JP2008516980A - 血小板の生存延長のための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
発明は、輸注された血小板の哺乳動物における循環からのクリアランスを低減し、かつ輸注された血小板の生物活性および生存を延長するための組成物および方法に関する。
血小板は、血管損傷部位に付着し、血漿フィブリン塊の形成を促進することにより傷つけられた哺乳動物を失血から保護する無核の骨髄由来血液細胞である。骨髄不全により循環血小板が枯渇したヒトは、生命を脅かす突発性出血を患い、そして血小板の比較的軽度の欠損は、外傷または手術の後で出血性合併症の一因となる。
本発明は、移植後の低減された発生率の血小板クリアランスを有するグリカン修飾された血小板、および異種性血小板移植レシピエントにおいて観察される血小板クリアランスを低減するための方法を提供する。また、哺乳類血小板、特にヒト血小板などの血小板の保存および貯蔵のための組成物および方法も提供する。本発明はまた、修飾された血小板を含む薬学的組成物を作るための、および止血を媒介するために哺乳動物、特に血球減少哺乳動物に薬学的組成物を投与するための方法も提供する。
(a)薬学的に許容される担体中に含まれる血小板の集団を、少なくとも1つのグリカン修飾剤と接触させ、処置された血小板調製物を形成する段階、
(b)処置された血小板調製物を貯蔵する段階、および
(c)処置された血小板調製物を温める段階。
本発明は、強化された循環特性を有しかつ実質的に正常なインビボ止血活性を保持する修飾された血小板の集団を提供する。止血活性は、出血停止を媒介する血小板の集団の能力に広く言及する。種々のアッセイが、血小板止血活性を決定するために利用可能である(Bennett, J. S. and Shattil, S. J., 1990, "Platelet function," Hematology, Williams, W. J., et al, Eds. McGraw Hill, pp 1233- 12250)。しかしながら、「止血」または「止血活性」の立証は最終的に、血小板減少症のまたは血小板病の(thrombopathic)(すなわち機能しない血小板)動物またはヒトの中に注入された血小板が循環しかつ自然にまたは実験的に誘導される出血を止めるという立証を必要とする。
実施例1
導入
穏当に冷やすことは、活性化に対して血小板を刺激するが、冷蔵は、治療用輸注のための血小板の貯蔵を危うくする、形状変化および急速なクリアランスをもたらす。発明者らは、形状変化の阻害は低温で誘導されるクリアランスを正常化しないことを見出した。発明者らはまた、冷やした血小板が、大部分は肝臓マクロファージ上に発現する補体受容体3受容体(CR3)による認識の標的となるように、フォンウィルブランド因子(vWF)受容体複合体αサブユニット(GP1bα)の表面立体配置を再配置し、血小板の食作用およびクリアランスをもたらすことも見出した。GP1bα除去は、冷却していない血小板の生存を延長する。冷却した血小板は、vWFに結合し、そしてCR3欠損マウスの中へ輸注後にインビトロおよびエクスビボで正常に機能する。しかしながら、冷やされた血小板は、トロンビンまたはADPに曝露された血小板のように「活性化されて」おらず、そのvWf-受容体複合体は、活性化されたvWfと正常に反応する。
発明者らは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)-結合アネキシンV、フィコエリトリン(PE)-結合抗ヒトCD11b/Mac-1モノクローナル抗体(mAb)、FITC結合抗マウスおよび抗ヒトIgM mAb、FITC結合抗マウスおよび抗ヒトCD62P-FITC mAbをPharmingen (San Diego, CA)から、FITC結合ラット抗マウス抗ヒトIgG mAbをSanta Cruz Biotechnology, Inc. ( Santa Cruz, CA)から、FITC結合抗ヒトCD61mAb(クローンBL-E6)をAccurate Scientific Corp. (Westbury, NY)から、FITC結合抗ヒトGP1bα mAb(クローンSZ2)をImmunotech (Marseille, France)から、およびFITC結合ポリクローナルウサギ抗vWf抗体をDAKOCytomation (Glostrup, Denmark)から入手した。発明者らは、EGTA-アセトキシメチルエステル(AM)、ヒト血漿由来のオレゴングリーン結合フィブリノーゲン、CellTracker(商標)オレンジCMTMR; CellTrackerグリーンCMFDA、ナイルレッド(Nile-red)(535/575)結合およびカルボン酸で修飾された1 μm微粒子/FluoSpheresをMolecular Probes, Inc. (Eugene, OR)から、ならびに111インジウムをNEN Life Science Products (Boston, MA)から購入した。発明者らは、サイトカラシンB、ジメチルスルホキシド(DMSO)、イソチオシアネート三ナトリウム(TRITC)、ヒトトロンビン、プロスタグランジンE1(PGE1)、ホルボールエステル12-テトラデカノイルホルボール-13アセタート(phorbol ester 12-tetradecanoylphorbol-13 acetate)(PMA)、A23187イオノフォアをSigma (St. Louis, MO)から; ボトロセチンをCenterchem Inc. (Norwalk, CT)から;およびO-シアロ糖タンパク質-エンドペプチダーゼをCerladane (Hornby, Canada)から購入した。Ca2+およびMg2+を含むHBSS pH 6.4、RPMI 1640、0.05% トリプシン-EDTA(0.53 mM)を含みCa2+およびMg2+を含まないHBSS、および他の補充物(ペニシリン、ストレプトマイシンおよびウシ胎児血清)はGIBCO Invitrogen Corp. (Grand Island, NY)からであった。TGF-β1はOncogene Research Products (Cambridge, MA)から、1,25-(OH)2ビタミンD3はCalbiochem (San Diego, CA)から、およびアデノシン-5'-二リン酸(ADP)はUSB (Cleveland, OH)からであった。アベルチン(Avertin)(2,2,2- トリブロモエタノール)はFluka Chemie (Steinheim, Germany)から購入した。コラーゲン関連ペプチド(CRP)は、Tufts Core Facility, Physiology Dept. (Boston, MA)で合成され、そして以前に記載されているように(Morton et al., 1995)架橋した。モカラギン(Mocarhagin)、ヘビ毒メタロプロテアーゼは、Dr. M. Berndt, Baker Medical Research Institute, Melbourne Victoria 318 1, Australiaより提供された。追加の結合されていない抗マウスGP1bα mAbおよびPE結合抗マウスGP1bα mAb pOp4は、Dr. B. Nieswandt (Witten/Herdecke University, Wuppertal, Germany)より提供された。発明者らは、THP-1細胞をAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA)から入手した。
