JP2008519588A - チューブリン変異診断 - Google Patents
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Abstract
本発明は、βチューブリン遺伝子またはタンパク質中の1個以上のヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体の存在を決定することによる、特定の治療薬剤に対する対象の応答能を決定する方法に関する。また、治療薬剤に対する応答能を評価した対象を処置する方法を提供する。本発明の方法に使用するための、βチューブリン遺伝子の変異体、βチューブリンタンパク質の変異体、変異βチューブリン核酸分子および変異βチューブリンタンパク質のそれぞれに結合する核酸分子および薬剤、ならびにこれを含むキットを提供する。
Description
発明の分野
本発明は、βチューブリン遺伝子またはタンパク質中の1種以上のヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体の存在を決定することによる、特定の治療薬剤に対する対象の応答能を決定する方法に関する。また、治療薬剤に対する応答能を評価した対象を処置する方法を提供する。本発明の方法に使用するための、βチューブリン遺伝子の変異体、βチューブリンタンパク質の変異体、変異βチューブリン核酸および変異βチューブリンタンパク質のそれぞれに結合する核酸分子および薬剤、ならびにこれを含むキットを提供する。
本発明は、βチューブリン遺伝子またはタンパク質中の1種以上のヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体の存在を決定することによる、特定の治療薬剤に対する対象の応答能を決定する方法に関する。また、治療薬剤に対する応答能を評価した対象を処置する方法を提供する。本発明の方法に使用するための、βチューブリン遺伝子の変異体、βチューブリンタンパク質の変異体、変異βチューブリン核酸および変異βチューブリンタンパク質のそれぞれに結合する核酸分子および薬剤、ならびにこれを含むキットを提供する。
発明の背景
βチューブリンは関連するタンパク質であるαチューブリンと2量体化して、微小管に重合するヘテロダイマーを形成する。細胞運動、細胞内輸送および細胞構造の維持の役割を果たすため、微小管は動性の構造であり、細胞が要求する通りに縮小または増大することができる。この動性はαチューブリンとβチューブリンのヘテロダイマーの重合および脱重合の進行によって達成される。伸長が必要なときは、ヘテロダイマーが微小管に取り込まれ、短縮が必要なときはヘテロダイマーが細胞質に放出される。
βチューブリンは関連するタンパク質であるαチューブリンと2量体化して、微小管に重合するヘテロダイマーを形成する。細胞運動、細胞内輸送および細胞構造の維持の役割を果たすため、微小管は動性の構造であり、細胞が要求する通りに縮小または増大することができる。この動性はαチューブリンとβチューブリンのヘテロダイマーの重合および脱重合の進行によって達成される。伸長が必要なときは、ヘテロダイマーが微小管に取り込まれ、短縮が必要なときはヘテロダイマーが細胞質に放出される。
微小管の最も重要な役割の1つは細胞分裂であり、有糸分列における染色体の移動を媒介する紡錘体を形成する。
様々なタンパク質が微小管に関連し、微小管関連タンパク質、あるいはMAPと呼ばれる。これらのタンパク質は微小管に結合し、それらの細胞内での安定性および運動性の両方に影響を及ぼす。例えば、MAP2およびMAP4は重合微小管を安定化するが、スタンチン(stanthim)を含む他のものは脱重合を誘導する。
αおよびβチューブリンは複数の遺伝子ファミリーによってコード化された関連タンパク質である。今日まで、6個のβチューブリンのアイソタイプが同定されており、これは高度に保存されている。ヒトアイソタイプM40はがん細胞を含む全ての細胞で普遍的に発現しており、最も一般的なアイソフォームである。様々なアイソタイプに加えて、βチューブリンの偽遺伝子も発見されている。
有糸分列の紡錘体形成における重要な役割の結果、チューブリンは有糸分列、したがって細胞分裂を妨げる薬剤にとって重要な標的であると長い間認識されていた。これらの薬剤は、しばしば抗分裂剤と呼ばれ、細胞分裂の阻害が必要な状態、例えばがんの処置に重要である。
抗分裂剤の4つの大きなファミリーが同定され、がんの処置での使用が提案されている。これらは、パクリタキセル(Taxol(商標))およびドセタキセルを含む、イチイに由来するタキサン類;ツルニチニチソウに由来するビンカアルカロイド類;土壌のバクテリアに由来するエポチロン類;そしてドラスタチン類である。タキサン類およびエポチロン類は、いずれも微小管を安定化し、脱重合を阻害する。他方、ビンカアルカロイド類およびドラスタチン類は、脱重合を促進し、そして微小管の安定性を減少させる。証拠はこれらの薬剤がその効果をチューブリンとの結合によって媒介していることを示し、したがって、チューブリンの機能的結合部位の維持がそれらの抗分裂効果に重要であると思われる(Nishio et al, Anti-Cancer Drug Design (1999) 14 133-141)。
がんのような状態の処置についてのそれらの能力にもかかわらず、抗分裂剤への抵抗性の増加が観察される。これは、細胞内の薬剤の蓄積が不十分であること、チューブリンとの結合の変化、薬剤の代謝の増大、およびMAPの変化を含む、様々な原因によると考えられる。抗分裂剤に対するこの抵抗性の性質を調べるため、抵抗性細胞株を確立し、調査用ツールとして使用した。かかる細胞株のいくつかにおいて、βチューブリンの遺伝子およびタンパク質の変異を含むチューブリンの変化が観察された。今日まで同定されてきた変異を再調査すると、Berriemanら(The Lancet, Vol 5 March 2004)が、タンパク質配列を変化させる遺伝子変異体のみが抗分裂剤に対する応答性に何らかの影響を有すると予期され得ると結論していた。かかる遺伝子変異は個人に固有であり得、またはおそらく処置中のがんの部位で表れるかもしれない。
ヌクレオチド多型は、平均して、ゲノムを通じて1キロベース毎に1個発生し、そして腫瘍群の遺伝的多様性の多くの原因を占める。かかる遺伝的多様性は遺伝子発現に影響を与え、したがって疾患の感受性または発症に関与すると考えられていたが、本発明において、この遺伝的多様性は特定の処置に対する個体の応答性をも決定する役割を有し得ることが見出された。
ゲノムの多型は、制限断片長変異多型、縦列反復、超可変領域、ミニサテライト、2−または複数ヌクレオチド反復、挿入因子、および1塩基変異多型を示し得る。後者はSNPといい、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって、遺伝子変異が起こる単独の位置である。SNP部位での異なる変異体はアレルといい、最初に同定されたアレルが標準アレルまたは野生型アレルと呼ばれる。SNP部位でのヌクレオチド代替物の数に依存して、2−または3―アレル性であり得る。例えば、野生型アレルが「T」残基であり、他のアレルが「C」、「G」または「A」を当該部位で含み得る。1塩基変異多型はアミノ酸配列に対応する変化をもたらし得る。例えば、ヌクレオチド残基の置換はコドンを変化させ、アミノ酸の変化をもたらすことがある。同様に、核酸配列中の3個の連続する塩基の欠失または挿入は、1個のアミノ酸残基の挿入または欠失をもたらし得る。
したがって、遺伝子のタンパク質コード配列中で起こるSNPは、タンパク質の構造または機能に影響することがある。影響は、環境に依存して、中立、有利または不利であり得る。遺伝子の非コーディング5’または3’非翻訳領域で起こるSNPはタンパク質配列には影響しないだろうが、RNA転写、プロセッシングおよび/または翻訳に影響することによって表現型の効果に影響し得る。多型は1個以上の表現型形質に影響することもあり、または特定の表現型に関連することもある。
がんのような状態は高度に侵襲性であり得て、生存の機会を最大にするため、しばしば素早くそして効果的に処置する必要がある。多くの抗がん治療は、本質的に、好ましくない副作用が厳しい。さらに、それらは高価であり、病院に経済的負担を強いる。これらの理由のため、対象が最も応答するであろう治療薬剤を、好ましくは処置の開始前に同定することが益々望まれる。
薬剤標的の分子変化を、例えば遺伝子配列および特徴的な多型によって理解することで、どのように対象間で薬剤の効果が変化するのかをよりよく理解できるだろう。究極的には、かかる変化の基礎を理解することによって薬剤を対象により適合させることができ、したがって処置を改善し、医療の費用対効果を増加させることができる。
本発明は、βチューブリン遺伝子およびタンパク質で新たに同定された多型を使用すること、および治療薬剤に抵抗性または過敏性であるかもしれない対象を同定するための試験を提供することが目的である。このように、本発明は、当該技術分野の欠陥を克服し、個人の必要に応じた処置プログラムを可能とすることを目的とする。
発明の説明
したがって、本発明の第1の局面において、治療薬剤に対する対象の応答能を決定する方法であって、対象の図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、270、274、276、293および364位の1個以上でのアミノ酸変異体の存在を決定することを含む方法を提供する。変異体の存在または不存在が当該治療薬剤に対する抵抗性または過敏性の指標である。
したがって、本発明の第1の局面において、治療薬剤に対する対象の応答能を決定する方法であって、対象の図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、270、274、276、293および364位の1個以上でのアミノ酸変異体の存在を決定することを含む方法を提供する。変異体の存在または不存在が当該治療薬剤に対する抵抗性または過敏性の指標である。
アミノ酸変異体の存在を、タンパク質のアミノ酸配列またはタンパク質をコードする核酸配列の試験によって決定することができる。したがって、本発明の第2の局面において、図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、270、274、276、293および/または364位でのアミノ酸変異を引き起こすβチューブリンをコードする核酸配列における、ヌクレオチド変異体の存在を決定することを含む、治療薬剤に対する対象の応答能を決定する方法を提供する。好ましくは、前記方法は図2に示すβチューブリンをコード化する核酸配列の787、803、808、821、827、878および/または1091位の1個以上でのヌクレオチド変異体の存在を決定することを含む。
第3の局面において、本発明は対象の疾患を処置する方法であって、
