終容量を100uLとした。MAbの最終濃度は、2ug/mL、0.4ug/mL、0.08ug/mLおよび0ug/mLであり、MAbZapの最終濃度は、1ug/mLであった。培地のみ、MAbのみ(2ug/mLのみ)、およびMAbZapのみのトリプリケートのウェルは、陰性対照として用いた。抗トランスフェリン受容体MAb5E9(ATCC, Manassus, VA)は、死滅の陽性対照MAbとして用いた。プレートは5分間ゆっくり振盪して試薬を混合させ、次に37℃、5%CO2中でインキュベートした。5日目(72時間)、10uLのアラマーブルー(Alamar Blue)原液(Biosource International, Camarillo, CA)を最初のプレートセットのウェルに加え、これを37℃、5%CO2中で、2〜7時間インキュベートした。次にプレートを、SpectraMAX GeminiEM分光光度計(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)(発光=590nm、励起=560nmおよび自動カットオフ=570nm)で分析し、生存能力を、培地のみの対照ウェルに対するパーセンテージとして表わした。
抗ヒトB7x/B7H4および抗マウスB7S1MAbは、活性化されたT細胞へ結合することが前に示された(Prasad et al., Immunity 18: 863-73 (2003); Sica et al., Immunity 18: 849-61 (2003); Zang et al., Proc. Nat.1 Acad. Sc.i U S A. 100: 10388-92 (2003))。本発明のOvr110MAbの活性化細胞への結合を確認するために、新鮮なヒトT細胞を精製し、下に述べるようにして、異なる化合物により刺激した。Ovr110MAbの、CD25(IL−2R)およびCD71(TFR)を発現するCD3陽性活性化T細胞への結合を、FACSにより分析した。BTLAが、Ovr110(B7x/B7H4)の推定受容体であるとの主張(Watanabe et al., Nat Immunol. 2003 4: 670-9; Carreno & Collins Trends Immunol. 2003 24: 524-7)並びに、本明細書に開示されたヒトBTLA−マウスIgG2aFc融合体の、これら活性化されたT細胞および腫瘍細胞への結合を検討した。
正常な男性ドナーからのヒト末梢血を、Stanford Blood Center (Palo Alto, CA)における自発的提供者から得た。単核細胞を、標準のFicoll/Hypaque一段階密度勾配遠心法(1.077g/mL)を用いて分離した。
単核細胞を最終濃度106/mLで3日間、37℃、10%CO2にて、標準の25cm2組織培養フラスコ中のPRMI−1640(CellGro)に以下のいずれかを加えて培養した:10%FCS(Hyclone, Utah)、10ug/mLのフィトヘマグルチニン(PHA−M)(Sigma, St. Louis, MO)または10ug/mLのリポ多糖体(LPS)(Sigma)、または10ng/mLのホルボールミリスチン酸アセテート(PMA)(Sigma)と1uMのイオノマイシン(Sigma)との組合せ。
細胞は、3日間のPHA刺激の後に採集し、よく洗浄した。単核細胞を96ウェルV底プレートに分散させ、自己血清中でインキュベートしてFc受容体を遮断した。抗CD3FITC抗体(Serotec, Raleigh, NC)を各ウェルに加え、CD80PE、CD86PE、CD25PEのいずれか、またはビオチン化抗CD71(Serotec)、Ovr110.A57.1またはOvr110.C3.2を、第二のMAbとして20ug/mLにて、二色分析のために加えた。細胞を2回洗浄し、ビオチン化MAbでプレインキュベートしたウェルに、フィコエリスリン−ストレプトアビジン(PESA)を加えた。細胞を2回洗浄し、FACS緩衝液中に再度懸濁させた。細胞を自己血清中でプレインキュベートし、Ovr110−IgまたはBTLA−Ig融合タンパク質20ug/mLで染色した。細胞を2回洗浄し、ロバ抗マウスPE(1ug/mL)を試料に加え、次に細胞を2回洗浄し、マウス血清中でインキュベートして、ロバ抗マウス抗体上のフリーの結合部位を遮断した。次に抗CD3FITC抗体を、T細胞を同定する最後のステップとして加えた。2回の洗浄の後、細胞をFACS緩衝液中に再懸濁させて、フローサイトメトリで解析した。ヒト腫瘍細胞系SKBR3は、MAbまたはBTLAFcで、前述のようにしてインキュベートした。
材料および方法
細胞および細胞培養物
RK3E、293T、IEC−18、SKOV3、HeLa、CaOV3、HT29、MCF7およびSKBR3細胞系は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Manassas, VA)から購入した。細胞は、L−グルタミンおよび4.5g/Lのグルコースを有し、10%FBSおよび100U/mLのペニシリン/ストレプトマイシン(Cellgro)を補足したDMEM(Invitrogen)中で増殖させた。すべての細胞を、加湿した37℃インキュベーター中で、5%CO2で保持した。