クリアランスおよび生存試験のアッセイのために、発明者らは、Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)から入手した齢、系統および性が合うC57BL/6およびC57BL/6×129/sv野生型マウスを用いた。補体成分C3を欠損したC57BL/6×129/svマウス(Wessels et al., 1995)は、Dr. M. C. Carroll (Center for Blood Research and Department of Pediatrics, Harvard Medical School, Boston, MA)より提供された。CR3を欠損したC57BL/6マウス(Coxon et al., 1996)は、Dr. T Mayadasより提供され、vWfを欠損したC57BL/6マウス(Denis et al., 1998)は、Dr. D. Wagnerより提供された。マウスは、The Guide for the Care and Use of Laboratory Animalsに記載のNIHスタンダードに従って、Harvard Medical Area Standing Committee on Animalsによって承認されたように維持されかつ扱われた。
(Institutional Review Boards of both Brigham and Women's HospitalおよびCenter forBlood Research (Harvard Medical School)から認可を得た)同意した正常なヒトボランティアから0.1倍量のAster-Jandlシトラートに基づく抗凝固剤の中へ静脈穿刺により採血し(Hartwig and DeSisto, 1991)、血小板に富む血漿(PRP)を室温で20分間、300×gでの抗凝固処理された血液の遠心分離により調製した。血小板を、室温で低分子量セファロース2Bカラムを通すゲルろ過により血漿タンパク質から分離した(Hoffmeister et al., 2001)。以下に記載されるインビトロ食作用アッセイにおいて用いられる血小板を、37℃で20分間、1.8 μM CellTracker(商標)オレンジCMTMR(CM-Orange)で標識し(Brown et al., 2000)、取り込まれなかった色素を、140 mM NaCl、5 mM KCl、12 mM シトラート三ナトリウム、10 mM グルコース、および12.5 mM スクロース、1 μg/ml PGE1を含む洗浄緩衝剤、pH 6.0(緩衝剤A)の5倍量で遠心分離(850×g、5分)により除去した。血小板を、140 mM NaCl、3 mM KCl、0.5 mM MgCl2、5 mM NaHCO3、10 mM グルコースおよび10 mM Hepesを含む溶液、pH 7.4 (緩衝剤B)中で3×108/mlで再懸濁した。
マウスに3.75 mg/g(2.5%)のアベルチンで麻酔をかけ、1 mlの血液を眼窩後眼神経叢(retroorbital eye plexus)から0.1倍量のAster-Jandl抗凝固剤の中へ得た。PRPを室温で8分間、300×gでの抗凝固処理された血液の遠心分離により調製した。血小板を1200×gで5分間の遠心分離により血漿タンパク質から分離し、5倍量の洗浄緩衝剤(緩衝剤A)を用いて遠心分離(1200×g、5分間)により2回洗浄した。「洗浄した」という用語のその後の使用は、この工程を意味する。血小板を、140 mM NaCl、3 mM KCl、0.5 mM MgCl2、5 mM NaHCO3、10 mM グルコースおよび10 mM Hepesを含む溶液、pH 7.4(緩衝剤B)中で1×109/mlの濃度で再懸濁した。血小板数を400×倍率での位相差顕微鏡下、Bright Line Hemocytometer(Hausser Scientific, Horsham, PA)を用いて決定した。いくつかの放射性血小板クリアランス試験を111インジウムで行った、そして発明者らは齧歯類血小板に対して記載された方法(Kotze et al., 1985)を用いてマウス血小板を標識した。血小板を0.9% NaCl、pH 6.5(0.1 M ナトリウムシトラートで調整される)中で2×109/mlの濃度で再懸濁した、続いて37℃で30分間、500 μCiの111塩化インジウムを添加し、上記に記載のように洗浄し、そして緩衝剤B中で1×109/mlの濃度で再懸濁した。
血小板の生存または機能に対する温度の効果を試験するために、標識されていない、放射活性物質で標識された、もしくは蛍光で標識されたマウスまたはヒト血小板を、室温(25〜27℃)で2時間、でなければ氷浴温度でインキュベートし、その後マウスの中への輸注またはインビトロ分析前に、37℃で15分間再び温めた。これらの処置に供される血小板はそれぞれ、冷やされたまたは冷却した(もしくは冷却し、再び温められた)および室温の血小板と呼ばれる。
CMFDAで標識された冷却したまたは室温のマウス血小板(108)を、27-ゲージ針を用いて側面尾静脈経由で同系のマウスの中に注射した。回復および生存の決定のために、血液サンプルを輸注後直ちに(2分未満)および0.5、2、24、48、72時間で、0.1倍量のAster-Jandl抗凝固剤の中へ収集した。フローサイトメトリーを用いる全血分析を行い、CMFDA陽性血小板の百分率をその前方および側方散乱特性に従う(Baker et al., 1997)全血小板に対するゲーティングにより決定した。50,000イベントを各試料中収集した。2分未満の時間で測定されたCMFDA陽性血小板を100%として設定した。マウス1匹当たりの輸注された血小板のインプットは、全血小板集団の〜2.5-3%だった。
通常の試験を行い、Bio/Dataアグリゴメーター(aggregometer)(Horsham, PA)内でモニターした。0.3〜mlマウスの洗浄されかつ攪拌された血小板の試料を、1 U/ml トロンビン、10 μM ADP、または3 μg/ml CRPに37℃で曝露した。光透過率を3分を超えて記録した。
血小板に富む血漿を37℃で5分間、2 U/ml ボトロセチンでまたはそれ無しで処置した(Bergmeier et al., 2001)。結合したvWfをFITC結合ポリクローナルウサギ抗vWf抗体を用いるフローサイトメトリーにより検出した。
室温で維持されまたは2時間冷却した、休止マウス血小板を、0.05% グルタルアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で2×106/mlの濃度に希釈された。血小板溶液(200 μl)を96ウェルプレートのウェル中に含まれるポリリシンでコーティングされたカバーグラス上に配置し、血小板を室温で5分間1,500×gでの遠心分離により各カバーグラスに付着させた。その後、上清流体を除去し、カバーグラスに結合した血小板を0.5%グルタルアルデヒドを用いてPBS中で10分間固定させた。固定剤、PBS中に0.1%水素化ホウ素ナトリウムを含む溶液でクエンチされた未反応のアルデヒドを除去し、続いて10%BSAを含むPBSで洗浄した。血小板表面上のGP1bαを3種類のラット抗マウスGP1bαモノクローナル抗体、各10 μg/mlの混合剤で1時間(Bergmeier et al., 2000)標識し、その後ヤギ抗ラットIgGでコーティングされた10 nm金が続いた。カバーグラスをPBSで徹底的に洗浄し、1%グルタルアルデヒドで固定化後、蒸留水で再び洗浄し、急速に冷凍し、凍結乾燥し、Cressington CFE-60 (Cressington, Watford, UK)中で1.2 nmのプラチナで回転式コーティングされ、その後回転なしで4 nmの炭素が続いた。血小板をJEOL 1200-EX電子顕微鏡(Hartwig et al., 1996; Kovacsovics and Hartwig, 1996)内で100 kVで検分した。