(a)図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、270、274、276、293および/または364位の1個以上でのアミノ酸変異の存在を、または上記位置の1個以上でのアミノ酸変異を引き起こすβチューブリンをコードする核酸配列におけるヌクレオチド変異体の存在を決定することで、治療薬剤に対する対象の応答能を決定すること、ここで、ヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体の存在が当該治療薬剤に対する抵抗性または過敏性の指標である;および
(b)対象が抵抗性ではない治療薬剤を投与すること
を含んでなる方法を提供する。
(a)図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、270、274、276、293および/または364位の1個以上でのアミノ酸変異の存在を、または上記位置の1個以上でのアミノ酸変異を引き起こすβチューブリンをコードする核酸配列におけるヌクレオチド変異体の存在を決定することで、治療薬剤に対する対象の応答能を決定すること、ここで、ヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体の存在が当該治療薬剤に対する抵抗性または過敏性の指標である;および
(b)対象が抵抗性ではない治療薬剤を投与すること
を含んでなる方法を提供する。
本発明の第4の局面において、図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、276および/または293位で変異を引き起こすか、あるいは図2に示す核酸配列の787、803、827および/または878位に対応する位置に存在するヌクレオチド変異体を有する、βチューブリンをコード化する核酸配列またはそれに相補的な核酸配列を含む、単離核酸分子または組み換え核酸分子;およびそのフラグメントを提供する。
第5の局面において、図2に示すβチューブリンをコード化する核酸配列またはその相補鎖とハイブリダイズすることができる核酸配列を提供する。これらの核酸配列は、好ましくは、変異部位を増幅するため、図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、276および/または293位での変異を引き起こすヌクレオチド変異体と、または当該変異体と隣接する領域とハイブリダイズすることができる。
第6の局面において、263、268、276および/または293位でのアミノ酸置換を有する、図1に示す単離βチューブリンタンパク質を提供する。
第7の局面において、図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、276および/または293位での変異体に特異的なタンパク質結合薬剤を提供する。
本発明の第8の局面において、適当な治療薬剤をスクリーニングする方法であって、
a)図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、270、274、276、293および364位の1個以上でのアミノ酸変異体;またはβチューブリンをコード化し、1個以上のアミノ酸変異を引き起こす変異体を有する核酸配列を含む、細胞を得ること;そして
b)当該細胞を治療薬剤に曝露すること;そして
c)治療薬剤への曝露による細胞のβチューブリンの重合および/または脱重合を観察すること;
ここで、適当な治療薬剤は細胞のβチューブリンの重合および/または脱重合に影響することができるものである、
を含んでなる方法を提供する。
a)図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、270、274、276、293および364位の1個以上でのアミノ酸変異体;またはβチューブリンをコード化し、1個以上のアミノ酸変異を引き起こす変異体を有する核酸配列を含む、細胞を得ること;そして
b)当該細胞を治療薬剤に曝露すること;そして
c)治療薬剤への曝露による細胞のβチューブリンの重合および/または脱重合を観察すること;
ここで、適当な治療薬剤は細胞のβチューブリンの重合および/または脱重合に影響することができるものである、
を含んでなる方法を提供する。
最後に、本発明は、本明細書に記載の核酸配列および/またはタンパク質結合薬剤を含む、本明細書に記載のβチューブリンのヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体の存在を検出するための、ヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体と特定の治療薬剤に対する対象の応答能の関係を示す標準チャートが付随した、本発明の方法に使用するためのキットを提供する。
図面の説明
本発明は、図面を参照しながら、以下に詳細に記載する:
図1はヒトM40βチューブリンcDNAのcDNA配列のインフレーム翻訳を示す。タンパク質は最初の開始メチオニン残基から最初の停止残基まで伸長する。変異体アミノ酸は太字で示し、全ての可能性のある開始メチオニン残基および停止位置をイタリック体で示す。
本発明は、図面を参照しながら、以下に詳細に記載する:
図1はヒトM40βチューブリンcDNAのcDNA配列のインフレーム翻訳を示す。タンパク質は最初の開始メチオニン残基から最初の停止残基まで伸長する。変異体アミノ酸は太字で示し、全ての可能性のある開始メチオニン残基および停止位置をイタリック体で示す。
図2はβチューブリン遺伝子のcDNA転写を示し、ここで、好適なプライマーはイタリック体の配列と結合し、変異体ヌクレオチド部位は太字で示す。
図3および3aはMH40βチューブリン遺伝子の単位複製配列を、プライマーと結合する配列をイタリック体で示し、エキソンには下線を付し、そしてイントロンは通常の字体で示す。
図4はAC006165のフラグメントに関する変異体の位置を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、チューブリンを介して作用を媒介するような治療薬剤に応答する能力に影響すると考えられるヒトM40βチューブリン遺伝子の多型の同定に基づく。HM40ヒトβチューブリン遺伝子のゲノム配列は同定されており、ジェンバンク受託番号AC006165で得られる。このクロモソーム6の44,118塩基対配列は、444アミノ酸、約49kDaの重量のタンパク質をコード化する4つのエキソンを含む。βチューブリンのcDNAまたはmRNA転写において、4つのエキソンはヌクレオチド1〜57、58〜166、167〜277、そして278〜1335に掛かる。
本発明は、チューブリンを介して作用を媒介するような治療薬剤に応答する能力に影響すると考えられるヒトM40βチューブリン遺伝子の多型の同定に基づく。HM40ヒトβチューブリン遺伝子のゲノム配列は同定されており、ジェンバンク受託番号AC006165で得られる。このクロモソーム6の44,118塩基対配列は、444アミノ酸、約49kDaの重量のタンパク質をコード化する4つのエキソンを含む。βチューブリンのcDNAまたはmRNA転写において、4つのエキソンはヌクレオチド1〜57、58〜166、167〜277、そして278〜1335に掛かる。
βチューブリンタンパク質は図2のcDNA配列によってコード化され、ユニプロット受託番号05218の配列に対応する。
本発明の変異体ヌクレオチドおよびアミノ酸は、それぞれ図1および/または2における位置指標(positional reference)を割り当てられている。ヌクレオチド変異体は図2に示すcDNA配列の787、803、808、820、821、827、878および1091位に位置する。これらの多型は787C>A、803T>A、808T>G、821C>T、820A>C、827G>A、878T>Aおよび1091G>Aのヌクレオチド変化をそれぞれもたらし、同意ではなく、図1のβチューブリンタンパク質において263L>I、268P>H、270F>V、274T>I、274T>P、276R>H、293V>D、および364A>Tの対応するアミノ酸の変化をもたらす。
βチューブリン遺伝子をAC006165で得られる配列と逆方向に転写する。したがって、説明を簡単にするため、本発明のヌクレオチド変異体を、cDNA配列について説明する。ゲノム配列のヌクレオチド変異体の対応する位置は、配列比較方法、例えばBLAST分析を使用して、容易に確認することが出来る。この後者の方法は、AC006165の配列を逆転した、逆配列の35273、35257、35252、35239、35233、35182および34970位に対応するcDNA配列の787、803、808、820、821、827、878および1091位でのヌクレオチド変異体を明らかにした。
抗分裂剤に対する抵抗性または過敏性は、薬剤のβチューブリンへの結合の変化によって起こると考えられる。配列の変化が薬剤の結合部位の変化を引き起こすことはよくある。図1の270および274位のアミノ酸変異体は、βチューブリンのエポチロン類および/またはタキサン類結合部位にある。これらの変異は、これらのクラスの抗分裂剤への抵抗性を付与すると考えられる(Wartmann et al; Curr. Med. Chem - Anti Cancer Agents (2002) 2 123-148)。
特定の治療薬剤に対する対象の応答能は、治療薬剤に対する対象の抵抗性または過敏性の指標である。したがって、本明細書に記載のβチューブリン遺伝子またはタンパク質の1個以上の変異体について対象をスクリーニングすることによって、特定の治療薬剤に対して抵抗性または過敏性であるかを予測することができる、すなわち、対象の応答能を評価することができる。本発明はβチューブリン安定化薬剤に対する抵抗性を付与し、また、βチューブリン脱安定化薬剤に対して過敏性を付与する、あるいはその逆の、βチューブリン遺伝子の変異体を見出した。したがって、本明細書に記載の変異体を分析することによって、異なるクラスの薬剤に対する抵抗性および過敏性の両方の観点から、処置に対する対象の応答能を決定することができる。
治療薬剤に対する応答能は、一部では、先天的な性質であるため、対象の、とりわけ疾患状態にある細胞、例えば疾患ががんであるとき腫瘍細胞の、遺伝子プロファイルに一般的に依存すると現在考えられている。対象の遺伝子プロファイルを決定することによって、先天的に治療薬剤に応答することができるかの指標を得ることができる。したがって、遺伝子プロファイルによると治療薬剤に対して応答することができると考えられる対象であるが、臨床的に応答が得られないときに、応答性に影響する他の要素を分析することができる。これは、多くの疾患、例えばがんの処置に含まれる多くの試行錯誤を効果的に減少させるだろう。
