JP2008504846A - ポリ核酸多重交叉分子の多角形ナノ構造および二重交叉接着に基づく格子の組み立て品 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願において報告する実験は、一部分:国立一般医学研究所、助成番号GM−29554;海軍研究局、助成番号N00014−98−1−0093;国立科学財団、助成番号DMI−0210844、EIA−0086015、DMR−01138790およびCTS−0103002;ならびにDARPA/AFSOR、助成番号F30602−01−2−0561、の援助を受けた。米国政府は、本発明について、一括払い実施権、および限定的状況下で、上記の助成金の条件によって提供される適切な条件で実施権を他者に付与するよう特許権者に要求する権利を有する。
関連技術の概要
極微細スケールの物質の構造を制御するためには、強固な分子内モチーフおよび確固とした分子間相互作用の両方について良好な設計が要求される。2次元結晶アレイの設計に用いられた以前のモチーフには、二重交叉(DX)(Fu et al., 1993 ; Winfree et al., 1998)、三重交叉(TX)(LaBean et al., 2000)、DNA平行四辺形((Mao et al, 1999)、および4×4構造(Yan et al., 2003)が含まれていた。これらのモチーフは、対称性を欠くまたは2回対称の2次元結晶アレイを生成するために用いられてきた(Seeman, 2003)。対照的に、三角形または六角形アレイを生成する以前の試みは、すべて失敗するかまたは非常に小さな構造しか生成されなかった。三角形の固有の剛性、自然における三角形モチーフの重要性(Kappraff et al.,1990)を考慮すれば、三角形がこの問題を解決する鍵である。三腕接合の柔軟性が、六角形格子を組み立てるための最初の試みにおいて発見された(Ma et al., 1986)。予期していたであろう六量体からだけではなく、突き出た3腕接合(Liu et al., 1994)から組み立てられた三角形が、三量体およびそれ以上による循環式閉環ができることを実証した(Qi et al., 1996)。DX分子に由来する同一平面上のヘリックスが稜に接している三角形が、同様の振舞いをした(Yang et al., 1998)。
本発明は、1以上の多角形単位からなるポリ核酸構造物を提供する。多角形単位はそれぞれ、その稜として、結合された核酸多重交叉ドメインを有する。多角形単位の各稜は、二重接着性(粘着性)末端で終る2つの平行した核酸ヘリックスを有する少なくとも1つの自由端(稜の延長)を有する。
本発明のポリ核酸構造物は、少なくとも部分的には多重交差分子から構成された反復単位からなる分岐した多量体を形成するように、本発明の方法に従って組み立てられるポリ核酸である。
二重交差接着に基づいた三角形二次元DNA結晶
二次元擬似六角形の三角形アレイが、DNAの自己集合によって構成された。用いるモチーフは、稜および延長部が、従来のDNA二重ヘリックスではなく、DNA二重交差(DX)分子である、突き出た接合部のDNA三角形である。この実施例における下記の実験を、このシステムの成功が、DX分子の追加の硬度によるのか、あるいは各稜の終端における2つの粘着性末端の存在によるのかを確証するために、行なった。1つの粘着性末端の除去が格子形成を妨げる。これは、格子形成を可能にする主要な因子が二重粘着性末端であることを示唆している。