単球THP-1細胞を、10%ウシ胎児血清、25 mM Hepes、2 mM グルタミンで補われるRPMI 1640細胞培養培地中で7日間培養し、1 ng/ml TGFPおよび50 nM 1,25-(OH)2ビタミンD3を用いて24時間分化させ、CR3の発現増加が伴う(Simon et al., 2000)。CR3発現をPE結合抗ヒトCD11b/Mac-1 mAbを用いるフローサイトメトリーによりモニターした。未分化のまたは分化したTHP-1細胞(2×106/ml)を24ウェルプレートの上に蒔いて培養し、37℃で45分間付着させた。付着した未分化のまたは分化したマクロファージを15 ng/ml PMAの添加により15分間活性化した。予め異なる処置に供された、CM範囲で標識された、冷却したまたは室温の血小板(107/ウェル)を、Ca2+およびMg2+を含むHBSS中で未分化のまたは分化した食細胞に添加し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション期間に続いて、食細胞単層をHBSSで3回洗浄し、血小板の付着または摂取のフローサイトメトリー分析のためにマクロファージを引き離すため付着した血小板を0.05%トリプシン/0.53 mM EDTAを含むHBSSで37℃5分間続いて4℃で5 mM EDTAの処置により除去した(Brown et al., 2000)。ヒトCMオレンジで標識された、冷却したまたは室温の血小板は全て、新鮮に単離された非標識の血小板と同量の血小板特異的マーカーCD61を発現した(示されていない)。マクロファージと一緒にインキュベートされたCMオレンジで標識された血小板を、それらの前方および側方散乱特性に従って食細胞から分離した。マクロファージ、各試料に対して獲得した10,000イベントをゲートし、データをCELLQuestソフトウェア(Becton Dickenson)で分析した。食細胞集団を関連付けるCMオレンジで標識された血小板はオレンジ蛍光においてシフトを有する(図6aおよび図6b、摂取、y軸)。それらCD61に対するFITC結合mAbで二重ラベルできなかったため、これらの血小板を付着のみよりむしろ摂取した。
洗浄されたマウスまたはヒト血小板(2×106)を、冷却または室温貯蔵の後37℃で10分間フルオロフォア結合Ab(5 μg/ml)で染色することにより、CD62P、CD61または表面結合IgMおよびIgGの表面発現を分析した。冷却したまたは室温の血小板によるホスファチジルセリン露出を、5 μlの血小板を10 mM Ca2+を含む400 μlのHBSS中で10 μg/mlのFITC結合アネキシンVと共に再懸濁することにより決定した。PS露出の陽性対照として、血小板懸濁液を1 μM A23187で刺激した。フィブリノーゲン結合を室温で20分間オレゴングリーン-フィブリノーゲンの添加により決定した。全ての血小板試料をフローサイトメトリーにより直ちに分析した。血小板を前方および側方散乱特性によりゲートした。
動物の調製、生体内ビデオ顕微鏡法準備の技術的局面および実験的局面は、記載されている(von Andrian, 1996)。両方の性別の6から8週齢マウスにキシラジンおよびケタミンの混合物の腹腔内注射により麻酔をかけた。右頸静脈にPE-10ポリエチレン管系でカテーテルを入れた。左肝葉の下面を外科的に調製し、記載されたように(McCuskey, 1986)さらなるインビボ顕微鏡法のためにカバーグラスにより覆われた。CMFDAおよびTRITCそれぞれで標識された、108の冷却した血小板および室温血小板を1:1で混合し、静脈内に投与した。肝臓類洞における標識された血小板の循環をビデオ誘発ストロボ落射照明(video triggered stroboscopic epi-illumination)により追跡した。10ビデオ場面をそれぞれ指示された時点で3つの小葉中心体(centrilobular zone)から記録した。同じ可視化領域における冷やされた(CMFDA)付着血小板/RT(TRITC)付着血小板の比率を計算した。共焦点顕微鏡法を、10×浸水対象を用いる、Olympus BX 50 WJ upright microscope (Biorad, Hercules, CA)に連結されたRadiance 2000 MP confocal-multiphotonイメージングシステムを用いて行った。イメージをLaser Sharp 2000ソフトウェア(Biorad) (von Andrian, 2002)で捕捉および分析した。
発明者らは、霊長類に対して記載されているように(Michelson et al., 1994)、傷から現れる全血における血小板による凝集物形成を分析するためにフローサイトメトリー法を用いた。発明者らは、108のCMFDAで標識された室温マウス血小板を同系の野生型マウスの中へ、および108のCMFDAで標識された冷却した血小板をCR3欠損マウスの中へ注射した。血小板注入後24時間、3-mm区分のマウス尾を切断する、標準的な出血時間アッセイを行った(Denis et al., 1998)。切断された尾を100 μlの0.9%等張食塩水中に37℃で浸した。現れた血液を2分間収集し、0.1倍量のAster-Jandl抗凝固剤を添加し、直ちに1%パラホルムアルデヒド(最終濃度)が続いた。上に記載されているように、末梢血を平行して眼窩後眼神経叢出血より得、直ちに1%パラホルムアルデヒド(最終濃度)で固定した。フローサイトメトリーによりインビボ凝集物の数を分析するために、出血時間傷から現れる流血、ならびに末梢全血試料を希釈し、PE結合抗マウスGP1bαmAb pOp4(5 μg/ml、10分)で標識した。血小板を、それらの前方散乱特性およびGP1bα陽性に従ってゲートすることにより赤血球および白血球から区別した。その後、(血小板の大きさを反映する)GP1bα結合に対する対数前方散乱光ののヒストグラムを生成した。末梢全血試料において、前方散乱軸上の集団の95%(領域1)およびこの前方散乱光閾の上方に現れる粒子の5%(領域2)を含むよう、分析領域をGP1bα陽性粒子の周りにプロットした。同じ領域を流血試料に対して用いた。単一血小板の数の百分率として流血中の血小板凝集物の数を、以下の色から計算した:[(流血の領域2中の粒子の数)-(末梢血の領域2中の粒子の数)]÷(流血の領域1中の粒子の数)×100%。注入された血小板をそのCMFDA標識により同定し、CMFDA陰性非注入血小板から区別した。
室温のCMオレンジで標識された室温血小板(108)を野生型マウスの中に、およびCM-オレンジで標識された冷却した血小板(108)をCR3欠損マウスの中に注射した。血小板注入後24時間、マウスを出血させ、血小板を単離した。休止しているまたはトロンビン活性化された(1 U/ml、5分)血小板懸濁液(2×108)をPBS中で希釈し、それぞれをFITC結合抗マウスP-セレクチンmAbでまたは50 μg/mlオレゴングリーン結合フィブリノーゲンで、室温で20分間染色した。血小板試料を直ちにフローサイトメトリーにより分析した。輸注された血小板および輸注されていない血小板をその前方散乱特性およびCM-オレンジ蛍光特性によりゲートした。P-セレクチン発現およびフィブリノーゲン結合を、トロンビンの刺激前および後に。それぞれCM-オレンジ陽性集団および陰性集団として測定した。
生体内顕微鏡法データを平均±SEMとして表す。集団を非対応t検定を用いて比較した。0.05より小さいP値を有意と見なした。全ての他のデータはを平均±SDとして表示する。
冷却した血小板のクリアランスは大部分は肝臓中に生じ、血小板の形状と無関係である
