JP2008511837A - 血液尿素窒素(bun)センサ - Google Patents
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Abstract
Description
(NH2)2CO+H2O⇔2NH3+CO2 (1)
(NH2)2CO+3H2O⇔2NH4 ++HCO3 −+OH− (2)
この例は、酵素が、酵素活性を保持するようにベース・センサの上において固定化される方式を扱う。好ましい材料は、エルバス(ELVACE)(登録商標)であり、これは、コポリマー・ポリ(エチレン)(酢酸ビニル)の水ベース・エマルジョンからなる市販の接着剤である。これは、酵素を固定化するための水浸透性基質(BUNカクテルと呼ばれる)として使用される。
新しいBUNセンサの好ましい実施形態は、薄膜微細製作プロセスおよびマイクロディスペンス技法の組合せを使用して製造される。これは、米国特許第4933048号に記載されているタイプの薄膜銀−塩化銀基準電極と組み合わされて動作する薄膜銀−塩化銀インジケータ電極を備える。
この応用例についてのウレアーゼの理想的な特性は、ウレアーゼが、低残留レベルの関連基板(尿素<0.0002μmol/酵素単位)および他の窒素化合物を有することである。さらに、ウレアーゼは、汚染プロテアーゼがないはずである。25℃において700U/mgたんぱく質を超える比放射能が、理想的な特性である。酵素の準備も、高純度であるべきである。ウレアーゼの他の望ましい特性は、酵素のKmが1から50(mM)の範囲にあり、好ましくは50mMにより近く、Vmaxが16,000(ミクロモル/ml/分)より大きく、またKcatが5×105分−1以上であることである。
この応用分野の炭酸脱水酵素の理想的な特性は、炭酸脱水酵素が低残留レベルの窒素化合物を有し、かつ汚染プロテアーゼがないことである。0℃において2500ウィルバー単位/mgたんぱく質を超える比放射能が、販売業者によって引用されている(Wilbur,K.M.およびN.G.Anderson、1948、Journal of Biological Chemistry、176:147〜154)。酵素の準備は、高純度であるべきである。
文献から、ウレアーゼの最適pHは、pH8.0であると報告されている(Wall&Laidler、1953、The Molecular Kinetics of the Urea−Urease System.IV.The Reaction in an Inert Buffer,Archives of Biochemistry and Biophysics,vol43:307〜311)。我々のデータは、4つのウレアーゼ準備について、6.5から7.4のpH範囲より近い8.0未満のpHが、最適な酵素活性を与えることを示唆する。
尿素についての電位差化学センサは、機能的に異なる構成要素から構築されるシステムと見なすことができる。血液尿素窒素(BUN)センサの一実施形態では、分析物溶液と接触している層である最外層により、尿素を輸送することが可能になり、同時に、酵素ウレアーゼおよび炭酸脱水酵素を固定化するように作用する。これらの酵素は、上述されたように尿素からアンモニアの加水分解に触媒作用を及ぼす。中性pH値において、そのように生成されたアンモニアは、主にアンモニウム・イオンとして存在する。層を含む酵素と銀−塩化銀インジケータ電極との間のアンモニウム・イオンについて高い感度および選択性を有するイオノフォアを含む別の層化構造を挿入することによって、電極境界面におけるアンモニウム・イオンの濃度を測定することができる。このタイプの測定では、インジケータ電極と基準電極との電位差が記録される。
上式で、Eは、測定された起電力(信号)、Rは気体定数、Tは絶対温度、Nは分析物種aに関する電荷の絶対値(たとえば、アンモニウム・イオンではn=1)、Fはファラデー定数、Aは分析物種aの活性、Bは干渉化学種bの活性、ka,bは分析物種aの活性の電気化学電位差決定に対する化学種bの存在に対する影響に関連する干渉係数、E0はT、A、またはBに独立の定数である。ニクルスキの式の追加の議論について、Amman,D.、Ion−Selective Microelectrodes、Springer、Berlin(1986)、68ページおよびそこで引用されている参考文献を参照されたい。
この時点において、この時点において、粒子ラテックスとその膜形成相当物の特性を区別することが重要である。粒子ラテックスは、ポリマー粒子が水媒介性であることを可能にする親水性材料でコーティングされているポリスチレンなどの固体重合構造を備える。粒子ラテックス材料は、従来、酵素を含むすべての種類の生物学的活性材料を固定化するために使用されてきた(Kraemer,D.ら、米国特許第4710825号を参照されたい)。しかし、本応用分野では不適切であるすべてではないいくつかの粒子ラテックスの重要な特性は、これらの材料が乾燥された後でも、水において容易に粒子を再分散することができることである。対照的に、膜形成ラテックスは、親水性最外コーティングを有する酢酸ビニルなどの可動重合液体コアからなるコロイド溶液である。そのような膜形成ラテックスは、水不混和有機モノマーまたはモノマーの混合物が遊離基触媒を含む水溶液媒質に追加されるエマルジョン−重合プロセスによって作成される。重合は、たとえば、機械的な撹拌によって開始することが可能である(たとえば、Vanderhoff,J.W.、J.Poly.Sci.Polymer Symposium 1985、72、161〜198を参照されたい)。この材料が乾燥されるとき、粒子は合着して、水に再分散することができない膜を形成する。膜形成ラテックスは水ベースであり、かつ親水性および疎水性の両方の成分を含むので、これらの組成は、生物学的活性種について安定な環境を提供し、それを固定化または組み込むための有効な媒質を構成することができることを考慮することが可能である。