鎖を、従来のホスホルアミダイト法により合成し(Caruthers, 1985)、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により精製した。各三角形用の鎖の化学量論的混合物(OD260により推定する)を、別々に0.5μM濃度に、40mMトリス-HCl、pH8.0、20mM酢酸、2mMEDTA、および12.5mM酢酸マグネシウムを含む溶液中で調製した。各混合物を、90℃から室温まで、500ml水浴中で48時間かけて冷却した。アレイを形成するために、2つの複合体、DTX−A(図2A)およびDTX−B(図2B)を化学量論的な量で混合し、45℃に温め、室温まで500mlの水浴を含む魔法瓶中で24時間かけてゆっくり冷却し;ある場合は試料を、さらに24時間16℃に冷却した。原子間力顕微鏡(AFM)撮像を、5〜7μLの試料を新たに切断された雲母上に置き、それを3分間放置して表面へ吸着させて、行なった。緩衝液の塩を除去するために、5〜10滴の再留水を雲母に置き、水滴を振落とし、試料を圧縮空気で乾燥させた。撮像は、接触モードで、NanoScope IV(Digital Instruments)装置の流体セル中の2-プロパノール下で、Si3N4の先端を有する市販のカンチレバー(DI)を用いて行なった。
2つの三角形を、組み合わせたとき三角格子配置を生成するように設計した。三角形の配列(配列番号1〜19)を図2Aおよび2Bに示す。経済的な目的のために、いくつかの鎖を両方の三角形の中で用いた。三角形の稜は、それらのDXヘリックスの各々に、65ヌクレオチド対を含み、またそれらは長さ6ヌクレオチドの5'粘着性末端で終る。各三角形内で、1つの稜あたり4回転が存在する。三角形は、互いに接着して長さで二重ヘリックス13回転(〜46nm)の連続的なDX構造を生成するように設計されている。図1Dは、1個の六角形の側面に位置する6個の三角形群、各三角形種3個ずつ、を図示する。三角形1つを除いた六角形の稜は長さで9回転(〜30nm)であり;中心間距離は〜34nmとなる筈である。図1Eは、2種のDX三角形を、擬似六角形の三角形二次元アレイへと集合させるように設計する方法を示す。図1Eに示す三角形格子は、図1Dに図示された6個の三角形複合体の精巧な合成物を示す。
DX分子からの新しいシステム
これらの新しいシステムの最初の3つは、3次元空間に跨るモチーフである。それらの相補的な粘着性末端対の方向(すべてが、本質的にDX単位を結合する)によって定義される3つのベクターに沿ってそれらを組み合わせれば、三次元立体が生じることになる。3つのモチーフはすべて、非変性ゲル上で良好に振る舞い、単一のバンドとして移動する。
図1Cおよび図2A〜2BのDX三角形と異なるDX三角形を、図4に図示する。稜の自由端(延長部)に二重接着性末端を有する三次元DX三角形の模式図を、図5に示す。三次元システムの幾何学的実現可能性についての良好なスクリーニングは、そのシステムから1対の接着性末端を除去し、次に、それが良好な二次元アレイを形成するかどうかを、AFMにより分析して確かめることである。システムの3つの二次元断面すべてが良好ならば、それは幾何学的設計問題が解決されたことを示している。図6A〜6Cに示すように、本発明者らは、三次元DX三角形のこの点に関して著しく成功した。
DNAの一巻き10.5塩基のヘリックス構造(Wang, 1979 ; および Rhodes and Klug, 1980)は、交差などの特徴の間の7および14ヌクレオチドの隔たりが特徴を120°だけ回転させることを意味する。この特徴を利用して、図7Aおよび7Bに図示するDNAの6本ヘリックス束(Mathieu et al., 2001)を、図8に示す配列番号20〜31の設計された鎖配列を組み合わせることにより生成した。
歪んだTX三角形モチーフは、図10Aに示すような、ヘリックスが対で延長しているTX分子から構成される。設計された、配列番号32〜64の鎖配列を組み合わせることにより、この分子の3つを、三次元空間に跨る歪んだ三角状に組み立てる(図11)。このモチーフの3つの二次元断面を、図12A〜12Cに示す。