室温(RT)で保たれかつ同系のマウスの中に注入されたマウス血小板は、約80時間にわたってほぼ一定速度で消失する(図1A)。対照的に、氷浴温度で冷却し注射前に再び温められた(低温)マウス血小板の約2/3は、ヒトおよびマウスにおいて以前に観察されたように(Becker et al., 1973; Berger et al., 1998)急速に循環から消失する。その円板状の形状を保存するために細胞透過性カルシウムキレート剤EGTA-AMおよびアクチンフィラメント反矢じり端キャッピング剤サイトカラシンBで処置された(Winokur and Hartwig, 1995)、冷却しかつ再び温められた血小板(低温+CytoB/EGTA)は、これらの血小板がインビトロでトロンビン、ADPまたはコラーゲン関連ペプチド(CRP)で誘導される凝集により決定されるように十分に機能するという事実(図1B)にもかかわらず、冷却した未処置の血小板と同じ位急速に去った。輸注の直後の注入された血小板の回復は50〜70%で、血小板消失の反応速度は、発明者らが血小板を標識するために111インジウムまたはCMFDAを用いても、区別がつかなかった。室温のおよび冷却したマウス血小板の相対的な生存割合は、同じように処置されたマウス血小板(Berger et al., 1998)およびヒト血小板(Becker et al., 1973)に対して以前に報告された値に似ている。
肝臓による冷却した血小板のクリアランスおよび血小板分解の証拠は、クッパー細胞、肝臓の主要な食作用性スカベンジャー細胞による冷却した血小板の認識および摂取と矛盾がない。図1Dは、輸注後1時間のマウス肝臓部位の代表的な共焦点顕微鏡写真における食作用性クッパー細胞および付着した冷却したCMFDAで標識された血小板の位置を示す。類洞マクロファージを、ナイルレッドでしるしがつけられた1 μmのカルボキシル修飾ポリスチレン微小球の注射により可視化した。輸注された血小板およびマクロファージの共存は、両方の蛍光発光の合体した顕微鏡写真中で黄色で示される。冷却した血小板は、ナイルレッドで標識された細胞と共に類洞マクロファージに富む部位である肝臓腺房の門脈周囲領域および中央帯状領域(midzonal domain)中に選択的に局在する(Bioulac-Sage et al., 1996; MacPhee et al., 1992)。
CR3(αMβ2インテグリン; CD11b/CD18; Mac-1)は、肝臓のマクロファージによるクリアランスと無関係の抗体の主要な媒介物である。図2aは、両方の血小板集団のクリアランスが野生型マウスのそれ(図1a)と比較してCR3欠損マウスにおいてより短いが、冷却した血小板がCR3欠損動物において室温血小板と同じ反応速度で循環することを示す。野生型マウスと比較してCR3欠損マウスによるわずかに早い血小板除去速度の理由は不確かある。冷却しかつ再び温められた血小板はまた、CR3を介する食作用およびクリアランスを促進する主要なオプソニンを失っている、補体因子3 C3欠損マウス(図2c)およびフォンウィルブランド因子(vWf)欠損マウス(Denis et al., 1998)(図2b)からも急速に取り除かれる。
野生型肝臓類洞への血小板付着はさらに、生体内顕微鏡法により調べられ、一緒に注入された冷却した付着血小板と室温で貯蔵された付着血小板の間の比率を決定した。図3は、冷却したおよび室温の血小板の両方が類洞領域に高いクッパー細胞密度で取り付いているが(図3aおよび図3b)、室温血小板より2.5から4倍多くの冷却した血小板が野生型マウスにおけるクッパー細胞に取り付いている(図3c)ことを示す。対照的に、CR3欠損マウスにおけるクッパー細胞に付着している血小板の数は、冷却または室温曝露に無関係であった(図3c)。
GP1bα、vWfに対するGP1b-IX-V受容体複合体の構成要素は、インビトロである条件下でCR3に結合できるので(Simon et al., 2000)、発明者らは、GP1bαをCR3に対する冷却した血小板上の可能性ある対の受容体として調査した。O-シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼは、マウス血小板GP1bαの45-kDa N末端細胞外ドメインを切断し、αIIbβ3、α2α1、GPVI/FCRγ鎖およびプロテアーゼで活性化された受容体などの他の血小板受容体を無傷の状態にしておく(Bergmeier et al., 2001)。よって、発明者らは、GP1bαの細胞外ドメインのこの部分をマウス血小板からO-シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼで取り除き(図4A挿入図)、室温または低温インキュベーション後にマウスにけるそれら生存を試験した。図4Aは、冷却した血小板がGP1bαの切断後にもはや急速なクリアランスを呈さないことを示す。加えて、GP1bαを除去された室温で処置された血小板は、GP1bαを含む室温対照と比較した場合、わずかに延長した生存時間(〜5〜10%)を有する。
図4Bは、血小板の冷却はマウス血小板表面上でGP1bαの分布の変化をもたらすが、ボトロセチンで活性化されたvWfは低温血小板上と同様に、室温でもGP1bαに良好に結合することを示す。免疫金で標識されたモノクローナルマウス抗GP1bα抗体により同定される、GP1bα分子は、室温で休止円板状血小板の滑面上に直線状の凝集物を形成する(図4C、RT)。この配置は、休止血液血小板の構造についての情報と矛盾がない。GP1bαの細胞質ドメインは、フィラメントA分子の仲介を介して血小板膜の平面に接して曲がるロングフィラメントに結合する(Hartwig and DeSisto, 1991)。冷却後(図4C、冷却)、多くのGP1bα分子は、内部アクチン再構成により変形する血小板膜にわたるクラスターとして組織化する(Hoffmeister et al., 2001; Winokur and Hartwig, 1995)。
TGF-β1および1,25-(OH)2ビタミンD3を用いるヒト単球様THP-1細胞の分化は、CR3の発現を〜2倍まで増加する(Simon et al., 1996)。冷却は、CR3による血小板取り込みの中央値と矛盾しない、未分化THP-1による血小板食作用の3倍の増加および分化したTHP-1細胞による〜5倍の増加をもたらす(図5Bおよび図5C)。対照的に、THP-1細胞の分化は、室温で貯蔵された血小板の取り込みに対して有意な効果を有さない(図5Aおよび図5c)。GP1bαが冷却したヒト血小板上でCR3媒介食作用の対の受容体かどうか決定するために、発明者らは、GP1bαの細胞外ドメインを除去するために、ヘビ毒メタロプロテアーゼ モカラギンを用いた(Ward et al., 1996)。モカラギンでのヒト血小板の表面からのヒトGP1bαの除去は、冷却後のその食作用を〜98%まで減じた(図5C)。
表1は、冷やすことがGP1bαよりほかの血小板受容体の発現またはそれらのリガンドとの相互作用に影響を与えるかどうかを試験した実験の結果である。これらの実験は、αIIbβ3インテグリン密度であるP-セレクチンの発現、またはαIIbβ3活性化のマーカーであるαIIbβ3フィブリノーゲン結合に対して検出可能な効果を示さなかった。冷却はまた、アポトーシスの指標、ホスファチジルセリン(PS)露出も増加せず、またIgGまたはIgMイムノグロブリンの血小板結合をも変化しなかった。
野生型マウスにおけるそれらの急速なクリアランスにもかかわらず、CM-オレンジまたはCMFDAで標識された冷却した血小板は、3つの独立の方法により決定されるように、CR3欠損マウスの中に注入後24時間機能した。第1に、冷却した血小板は、標準化された尾静脈出血傷から現れる流血中の血小板凝集物の中に取り込まれる(図6)。野生型マウスの中に輸注されたCMFDA陽性室温血小板(図6b)およびCR3欠損マウスの中に輸注されたCNIFDA陽性冷却した血小板は(図6d)、レシピエントマウスのCMFDA陰性血小板と同じ程度に流血中に凝集物を形成させた。第2に、トロンビンによるエクスビボ刺激に続いて、CR3欠損マウスの中へのCM-オレンジで標識された冷却しかつ再び温められた血小板の輸注後24時間のαIIbβ3上のフィブリノーゲン結合部位の血小板表面露出により決定される。第3に、冷却しかつ再び温められたCM-オレンジ血小板は、トロンビン活性化に反応してP-セレクチンの上方制御する能力が十分あった(図6e)。