図8Aは、細胞系におけるmAbA57.1を用いたOvr110タンパク質のウェスタンブロット検出であり、mRNA発現とタンパク質発現の相関を示す。図8Bのウェスタンブロットは、細胞系およびヒト卵巣腫瘍組織試料中においてはOvr110タンパク質の検出を示すが、正常隣接組織(NAT)においては検出を示さない。図8Bのウェスタンブロットは、細胞系およびヒト乳房腫瘍組織試料中においてはOvr110タンパク質の検出を示すが、正常隣接組織(NAT)においては検出を示さない。さらに、図9は、Ovr110タンパク質が主要器官の抽出物には検出されないことを示すウェスタンブロットであり、Ovr110に指向された治療戦略は、主要なまたは重要な器官の機能に干渉しないであろうことを示唆する。
siRNA分子を設計するために、配列を、前に記載された方法(Elbashir et al., 2001)に基づいて、Ovr110 mRNAのオープンリーディングフレームから選択した。いかなる既知の細胞mRNAのノックダウンをも生じない、無秩序な「スクランブルした」siRNA配列を、陰性対照として用いた。追加の陰性対照として、エメリン(Emerin)を標的化するsiRNA用いて、非必須mRNAのノックダウンが、Ovr110レベルにも、試験したいずれの生物学的終点にも影響しないことを実証した(データ示されず)。アポトーシス誘発をもたらすmRNAのノックダウンについての陽性対照として、DAXXを標的化するsiRNAを、刊行されたデータに基づいて用いた(Michaelson et al., J. Cell Sci., 2003 Jan 15; 116(Pt2): 345-52)。ヒトゲノムに対するBLAST探索を、各々の選択されたsiRNA配列について行い、siRNAが標的に特異的であり、他の配列をノックダウンする機能を有さないことを確実にした。すべてのsiRNA分子(HPP精製階級)は、Xeragon Inc. (Germantown, MD)により化学的に合成した。siRNAは用いる前に、無菌の緩衝液に溶解し、90℃で1分間加熱し、次に37℃で1時間インキュベートした。配列の3’末端における2つのチミジン残基(dTdT)を有するsiRNAオリゴヌクレオチドは、以下の特異的なRNA配列からなっていた:
6×104個のSKBR3細胞を、12ウェルプレート中に、形質移入の18〜24時間前に播種した。一過性形質移入を、オリゴフェクタミン(Oligofectamine)試薬(Invitrogen)を用いて、製造者のプロトコルに従って行った。最終濃度100nMのsiRNA(200nMであったDAXX siRNAを除く)および1.5ulのオリゴフェクタミンを、細胞のウェルあたり用いた。すべての実験について、siRNAをトリプリケートで形質移入した。細胞の平行ウェルの評価を、形質移入の72時間後、mRNAレベルの変化については定量的なリアルタイムRT−PCR(QPCR)により、タンパク質レベルの変化についてはウェスタンイムノブロットにより、およびアポトーシスの変化については2つの異なるアッセイシステム(以下を参照)により行った。図10Aは、Ovr110 siRNAがOvr110転写物に特異的であり、QPCRで測定されたようにGAPDHをノックダウンしないことを示す。図10Bは、Ovr110 siRNAは、不在の場合およびスクランブルsiRNA対照と比較して、Ovr110メッセージ発現を低減させることを示す。Ovr110タンパク質の下方制御を示す結果を、図11に示す。Ovr110に対するsiRNA#37もまた、Ovr110を発現しない細胞により試験し、アポトーシスへの影響はみられなかった(データ示されず)。全ての所見は、少なくとも2回の追加実験により確認した。
Qiagen Inc.からのQuantiTech SYBR Green RT-PCRキットを、QPCR評価のために用いた。20〜40ngの鋳型RNAを、反応あたり用いた。QPCRは、Taqman 7700配列検出システム(Applied Biosystem Inc.)を用いて行った。
2つの異なるアッセイキットを用いて、siRNAのアポトーシスに対する影響を評価した。「Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay」キット(Promega Inc.)を用いて、試験細胞を培養プレート内で直接可溶化し、蛍光読み取り値に反映されるカスパーゼ活性を、供給者の指示に従って測定した。第2のキットである「Guava Nexin V-PE Kit」(Guava Technologies Inc.)を用いて、処理した細胞をトリプシン処理および洗浄により収穫し、約105個の細胞を、40ulの提供された緩衝液中に再懸濁させ、各々5ulのアネキシンV(+)および7−AAD(−)を加えた。氷上での20分間のインキュベーションに続いて、細胞を、製造者の指示に従ってGuava PCAフローサイトメーターを用いて分析した。図12および図13に、Ovr110ノックダウンによりアポトーシスが誘発されることを示す結果を示す。
