JP2008509693A5

JP2008509693A5 -

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Publication number: JP2008509693A5
Application number: JP2007526506A
Authority: JP
Filing date: 2005-08-05
Publication date: 2008-09-25

Claims

体液中の酵素活性を測定する方法であって、以下の工程:
a)測定される酵素活性に特異的な基質がその上に固定化されている伝導性表面を有する担体を提供する工程、該基質は電気活性残基を含む;
b)該体液のサンプルを該基質と反応させ、酵素反応を引き起して電気活性生成物を生成する工程;
c)該酵素を含有する媒体と接触している担体を用いる電流測定によって、電気活性生成物の量を検出する工程、
を含むことを特徴とする、方法。
基質が、以下の一般式I及びIIの一つに対応する分子の少なくとも1種の単分子層形態で沈着する、請求項１記載の方法:
S-C_n-(E)-P-X (I)
S-C_n-(E)-X-P (II)
式中:
Sは、伝導性表面との結合を形成することのできる化学基を意味し、
C_nは、n個の炭素原子からなる脂肪族メチレン鎖を意味し、
Eは、鎖C_nを満たすために存在してもよいポリエチレングリコールタイプの非電気活性親水性スペーサーを意味し、
Pは、測定される酵素活性に特異的なポリペプチドシーケンスを意味し、及び
Xは、酵素加水分解の後に、媒体で受け得る電位範囲内で酸化又は還元することのできる電気活性残基を意味する。
式I及びIIにおいて、Sがチオール基を意味し、C _n がn個の炭化水素要素を含み、且つ親水性スペーサーEを有する疎水性炭素鎖を意味し、Pが測定される酵素活性に特異的な基質の少なくとも2種のアミノ酸を有するペプチドシーケンスを意味し、及びXが芳香族アミンである、請求項２記載の方法。
C _n がメチレンである、請求項３記載の方法。
Xがパラ-アミノジフェニルアミドである、請求項３又は４記載の方法。
体液が、濁っている及び/又は着色されていてもよい液体である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
体液が全血である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
酵素活性が、凝固性因子又は全血からの補体のものである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
酵素活性が凝固性因子のものである、請求項８記載の方法。
凝固性因子がトロンビンである、請求項９記載の方法。
酵素活性を用いて、血液凝固物の内因性又は外因性の阻害剤又は補因子を滴定する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
工程b)において、サンプルの一滴が、基質が固定化されている担体上に直接沈着される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
サンプルが全血である、請求項１２記載の方法。
伝導性表面が、共有結合層(I)又は(II)を固定化することのできる金属の層である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
伝導性表面が金の層である、請求項１４記載の方法。
検出工程が、作用電極、対電極及び任意に参照電極を含む電流測定用電極を用いることを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
作用電極が担体からなる、請求項１６記載の方法。
対電極及び参照電極が同一である、請求項１６又は１７記載の方法。
検出工程が、酵素反応中に検出される電気活性生成物の量に比例する信号の振幅を測定することを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法を行うための、体液中の酵素活性を測定するための装置であって、
-伝導性表面を有する担体;
-測定される酵素活性に特異的であり、且つ電気活性残基を含み、該伝導性表面に固定化されている基質;及び
-電気化学的測定による検出手段、
を含む、装置。
電気化学的測定が電流測定である、請求項２０記載の装置。
基質が、以下の一般式I及びIIの一つに対応する分子の少なくとも1種の単分子層形態で沈着する、請求項２１記載の装置:
S-C_n-(E)-P-X (I)
S-C_n-(E)-X-P (II)
式中:
Sは、伝導性表面との結合を形成することのできる化学基を意味し、
C_nは、n個の炭素原子からなる脂肪族メチレン鎖を意味し、
Eは、鎖C_nを満たすために存在してもよいポリエチレングリコールタイプの非電気活性親水性スペーサーを意味し、
Pは、測定される酵素活性に特異的なポリペプチドシーケンスを意味し、及び
Xは、酵素加水分解の後に、媒体で受け得る電位範囲内で酸化又は還元することのできる電気活性残基を意味する。
式I及びIIにおいて、Sがチオール基を意味し、C _n がn個の炭化水素要素を含み、且つ親水性スペーサーEを有する疎水性炭素鎖を意味し、Pが測定される酵素活性に特異的な基質の少なくとも2種のアミノ酸を有するペプチドシーケンスを意味し、及びXが芳香族アミンである、請求項２２記載の装置。
C _n がメチレンである、請求項２３記載の装置。
Xがパラ-アミノジフェニルアミドである、請求項２３又は２４記載の装置。
伝導性表面が、担体上に沈着されている貴金属の層である、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の装置。
伝導性表面が、担体上に沈着されている金の層である、請求項２６記載の装置。
検出手段が、作用電極、対電極及び任意に参照電極を含む電極を電流測定することを含む、請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の装置。
作用電極が担体からなる、請求項２８記載の装置。
対電極及び参照電極が同一である、請求項２８又は２９記載の装置。
電流測定検出手段が、作用電極及び参照電極の間に、周期的で且つマーカーの検出範囲に調整可能な電位差を送達することのできるポテンシオスタットを含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の装置。
それぞれが異なる酵素に特異的な一連の基質を含み、それによって診断プロフィールの同時の分析及び確立を可能にする、請求項２０〜３１のいずれか１項に記載の装置。