低温で誘導される血小板形状変化単独ではインビボで血小板クリアランスをもたらさない
冷やすことは、細胞内細胞骨格再構成により媒介される広範囲な血小板形状変化を急速に誘導する(Hoffmeister et al., 2001; White and Krivit, 1967; Winokur and Hartwig, 1995)。これらの変化は、再び温めることにより、完全にではないが部分的に可逆であり、再び温められた血小板は、円板状というより球状である。トロンビンによりエクスビボで活性化された注入されたマウスおよびヒヒ血小板は、広範囲な形状変化を伴い正常に循環するという証拠にもかかわらず(Berger et al., 1998; Michelson et al, 1996)、血小板の円板状の形状の保存が血小板生存の主要な必要条件であるという考えはドグマとなっている。ここに、発明者らは、冷却が形状変化とは独立にそれらの除去を媒介する血小板表面の特定の変化をもたらし、そして形状変化それ自体は急速な血小板クリアランスをもたらさないということを示している。薬学的作用剤と一緒に円板として保存される、冷却しかつ再び温められた血小板は、未処置の冷却した血小板と同じ速度で消え、ゆがんだ冷却しかつ再び温められた血小板は、CR3欠損マウスにおいて室温で維持された血小板のように循環する。血小板の小さなサイズは、これら広範囲の形状の異常にかかわらず捕捉を逃れ、循環中に残ることを可能にする可能性がある。
ヒトにおける正常な血小板寿命は、約7日である(Aas, 1958; Ware et 2000)。播種性血管内凝固の間に起こるような、大規模な凝固反応は血小板減少症を引き起こすので、連続的な機械的ストレスにより発生する小さな血塊の中への血小板の取り込みは疑いなく、血小板クリアランスの一因となる(Seligsohn, 1995)。インビボ血小板刺激は傷つけられた血管壁上で起こり、活性化された血小板はこれらの部位で急速に隔離されるので、このような凝固反応における血小板の運命は、Michelson et al(Michelson et al., 1996)およびBerger et al(Berger et al., 1998)の実験におけるような注入されたエクスビボで活性化された血小板のそれとは異なる。
休止している円板状血小板の表面上のGP1bαは、フィラミンAおよびフィラミンBにより膜直下のアクチン細胞骨格に付着する、GP1bα、GP1XおよびGP1Vを伴う複合体中に直線的な配列(図5)で存在する(Stossel et al., 2001)。止血におけるその役割は、血管損傷の部位でvWfの活性化型に結合することである。活性化されたvWfは休止したまたは刺激された血小板上でGP1bαに等しくよく結合するので、活性化されたvWfへのGP1bα結合は、本質的であり、血小板からの積極的な寄与を必要としない。トロンビンおよび他のアゴニストによる懸濁液中の血小板の刺激は、血小板に部分的に血小板表面から開放小管系(open canalicular system)である内膜ネットワークの中への再分布を引き起こすが、インビボで血小板クリアランス(Berger et al., 1998; Michelson et al., 1996)またはインビトロで食作用(刊行されていない知見)をもたらさない。しかしながら、血小板の冷却は、内部移行よりむしろGP1bαクラスター形成を引き起こす。それはサイトカラシンBの存在下で起こるので、このクラスター形成は、反矢じり端アクチン集合には関係ない。
著しい血小板形状変化は15℃より低い温度でのみ明らかになるが、精密な生化学的な解析は、細胞骨格変化およびトロンビンへの反応性の増加が37℃を下回る温度で検出可能であることを示す(Faraday and Rosenfeld, 1998; Hoffmeister et al., 2001; Tablin et al., 1996)。低温で曝露された血小板とトロンビンまたはADPで刺激された血小板の間に残る多くの機能的な差違のために、発明者らは、それらの変化を「プライミング」として言及する。血小板活性化は、中核体温に供される冠状血管および脳血管において潜在的に致死性であるので、発明者らは、血小板が中心循環の中核温度で比較的不活性であるが、進化の歴史を通じてもっとも出血を受けやすい部位である、外側の体表のより低い温度で活性化に対して予備刺激される状態になるよう設計された、温度センサーであることを提案している(Hoffmeister et al., 2001)。ここに報告された発見は、GP1bαの不可逆性の変化が冷やした血小板のクリアランスの理由であることを示唆する。冷却した血小板を循環させることよりむしろ、生物体が食作用により低温で予備刺激された血小板を取り除く。
冷却した血小板食作用におけるαMβ2(CR3)レクチンドメインの影響
αMβ2(CR3)は、マンナン、グルカンおよびN-アセチル-D-グルコサミン(GlcNAc)に結合し、そのIドメインに「C-T」を位置する、カチオン非依存性糖結合レクチン部位を有する(Thornton et al, J. Immonol. 156, 1235-1246, 1996)。CD16b/αMβ2膜複合体は、β-グルカン、N-アセチル-D-ガラクトサミン(GalNAc)、およびメチル-α-マンノシドにより分裂するが、他の糖により分裂しないので、この相互作用はαMβ2インテグリン(CR3)のレクチン部位で起こると見られている (Petty et al, J. Leukoc. Biol. 54, 492-494, 1993; Sehgal et al, J. Immunol. 150, 4571-4580, 1993)。
血小板食作用に対する単糖の効果を分析するために、食細胞(分化された単球性細胞株THP-1)を種々の濃度で単糖溶液中でインキュベートし、冷却したまたは室温の血小板を添加した。図中の値は、RT血小板または冷却した血小板と共にインキュベートされた摂取された血小板を含むオレンジ陽性単球の百分率を比較する3〜5実験の平均±SDである。100 mM D-グルコースが冷却した血小板食作用を65.5%(P<0.01)まで抑制したのに対し、100 mM D-ガラクトースは冷却した血小板食作用を有意に抑制しなかった(n=3)(図8A)。100 mMは90.2%まで抑制したが、D-グルコースα-アノマー(α-グルコシド)は冷却した血小板食作用に対する抑制的な効果を有さなかった(図8B)。対照的に、β-グルコシドは用量依存的動態で食作用を抑制した(図8B)。100 mM β-グルコシドとの食細胞のインキュベーションは、食作用を80%まで(P<0.05)、および200 mMは97%まで(P<0.05)抑制した、したがって発明者らはβ-アノマーが好ましいと結論を下した。D-マンノースならびにそのα-およびβ-アノマー(メチル-α-D-マンノピラノシド(図8C)およびメチル-β-D-マンノピラノシド(図8C))は、冷却したまたはRT血小板食作用に対して抑制的な効果を有さなかった。25から200 mM GlcNAc(N-アセチル-D-グルコサミン)との食細胞のインキュベーションは、冷却した血小板食作用を有意に抑制した。25 mM GlcNacとのインキュベーションは、冷却した血小板の食作用を86%(P<0.05)まで抑制するのに十分であった(図8D)のに対し、10 μMのGlcNAcのβ-アノマーは冷却した血小板の食作用を80%(P<0.01)まで抑制した(図8D)。どの単糖もRT血小板食作用に対する抑制的な効果を有さなかった。表2は、冷却した血小板食作用に対する表示された濃度での単糖の抑制的な効果を要約する(**P<0.01、*P<0.05)。どの単糖も、P-セレクチン露出により測定されるような、トロンビンまたはリストセチン(ristocetin)で誘導されるヒト血小板凝集またはα-顆粒分泌誘導を抑制しなかった。