siRNAによる形質移入の72時間後に、細胞抽出物を氷上で、溶解緩衝液(1%NP40、10mMのNa2PO4、0.15MのNaCl)とプロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche Inc.)を用いて調製した。ウィルス感染細胞または形質移入なしの細胞を用いる他の実験用の抽出物を、同様の様式で調製した。収穫した腫瘍から抽出したタンパク質を、抽出緩衝液(50mMトリス−HCl、pH=7.2、150mM NaCl、0.5%IG−Palに、プロテアーゼ阻害剤を加える)中でスナップ凍結し、すりつぶした腫瘍細胞を均一化して調製し、続いて超音波処理し、次に微量遠心管内で遠心分離して、抽出物を浄化した。20〜50ugの間のタンパク質抽出物を、各ゲルレイン(gel lane)に用いた:タンパク質当量濃度を評価して、同一ゲル上でのタンパク質レベルを比較した。浄化した抽出物を、等しい容積の2×濃縮Laemmli試料緩衝液(Invitrogen)と混合し、70℃まで10分間加熱し、次に、プレキャスト4〜12%SDS−ポリアクリルアミドミニゲル(Nupage, Invitrogen)をMES実行緩衝液(Nupage, Invitrogen)と共に用いて分析した。ゲルを、Immobilon-P PVDF膜(0.45μmの孔サイズ、Invitrogen)に、1×Nupage移送緩衝液および10%メタノールを用いて移送した。膜を洗浄し、1時間室温で、0.05%のTween-20を含むPBS中の5%脱脂粉乳を用いて遮断した。膜を、一次抗体と共に一晩、0.05%のTween-20を含むPBS中の5%脱脂粉乳中でインキュベートした。Ovr110に対して指向されたマウスモノクローナル抗体を、組換えOvr110タンパク質を用いて産生した。Ovr110に対するモノクローナル抗体を1ug/mlの最終濃度で用いて、GAPDH(Chemicon Inc.)に対するマウスモノクローナル抗体を最終濃度2ug/mlで用いた。一次抗体インキュベーションに続いて、膜を、室温で10分間、各々0.05%のTween-20を含む1×PBS中で4回洗浄した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン(Jackson Lab Inc.)を、0.05%のTween-20を含むPBS中の5%脱脂粉乳中で、室温で1時間用いて(1:10,000希釈)、一次モノクローナル抗体を検出した。膜を最後に、0.05%のTween-20を含む1×PBS中で10分間、4回洗浄し、続いて製造者の指示(Amersham)による増強した化学発光(ECL)試薬を用いて検出した。
哺乳類細胞でのOvr110タンパク質の発現のために、Ovr110 cDNAをpLXSNベクター(BD Bioscience/Clontech)中にサブクローニングし、配列を確認した。pLXSNレトロウィルスベクターは、MLV LTRを利用して、cDNA発現の、多数のクローニング部位へのクローニングを駆動し、SV40プロモーターは、G418抵抗をコードするNeo遺伝子の発現を駆動する。アルカリホスファターゼ(AP)をコードするレトロウィルス発現ベクターであるpLAPSNは、BD Bioscience/Clontechから購入した(pLXSN−AP)。
狭宿主性ウイルスを用いて、RK3EおよびIEC−18細胞を感染させ、広宿主性ウイルスを用いて、SKOV3細胞を感染させた。狭宿主性ウイルスパッケージングのために、形質移入の1日前に、293T細胞を、6ウェル皿のウェルあたり8×105個の細胞の密度で、Biocoatコラーゲン被覆プレート(BD)上に播種した。細胞は、精製したプラスミドDNAで、PLUS試薬(Invitrogen)を加えたリポフェクタミンを用いて形質移入した。細胞ウェルあたり0.8μgのウイルスプラスミドDNA:pLXSN−Ovr110、pLXSN−Ovr110HAまたはpLXSN−APと、0.8μgのpVpack-Ecoおよび0.8μgのpVpack GP (Stratagene)を、血清を含まない125μLのDMEMおよび10μLのPLUS試薬のストックに添加し、続いて15分間室温でインキュベートした。その後、125μLのDMEM培地中に希釈した8μLのリポフェクタミンを、DNA/PLUS試薬混合物に加え、15分間室温でインキュベーションした。1mlのDMEMを、最終的なリポフェクタミン/DNA混合物に加え、すでに1mlのDMEMを含むが血清は含まない細胞単層に適用し、続いて37℃で3時間インキュベーションした。形質移入混合物を、20%FBSを含むDMEMで置き換えて、細胞を一晩増殖させた。最後に、培地を、10%のFBSおよび100U/mLのPen/Strepを補足したDMEMと交換して、ウイルスを採集した。ウイルス含有培地を24時間後に収穫し、0.45μmのポリスルホンフィルターを通して濾過した。広宿主性ウイルスパッケージングのために同一の手順を繰り返したが、ただし、pVpack Ecoプラスミドの代わりに、pVpack Amphoプラスミド(Stratagene)を用いた。