対象の治療薬剤に対する予期される臨床的応答を、状態の改善、有害な症状を減少させ、および/または疾患の進行を遅らせるという意味で決定することができる。例えば疾患ががんであるとき、臨床的応答は腫瘍サイズ、悪性腫瘍、または他の非腫瘍関連症状の減少を含む。
任意の具体的な治療薬剤に対する抵抗性および/または過敏性の程度は遺伝子プロファイルに依存して異なり得る。したがって、本明細書に記載のβチューブリン遺伝子またはタンパク質の変異体の分析は、対象が特定の治療薬剤に対して応答能を有するかだけでなく、予期され得る応答の程度をも示すために使用することができる。
抵抗性なる用語において、これが完全であるとき、対象は、特定の処置する疾患に対して、あらゆる能力において治療薬剤に応答することができないと見なされる。しかし、この文脈において、部分的抵抗性は、対象が、全く抵抗性でないときよりも低い程度ではあるが、治療薬剤に応答し得ることを意味する。同様に、この文脈において、過敏症は、対象が遺伝的に過敏性ではないと予期される場合と比較して、治療薬剤に対してポジティブな臨床的応答の上昇である。
遺伝子プロファイルによって決定される対象の抵抗性または過敏性のレベルは、どの薬剤が有効であるか、そしてどの程度の用量を投与するべきかの決定を補助する。抵抗性または過敏性の程度、したがって治療薬剤の用量を評価するため、対象の遺伝子プロファイルを「標準」と比較することが望まれ得る。かかる標準は、多くの対象および特定の遺伝子プロファイルの抵抗性または過敏性の程度を平均化することによって作成することができる。
処置の開始前に、対象の特定の治療薬剤に対する応答能を決定して、対象の遺伝子プロファイルに基づき適当な治療薬剤を選択することが、一般的に好ましい。したがって、当該方法は任意の好適な時点、好ましくは疾患の診断後、そして好ましくは処置の開始前に行い得る。
しかし、対象の応答性が処置の間に変化することが観察されるため、必要に応じて処置を変更することができるように処置プログラムの間これを観察することが望まれ得る。これは、できるだけ対象が応答可能な処置のみを投与することを保証する。この方法での観察は、任意の時点で、あるいは好ましくは対象が抵抗性の徴候を示し始めたとき、または処置プログラムの間の特定の間隔、例えば1日、1週間、または1ヶ月に1回、行うことができる。
本発明は、好ましくは対象から採取した好適な試料で行う。好適な試料は、核酸またはタンパク質を含むものである。好ましくは、それは外科的処置の必要なく、患者から容易に採取できるか、または予め、例えば生検で患者から採取した保存組織である。好ましい試料には、全血、精液、尿、便、唾液、皮膚、毛髪、涙、または頬側細胞が含まれる。cDNA、mRNAまたはタンパク質を分析することが望まれるとき、試料は、好ましくはβチューブリン遺伝子が発現しているもの、例えばまたは、βチューブリンタンパク質もしくは遺伝子産物を含むものである。試料から核酸またはタンパク質を当業者に利用可能な方法で抽出することができる。
本発明において、上記βチューブリンcDNAまたはタンパク質の変異体の位置、およびその使用が新規かつ臨界的特徴であることは明らかである。標準の図1および2の配列は、変異体がβチューブリンにあることを確認するために指標でしかない。本発明で試験された核酸またはタンパク質配列が図1または2のものと同一である必要がないと予測される。したがって、本明細書の標準のβチューブリン遺伝子には、図2のものと配列が異なり得るゲノム、cDNAまたはRNA配列、例えばβチューブリンのアイソタイプ、例えばBerriemanら(上記)に記載のものが含まれる。標準のβチューブリンタンパク質には、図1のものとは異なり得るタンパク質配列を含む。試験される配列が図1または2のものと同一ではないとき、変異が予期される位置は、図1または2のもの、または他の利用可能なクローンと、当業者に利用可能な方法、例えばDNASIS、Word SearchまたはFASTAのようなコンピュータープログラムを使用して、配列を比較することによって容易に決定することができる。ヌクレオチド変異体とAC006165のゲノム配列のアラインメントは、図4の配列でのBLAST分析を使用して行うことができる。
本発明において、「変異体」は、任意の特定の位置での、図1および2に記載の標準配列の残基とはそれぞれ異なるヌクレオチドまたはアミノ酸残基である。変異体はヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失、置換または挿入であってもよく、また、多型または変異を意味し得る。図2またはAC006165の配列のDNA相補鎖で起こるヌクレオチド変異体とは、特定の位置での変異体はそれが対となっている野生型残基と相補的ではない残基である。図2に示すDNAストランドの特定の位置の残基が変異体であるとき、逆ストランドと対である残基は、それが野生型残基か変異体であるかに依存して、相補的であり得るかまたはそうでない。簡単に説明すると、変異体が遺伝子配列の挿入または欠失であるとき、図2の番号付けは維持される。
βチューブリン遺伝子またはタンパク質の「変異体の存在を決定すること」とは、どの特異的アミノ酸またはヌクレオチド残基がその部位に存在するかを決定するため、特定の位置での遺伝子またはタンパク質の配列を確認することを意味する。βチューブリンの1個以上のアミノ酸またはヌクレオチド変異体の存在を決定するための、あらゆる好適な方法を使用することができる。
本発明の方法は、βチューブリン遺伝子、遺伝子産物またはタンパク質の全長について行う必要はなく、簡便さのために、1個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸変異体を含むそのフラグメントについて行うことができる。フラグメントは、当該フラグメントがβチューブリンフラグメントであると確認できる、および/またはその中に1個以上の変異体が存在することを決定できる程度の長さであれば、いかなるサイズでもよい。フラグメントがチューブリンであるか、またはそれが由来する遺伝子のどの部分であるかを決定するため、フラグメントを図1もしくは2の配列またはAC006165のゲノム配列と整列させて、例えばDNASIS(Hitachi Engineering Inc)、Word SearchまたはFASTA(Genetic Computer Group, Madison W1)のようなコンピュータープログラムで比較することができる。このようにして、図1または2の配列の変異体に使用する位置指標を、これらの配列のフラグメントを参照するときに維持することができる。好ましいフラグメントは少なくとも1個の遺伝子のエキソンを含み、図3に示される。好適なフラグメントは、好ましくは10〜400ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも10、50、80、100、200、300または350ヌクレオチド長である。好ましくは、フラグメントは少なくとも1個の本明細書に記載の変異体またはβチューブリンを含むかまたはコード化する。
ヌクレオチド変異体を決定するとき、最初に核酸試料を増幅することが一般的に好ましく、これはあらゆる利用可能な技術、例えばPCRまたはPCR利用技術、リガーゼ媒介反応、転写増幅、自己維持配列複製および核酸利用配列増幅を使用して行うことができる。後者2つの方法は、等温転写に基づく等温反応を含む。好ましくは、βチューブリン遺伝子のサイズのため、遺伝子のフラグメントを増幅し、変異体をスクリーニングする。好適な増幅する遺伝子のフラグメントを、螺旋度の%、塩濃度、単位複製配列の長さ、GC残基の%、および移動相の濃度のような分析条件を含む基準に基づいて選択する。遺伝子の任意の好適な位置を、1個以上の変異体配列を含む単位複製配列を増幅することができる。好ましくは、単位複製配列は、1個以上のエキソン配列またはその一部を含む。単位複製配列の例を、図3および3aに示す。βチューブリン遺伝子の一部の増幅のための好適なプライマーの製造は、当業者の能力の範囲内である。βチューブリン遺伝子を増幅するとき、偽遺伝子の同時増幅を避ける方法で行うことが好ましい。好適な方法は、当業者に既知である。好適な方法には、βチューブリン遺伝子のイントロン、好ましくは第3〜第4エキソン間のイントロンにある1個の増幅プライマーを設置することを含む。任意の好適なイントロンベースのプライマーを使用することができ、そして本明細書に記載のプライマー設計基準または当業者に利用可能な方法論を使用して、当業者が設計することができる。好ましいイントロンベースのβチューブリン偽遺伝子の増幅予防プライマーには、実施例に記載のものが含まれる。
本発明の1個以上のヌクレオチド変異体の存在を決定するための好適な方法には、限定されないが、PCR産物のシークエンシング、直接プロービング直接クローニングおよびシークエンシング、アレル特異的ハイブリダイゼーション、変異アレル特異的増幅(MASA)、RFLP、ポリメラーゼ媒介性プライマー伸長、1塩基伸長、または回転サイクル増幅後アレル特異的ライゲーションが含まれる。
好ましい変異体の存在を決定するための方法は、MASAである。したがって、本発明の好ましい態様において、特定の治療薬剤に対する対象の応答能を予測する方法には、変異体アレルに特異的な対のプライマーでβチューブリン遺伝子を増幅すること、および/または標準アレルの野生型と同じ位置で特異的な第2の対のプライマーでβチューブリン遺伝子を増幅することを含む。変異体アレルに特異的なプライマーを使用して増幅が起こったとき、変異体が存在する。逆に、野生型アレルに特異的なプライマーを使用して増幅が起こったとき、その位置には野生型アレルが存在する。両方の反応での増幅は、その位置のヘテロ接合型の遺伝子型を示す。
本発明のMASAに使用する好ましいプライマーは、コンピュータープログラムおよび当業者に利用可能な方法論を使用して設計することができる。好ましいプライマーは実施例に詳述している。
好ましい態様において、野生型アレルの増幅は、野生型アレルに特異的であるが、増幅を媒介することができない第3のプライマーを使用することで予防または阻止することができる。このプライマーは、好ましくは、変異体アレル特異的プライマーと配列が同じであるが、野生型アレルに特異的であり、さらにプライマー伸長を媒介することができない。例えば、この第3のプライマーはその3’末端で阻止することができ、したがってプライマー伸長および増幅を媒介することができない。好適なプライマーは、遺伝子配列および野生型アレルを考慮に入れて、当業者によって容易に設計される。
アミノ酸変異体を決定するとき、好ましくはタンパク質結合薬剤の変異体アミノ酸への結合を検出することによって行う。好適な結合薬剤には、アプタマーおよび抗体が含まれる。好ましくは、変異体アミノ酸への結合の検出を補助するために、結合薬剤を標識化し、あるいは本明細書に記載の通りに検出することができる第2の抗体、酵素または分子とカップリングする。