本発明において記述される微細製造プロセスの重要な態様は、自動システムであり、これは、対象のセンサにおいて使用される材料の精確でプログラム可能な量をマイクロディスペンスすることができる自動システムである。マイクロディスペンス・システムは、真空チャックおよび注射器からなり、それぞれ、これらの要素の垂直、水平、横方向、または回転の変位の1つまたは複数を変化させる別々の手段に添付される。経済性のために、真空チャックの位置を多方向について変化させることができる限り、注射器の垂直変位を変化させる手段を有することが十分である。両要素の移動は、パーソナル・コンピュータによって制御することが可能である。真空チャックの位置は、xまたはy方向において±13ミクロン以上の範囲内において再現可能とすることが可能である。
この時点において、流体の単一液滴が形成され、針から排出されるときに関わる力学を考慮することが有用である。
純粋液体とその蒸気相との間の表面張力は、試薬を追加することによって変化させることができる。たとえば、水に追加された脂肪酸が表面張力を低減し、一方、追加された塩が表面張力を増大させることができる。
規定組成に関連する最適表面張力を有する流体の制御容積ディスペンスに関して上記で議論された因子の他に、基板または流体が上にわたってディスペンスされる表面の表面自由エネルギーを適応させることは、結果として得られる最終寸法、特に厚さに対する制御を提供する。結果的なプロセスは高度に多用途であり、変化した組成および有用性の層のアレイを付着するのを可能にする。
好ましい実施形態は、サンプルにおける分析物の存在または量を決定するために液体サンプルを処理するためのカートリッジおよびその使用方法を提供する。
Claims (54)
- サンプルにおいて尿素を検出するデバイスであって、(a)尿素を含むと思われるサンプルが接触することが可能であるセンサであって、前記センサの少なくとも一部の上に固定化されたウレアーゼおよび炭酸脱水酵素の少なくとも2つの酵素を含むセンサ、ならびに(b)前記センサからの信号を処理するための検出器システムを備える、デバイス。
- 前記センサが、アンモニウム・イオン選択性センサを備える、請求項1に記載のデバイス。
- 前記センサが、pHセンサを備える、請求項1に記載のデバイス。
- 前記センサが、二酸化炭素センサまたは重炭酸センサを備える、請求項1に記載のデバイス。
- 前記センサが、導電率センサを備える、請求項1に記載のデバイス。
- 前記固定化酵素を有さない第2のセンサをさらに備える、請求項1に記載のデバイス。
- 前記センサが、電流滴定電極、電位差電極、導電率測定電極、光学センサ、またはその組合せからなる群から選択される、請求項1に記載のデバイス。
- 前記第2のセンサが、電流滴定電極、電位差電極、導電率測定電極、光学センサ、またはその組合せからなる群から選択される、請求項6に記載のデバイス。
- 前記アンモニウム・イオン選択性センサが、アンモニウム・イオノフォアを含む、請求項2に記載のデバイス。
- 前記アンモニウム・イオン選択性センサが、ノナクチンを含む、請求項2に記載のデバイス。
- 前記アンモニウム・イオン選択性センサが、可塑化ポリマーを含む、請求項2に記載のデバイス。
- 前記センサが、電位差アンモニウム・イオン選択性電極を備える、請求項1に記載のデバイス。
- 前記酵素が層において固定化され、前記層が水浸透性基質を備える、請求項1に記載のデバイス。
- 前記水浸透性基質が、膜形成ラテックスを備える、請求項13に記載のデバイス。
- 前記膜形成ラテックスが、エチレンおよび酢酸ビニルのコポリマーを備える、請求項14に記載のデバイス。
- 前記酵素の少なくとも1つが、化学架橋試薬を介して固定化される、請求項1に記載のデバイス。
- 前記酵素の少なくとも1つが、物理的吸収を介して固定化される、請求項1に記載のデバイス。
- 前記層が緩衝剤をさらに備える、請求項13に記載のデバイス。
- 前記緩衝剤が、リン酸塩、トリス、HEPES、またはその組合せからなる群から選択される、請求項18に記載のデバイス。
- 前記膜形成ラテックスが、リン酸塩、トリス、HEPES、またはその組合せからなる群から選択された緩衝剤を含む、請求項14に記載のデバイス。
- ウレアーゼおよび炭酸脱水酵素の少なくとも2つの酵素が含まれる水浸透性基質を備えるメンブレン。
- 前記少なくとも2つの酵素が、前記水浸透性基質において固定化される、請求項21に記載のメンブレン。