ポリブレン(Hexadimethrine Bromide; Sigma)を、新鮮なウイルス含有培地に、4μg/mlの最終濃度で加えた。前日に100mm2の皿あたり3×105個の細胞密度でプレーティングした、RK3E、IEC−18またはSKOV3細胞を、Ca2+およびMg2+を含むリン酸緩衝生理食塩水(Cellgro)で1回洗浄した。ウイルス溶液(100mm2の皿あたり6ml)を、細胞に直接適用し、次に3時間、加湿した37℃インキュベーター中で、5%CO2と共に、時々回旋しながらインキュベートした。ウイルス含有培地を、新鮮な増殖培地と交換し、細胞を37℃で60〜72時間インキュベートし、この時点で、350ug/mLの最終濃度のG418硫酸塩(Cellgro)を増殖培地中に含有させて、ウイルスに感染した細胞を選択した。細胞は70〜80%の集密に維持し、G418含有培地を2日毎に交換した。G418選択に続いて、細胞のプールを、ウェスタンイムノブロット分析によるOvr110タンパク質発現の検証を含むその後の実験のために用い、ここで細胞は、上記のようにして抽出し分析した。感染した細胞単層によるAPの発現を、染色によりモニタリングし、これにより細胞の単層を、室温で10分間0.5%グルタルアルデヒド溶液で固定し、PBSで洗浄し、65℃で30分間加熱し、BCIP/NBT液体基質(Sigma)と共に2〜3時間インキュベーションすることにより、APを視覚化した。
APまたはOvr110のいずれかを発現するSKOV3細胞の、レトロウィルスに感染したG418選択プールを、皮下的にヌードマウスに注射した。親SKOV3細胞も比較のために用いた。各種類107個の細胞を、マトリゲルで、6匹のマウスそれぞれに移植した。腫瘍細胞を注射したマウスは100%腫瘍を発症し、腫瘍の形成は、触診および可能な場合にはノギス測定にて、本研究の期間中4日毎にモニタリングした。結果を図14に示す。データは、時間経過に渡る平均グループ腫瘍容積として表わす。
高結合ポリスチレンプレート(Corning Life Sciences (MA))を、0.8μg/ウェルの抗Ovr110MAbで4℃にて一晩被覆した。被覆溶液を吸引して除去し、フリーの結合部位を、300μl/ウェルのSuperblock-TBS (Pierce Biotechnology, Illinois)と100%仔ウシ血清を加えて、1時間室温(RT)で遮断した。TBS+0.1%Tween 20で4回洗浄した後、50μlのアッセイ緩衝液(TBS、1%BSA、1%マウス血清、1%仔ウシ血清、0.1%Tween 20)を各ウェルに加え、次に50μlの抗原を加えて、90分間インキュベーションした。チェッカー盤実験のために、各々の対を50ng/mlおよび0ng/mlの組換え哺乳類Ovr110(細胞外部位)上で試験した。各サンドイッチELISAに対し、10、2.5、0.5、0.25、0.1および0ng/mlOvr110の標準物を、試験試料と平行して走らせた。標準物および試験試料は、アッセイ緩衝液で希釈した。検出には、100μlのビオチン化MAb(1μg/ml)を各ウェルに加え、室温で1時間振盪しながらインキュベートした。洗浄後、100μlのホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(1mg/ml、Jackson ImmunoReserach Laboratories, PA)を1:20,000の希釈で各ウェルに加え、RTで30分、振盪しながらインキュベートした。洗浄後、プレートを次にDAKO TMB Plus 基質(DAKO, Denmark)を用いて30分、RTで発現させた。反応は、1NのHClを100μl/ウェル用いて停止させ、プレートをSpectramax190プレートリ−ダー(Molecular Devices, CA)を用いて405nmで読み取った。
Aシリーズの10種類のMAbおよびCシリーズの8種類のMAbを試験した、チェッカー盤ELISAの結果を、表9Aおよび9Bに示す。各々の抗体は、可能な全組み合わせにおいて、被覆抗体と検出抗体の両方として試験した。すべての対を、緩衝液中100ngの組換えOvr110Bタンパク質上でデュプリケートで、緩衝液のみをブランクとして試験した。結果は、特異的シグナル/ノイズ比として示す。これらの対形成データに基づき、MAbは2つの異なるエピトープを検出した。Ovr110 A7、A77、A87およびA10 MAbは、他の3つのMAbの結合を立体的に妨げるのに十分近い、1または2以上のエピトープと反応する。全てのCシリーズ抗体は、このエピトープ(または重複する複数のエピトープ)も検出する。1または2以上の他の異なるエピトープは、Ovr110 A89、A57、A31、A72、A107MAbにより検出される。最大のシグナル/ノイズ比を有する幾つかの対を用いて、組換えタンパク質に対する感受性および、細胞系および幾つかの初めの血清試料中における天然タンパク質に対する反応性について試験した。
ヒト癌試料および良性血清試料を、IMPATH-BCP, Inc and DSS(Diagnostic Support Service)から得た。健康な女性からの血清試料を、ProMedex, LCCから得た。全ての試料は、到着時に等分し、使用するまで−80℃で貯蔵した。