β-GlcNAcは、μM濃度でインビトロで冷却したヒト血小板食作用を強力に抑制し、GlcNAcが低温での血小板のインキュベーション後に露出されることを示した。その後、発明者らは、末端糖(GlcNAc)に対して特異性を持つレクチンであるコムギ胚芽凝集素(WGA)が室温血小板より冷却した血小板により効果的に結合するかどうか調べた。洗浄された、冷却したまたは室温の血小板を2μg/mlのFITC結合WGAまたはFITC結合スクシニル-WGAと一緒に30分間室温でインキュベートし、フローサイトメトリーにより分析した。図9Aおよび図9Bは、室温(RT)または冷却した(低温)ヒト血小板のFITC-WGAとのインキュベーション後のドットプロットを示す。WGAは、25〜50 μg/ml WGAの間の濃度で血小板凝集およびセロトニンまたはADPの遊離を誘導する(Greenberg and Jamieson, Biochem. Biophys. Acta 345, 231-242, 1974)。2 μg/ml WGAとのインキュベーションは、RT-血小板の有意な凝集を誘導しなかった(図9A、RT w/WGA)が、2μg/ml WGAとの冷却した血小板のインキュベーションは、大規模な凝集を誘導した(図9B、冷温/w WGA)。図9Cは、冷却したまたは室温の血小板に結合するFITC-WGA蛍光の分析を示す。蛍光結合の増加が凝集に関係しないことを実証するために、発明者らは、血小板凝集を誘導しないレクチンの二量体誘導体であるスクシニル-WGA(S-WGA)を用いた(Rendu and Lebret, Thromb Res 36, 447-456, 1984)。図9Dおよび図9Eは、スクシニル-WGA(S-WGA)が室温のまたは冷却した血小板の凝集を誘導しなかったが、室温血小板に対して冷却した血小板へのWGA結合の同様の増加を結果として生じる(図9F)ことを示す。血小板の冷却後のS-WGAの増強された結合を、37℃に冷却した血小板を温めることにより逆転させることは出来ない。
酵素β-ヘキソサミニダーゼは、オリゴ糖からの末端のβ-D-N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)およびガラクトサミン(GalNAc)残基の加水分解を触媒する。GlcNAc残基の除去が血小板表面へのWGA結合を減ずるかどうか分析するために、冷却したおよび室温の洗浄されたヒト血小板を37℃で30分間100 U/ml β-Hexで処置した。図11Aは、β-ヘキソサミニダーゼ処理の前および後にフローサイトメトリーにより得られた、室温のまたは冷却した血小板の表面へのFITC-WGA結合の概要を示す。冷却した血小板へのFITC-WGA結合は、GlcNacの除去後85%まで減ぜられた(n=3)。発明者らはまた、予想通りに、血小板表面からのGP1bαの除去が血小板冷却後WGA結合の減少をもたらすかどうか確認した。以前に記載されているように(Ward et al, Biochemistry 28, 8326-8336,1996)、GP1bαをヘビ毒モカラギン(MOC)を用いて血小板表面から除去した。図11Bは、血小板表面からのGP1bα除去が冷却した血小板へのFITC-WGA結合を75%まで減じ、GP1bαを除去した室温血小板へのWGA結合に対してほとんど影響がないことを示す(n=3)。これらの結果は、WGAは主としてヒト血小板の冷却後、GP1bα上でオリゴ糖に結合するということを示し、Mac-1レクチン部位はまた、食作用をもたらすGP1bα上でこれら露出した糖も認識すると推測したくなる。
血小板の上へガラクトース転移を成し遂げるために、単離されたヒト血小板を200μM UDP-ガラクトースおよび15 mU/mlガラクトースと共に37℃で30分間インキュベートし、続いて2時間冷却または室温で維持した。ガラクトシル化は、ほぼ休止室温レベルまでFITC-WGA結合を減らした。血小板を単球に摂食させ、血小板食作用を上に記載されたように分析した。図12は、血小板オリゴ糖の上へのガラクトース転移は冷却した血小板(低温)食作用を大幅に減らすが、室温(RT)血小板の食作用に影響を与えないことを示す(n=3)。これらの結果は、冷却した血小板のインビトロ食作用が露出したGlcNAc残基の被覆を介して減ぜられ得ることを示す。発明者らは、このやり方が動物に拡大され、冷却した血小板の循環時間を増大するよう用いられ得るかどうか試験した。マウス血小板を単離し、CMFDAで染色した。上でヒト血小板に対して記載された同じガラクトース転移のやり方を用いて、野生型マウス血小板をガラクトシル化し、2時間冷蔵したまたはしなかった。108の血小板を野生型マウスの中に輸注し、その生存を決定した。図13は、未処置の血小板に対するこれらの冷却した、ガラクトシル化されたマウス血小板の生存を示す。両方の血小板は室温(RT)で保たれ、ガラクトシル化された冷却した血小板(低温+GalT)はほとんど同じ生存時間を有していたのに対し、冷却した未処置の血小板(低温)は予測されたように急速に取り除かれた。発明者らは、ガラクトシル化され冷却した血小板はヒトにおいて循環すると考えられると確信している。
別の実験一式において、発明者らは、14Cで標識されたUDP-ガラクトースが酵素ガラクトシルトランスフェラーゼ存在または非存在下で時間依存性動態でヒト血小板の中に取り込まれることを示している。図15は、洗浄されたヒト血小板の中への14Cで標識されたUDP-ガラクトース取り込みの経時変化を示す。ヒト血小板をガラクトシルトランスフェラーゼの非存在下で異なる時間間隔で14Cで標識されたUDP-ガラクトースと共にインキュベートした。その後、血小板を洗浄し、血小板に関連する14C放射能を測定した。
血小板β-グリカンの酵素的な修飾は、インビトロでマクロファージによる冷やした血小板の食作用を抑制し、インビボで正常な循環に適応させる
発明者らの予備的な実験は、冷却したヒト血小板表面の上へのガラクトース転移(グリカン修飾)を用いるGP1bα上のGlcNAc残基の酵素的な被覆が、そのインビトロ食作用を大幅に減らすことを明らかにしている。これらの発見の1つの解釈は、GP1bα構造が冷却したヒトおよびマウス血小板の表面上で変化したというものである。これは、血小板除去をもたらすαMβ2のレクチン結合ドメインにより認識される、GlcNAcの露出またはクラスター形成を引き起こす。β-GlcNAc露出は、WGA結合によりおよびあるいは組換えαMβ2レクチンドメインペプチドの結合により測定され得る。休止ヒト血小板は、冷却後に大幅に増加する、WGAに結合する。発明者らは、ガラクトース転移(グリカン修飾)は、vWfではなくαMβ2-レクチンとのGP1bαの相互作用を妨げると考えられることを提案する。この修飾(血小板表面上へのガラクトース転移)は、発明者らの予備的な実験により示されるように、WTマウスにおける冷却した血小板の正常な生存をもたらす。
この実施例は、αMβ2レクチン部位模倣体WGAおよび糖修飾が冷却した血小板と組換えレクチン部位の結合を妨げることを示す。Dr. T. Springer (Corbi, et al., J Biol Chem. 263, 12403-12411, 1988)は、ヒトαM cDNAおよびいくつかの抗αM抗体を提供した。報告されているレクチン活性を示す最も小さいr-huαM構築物は、そのC-Tおよびその二価カチオン結合領域の1部分(残基400〜1098)を含む(Xia et al, J Immunol 162, 7285-7293, 1999)。構築物は、精製の容易さのために6xHisで標識される。発明者らは第1に、組換えレクチンドメインが食作用アッセイにおいて冷却した血小板摂取の競合的な阻害剤として用いられ得るかどうか決定した。競合は、αMレクチン部位が血小板表面への結合を媒介し、食作用を開始することを証明した。対照として、αMのレクチン結合領域を欠く構築物を用い、組換えタンパク質を変性した。レクチン結合ドメインは、冷却した血小板摂取の特異的阻害剤として機能する。発明者らは、GFPを含みかつ発現するαM構築物を作製し、FITCでαM-レクチン結合部位を標識し、フローサイトメトリーにより冷却した血小板の表面を標識するためにそれを用いた。血小板をCMFDAで標識した。発明者らは、冷却した血小板が室温血小板と比較してαMβ2インテグリンのαMレクチン部位により効果的に結合することを見出した。レクチン部位およびαM-構築物全体(Mac-1)をSf9昆虫細胞中で発現した。