本発明の好ましい態様において、βチューブリン遺伝子またはタンパク質は、変異体を決定する前に、いずれかの変異体が存在するかどうかを確立するためにスクリーニングすることができる。このスクリーニング工程は、とりわけいずれの変異体配列も発見されず、したがってどの変異体が存在するかを決定するためにさらに試験をする必要がなく、速やかに処置を開始することができる対象について、薬剤および処置方法の選択を早めるために使用する。好適なスクリーニング方法には、ヘテロ2量体分析に依存するものが含まれる。好ましい方法には、例えばE. coli mutSもしくはリボプローブ、ゲル電気泳動、変性高速液体クロマトグラフィー(DHPLC)および1本鎖コンホメーション多型分析(SSCP)を使用した、ミスマッチ検出が含まれる。本発明の最も好ましい態様において、DHPLCを、βチューブリン遺伝子またはタンパク質のいずれかの変異体の存在を決定するために使用する。したがって、本発明の方法は、好ましくはさらなる工程を含む:
(a)試験する核酸試料のストランドを分離する工程;
(b)図2の787、803、808、820、821、878および/または1091位の1個以上で変異体ヌクレオチドを含まないことが知られているストランドと2本鎖を形成させる工程;そして
(c)2本鎖の融解プロファイル(melting profile)を作成する工程、ここで前記プロファイルは試験ストランド中に1個以上の変異体が存在することを示す。
(a)試験する核酸試料のストランドを分離する工程;
(b)図2の787、803、808、820、821、878および/または1091位の1個以上で変異体ヌクレオチドを含まないことが知られているストランドと2本鎖を形成させる工程;そして
(c)2本鎖の融解プロファイル(melting profile)を作成する工程、ここで前記プロファイルは試験ストランド中に1個以上の変異体が存在することを示す。
好ましくは、DHPLCをWAVE(登録商標)System(Transgenomic)またはHelix System(Varian)を使用して行う。
本発明のアミノ酸またはヌクレオチド変異体の1個以上の存在を、上記βチューブリンヌクレオチド変異体の1個以上と連鎖不平衡な他の変異体の存在を決定することによって、間接的に決定することができる。変異部位は、1個の変異体の存在が第2の変異体の存在の機会を増加させるとき、連鎖不平衡である。したがって、1個の変異体の存在を決定することによって、第2の変異体の存在を推測すること、そして実際に第2の変異体の存在を確認することなしにそれに基づいて進めることが可能である。本発明のヌクレオチド変異体の1個以上と連鎖不平衡であり得る変異体が、既知であり、そして他の遺伝子またはβチューブリンと関係ない他のゲノムの一部に位置し得ることは明らかである。
本発明は、βチューブリンを標的とするか、またはβチューブリンを介してその作用を媒介する治療薬剤に対象が応答することができるかどうかを評価するのに好適である。かかる治療薬剤には、チューブリンを安定化するもの、例えばタキサン類、エポチロン類(epothilane)、ディスコデルモリド類、およびチューブリンを脱安定化するもの、例えばコルヒチン類および他のコルヒチン部位結合剤、ビンカアルカロイド類等が含まれる。抗分裂剤には、エポチロン類、ビンカアルカロイド類、およびドラスタチン類が含まれる。
対象の遺伝子プロファイルを一度確認すると、適当な治療薬剤を選択し、用量を確立することができる。したがって、遺伝子プロファイルが、対象が特定の薬剤に完全に抵抗性であることを示すとき、これは候補薬剤から削除することができる。対象が抵抗性を示さないか、または過敏性であり得る他の薬物をその代わりに選択することができる。遺伝子プロファイルが、対象が薬物に部分的に抵抗性であるかまたは過敏性であることを示すとき、これは投与する薬剤の用量に影響し得る。例えば、用量を増加または減少、あるいは投与の頻度を変更することができる。
したがって、本発明はまた、好ましくは本明細書に記載の通りに治療薬剤に対する応答能を一度決定した対象を処置する方法を提供する。したがって、一度遺伝子プロファイルを作成すると、この方法は、好ましくは患者が完全に抵抗性ではないか、または過敏性である治療薬剤を投与することを含む。
したがって、本発明は、治療薬剤に完全に抵抗性ではない対象の疾患の処置に使用するために当該治療薬剤を提供する。
あるいは、本発明は、薬剤に完全に抵抗性ではない対象の疾患の処置用医薬の製造における、治療薬剤の使用を提供する。
本発明は、βチューブリンまたは微小管が関係するプロセスの脱制御、またはβチューブリンを標的とすることによって処置される疾患の、応答能を評価するか、あるいは当該疾患を処置するのに好適であり得る。かかる疾患には、がん、例えば乳がん、卵巣がん、肺がん、膵臓がん、腎臓がん、肝臓がん、子宮がん、胃がん、腸がん、食道がん、血液のがん、膀胱がん、骨のがん、頸がん、皮膚がんおよび他のいずれかの臓器のがんが含まれる。好ましくは、この方法は非卵巣がん、例えば乳がんに使用される。
本発明はまた、βチューブリンをコード化する核酸配列、またはそれと相補的な核酸配列を含み、図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、270、274、276、293および/または364位で、または図2の787、803、808、820、821、827、878および/または1091位に対応する位置で変異を引き起こすヌクレオチド変異体を含む、単離核酸分子または組み換え核酸分子;およびそのフラグメントを提供する。
核酸はDNA、RNAまたはPNAであり得る。
核酸分子は図2に示すAC006165の全βチューブリン遺伝子もしくは転写産物、またはそのフラグメントを含んでいてもよい。フラグメントは好ましくは、少なくとも1個の変異体を上記位置の1個で含む。好ましいフラグメントは、10〜400ヌクレオチド長、好ましくは20、50、80、100、200、300、または350ヌクレオチドである。
核酸分子はインビボまたはインビトロでの発現を可能とするため、ベクター中で提供することもできる。好適なベクターは当業者に既知であり、pBluescript II、Lambda Zap、およびpCMV−Scriptを含む。核酸分子は、プロモーターまたはエンハンサーのような制御配列、および複製起点、1個以上の制限部位、マーカー、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、転写終結領域、重合部位および3’ポリアデニル化部位のような1個以上のクローニングまたは発現を促進する他の配列、および核酸分子または生成物、例えばGFPのようなタグの検出および精製を促進する配列を含む、1個以上のさらなる核酸配列と、作動可能なように結合していてもよい。
制御配列および他の配列の具体的な選択は、使用する発現系に大きく依存し、当該技術分野において利用可能なあらゆるものから選択されてよい。
また、βチューブリン遺伝子と、および好ましくは本発明の変異体ヌクレオチドのアレルとハイブリダイズする核酸配列を提供する。かかるアンチセンス配列はアレルを検出するプローブまたはプライマーとして、あるいは疾患の診断または処置に、有用である。
本発明の方法におけるプローブとして有用であるために、アンチセンスヌクレオチド配列はβチューブリン遺伝子の変異体核酸配列(nucleiticles)の異なるアレルを、当該技術分野において利用可能な方法を使用して、区別できなければならない。したがって、プローブは、好ましくは変異体部位を含む領域とハイブリダイズし、そしてプローブはその位置で変異体部位の正確な補体を含む。
1塩基ミスマッチを検出するための特異的なハイブリダイゼーションが可能なアンチセンス配列は、当業者に既知であるか、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor, NY、およびBerger et al., Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) Academic Press Inc. San Diego, CA;Gibbs et al., Nuc Acids Res., 17:2437(1989);Kwok et al., Nucl Acids Res 18:999;およびMiyada et al., Methods Enzymol. 154: 94 (1987)に記載の方法によって設計することができる。これらのアンチセンス配列の配列変動は本発明の目的のために許容されるが、変異体アレルを区別するアンチセンス配列の能力は損なわれない。プライマー配列についての変動は許容されるが、選択領域の増幅を媒介する能力は損なわれない。好ましくは、プライマー配列は下記定義のストリンジェンとな条件下で、βチューブリン遺伝子とハイブリダイズする。
本発明との関係において、「ストリンジェンとな条件」とは、ハイブリダイゼーションプロトコルにおいて使用される洗浄条件を意味する。一般的に、洗浄条件は、変性温度が研究下で計算された核酸のTmよりも約5〜20℃低いように、温度および塩濃度の組合せであるべきである。20塩基以下の核酸プローブのTmを、[4℃×(G+C)+2℃×(A+T)]として、標準的な条件(1M NaC1)下で、短オリゴヌクレオチドに関するWallace則によって計算する。長DNAフラグメントについては、固体熱力学および実験データのを組み合わせた最も近似の方法を、Breslauer et al., PNAS 83: 3746-3750 (1986)に記載の原理によって使用することができる。
ハイブリダイゼーションに最適な塩および温度条件を、フィルターに固定したDNA試料を目的のプローブにハイブリダイズし、ストリンジェントではない条件下で洗浄する、予備実験によって容易に決定することができる。PCR条件は標準的な条件とは異なり得るが、Tmは予想されるプライマーの相対的安定性についての指標として使用され得る。約14ヌクレオチドの短プライマーについては、約44℃〜50℃の低アニーリング温度を使用する。温度は使用するプライマー配列の塩基組成に依存して高くなり得る。
プローブは合成的に、またはニックトランスレーションと呼ばれる方法で製造することができる。βチューブリン遺伝子の領域と結合した後でプローブの可視化を可能とするため、好ましくはプローブを、例えば放射線標識、酵素、フッ素標識、およびビオチン−アビジン結合体を使用して標識化する。βチューブリン核酸と結合すると、プローブを標識の検出が可能な方法を使用して検出することができる。例えば、標識が放射線標識のとき、プローブをオートラジオグラフを使用して検出することができる。