上に記したように、血清試料中のOvr110の検出のために、ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)および高感度TMB基質(DAKO)の使用に基づく、高感度検出システムを用いた。このELISAの様式におけるOvr110についての最小検出用量(MDD)は、100pg/mlである。中央値の計算のために、MDDより低い値の試料を100pg/mlOvr110と定義した。最小検出可能用量は、背景シグナルを超える2つの標準省略値(two standard abbreviations)として定義される。健康な患者からのほとんどの血清試料は、サンドイッチELISAにより低いOvr110濃度を示し、一方、卵巣癌患者からの血清は、増加したレベルのOvr110を有する。
漿液性または子宮内膜性卵巣癌を有する147人の女性の血清および、粘液性癌を有する女性の67の血清中のOvr110濃度を、腫瘍進行の全4ステージを表わす血清を用いて試験した。図18に示すように、初めの2つの卵巣癌の種類はIHCによりOvr110について陽性であり、一方、粘液性癌ではそうでなかった。これらのデータとよく整合して、子宮内膜性および漿液性卵巣癌を有する患者の結成におけるOvr110濃度の中央値は、粘液性癌患者におけるより高い。
Ovr110が細胞表面膜タンパク質として発現されるとの我々の所見と一致して、血清におけるOvr110の濃度は概して、漿液性癌の女性においてさえも、非常に低い。従って、漿液性癌を有する女性からの血清中に検出されるOvr110濃度は、20ng/mlより低い。
A、CおよびIシリーズからの抗体パネルにより認識されるエピトープを、重複ペプチドの抗体への反応性について、ELISAに基づくアッセイを通してスクリーニングすることにより決定した。24個の重複ペプチドは、SynPep(Dublin, CA)から注文した。ペプチド1〜23は15マーであり、ペプチド24は8個のアミノ酸を含んでいた。ペプチド配列は、Ovr110タンパク質の、N末端のアミノ酸G21から開始し、C末端のA258で終了した。これらのペプチドは、シグナルペプチド配列の終りから膜透過ドメインの始まりまでの、成熟したOvr110タンパク質の細胞外領域に広がっている。図20を参照。ペプチドは、原液として1〜3mgの範囲の小量のアリコットで提供された。各ペプチドのPBSで1:400倍の希釈を行い、96ウェル4XCostar plates (#3690)(Costar Corporation; Cambridge, MA)上に、50μlを各ウェルにデュプリケートで加え、一晩放置した。上記の、hisタグ化哺乳類Ovr110完全長タンパク質を、各96ウェルプレート上の陽性対照として用いた。翌日、プレートをフリック乾燥し(flicked dry)、TBST0.5%BSAで約40分間遮断した。抗Ovr110抗体(50μl)を、ウェル当たり20μg/mlで加え、室温で約2時間インキュベートした。プレートは、TBST洗浄緩衝液で3回洗浄した。二次結合体のヤギ抗マウスIgFc−AP(Pierce, Rockford, IL)を、TBST/BSA溶液中で1:5000に希釈し、50μlを各ウェルに加えた。プレートは2時間室温で振盪した。プレートを3回洗浄し、50μlの基質を各ウェルに加え、室温で15分間インキュベートした。用いた基質は、1xDEA中のpNPP(1mg/ml)であった。アッセイを視覚化するため、プレートをSpectraMaxPlus(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)上405nmにて、Softmax Pro(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)および解析用にExcel(Microsoft; Seattle, WA)ソフトウェアを用いて読み取った。
公的に利用可能なソフトウェアを用いて、翻訳後修飾を完全Ovr110タンパク質について予測し、各特徴をそれぞれのペプチドにマッピングした。
抗体A57.1、A72.1、C10.1、C11.1、C17.1およびI11は、ペプチド13に強い反応性を示すが、ペプチド14または15に対しては反応性ではない。ヒトからマウスへのアミノ酸配列変化は、イソロイシン(I)がバリン(V)によって置き換えられている155位で起こり(SMPEIからSMPEV)、従って、これらの抗体は、配列SMPEV(配列番号:45)によって生成されるエピトープに対しておそらく特異的であると結論づけることができる。
A、CおよびIシリーズ抗Ovr110抗体のペプチド13および15への結合に基づき、これらの部位が免疫系を保護するのに、特にT細胞活性を維持することに関して重要であると考えられる。図23は、T細胞活性化の複雑性を簡略に図示したものである。T細胞を活性化するには、幾つかのT細胞表面タンパク質と、抗原提示細胞(APC)例えばB細胞または樹状細胞などの上に見出される特異的リガンドとの、相互反応が必要である。