この実施例は、冷却し修飾されていないおよび冷却しガラクトシル化された(修飾された)血小板がインビトロおよびインビボで止血機能を有することを明らかにする。冷却した血小板は、アゴニストで刺激された血小板という意味で「活性化」されない。低体温条件下で手術を受ける患者は、血小板減少を発生する、または重篤な術後止血障害を示す可能性がある。これら低体温条件下で、血小板はその機能性を喪失する可能性があると考えられている。しかしながら、患者が低体温手術を受ける場合、生物体全体が結果的に複数の組織で変化をもたらす低体温に曝露される。肝臓類洞内皮細胞への冷却しない血小板の付着は低温保存損傷の主要な機構である(Takeda, et al. Transplantation 27, 820-828, 1999)。従って、それは、血小板冷却それ自体ではなく、手術の低体温条件または低温で保存された器官の移植下で有害な結果をもたらす、低温肝臓内皮と血小板の間の相互作用であると思われる(Upadhya et al, Transplantation 73, 1764-1770, 2002)。2つのやり方が冷却した血小板が止血機能を有することを示した。1つのやり方において、αMβ2欠損マウスにおける冷却した血小板の循環が、冷却後血小板機能の試験を容易にする。他のやり方において、修飾され冷却したおよび(多分)循環する血小板の機能を試験した。
インビトロ血栓症モデル
第1に、発明者らは、二重に蛍光で標識された血小板を用いてαMβ2欠損マウスの傷つけられた内皮へのRTのおよび修飾されず冷却した血小板の送達を示す。静止した血管を4分間モニターし、その後塩化第二鉄(30 μlの250-mM溶液)(Sigma, St Louis, MO)を灌流により細動脈の上部に適用し、更に10分間ビデオ記録を再開する。中心線赤血球速度(centerline erythrocyte velocity)(Vrbc)を撮影する前および塩化第二鉄損傷後10分、測定する。ずり速度を、Newtonian流体に対するPoiseuille's lawに基づいて計算する(Denis, et al, Proc Natl Acad Sci USA 95, 9524-9529, 1998)。これらの実験は、冷却した血小板が正常な止血機能を持つかどうかを示す。発明者らは、同じマウスの中に注射された2つの異なる蛍光で標識された血小板集団を用いてRTのおよびガラクトシル化され冷却した血小板を比較するWTマウスにおけるこれらの実験を繰り返し、両方の血小板集団の血栓形成および取り込みを分析する。
血小板濃縮物における血小板のガラクトシル化
4つの異なる血小板濃縮物をUDP-ガラクトースの増加濃度:400 μM、600 μMおよび800 μMで、処置した。今後の実験は、10 μMと5000 μMの間のUDPガラクトースを用いる。RCA結合比率測定は、4つの試験された試料中のガラクトシル化の用量依存性増加を示した(図16)。発明者らの結果は、ガラクトシル化が血小板濃縮物中で可能であるという証拠を提供する。
低温中で貯蔵された、UDP-ガラクトースで処置された血小板のインビボ生存の評価
活性化された糖質基質UDP-ガラクトースの使用を伴うヒト血小板をガラクトシル化するための技術は、冷蔵(4℃)下での大規模ヒト血小板貯蔵を可能にする可能性がある。4℃で貯蔵された未処置の血小板は、循環から急速に取り除かれる。対照的に、室温で貯蔵された、未処置の血小板は、輸注の後で、5〜7日間生存する。本試験は、ガラクトシル化され修飾されたヒト血小板が、個体の中に自己由来で注入された場合、インビボで循環することを明らかにすることを企図される。
CMP-シアル酸から内因性血小板シアリルトランスフェラーゼ活性により触媒される血小板複合糖質上に露出したβ-ガラクトースへのシアル酸の酵素的転移の立証
本実施例は、ヒト血小板が、CMP-シアル酸から露出したβ-ガラクトース残基を有する外因性高分子量基質ならびに血小板中の内因性複合糖質へのシアル酸の転移を触媒し得る、内因性シアリルトランスフェラーゼ活性を含むという証拠を提供する。酵素的な修飾は、外因性シアリルトランスフェラーゼの添加なしかつ供与体基質CMP-シアル酸単独の単純な添加により成し遂げられ得る。
表面シアル酸低減を伴う血小板は急速にインビボで取り除かれる
本実施例は、表面シアル酸の減少および故のガラクトースの露出が、哺乳動物の中への自家移植または異種移植後に循環からの血小板の除去増加をもたらすことを明らかにする。シアリルトランスフェラーゼは、α2-3、α2-6またはα2-8結合いずれか中の種々のグリカンへのシアル酸の転移を触媒する18種類の酵素のファミリーである。血漿成分に取り付く大部分のシアル酸は、6つの異なるST3Galトランスフェラーゼ(ST3Gal I-IV)の1つにより合成される、α2-3結合型である。異なるシアリルトランスフェラーゼが欠損しているマウスの試験は、ST3Gal-IVが血小板の機能および止血の最も重要な修飾因子であることを示唆している(Ellies, LG, et al., PNAS 99: 10042-10047を参照のこと)。Elliesらは、マウスにおける2,3シアリルトランスフェラーゼIVの欠如が血小板数低下をもたらし、KOマウスからの血小板はGalβ4GlcNAc-Rに結合する2,3シアル酸を欠くことを明らかにする。血小板数低下は、血小板形成の抑制または/および血小板生存の減少の結果であることが示唆された。著者らは、血小板数低下の主な理由はアシアロ糖タンパク質受容体による血小板取り込み増加であることを示唆する。これは、競合的阻害剤タンパク質アシアロフェツインの投与が血小板数を正すという事実により示唆される。これは、提案された機構の強力な指標だが、Elliesらは、(シアリル化低下を伴う)KO血小板が本実施例により図示される、生存減少を有することを示していない。加えて、KO血小板の再シアリル化がその生存をレスキューすることは、本発明のある態様により正しく認識される。
シアリル化は非冷蔵マウス血小板の生存を改善する
本実施例は、血小板調製物が室温(約18℃から25℃)で維持された場合に、UDP-ガラクトースおよびCMP-シアル酸でのマウス血小板のグリコシル化が生存増加および貯蔵障害低減ををもたらすことを明らかにする。以前に、フォンウィルブランド因子受容体(VWF)複合体が、そのレクチンドメインを介してVWF受容体のGPi1bαサブユニット上の露出したβN-アセチルグルコサミン(βGlcNAc)残基に結合する、肝臓のマクロファージ上のαMβ2-インテグリンにより認識されることが明らかにされている。ガラクトシル化による露出したGlcNAcの被覆は、冷却した血小板の認識およびクリアランスを防ぐ。さらに、血小板は循環中または貯蔵時のいずれか時間とともに表面シアル酸を失うことが公知である。理論に制限されることなしに、これは膜表面上でのグリカンの交換から、ならびに一部分膜の流動性のために起こる。このシアル酸の喪失は、アシアロ受容体により認識され得る最後から2番目のガラクトースの露見をもたらす。冷却されない血小板の再ガラクトシル化および再シアリル化が血小板生存を増大するかどうか試験するために、発明者らは、ガラクトシル化された血小板とガラクトシル化されていない血小板の生存を比較する輸注実験を行った。図70に見られるように、より大きなの割合シアリル化されかつガラクトシル化された血小板(黒四角)が、未処置対照(白四角)と比べて異なる時点で回復され得る。グリコシル化が未処置の血小板に比べて異種的に輸注され冷却されずグリカン修飾された血小板の生存を増大することを明らかにする。