例えば上記の、βチューブリン遺伝子の一部を増幅することが可能な好ましいプライマーを、当業者であれば容易に設計することができる。好ましくは、かかるプライマーはエキソン配列と隣接するかまたはエキソン配列中のイントロン領域と結合する。好適なゲノム配列の増幅部分のプライマーは、図3および/または3aの下線部の配列またはその相補鎖と、増幅が可能な条件下で結合するものである。エキソン4の全部または一部の増幅に好ましいゲノムプライマーは下記のものである:
表中のプライマー:
4afはgaaacatcatgtatcttccatacであり
4xはgaaacatcatgtatcttccataccであり
4crはtccattccacaaagtagctgであり
4cr inv/compはcagctactttgtggaatggaであり
4arはaggcataaagaaatggagacgであり
4ar inv/compはcgtctccatttctttatgcctであり
4dfはcatggaggaggtcgatgagであり
4b/4cfはgtcaccacctgcctccgttであり
4b/4drはcctgtatttctttctggtgcccであり
4b/dr inv/compはgggcaccagaaagaaatacaggである。
4afはgaaacatcatgtatcttccatacであり
4xはgaaacatcatgtatcttccataccであり
4crはtccattccacaaagtagctgであり
4cr inv/compはcagctactttgtggaatggaであり
4arはaggcataaagaaatggagacgであり
4ar inv/compはcgtctccatttctttatgcctであり
4dfはcatggaggaggtcgatgagであり
4b/4cfはgtcaccacctgcctccgttであり
4b/4drはcctgtatttctttctggtgcccであり
4b/dr inv/compはgggcaccagaaagaaatacaggである。
別のプライマーはSale et al., Molecular Cancer therapeutics 2002に記載のものである。
これらのプライマーの使用によって図3aに示す単位複製配列がもたらされる。
これらのプライマーの使用によって図3aに示す単位複製配列がもたらされる。
βチューブリン転写産物またはcDNAの増幅に好適なプライマーには、図2の下線部とハイブリダイズするもの、例えば下記のものが含まれる:
フォワード: CTTGCCCCATACATACCTTGAG
リバース : CCCAGACTGACCAAATACAAAG
フォワード: GACCTGCAGCTGGACCGC
リバース : TCAGGGTATTCTTCTCGGATCTT
フォワード: TGGTTGATTCTGTCCTGGATG
リバース : GTTGGTGTGGTCAGCCTCAGAG
フォワード: TACAATGCCACCCTCTCCGT
リバース : GCATCTGCTCATCGACCTCCT
フォワード: GGAAGCCAGCAGTATCGAGC
リバース : CTCACCGAAATCCTCCTCCTC
フォワード: CTGAGAGCAACATGAACGACC
リバース : GAGCGCCTACTATTGCCAG
フォワード: GACCTCCGCAAGTTGGCAGT
リバース : CAGGCAGCCATCATGTTCTTG
フォワード: CTTGCCCCATACATACCTTGAG
リバース : CCCAGACTGACCAAATACAAAG
フォワード: GACCTGCAGCTGGACCGC
リバース : TCAGGGTATTCTTCTCGGATCTT
フォワード: TGGTTGATTCTGTCCTGGATG
リバース : GTTGGTGTGGTCAGCCTCAGAG
フォワード: TACAATGCCACCCTCTCCGT
リバース : GCATCTGCTCATCGACCTCCT
フォワード: GGAAGCCAGCAGTATCGAGC
リバース : CTCACCGAAATCCTCCTCCTC
フォワード: CTGAGAGCAACATGAACGACC
リバース : GAGCGCCTACTATTGCCAG
フォワード: GACCTCCGCAAGTTGGCAGT
リバース : CAGGCAGCCATCATGTTCTTG
βチューブリン遺伝子を増幅するとき、偽遺伝子の同時増幅を減少させるかまたは好ましくは完全に回避するような方法で行うのが好ましい。好適な方法は当業者に既知である。好ましい方法には、βチューブリン遺伝子のイントロン、好ましくは第3エキソンと第4エキソンの間のエキソン中に1個の増幅プライマーを配置することが含まれる。あらゆる好適なイントロンベースのプライマーを使用することができ、そして本明細書に記載のプライマー設計基準または当該技術分野において利用可能な方法を使用して、当業者が設計することができる。
多くの場合、1体の対象に由来する試料の複数の変異体を分析することが、または逆に、多くの対象に由来する試料の1個以上の変異体の存在を決定することが、望まれ得る。この場合、プローブプライマーまたはβチューブリン核酸を共有的にまたは非共有的に支持体に固定し、核酸アレイに基づく分析を行うことが望まれ得る。配列は任意の好ましい形態であり得る。既知のアレイには、ウェル、スライド、チップ、シート、ビーズ、背におよび膜が含まれる。アレイの繊維は好ましくは固体、例えば紙、シリコン、プラスチック、およびガラスである。支持体への核酸の結合をあらゆる好適な方法によって媒介することができる。既知の方法には抗体−抗原相互作用、ストレプトアビジンまたはアビジン−ビオチン結合体、疎水性相互作用、UV架橋および化学結合が含まれる。
あるいは、本発明の方法は、図1に示すβチューブリンタンパク質の263、293および/または294位での変異体の存在を決定することができる。また、アミノ酸配列の変異体を決定するあらゆる好適な方法を使用することができ、これには質量分析(Verdiner-Pinard et al Biochemistry (2003) 42 5319 - 5357)が含まれる。好ましい方法には、異なるタンパク質配列と結合することができ、区別することができる、抗体または抗体フラグメント、もしくはアプタマーの使用が含まれる。
本発明に使用する好適な抗体は、アミノ酸配列に結合するものである。抗体には標準的な方法として記載されている方法(Harlow and Lane, “Antibodies; A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1998)によって製造することができる。精製した抗原を動物に、免疫応答を誘発するのに十分な量と間隔で注射することができる。抗体を直接精製することができ、あるいは脾臓細胞を動物から得ることができる。細胞を不死細胞系と融合し、抗体分泌についてスクリーニングする。抗体を、抗原を発現または分泌している細胞またはファージについてのDNAクローンライブラリーのスクリーニングに使用することができる。これらの陽性クローンを、例えば、Kellys et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)およびBebbington et al., Bio/Technology 10:169-175 (1992)に記載の通りにシークエンシングすることができる。抗体は、好ましくは本発明の変異体アミノ酸配列に特異的であり、そして好ましくは、抗体は標準βチューブリンタンパク質と上記位置での変異体を区別できる程度に十分に特異的である。好ましくは、特定の抗体を検出および/または製造するのに使用する抗原には、本明細書に記載のβチューブリンタンパク質またはタンパク質フラグメントが含まれる。
抗体、抗体フラグメントまたはアプタマーの結合を、免疫蛍光アッセイ、ELISAまたは免疫ブロットのような適当な方法を使用することによって検出することができる。好ましくは、1次抗体と結合する2次抗体またはリガンドを使用することができる。2次抗体またはリガンドを、例えば放射標識、蛍光または西洋わさびペルオキシダーゼのような好適な酵素で標識化する。
適当な治療薬剤を同定するスクリーニング法は、好ましくは細胞に対して行い得るが、あるいは適当なβチューブリン核酸および/またはタンパク質を含むインビトロ系で行うこともできる。細胞またはインビトロ系を、いずれかの好適な方法によって試験する治療薬剤に曝露する。適当な治療薬剤はチューブリンを安定化または脱安定化し、その結果βチューブリンの重合および/または脱重合に影響するものである。かかる重合および/または脱重合を、それと関係する適当な細胞マーカー、例えば細胞の増殖(細胞を使用するとき)を使用して観察することができる。
好ましくは、本発明のキットは、本明細書の本発明の第3〜第6の局面に記載の核酸分子、タンパク質、核酸および/またはタンパク質結合薬剤を含む。最も好ましくは、キットは、本明細書に記載のプローブもしくはプライマーのようなβチューブリン遺伝子とハイブリダイズすることができる核酸配列、またはβチューブリンタンパク質変異体に特異的なタンパク質結合薬剤を含む。キットはさらに、存在する具体的なヌクレオチドまたはタンパク質変異体と、1種以上の治療薬剤に対する抵抗性または過敏性のレベルの関係を示す標準チャートを含んでいてもよい。
キットはまた、好ましくは、核酸配列またはタンパク質結合薬剤を検出する手段、および核酸配列またはタンパク質結合薬剤に結合する基質、例えば本明細書に記載のアレイを含む。
各局面の好ましい態様は、他の局面に準用することができる。
本発明の製造および適用のより完全な理解を、下記実施例から得ることができる。これは説明のみを目的としており、本発明の技術的範囲をいかなる方法でも限定することがない。
実施例
変異分析のためのHM40タイプ1 βチューブリン領域の製造。
5個の対照ゲノムDNA試料から下記プライマーで増幅したPCR産物を配列決定した。DNA配列を分析した4つの領域の全てで100%のマッチを示すAC006165標準配列と整列させた。配列をJ00314エントリーのシークエンシングまたは注釈エラーに関連し得るいくつかの不一致領域を示すJ00314エントリーとも整列させた。これらのPCR産物をクローニングし、各エキソンを示す15個のクローンをシークエンシングすると、プライマーおよび条件がAC006165遺伝子座またはAC006165と100%同一の領域を含む遺伝子座から配列を増幅するのみであることを示す同一の結果が得られた。
エキソン1プライマー:
cctctcctttctccctctcおよびtcttggcaggcacattt
エキソン2プライマー:
ctgggacttgacctgttgtおよびcttccctgtctcccacttat
エキソン3プライマー:
ccttcccttctgccagatttctおよびgaaacatcatgtatcttcca
エキソン4プライマー:
表1に示す通り。
変異分析のためのHM40タイプ1 βチューブリン領域の製造。