何よりもまず、T細胞受容体(TCR)が、主要な組織適合性複合体(MHC)分子の文脈において、抗原ペプチドを作動させなければならない。このTCRペプチド/MHCシグナルは、T細胞活性化に必要であるが、第二のシグナルもまた必要であり、これは共刺激シグナルと呼ばれる。このシグナルは、CD28と呼ばれる細胞表面分子の別のセット並びにそのリガンドB7.1およびB7.2によって生成される。T細胞増殖は、CD28とB7.1またはB7.2との相互作用を通じて増強されるが、それはこの相互作用がIL−2mRNAを産生し、これによってIL−2サイトカイン産生が増加するからである。従って、IL−2の産生は、T細胞活性化および増殖の直接の測度として用いることができる。一方で、CD28のホモログであるCTLA−4がB7.1またはB7.2に結合した場合、IL−2産生は大きく低減され、T細胞拡大が制限されることになる。
さらに、抗Ovr110腫瘍特異的抗体、例えばC3.2、A7.1またはC6.3は、抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)を、ナチュラルキラー(NK)細胞をエフェクター細胞として用いて、媒介することができる。これは、SKBr3細胞を51クロミウムで1時間標識することによって示される。過剰な51Crは洗浄して取り除き、腫瘍細胞を、C3.2またはC6.3などの抗Ovr110腫瘍特異的抗体により、陰性および陽性の対照細胞とともに、2μg/mlで15〜30分間、プレインキュベートする。ナチュラルキラー細胞は、エフェクター中の96ウェルプレートに、100:1〜0.4415:1の範囲の目標比まで滴定する。インキュベートした腫瘍細胞を、ウェル当たり10,000細胞の一定量で加える。腫瘍細胞のみを含むウェルは、自発的溶解のレベルを提供する。可能な最大溶解は、PBS中に希釈した1%トリトン−Xをいかなるエフェクター細胞も含まない腫瘍細胞のセットに加えて決定する。全てのウェルは、トリプリケートで実施する。
(実験値−自発値)(トリトンX処理−自発値)×100
対照抗体より高い特異的溶解を有する抗Ovr110抗体は治療的に有用であり、免疫系を刺激し身体自体のエフェクター細胞を用いることにより、体内の腫瘍を消滅させる。in vitroでの抗Ovr110抗体の有用性を示すADCCin vitroアッセイからの結果は、これらの抗体が、in vivoでADCCを促進する有用性を有することを示唆する。
細胞系およびDNAの寄託
以下のハイブリドーマ細胞系を、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, U.S.A. にあるアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)に寄託し、受託番号が付与された。
寄託されたハイブリドーマ細胞系の名称を、参照の便宜上短縮することができる。例えば、A57.1はOvr110.A57.1に相当する。これらのハイブリドーマは、表13にリストされたクローン(これらの完全な名称と共に)に相当する。
Claims (78)
- 哺乳類細胞上のOvr110に結合する、単離されたOvr110抗体。
- 哺乳類細胞上のOvr110に結合すると内部移行する、請求項1に記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 抗体断片である、請求項1に記載の抗体。
- キメラ抗体またはヒト化抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 抗体が、配列番号27、32、34および35からなる群から選択されるOvr110ペプチドに結合する、請求項1に記載の抗体。
- Ovr110ペプチドが翻訳後修飾を含む、請求項6に記載の抗体。
- 翻訳後修飾がリン酸化である、請求項7に記載の抗体。
- 抗体が、配列番号44〜47からなるエピトープに結合する、請求項1に記載の抗体。
- アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される、請求項3に記載の抗体。
- 抗体が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体により結合されるエピトープと同一のエピトープへの結合に対して競合する、請求項3に記載の抗体。
- 増殖阻害剤に結合している、請求項3に記載の抗体。
- 細胞毒性剤に結合している、請求項3に記載の抗体。
- 細胞毒性剤が、毒素、抗生物質、放射性同位体および核酸分解酵素からなる群から選択される、請求項13に記載の抗体。
- 細胞毒性剤が、毒素である、請求項14に記載の抗体。
- 毒素が、リシン、サポニン、メイタンシノイドおよびカリケアマイシンからなる群から選択される、請求項15に記載の抗体。
- 毒素が、メイタンシノイドである、請求項16に記載の抗体。
- 哺乳類細胞が、癌細胞である、請求項3に記載の抗体。
- Ovr110発現細胞を選択的に結合する、抗Ovr110モノクローナル抗体。
- in vivoでOvr110発現癌細胞の増殖を阻害する、抗Ovr110モノクローナル抗体。
- ヒト化抗体またはヒト抗体である、請求項20に記載の抗体。