Claims (47)
- 血小板集団を得る段階、および血小板を少なくとも1つのグリカン修飾剤の有効量と接触させ、それによりその末端で修飾された表面グリカン残基を有する修飾された血小板集団を生ずる段階を含む方法であって、修飾された血小板集団が哺乳動物の中に移植された時、少なくとも修飾されていない血小板と同じくらいの長さ哺乳動物中を循環する、血小板集団の循環時間を増大するための方法。
- グリカン修飾剤が、CMP-シアル酸またはCMP-シアル酸前駆体である、請求項1記載の方法。
- CMP-シアル酸前駆体を有する血小板集団に、CMP-シアル酸前駆体をCMP-シアル酸に変換する酵素を添加する段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
- グリカン修飾剤が、CMP-シアル酸およびUDP-ガラクトースである、請求項1記載の方法。
- 血小板をグリカン修飾剤と接触させる前に、接触と同時に、または接触後に血小板集団を冷却する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 血小板をグリカン修飾剤と接触させる前に、接触と同時に、または接触後に室温で血小板集団を貯蔵する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 血小板集団が、哺乳動物の中に移植される時、実質的に正常な止血活性を保持する、請求項5または6記載の方法。
- 血小板集団が哺乳動物の中に移植される時、修飾されていない血小板の循環半減期より約5%またはそれより長い循環半減期を有する、請求項5または6記載の方法。
- 修飾された血小板集団がヒトの中への移植に適している、請求項1記載の方法。
- 血小板集団を得る段階、および血小板を少なくとも1つのグリカン修飾剤の有効量と接触させ、それによりその末端で修飾された表面グリカン残基を有する修飾された血小板集団を生ずる段階、および血小板集団中で微生物の増殖を低減するために血小板を冷却し、それにより血小板集団の貯蔵時間を増大する段階を含む、血小板の貯蔵時間を増大するための方法。
- グリカン修飾剤が、CMP-シアル酸またはCMP-シアル酸前駆体である、請求項10記載の方法。
- CMP-シアル酸前駆体を有する血小板集団に、CMP-シアル酸前駆体をCMP-シアル酸に変換する酵素を添加する段階をさらに含む、請求項11記載の方法。
- グリカン修飾剤が、CMP-シアル酸およびUDP-ガラクトースである、請求項10記載の方法。
- 血小板をグリカン修飾剤と接触させる前に、接触と同時に、または接触後に血小板集団を冷却する段階をさらに含む、請求項10記載の方法。
- 血小板をグリカン修飾剤と接触させる前に、接触と同時に、または接触後に室温で血小板集団を貯蔵する段階をさらに含む、請求項10記載の方法。
- 血小板集団が、哺乳動物の中に移植される時、実質的に正常な止血活性を保持する、請求項14または15記載の方法。
- 血小板集団が哺乳動物の中に移植される時に、修飾されていない血小板の循環半減期より約5%またはそれより長い循環半減期を有する、請求項14または15記載の方法。
- 修飾された血小板集団がヒトの中への移植に適している、請求項10記載の方法。
- 修飾されてない血小板と比べて哺乳動物移植後により長い生存を有する、血小板の表面上に複数の修飾されたグリカン分子を含む修飾された血小板。
- 血小板の表面上の修飾されたグリカン分子が、その末端でガラクトシル化される、請求項19記載の修飾された血小板。
- 血小板の表面上の修飾されたグリカン分子が、その末端でシアリル化される、請求項19記載の修飾された血小板。
- 修飾されたグリカン分子が、GP1bα分子である、請求項19記載の修飾された血小板。
- GP1bα分子が少なくとも1つの単糖を有するその末端で修飾される、請求項22記載の修飾された血小板。
- 単糖がガラクトースである、請求項23記載の修飾された血小板。
- 単糖がシアル酸である、請求項23記載の修飾された血小板。
- GP1bα分子が、単糖、ガラクトース、およびシアル酸で修飾される、請求項23記載の修飾された血小板。
- 請求項19記載の修飾された血小板を含み、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、薬学的組成物。
- 血小板の表面上の修飾されたグリカン分子が、その末端でガラクトシル化される、請求項27記載の薬学的組成物。
- 血小板の表面上の修飾されたグリカン分子が、その末端でシアリル化される、請求項27記載の薬学的組成物。
- 修飾された血小板が、出血性疾患で苦しめられているヒト患者の中への移植に適している、請求項27記載の薬学的組成物。
- 組成物がヒトへの投与前に少なくとも5日間冷却貯蔵可能で、かつ該組成物が修飾されない血小板に比べてヒトにおいて止血機能の有意な喪失または血小板クリアランスの有意な増加なしに貯蔵後ヒトの中に移植可能である、請求項27記載の薬学的組成物。
- 複数の修飾された血小板を含み、血小板が少なくとも24〜60時間貯蔵される能力があり、かつ血小板調製物が修飾されない血小板に比べてヒトにおいて止血機能の有意な喪失または血小板クリアランスの有意な増加なしに貯蔵後ヒトへの投与に適している、安定な血小板調製物。
- 修飾された血小板が、そのGP1bα分子の末端でガラクトシル化される、請求項32記載の安定な血小板調製物。
- 修飾された血小板が、そのGP1bα分子の末端でシアリル化される、請求項32記載の安定な血小板調製物。
- 血小板が、低温で貯蔵される能力のある、請求項32記載の安定な血小板調製物。
- 血小板が、修飾されていない血小板と比較して生物活性の実質的な低減なしに室温で貯蔵される能力がある、請求項32記載の安定な血小板調製物。
- 請求項32、35、または36に記載の安定な血小板調製物を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における止血を媒介するための方法。
- 周囲に対して実質的に閉ざされた、血小板集団を収容しかつ含む能力のある滅菌した容器、および容器中に収集されかつ貯蔵された血小板の容量を修飾するのに十分な量の滅菌したグリカン修飾剤を含み、使用のための適切なパッケージング材料および説明書をさらに含む、キット。
- グリカン修飾剤が、UDP-ガラクトースである、請求項38記載のキット
- グリカン修飾剤が、CMP-シアル酸である、請求項38記載のキット。
- グリカン修飾剤が、CMP-シアル酸およびUDP-ガラクトースである、請求項38記載のキット。
- 容器が、血小板の低温貯蔵に適している、請求項38記載のキット。
- GP1bα分子を有する複数の血小板を得る段階、および血小板をグリカン修飾剤と接触させる段階を含み、グリカン修飾剤が血小板上のGP1bα分子の末端をガラクトシル化またはシアリル化する、血小板糖タンパク質を修飾する方法。
- 請求項43に従う修飾された糖タンパク質および改良された貯蔵特性を有する血小板を含む、輸注可能な血小板調製物。
- 血小板を有する血液の試料を得る段階、および少なくとも血小板をグリカン修飾剤と接触させる段階を含み、グリカン修飾剤が血小板上のGP1bα分子の末端をガラクトシル化またはシアリル化する、血液成分を修飾する方法。
- 血小板を有する血液の試料を得る段階、少なくとも血小板をグリカン修飾剤に接触させる段階を含み、グリカン修飾剤が血小板上のGP1bα分子の末端をガラクトシル化またはシアリル化し、および修飾された血小板を有する血液試料を約2℃から約18℃の温度で少なくとも3日間貯蔵し、それにより血液試料中の病原体増殖を低減する段階を含む、血液試料中の病原体増殖を低減する方法。
- 血液試料が緩やかに再び温められる、請求項46記載の方法。
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