5個の対照ゲノムDNA試料から下記プライマーで増幅したPCR産物を配列決定した。DNA配列を分析した4つの領域の全てで100%のマッチを示すAC006165標準配列と整列させた。配列をJ00314エントリーのシークエンシングまたは注釈エラーに関連し得るいくつかの不一致領域を示すJ00314エントリーとも整列させた。これらのPCR産物をクローニングし、各エキソンを示す15個のクローンをシークエンシングすると、プライマーおよび条件がAC006165遺伝子座またはAC006165と100%同一の領域を含む遺伝子座から配列を増幅するのみであることを示す同一の結果が得られた。
エキソン1プライマー:
cctctcctttctccctctcおよびtcttggcaggcacattt
エキソン2プライマー:
ctgggacttgacctgttgtおよびcttccctgtctcccacttat
エキソン3プライマー:
ccttcccttctgccagatttctおよびgaaacatcatgtatcttcca
エキソン4プライマー:
表1に示す通り。
Navigator Software(Transgenomic, Inc.)を使用して、HM40配列を分析し、PCRおよびDHPLC分析に最適な単位複製配列を設計した。ソフトウェアは固有アルゴリズムを使用して、選択された温度および融解プロファイルを作成するための分析条件(移動相濃度、塩濃度、単位複製配列の長さ、%GC)でのDNAのセグメントの%ヘリシティを定義する配列内用に基づいて単位複製配列を選択する。
表1のプライマーセットおよび本明細書に記載の単位複製配列を、HM40エキソン4分析で使用した。これはDHPLC分析および確認DNAシークエンシングのためのPCRプライマーを含む。
変異体を調査するために使用した配列は、AC006161のフラグメント38466〜38775、36246〜36744、35818〜36250、35256〜35841および34467〜35354、および図1を含むエキソンである。各フラグメントのPCRプライマーは参考文献(Sale, et. al., Molecular Cancer Therapeutics, 2002)から得る。エキソン4は3〜4個のフラグメントに分割されなければならないが、文献には2個が記載されている。所望により、よりよいプライマー設計のために増幅領域を伸長することができる。
βチューブリンエキソン4反転イントロンアンカーMASAアッセイ設計
DNAを5〜10μmの厚みのスライドから抽出する。1〜5μlのDNA調製物を50μlのPCR反応に使用した。プライマーを10mMの濃度で使用した。Hotmaster TaqまたはAmpliTaq GoldをDNAポリメラーゼとして使用した。MASAのアニーリング温度を陽性対照および陰性対照を使用して経験的に決定した。最適アニーリング温度は陽性対照から強いシグナルが得られ、陰性対照からはシグナルが検出されないものである。勾配熱循環器を使用して最適アニーリング温度を選択し、試験試料のMASAのために選択した。
DNAを5〜10μmの厚みのスライドから抽出する。1〜5μlのDNA調製物を50μlのPCR反応に使用した。プライマーを10mMの濃度で使用した。Hotmaster TaqまたはAmpliTaq GoldをDNAポリメラーゼとして使用した。MASAのアニーリング温度を陽性対照および陰性対照を使用して経験的に決定した。最適アニーリング温度は陽性対照から強いシグナルが得られ、陰性対照からはシグナルが検出されないものである。勾配熱循環器を使用して最適アニーリング温度を選択し、試験試料のMASAのために選択した。
5μlのMASA PCR産物を、5〜10pgのdsDNAを検出することができるWAVE−HS系のdsDNAのサイズ分析のために注入した。
BT 4 F270V
変異:コドン270でTTTからGTT、PheからVal
配列:ATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCACCAGCCGTGGAAGCCAGCA
MASAフォワードプライマー:GAAACATCATGTATCTTCCATACCCTG 予定温度:70.2℃
MASAアレルリバースプライマー#3:CTGGTGAGAGGGGCAAC 予定温度:58.8℃
PCR条件:
工程 温度 時間
1 95℃ 2分
2 95℃ 15秒
3 62.5℃ 15秒
4 68℃ 15秒
5 工程2に39回戻る
6 68℃ 5分
7 4℃ ホールド
ポリメラーゼ:Hotmaster(Eppendorf)。
備考:このアッセイは約10ngのgDNAを使用して開発した。より多くのDNAはバックグラウンドの増加および偽陽性を引き起こし得る。
変異:コドン270でTTTからGTT、PheからVal
配列:ATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCACCAGCCGTGGAAGCCAGCA
MASAフォワードプライマー:GAAACATCATGTATCTTCCATACCCTG 予定温度:70.2℃
MASAアレルリバースプライマー#3:CTGGTGAGAGGGGCAAC 予定温度:58.8℃
PCR条件:
工程 温度 時間
1 95℃ 2分
2 95℃ 15秒
3 62.5℃ 15秒
4 68℃ 15秒
5 工程2に39回戻る
6 68℃ 5分
7 4℃ ホールド
ポリメラーゼ:Hotmaster(Eppendorf)。
備考:このアッセイは約10ngのgDNAを使用して開発した。より多くのDNAはバックグラウンドの増加および偽陽性を引き起こし得る。
BT 4 T274Ile
変異:コドン274でACCからATC、ThrからIle
配列:ATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCACCAGCCGTGGAAGCCAGCA
MASAフォワードプライマー:GAAACATCATGTATCTTCCATACCCTG 予定温度:70.2℃
MASAアレルリバースプライマー#2:TGGCTTCCACGGCTGA 予定温度:61.6℃
PCR条件:
工程 温度 時間
1 95℃ 2分
2 95℃ 15秒
3 63.5℃ 15秒
4 68℃ 15秒
5 工程2に39回戻る
6 68℃ 5分
7 4℃ ホールド
ポリメラーゼ:Hotmaster(Eppendorf)。
備考:このアッセイは約10ngのgDNAを使用して開発した。より多くのDNAはバックグラウンドの増加および偽陽性を引き起こし得る。
変異:コドン274でACCからATC、ThrからIle
配列:ATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCACCAGCCGTGGAAGCCAGCA
MASAフォワードプライマー:GAAACATCATGTATCTTCCATACCCTG 予定温度:70.2℃
MASAアレルリバースプライマー#2:TGGCTTCCACGGCTGA 予定温度:61.6℃
PCR条件:
工程 温度 時間
1 95℃ 2分
2 95℃ 15秒
3 63.5℃ 15秒
4 68℃ 15秒
5 工程2に39回戻る
6 68℃ 5分
7 4℃ ホールド
ポリメラーゼ:Hotmaster(Eppendorf)。
備考:このアッセイは約10ngのgDNAを使用して開発した。より多くのDNAはバックグラウンドの増加および偽陽性を引き起こし得る。
BT 4 R276H
変異:コドン276でCGTからCAT、ArgからHis
配列:ATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCACCAGCCGTGGAAGCCAGCA
MASAフォワードプライマー:GAAACATCATGTATCTTCCATACCCTG 予定温度:70.2℃
MASAアレルリバースプライマー#4:GATACTGCTGGCTTCCAT 予定温度:56.0℃
PCR条件:
工程 温度 時間
1 95℃ 2分
2 95℃ 15秒
3 62℃ 15秒
4 68℃ 15秒
5 工程2に39回戻る
6 68℃ 5分
7 4℃ ホールド
ポリメラーゼ:Hotmaster(Eppendorf)。
備考:このアッセイは約10ngのgDNAを使用して開発した。より多くのDNAはバックグラウンドの増加および偽陽性を引き起こし得る。
変異:コドン276でCGTからCAT、ArgからHis
配列:ATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCACCAGCCGTGGAAGCCAGCA
MASAフォワードプライマー:GAAACATCATGTATCTTCCATACCCTG 予定温度:70.2℃
MASAアレルリバースプライマー#4:GATACTGCTGGCTTCCAT 予定温度:56.0℃
PCR条件:
工程 温度 時間
1 95℃ 2分
2 95℃ 15秒
3 62℃ 15秒
4 68℃ 15秒
5 工程2に39回戻る
6 68℃ 5分
7 4℃ ホールド
ポリメラーゼ:Hotmaster(Eppendorf)。
備考:このアッセイは約10ngのgDNAを使用して開発した。より多くのDNAはバックグラウンドの増加および偽陽性を引き起こし得る。
プライマーを5’フォワードイントロンアンカープライマーおよび3’変異アレル特異的プライマーを使用するHM−40 βチューブリン変異アレル特異的増幅(MASA)に使用する。
βチューブリンエキソン4 MASAアッセイプライマー
βチューブリンエキソン4
5’フォワードイントロンアンカープライマー配列:
フォワードプライマー#1:GAAACATCATGTATCTTCCATACCCTG 温度:70.2℃
フォワードプライマー#2:GAGCTTTTCTCCTGACTGCATTCCAG 温度:74.5℃
フォワードプライマー#3:CATCCGAGGGAATTATTTGAAAAGTTG 温度:73.8℃
フォワードプライマー#4:CCGAGGGAATTATTTGAAAAGTTG 温度:69.3℃
βチューブリンエキソン4
5’フォワードイントロンアンカープライマー配列:
フォワードプライマー#1:GAAACATCATGTATCTTCCATACCCTG 温度:70.2℃
フォワードプライマー#2:GAGCTTTTCTCCTGACTGCATTCCAG 温度:74.5℃
フォワードプライマー#3:CATCCGAGGGAATTATTTGAAAAGTTG 温度:73.8℃
フォワードプライマー#4:CCGAGGGAATTATTTGAAAAGTTG 温度:69.3℃
BT 4 F270V 配列:TttgcccctctcAccagcCgtggaagccagcagtatcgagctctcacagtgccgg
変異:TTTからGTT、PheからVal
MASAリバースプライマー通常:GGCTGGTGAGAGGGGCAAA 予定温度:69.4℃
MASAアレルリバースプライマー#1:GGCTGGTGAGAGGGGCAAC 予定温度:68.7℃