- 細菌中で産生される、請求項21に記載の抗体。
- ATCC受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗Ovr110抗体のヒト化形態である、請求項19に記載の抗体。
- 癌細胞が、卵巣癌、膵臓癌、肺癌および乳癌からなる群から選択される癌からのものである、請求項20に記載の抗体。
- 癌が、卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌である、請求項24に記載の抗体。
- 請求項3に記載の抗体を産生する、細胞。
- 細胞が、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129の下で寄託されるハイブリドーマ細胞からなる群から選択される、請求項26に記載の細胞。
- 適切な細胞を培養し、抗体を該細胞培養物から回収することを含む、請求項3に記載の抗体を産生する方法。
- 請求項3または19に記載の抗体、および担体を含む、組成物。
- 抗体が、細胞毒性剤に結合している、請求項29に記載の組成物。
- 細胞毒性剤が、メイタンシノイドである、請求項30に記載の組成物。
- 抗体が、ヒト抗体またはヒト化抗体であり、担体が、薬学的担体である、請求項29に記載の組成物。
- ヒト化抗体が、ATCC受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗Ovr110抗体のヒト化形態である、請求項32に記載の組成物。
- Ovr110発現癌細胞を死滅させる方法であって、該癌細胞を、請求項1または2に記載の抗体と接触させ、これにより該癌細胞を死滅させることを含む、前記方法。
- 癌細胞が、卵巣癌細胞、膵臓癌細胞、肺癌細胞および乳癌細胞からなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
- 癌細胞が、卵巣癌細胞または乳癌細胞である、請求項35に記載の方法。
- 卵巣癌または乳癌が、卵巣漿液性腺癌または乳房浸潤性乳管癌である、請求項36に記載の方法。
- 癌細胞が、転移性の卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌からのものである、請求項35に記載の方法。
- 抗体が、抗体断片である、請求項34に記載の方法。
- 抗体が、ヒト化抗体である、請求項34に記載の方法。
- 抗体が、細胞毒性剤に結合している、請求項34に記載の方法。
- 細胞毒性剤が、メイタンシノイド、リシン、サポリンおよびカリケアマイシンからなる群から選択される毒素である、請求項41に記載の方法。
- 抗体が、ATCC受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗体のヒト化形態である、請求項34に記載の方法。
- 細胞毒性剤が、放射性同位体である、請求項41に記載の方法。
- 哺乳類におけるOvr110発現癌を寛解する方法であって、請求項19に記載の抗体の治療的に有効な量を、該哺乳類に投与することを含む、前記方法。
- 癌が、卵巣癌、膵臓癌、肺癌および乳癌からなる群から選択される、請求項45に記載の方法。
- 卵巣癌または乳癌が、卵巣漿液性腺癌または乳房浸潤性乳管癌である、請求項46に記載の方法。
- 抗体が、ヒト化抗体である、請求項45に記載の方法。
- 抗体が、細胞毒性剤に結合している、請求項45に記載の方法。
- 細胞毒性剤が、メイタンシノイドである、請求項44に記載の方法。
- 抗体を、少なくとも1種の化学療法剤と組み合わせて投与する、請求項50に記載の方法。
- 化学療法剤が、パクリタキセルまたはその誘導体である、請求項51に記載の方法。
- 容器およびその中に含まれた組成物を含む製造品であって、該組成物が、請求項3に記載の抗体を含む、前記製造品。
- 組成物が卵巣癌、膵臓癌、肺癌または乳癌を処置するために使用可能であることを示す添付文書をさらに含む、請求項53に記載の製造品。
- 試料中の細胞がOvr110を発現するか否かを決定する方法であって、
(a)細胞の試料を、請求項3に記載のOvr110抗体と、Ovr110抗体のOvr110への特異的な結合に適する条件の下で接触させること、および
(b)該抗体の前記試料中の細胞への結合のレベル、または前記試料中の細胞によるOvr110抗体の内部移行のレベルを、決定すること、
を含み、ここで、前記試料中の細胞に結合するOvr110抗体、または前記試料中の細胞によるOvr110抗体の内部移行が、前記試料中の細胞がOvr110を発現することを示す、前記方法。 - 細胞の試料を、アメリカンタイプカルチャーコレクション受託番号PTA-5180、PTA-5855、PTA-5856、PTA-5884、PTA-6266、PTA-7128およびPTA-7129からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生される抗体と接触させる、請求項55に記載の方法。
- 細胞の試料が、癌を有するか、癌を有することが疑われるか、または癌を発生する素因を有し得る対象からのものである、請求項55に記載の方法。