- イオン選択性電極と物理的に接触する、請求項21に記載のメンブレン。
- 検出器と物理的に接触する、請求項21に記載のメンブレン。
- Oリングによってイオン選択性電極に物理的に添付される、請求項21に記載のメンブレン。
- イオン選択性電極と対合することができる固定具に添付される、請求項21に記載のメンブレン。
- 液体混合物を表面上に加え、前記液体混合物が前記表面上において乾燥することを可能にすることによって形成される、請求項21に記載のメンブレン。
- 尿素検出デバイスの構成要素を形成する、請求項27に記載のメンブレン。
- 前記尿素検出デバイスが、電流滴定電極、電位差イオン選択性電極、光学センサ、導電率測定電極、またはその組合せからなる群から選択される、請求項28に記載のメンブレン。
- 前記尿素検出デバイスが、微細製作センサを備える、請求項28に記載のメンブレン。
- 前記微細製作センサが、イオン選択性電極を備える、請求項30に記載のメンブレン。
- 前記微細製作センサが、アンモニウム・イオンに応答する、請求項30に記載のメンブレン。
- 前記水浸透性メンブレンがラテックスである、請求項21に記載のメンブレン。
- 酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリウレタン、グルタルアルデヒドで架橋された牛の血清アルブミン、アクリルアミド、セロファン、膜形成ラテックス、またはその混合物からなる群から選択されたポリマーを備える、請求項21に記載のメンブレン。
- 第1の層でコーティングされた電極を備えるサンプルにおいて尿素を検出するデバイスであって、前記第1の層が、可塑化ポリマー、アンモニウム・イオノフォア、ならびに前記第1の層の上において固定化されたウレアーゼおよび炭酸脱水酵素の少なくとも2つの酵素を備える、デバイス。
- サンプルにおいて尿素を検出するためのデバイスであって、可塑化ポリマーおよびアンモニウム・イオノフォアを備える第1の層と、前記第1の層の少なくとも一部の上にわたって、かつそれと接触して配置され、ウレアーゼおよび炭酸脱水酵素の少なくとも2つの酵素が含まれる水浸透性基質を備える第2の層とでコーティングされた電極を備える、デバイス。
- 前記少なくとも2つの酵素が、前記水浸透性基質において固定化される、請求項36に記載のデバイス。
- サンプルにおいて尿素を検出するための微細製作感知デバイスであって、
(a)パターニングされた微細電極表面を有するほぼ平面の基板と、
(b)可塑化ポリマーおよびノナクチンを備える前記基板の少なくとも一部の上にわたる第1の層と、
(c)前記第1の層の少なくとも一部の上にわたって配置され、ウレアーゼおよび炭酸脱水酵素の少なくとも2つの酵素が含まれる水浸透性基質を備える第2の層とを備える、デバイス。 - 前記ポリマーがポリ塩化ビニルである、請求項38に記載の微細製作感知デバイス。
- 前記パターニングされた微細電極表面が、アンモニウム・イオンの存在に応答して電位を確立する、請求項38に記載のデバイス。
- 前記少なくとも2つの酵素が、前記水浸透性基質において固定化される、請求項38に記載のデバイス。
- 前記第1および第2の層がマイクロディスペンスされる、請求項38に記載のデバイス。
- 酵素ウレアーゼが固定化される層を有する尿素を検出するための改良イオン選択性センサであって、改良が、前記層において少なくとも1つの他の酵素炭酸脱水酵素を固定化することを備える、改良イオン選択性センサ。
- サンプルにおいて尿素を検定する方法であって、尿素を含むと思われるサンプルとウレアーゼおよび炭酸脱水酵素の少なくとも2つの固定化酵素を有するセンサとを接触させることと、
アンモニウム・イオン・センサ、pHセンサ、二酸化炭素センサ、重炭酸塩センサ、導電率センサ、またはその組合せからなる群から選択されたセンサで化学成分を検出することとを備える、方法。 - 前記化学成分が、アンモニウム・イオンである、請求項44に記載の方法。
- 検出されたアンモニウム・イオンの量が、前記サンプルにおける尿素の量の関数である、請求項45に記載の方法。
- 前記センサが電位差式であり、前記関数が実質的に対数的である、請求項46に記載の方法。
- 前記センサが、前記サンプルが前記センサと接触する前または後に、既知の量のアンモニウム・イオンを含む水溶液流体に前記センサを暴露することによって較正される、請求項44に記載の方法。
- 尿素センサの感度を向上させる方法であって、センサが、検出器および固定化酵素ウレアーゼを備え、第2の固定化された酵素である炭酸脱水酵素の有効量を前記センサに追加することを備える、方法。
- 前記検出器が、アンモニウム・イオン選択性センサを備える、請求項49に記載の方法。
- 前記検出器が、pHセンサを備える、請求項49に記載の方法。
- 前記検出器が、二酸化炭素センサまたは重炭酸塩センサを備える、請求項49に記載の方法。
- 前記検出器が、導電率センサを備える、請求項49に記載の方法。
- 前記酵素のない第2の検出器が、異なる信号を測定するために使用される、請求項49に記載の方法。
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