MASAアレルリバースプライマー#2:GCTGGTGAGAGGGGCAAC 予定温度:64.1℃
MASAアレルリバースプライマー#3:CTGGTGAGAGGGGCAAC 予定温度:58.8℃
変異:TTTからGTT、PheからVal
MASAリバースプライマー通常:GGCTGGTGAGAGGGGCAAA 予定温度:69.4℃
MASAアレルリバースプライマー#1:GGCTGGTGAGAGGGGCAAC 予定温度:68.7℃
MASAアレルリバースプライマー#2:GCTGGTGAGAGGGGCAAC 予定温度:64.1℃
MASAアレルリバースプライマー#3:CTGGTGAGAGGGGCAAC 予定温度:58.8℃
BT 4 T274P 配列:TttgcccctctcAccagcCgtggaagccagcagtatcgagctctcacagtgccgg
変異:ACCからCCC、ThrからPro
MASAリバースプライマー通常:CTGGCTTCCACGGCTGGT 予定温度:67.6℃
MASAアレルリバースプライマー#1:CTGGCTTCCACGGCTGGG 予定温度:70.6℃
変異:ACCからCCC、ThrからPro
MASAリバースプライマー通常:CTGGCTTCCACGGCTGGT 予定温度:67.6℃
MASAアレルリバースプライマー#1:CTGGCTTCCACGGCTGGG 予定温度:70.6℃
BT 4 T274Ile 配列:TttgcccctctcAccagcCgtggaagccagcagtatcgagctctcacagtgccgg
変異:ACCからATC、ThrからIle
MASAリバースプライマー通常:CTGGCTTCCACGGCTGGT 予定温度:67.6℃
MASAアレルリバースプライマー#1:CTGGCTTCCACGGCTGA 予定温度:63.7℃
MASAアレルリバースプライマー#2:TGGCTTCCACGGCTGA 予定温度:61.6℃
MASAアレルリバースプライマー#3:GGCTTCCACGGCTGA 予定温度:57.6℃
変異:ACCからATC、ThrからIle
MASAリバースプライマー通常:CTGGCTTCCACGGCTGGT 予定温度:67.6℃
MASAアレルリバースプライマー#1:CTGGCTTCCACGGCTGA 予定温度:63.7℃
MASAアレルリバースプライマー#2:TGGCTTCCACGGCTGA 予定温度:61.6℃
MASAアレルリバースプライマー#3:GGCTTCCACGGCTGA 予定温度:57.6℃
BT 4 R276H 配列:CGTGGAAGCCAGCAGTATCGAGCTCTCACAGTGCCGGACC
変異:CGTからCAT、ArgからHis 実験温度
MASAリバースプライマー通常:TCGATACTGCTGGCTTCCAC
MASAアレルリバースプライマー#1:CTCGATACTGCTGGCTTCCAT 予定温度:66.3℃
MASAアレルリバースプライマー#2:TCGATACTGCTGGCTTCCAT 予定温度:64.6℃
MASAアレルリバースプライマー#3:CGATACTGCTGGCTTCCAT 予定温度:62.3℃
MASAアレルリバースプライマー#4:GATACTGCTGGCTTCCAT 予定温度:56.0℃
変異:CGTからCAT、ArgからHis 実験温度
MASAリバースプライマー通常:TCGATACTGCTGGCTTCCAC
MASAアレルリバースプライマー#1:CTCGATACTGCTGGCTTCCAT 予定温度:66.3℃
MASAアレルリバースプライマー#2:TCGATACTGCTGGCTTCCAT 予定温度:64.6℃
MASAアレルリバースプライマー#3:CGATACTGCTGGCTTCCAT 予定温度:62.3℃
MASAアレルリバースプライマー#4:GATACTGCTGGCTTCCAT 予定温度:56.0℃
BT cDNA分析
HM−40 βチューブリン転写のためのプライマーおよび条件
BT cDNAプライマー:
BT配列1フォワード:CTTGCCCCATACATACCTTGAG
BT配列1リバース:CCCAGACTGACCAAATACAAAG
BT配列2フォワード:GACCTGCAGCTGGACCGC
BT配列2リバース:TCAGGGTATTCTTCTCGGATCTT
BT配列3フォワード:TGGTTGATTCTGTCCTGGATG
BT配列3リバース:GTTGGTGTGGTCAGCCTCAGAG
BT配列4フォワード:TACAATGCCACCCTCTCCGT
BT配列4リバース:GCATCTGCTCATCGACCTCCT
BT配列5フォワード:GGAAGCCAGCAGTATCGAGC
BT配列5リバース:CTCACCGAAATCCTCCTCCTC
BT配列6フォワード:CTGAGAGCAACATGAACGACC
BT配列6リバース:GAGCGCCTACTATTGCCAG
BT HZ配列フォワード:GACCTCCGCAAGTTGGCAGT
BT HZ配列リバース:CAGGCAGCCATCATGTTCTTG
HM−40 βチューブリン転写のためのプライマーおよび条件
BT cDNAプライマー:
BT配列1フォワード:CTTGCCCCATACATACCTTGAG
BT配列1リバース:CCCAGACTGACCAAATACAAAG
BT配列2フォワード:GACCTGCAGCTGGACCGC
BT配列2リバース:TCAGGGTATTCTTCTCGGATCTT
BT配列3フォワード:TGGTTGATTCTGTCCTGGATG
BT配列3リバース:GTTGGTGTGGTCAGCCTCAGAG
BT配列4フォワード:TACAATGCCACCCTCTCCGT
BT配列4リバース:GCATCTGCTCATCGACCTCCT
BT配列5フォワード:GGAAGCCAGCAGTATCGAGC
BT配列5リバース:CTCACCGAAATCCTCCTCCTC
BT配列6フォワード:CTGAGAGCAACATGAACGACC
BT配列6リバース:GAGCGCCTACTATTGCCAG
BT HZ配列フォワード:GACCTCCGCAAGTTGGCAGT
BT HZ配列リバース:CAGGCAGCCATCATGTTCTTG
RT反応をAmbion's Retroscript First Strand Synthesis Kit(物件#1710)を使用して、製造業者の指示書にしたがって、このキットに含まれるランダム10量体を使用して行った。
テンプレート−2マイクロリットルの上記cDNA反応
PCR条件:
工程 温度 時間
1 95℃ 2分
2 95℃ 15秒
3 56℃ 15秒
4 68℃ 15秒
5 工程2に39回戻る
6 68℃ 5分
7 4℃ ホールド
ポリメラーゼ:Hotmaster(Eppendorf)。
PCR条件:
工程 温度 時間
1 95℃ 2分
2 95℃ 15秒
3 56℃ 15秒
4 68℃ 15秒
5 工程2に39回戻る
6 68℃ 5分
7 4℃ ホールド
ポリメラーゼ:Hotmaster(Eppendorf)。
βチューブリンエキソン4 MASAプライマー(cDNAまたはgDNA分析)−非イントロンアンカーMASA
βチューブリンエキソン4
BT 4 F270V 配列:ATGGTCCCCTTCCCACGTCTCCATTTCTTTATGCCTGGCTTT
変異:TTTからGTT、PheからVal 実験温度
MASAフォワード2プライマー変異:CATTTCTTTATGCCTGGCG 温度:63.5℃ 64℃
MASAフォワード2プライマー通常:CATTTCTTTATGCCTGGCT 温度:59.6℃
MASAフォワード3プライマー変異:CCATTTCTTTATGCCTGGCG 温度:67.7℃
MASAフォワード3プライマー通常:CCATTTCTTTATGCCTGGCT 温度:64.1℃ 62〜63℃
MASAフォワード4プライマー通常:TCCATTTCTTTATGCCTGGCT 温度:66.2℃
MASAリバースプライマー:CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC 温度:77.0℃
生成物サイズ:210bp v.2および211bp v.3
βチューブリンエキソン4
BT 4 F270V 配列:ATGGTCCCCTTCCCACGTCTCCATTTCTTTATGCCTGGCTTT
変異:TTTからGTT、PheからVal 実験温度
MASAフォワード2プライマー変異:CATTTCTTTATGCCTGGCG 温度:63.5℃ 64℃
MASAフォワード2プライマー通常:CATTTCTTTATGCCTGGCT 温度:59.6℃
MASAフォワード3プライマー変異:CCATTTCTTTATGCCTGGCG 温度:67.7℃
MASAフォワード3プライマー通常:CCATTTCTTTATGCCTGGCT 温度:64.1℃ 62〜63℃
MASAフォワード4プライマー通常:TCCATTTCTTTATGCCTGGCT 温度:66.2℃
MASAリバースプライマー:CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC 温度:77.0℃
生成物サイズ:210bp v.2および211bp v.3
BT 4 A271P 配列:ATGGTCCCCTTCCCACGTCTCCATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCC
変異:GCCからCCC、AlaからPro
MASAフォワードプライマー変異:ATTTCTTTATGCCTGGCTTTC 温度:63.3℃
MASAフォワードプライマー通常:ATTTCTTTATGCCTGGCTTTG 温度:64.1℃
MASAフォワード2プライマー変異:CATTTCTTTATGCCTGGCTTTC 温度:66.1℃
MASAフォワード2プライマー通常:CATTTCTTTATGCCTGGCTTTG 温度:66.9℃
MASAリバースプライマー:CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC 温度:77.0℃
生成物サイズ:209bp v.1および210bp v.2.
変異:GCCからCCC、AlaからPro
MASAフォワードプライマー変異:ATTTCTTTATGCCTGGCTTTC 温度:63.3℃
MASAフォワードプライマー通常:ATTTCTTTATGCCTGGCTTTG 温度:64.1℃
MASAフォワード2プライマー変異:CATTTCTTTATGCCTGGCTTTC 温度:66.1℃
MASAフォワード2プライマー通常:CATTTCTTTATGCCTGGCTTTG 温度:66.9℃
MASAリバースプライマー:CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC 温度:77.0℃
生成物サイズ:209bp v.1および210bp v.2.