- 癌が、乳癌、結腸癌または卵巣癌である、請求項57に記載の方法。
- 抗体が、標識抗体である、請求項55に記載の方法。
- 試験細胞試料中でのOvr110過剰発現を検出するための方法であって:
(a)Ovr110の、試験試料中の細胞により発現されたOvr110への特異的な結合に適する条件の下で、前記試験細胞試料を請求項3に記載のOvr110抗体と混ぜ合わせること、
(b)該Ovr110抗体の前記試験試料中の細胞への結合のレベルを決定すること、
(c)ステップ(b)において細胞に結合したOvr110抗体のレベルを、対照の細胞試料中の細胞に結合するOvr110抗体のレベルと比較すること、
を含み、ここで、対照と比較した前記試験細胞試料中のOvr110抗体の結合の増加が、前記試験細胞試料中の細胞によるOvr110過剰発現を示す、前記方法。 - 試験細胞試料が、癌細胞試料である、請求項60に記載の方法。
- 癌細胞試料が、乳癌または卵巣癌のものである、請求項61に記載の方法。
- 卵巣癌が卵巣漿液性腺癌であり、乳癌が乳房浸潤性乳管癌または転移癌である、請求項62に記載の方法。
- 対照が、隣接する正常組織の試料である、請求項61に記載の方法。
- Ovr110過剰発現を、その検出を必要としている対象において検出する方法であって、
(a)対象の血清試料を、請求項3に記載のOvr110抗体と、Ovr110抗体の、前記血清試料中のOvr110への特異的な結合に適する条件の下で混ぜ合わせること、
(b)前記血清試料中のOvr110のレベルを決定すること、
(c)ステップbにおいて決定したOvr110のレベルを、対照中のOvr110のレベルと比較すること、を含み、ここで、対照と比較した、対象からの前記血清試料中のOvr110のレベルの増大が、対象におけるOvr110過剰発現を示す、前記方法。 - 対象が、癌を有する、請求項65に記載の方法。
- 対象が、乳癌または卵巣癌を有する、請求項66に記載の方法。
- 卵巣癌が卵巣漿液性腺癌であり、乳癌が乳房浸潤性乳管癌または転移癌である、請求項67に記載の方法。
- 対照が、Ovr110を過剰発現する癌を有さない対象からの血清試料である、請求項65に記載の方法。
- 請求項3に記載の抗体により結合されたエピトープに結合する抗体のスクリーニング方法であって、
(a)Ovr110含有試料を、試験抗体および請求項3に記載の抗体と混ぜ合わせて、混合物を形成すること、
(b)前記混合物中のOvr110に結合したOvr110抗体のレベルを決定すること、および
(c)ステップ(a)の混合物中で結合したOvr110抗体のレベルを、対照混合物と比較すること、
を含み、ここで、対照と比較した、前記混合物中のOvr110に結合するOvr110抗体のレベルが、請求項3に記載の抗Ovr110抗体により結合されたエピトープへの試験抗体の結合の指標である、前記スクリーニング方法。 - Ovr110に結合するOvr110抗体のレベルを、ELISAにより決定する、請求項70に記載のスクリーニング方法。
- 対照が、Ovr110、請求項3に記載のOvr110抗体および、請求項3に記載のOvr110抗体により結合されるエピトープに結合することが知られている抗体の混合物である、請求項70に記載のスクリーニング方法。
- 抗Ovr110抗体が標識されている、請求項70に記載のスクリーニング方法。
- Ovr110が固体支持体に結合された、請求項73に記載のスクリーニング方法。
- 固体支持体がセファロースビーズである、請求項74に記載のスクリーニング方法。
- 負のシグナリング免疫細胞Ovr110受容体のシグナリングを、Ovr110を請求項6に記載の抗体に結合させることにより調節し、これにより、抑制された免疫機能を、低減させる方法。
- 哺乳類におけるOvr110発現自己免疫疾患を寛解させる方法であって、請求項6に記載の抗体の治療的有効量を、該哺乳類に投与することを含む、前記方法。
- 自己免疫疾患が、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫性神経障害例えばギランバレー、自己免疫性ブドウ膜炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫性血小板減少症、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎例えばヴェーゲナー肉芽腫症、ベーチェット病、乾癬、疱疹状皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、I型もしくは免疫介在性糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、副腎の自己免疫疾患、関節リューマチ、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症例えば強直性脊椎炎、およびシェーグレン症候群からなる群から選択される、請求項77に記載の方法。
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