BT 4 T274P 配列:GTCCCCTTCCCACGTCTCCATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCACC
変異:ACCからCCC、ThrからPro
MASAフォワード2プライマー変異:CTGGCTTTGCCCCTCTCC 温度:66.5℃
MASAフォワード2プライマー通常:CTGGCTTTGCCCCTCTCA 温度:65.2℃
MASAフォワード3プライマー変異:CCTGGCTTTGCCCCTCTCC 温度:70.7℃
MASAフォワード3プライマー通常:CCTGGCTTTGCCCCTCTCA 温度:69.6℃
MASAフォワード4プライマー変異:TGGCTTTGCCCCTCTCC 温度:64.7℃
MASAフォワード4プライマー通常:TGGCTTTGCCCCTCTCA 温度:63.3℃
MASA リバースプライマー:CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC 温度:77.0℃
生成物サイズ:198bp v.2および197bp v.3
変異:ACCからCCC、ThrからPro
MASAフォワード2プライマー変異:CTGGCTTTGCCCCTCTCC 温度:66.5℃
MASAフォワード2プライマー通常:CTGGCTTTGCCCCTCTCA 温度:65.2℃
MASAフォワード3プライマー変異:CCTGGCTTTGCCCCTCTCC 温度:70.7℃
MASAフォワード3プライマー通常:CCTGGCTTTGCCCCTCTCA 温度:69.6℃
MASAフォワード4プライマー変異:TGGCTTTGCCCCTCTCC 温度:64.7℃
MASAフォワード4プライマー通常:TGGCTTTGCCCCTCTCA 温度:63.3℃
MASA リバースプライマー:CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC 温度:77.0℃
生成物サイズ:198bp v.2および197bp v.3
BT 4 T274Ile 配列:GTCCCCTTCCCACGTCTCCATTTCTTTATGCCTGGCTTTGCCCCTCTCATC
変異:ACCからATC、ThrからIle 実験温度
MASAフォワード2プライマー変異:TGGCTTTGCCCCTCTCAT 温度:64.6℃
MASAフォワード2プライマー通常:TGGCTTTGCCCCTCTCAC 温度:64.9℃
MASAフォワード3プライマー変異:CTGGCTTTGCCCCTCTCAT 温度:66.4℃ 66℃
MASAフォワード3プライマー通常:CTGGCTTTGCCCCTCTCAC 温度:66.7℃ 68〜69℃
MASAリバースプライマー:CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC 温度:77.0℃
生成物サイズ:198bp v.2および197bp v.3
変異:ACCからATC、ThrからIle 実験温度
MASAフォワード2プライマー変異:TGGCTTTGCCCCTCTCAT 温度:64.6℃
MASAフォワード2プライマー通常:TGGCTTTGCCCCTCTCAC 温度:64.9℃
MASAフォワード3プライマー変異:CTGGCTTTGCCCCTCTCAT 温度:66.4℃ 66℃
MASAフォワード3プライマー通常:CTGGCTTTGCCCCTCTCAC 温度:66.7℃ 68〜69℃
MASAリバースプライマー:CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC 温度:77.0℃
生成物サイズ:198bp v.2および197bp v.3
BT 4 Val293Asp 配列:GCAGTATCGAGCTCTCACAGTGCCGGAACTCACCCAGCAGGTC
変異:GTCからGAC、ValからAsp
MASAフォワードプライマー1変異:CGGAACTCACCCAGCAGGA 温度:67.6℃
MASAフォワードプライマー1通常:CGGAACTCACCCAGCAGGT 温度:66.7℃
MASAフォワードプライマー2変異:GGAACTCACCCAGCAGGA 温度:61.5℃
MASAフォワードプライマー2通常:GGAACTCACCCAGCAGGT 温度:60.6℃
MASAリバースプライマー:CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC 温度:77.0℃
生成物サイズ:138bp v.1および137 v.2
変異:GTCからGAC、ValからAsp
MASAフォワードプライマー1変異:CGGAACTCACCCAGCAGGA 温度:67.6℃
MASAフォワードプライマー1通常:CGGAACTCACCCAGCAGGT 温度:66.7℃
MASAフォワードプライマー2変異:GGAACTCACCCAGCAGGA 温度:61.5℃
MASAフォワードプライマー2通常:GGAACTCACCCAGCAGGT 温度:60.6℃
MASAリバースプライマー:CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC 温度:77.0℃
生成物サイズ:138bp v.1および137 v.2
BT 4 A364T 配列:TCTGTGACATCCCACCTCGTGGCCTCAAGATGGCA
変異:GCAからACA、AlaからThr
MASAフォワード1プライマー変異:CACCTCGTGGCCTCAAGATGA 温度:69.6℃
MASAフォワード1プライマー通常:CACCTCGTGGCCTCAAGATGG 温度:71.5℃
MASAフォワード2プライマー変異:ACCTCGTGGCCTCAAGATGA 温度:66.5℃
MASAフォワード2プライマー通常:ACCTCGTGGCCTCAAGATGG 温度:68.6℃
MASAリバースプライマー:CAGAGACGAGGTCGTTCATGTTGCT℃ 温度:75.6℃
生成物サイズ:192bp v.1および191bp v.2
変異:GCAからACA、AlaからThr
MASAフォワード1プライマー変異:CACCTCGTGGCCTCAAGATGA 温度:69.6℃
MASAフォワード1プライマー通常:CACCTCGTGGCCTCAAGATGG 温度:71.5℃
MASAフォワード2プライマー変異:ACCTCGTGGCCTCAAGATGA 温度:66.5℃
MASAフォワード2プライマー通常:ACCTCGTGGCCTCAAGATGG 温度:68.6℃
MASAリバースプライマー:CAGAGACGAGGTCGTTCATGTTGCT℃ 温度:75.6℃
生成物サイズ:192bp v.1および191bp v.2
BT 4 P268H 配列:ATGGTCCCCTTCCCACGTCTCCATTTCTTTATGCCT
変異:CCTからCAT、ProからHis
MASAフォワード1プライマー変異:CACGTCTCCATTTCTTTATGCA 温度:65.1℃
MASAフォワード1プライマー通常:CACGTCTCCATTTCTTTATGCC 温度:66.2℃
MASAフォワード2プライマー変異:CCACGTCTCCATTTCTTTATGCA 温度:69.0℃
MASAフォワード2プライマー通常:CCACGTCTCCATTTCTTTATGCC 温度:70.0℃
MASAリバースプライマー:CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC 温度:77.0℃
生成物サイズ:218bp v.1および219bp v.2
変異:CCTからCAT、ProからHis
MASAフォワード1プライマー変異:CACGTCTCCATTTCTTTATGCA 温度:65.1℃
MASAフォワード1プライマー通常:CACGTCTCCATTTCTTTATGCC 温度:66.2℃
MASAフォワード2プライマー変異:CCACGTCTCCATTTCTTTATGCA 温度:69.0℃
MASAフォワード2プライマー通常:CCACGTCTCCATTTCTTTATGCC 温度:70.0℃
MASAリバースプライマー:CGTTAAGCATCTGCTCATCGACCTCC 温度:77.0℃
生成物サイズ:218bp v.1および219bp v.2
Claims (24)
- 治療薬剤に対する対象の応答能を決定する方法であって、図1に示す対象のβチューブリンタンパク質の263、268、270、274、276、293および364位の1個以上でのアミノ酸変異体の存在を決定することを含み、変異体の存在または不存在が当該治療薬剤に対する抵抗性または過敏性の指標である、方法。
- 図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、270、274、276、293および/または364位でのアミノ酸変異を引き起こすβチューブリンをコードする核酸配列における、ヌクレオチド変異体の存在を決定することを含む、請求項1に記載の方法。
- 図2に示すβチューブリンをコード化する核酸配列の787、803、808、821、827、878および/または1091位の1個以上でのヌクレオチド変異体の存在を決定することを含む、請求項2に記載の方法。
- 図1および2にそれぞれ示すβチューブリンタンパク質または遺伝子における変異体の存在を最初に確立することを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 変異体の存在を、βチューブリンをコード化する核酸配列またはそのフラグメントのヘテロ2本鎖分析によって確立することを含む、請求項4に記載の方法。
- 変異体の存在をDHPLC、ミスマッチ検出、ゲル電気泳動またはSSCPによって確立する、請求項4または5に記載の方法。
- (a)試験する核酸試料のストランドを分離する工程;
(b)図2の787、803、808、820、821、878および/または1091位の1個以上で変異体ヌクレオチドを含まないことが知られているストランドと2本鎖を形成させる工程;そして
(c)2本鎖の融解プロファイル(melting profile)を作成する工程、ここで前記プロファイルは試験ストランド中に1個以上の変異体が存在することを示す:
をさらに含む、請求項6に記載の方法。 - βチューブリンをコード化する核酸配列をヌクレオチド変異体の存在を決定する前に増幅する、請求項2〜7のいずれかに記載の方法。
- ヌクレオチド変異体の存在をPCR産物のシークエンシング、直接プロービング直接クローニングおよびシークエンシング、アレル特異的ハイブリダイゼーション、変異アレル特異的増幅(MASA)、RFLP、ポリメラーゼ媒介性プライマー伸長、1塩基伸長、または回転サイクル増幅後アレル特異的ライゲーションによって決定する、請求項2〜8のいずれかに記載の方法。
- ヌクレオチド変異体の存在をMASAによって決定する、請求項9に記載の方法。
- 野生型アレルまたは標準アレルに特異的であって、増幅を媒介することができないプライマーをさらに使用する、請求項10に記載の方法。
- アミノ酸変異体の存在を質量分析によって、またはタンパク質結合薬剤の使用によって決定する、請求項1、および4〜7のいずれかに記載の方法。
- 治療薬剤がβチューブリンを標的とするか、またはβチューブリンを介してその作用を媒介するものである、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。
- 治療薬剤がβチューブリンまたは微小管に関連するプロセスの脱制御からもたらされる疾患の処置に使用するためのものである、請求項13に記載の方法。
- 対象の疾患を処置する方法であって、
(a)治療薬剤に対する対象の応答能を請求項1〜14のいずれかに記載の方法で決定すること、ここで、ヌクレオチド変異体またはアミノ酸変異体の存在が当該治療薬剤に対する抵抗性または過敏性の指標である;および
(b)対象が抵抗性でない治療薬剤を投与すること
を含んでなる方法。 - 図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、276および/または293位で変異を引き起こすヌクレオチド変異体を有するβチューブリンをコード化する核酸配列またはそれに相補的な核酸配列を含む、単離核酸分子または組み換え核酸分子;またはそのフラグメント。
- ヌクレオチド変異体が図2に示す核酸配列の787、803、827および/または878位に対応する位置に存在する、請求項5に記載の単離核酸分子または組み換え核酸分子;またはそのフラグメント。
- 核酸分子が図2に示すβチューブリンをコード化する核酸配列、またはその相補鎖とハイブリダイズすることができる核酸配列を含む、単離核酸分子または組み換え核酸分子。
- 図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、276および/または293位で変異を引き起こすヌクレオチド変異体または当該変異体と隣接する領域とハイブリダイズすることができる、請求項7に記載の単離核酸分子または組み換え核酸分子。
- 263、268、276および/または293位でアミノ酸置換を有する、単離された図1に示すβチューブリンタンパク質。
- 図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、276および/または293位での変異体に特異的な、タンパク質結合薬剤。
- 適当な治療薬剤をスクリーニングする方法であって、
a)図1に示すβチューブリンタンパク質の263、268、270、274、276、293および364位の1個以上でのアミノ酸変異体を含む細胞;またはβチューブリンをコード化し、1個以上のアミノ酸変異を引き起こす変異体を有する核酸配列を含む細胞を得ること;そして
b)当該細胞を治療薬剤に曝露すること;そして
c)治療薬剤への曝露による細胞のβチューブリンの重合および/または脱重合を観察すること;
ここで、適当な治療薬剤は細胞のβチューブリンの重合および/または脱重合に影響することができるものである、
を含んでなる方法。 - 重合および/または脱重合の観察を細胞の増殖を観察することによって行う、請求項22に記載の方法。
- 請求項16〜19のいずれかに記載の核酸配列および/またはタンパク質結合薬剤を含む、図1に示すβチューブリンタンパク質のβチューブリン263、268および/または276、293位の1個以上での変異体の存在を決定するための、ヌクレオチドまたはアミノ酸変異体と治療薬剤に対する対象の抵抗性の関係を示す標準チャートが付随したキット。
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