DNA平行四辺形に基づいた二次元システム(Mao et al., 1999)も、単一のヘリックス(単一の粘着性/接着性末端)を用いたときは、手に負えないことが分かった。しかし二重粘着性/接着性末端を有するDX分子を用いる場合は、見ることのできるアレイが得られた。最初の平行四辺形システムは、各交差点を越えてヘリックスの1回転が、また交差点の間にヘリックスの4回転が存在したシステムに基づいていた(Mao et al., 1999)。二重粘着性/接着性末端を有するDX平行四辺形の2つのバージョンを設計した。DX分子は、それらのヘリックスの相対的な配向および接合点間のヘリックス半回転の数により特徴づけられる。ヘリックスの配向は両方の設計において逆平行であったが、しかし接合部間のヘリックス半回転の数は異なっていた。最初のバージョンは、接合部間にすべて偶数のヘリックス半回転の数を持つように設計した。したがって、この分子をPDX−E−Eと呼ぶ。この分子の周期性は40nmであった。配列番号65〜96を、このPDX−E−E DNA平行四辺形の鎖配列として設計した(図14)。システムを2倍にして、頂点を越えてヘリックス2回転、および頂点の間をヘリックス8回転としたときは、格子が得られなかった。このモチーフを図13に示す。図15Aおよび15Bから、図13および14のモチーフから平行四辺形アレイを形成することができることが明らかである。それらは以前には不可能であった。この設計は、大規模で良く配列されたアレイを生成しなかったし、このモチーフの角度を正確に測定することはできなかった。第2のバージョンを、接合部間のヘリックス半回転の数が1つおきに奇数と偶数の繰り返しパターンを持つように設計した。したがって、この分子をPDX−E−Oと呼ぶ(図16および17)。この分子の全体の周期もまた41nmと測定された。AFM画像(図18A〜18D)に図示されているように、分岐した接合部の腕の間のねじれ角は52°と測定された。アレイには14nmの小さな空洞および27nmの大きな空洞がある。これらの新しい設計は、パターン構成に有用な、より大きなサイズの平行四辺形を提供する。
Claims (18)
- 結合された核酸多重交差ドメインを稜として有する多角形単位を含むポリ核酸構造物であって、前記稜の各々は、2本の並行ヘリックスを有する少なくとも1つの自由端を有し、前記2本の並行ヘリックスの各々が接着性末端で終り、前記少なくとも1つの自由端に二重接着性末端を提供する、ポリ核酸構造物。
- 前記核酸多重交差ドメインが二重交差ドメインである、請求項1記載のポリ核酸構造物。
- 前記核酸多重交差ドメインが三重交差ドメインである、請求項1記載のポリ核酸構造物。
- 前記多角形単位が三角形である、請求項1記載のポリ核酸構造物。
- 前記多角形単位が平行四辺形である、請求項1記載のポリ核酸構造物。
- 前記稜の各々は、2本の並行ヘリックスを有する単一の自由端を有し、前記2本の並行ヘリックスの各々が接着性末端で終り、前記自由端において二重接着性末端を提供する、請求項1記載のポリ核酸構造物。
- 前記稜は、各々が2本の並行ヘリックスを有する2つの自由端を有し、前記自由端の2本の並行ヘリックスの各々が接着性末端で終り、前記自由端において二重接着性末端を提供する、請求項1記載のポリ核酸構造物。
- 前記2本の並行ヘリックス上の接着性末端が異なる、請求項1記載のポリ核酸構造物。
- 前記多角形単位が、結合された核酸二重交差ドメインを稜として有する三角形であり;
前記稜の各々は2本の平行ヘリックスを有する単一の自由端を有し;および
前記2本の平行ヘリックスの各々が接着性末端で終り、前記自由端において二重接着性末端を提供する、
請求項1記載のポリ核酸構造物。 - 前記多角形単位が、結合された核酸三重交差ドメインを稜として有する三角形であり;
前記稜の各々はそれぞれ2本の平行ヘリックスを有する2つの自由端を有し;および
前記2本の平行ヘリックスの各々が接着性末端で終り、前記自由端において二重接着性末端を提供する、
請求項1記載のポリ核酸構造物。 - 前記多角形単位が、核酸二重交差ドメインを稜として有する平行四辺形であり;
前記稜の各々はそれぞれ2本の平行ヘリックスを有する2つの自由端を有し;および
前記2本の平行ヘリックスの各々が接着性末端で終り、前記自由端において二重接着性末端を提供する、
請求項1記載のポリ核酸構造物。 - 相補的な二重接着性末端によって互いに連結された多角形単位のアレイである、請求項1記載のポリ核酸構造物。
- 前記アレイが、相補的な二重接着性末端で互いに連結されて三角形格子を形成する三角形単位のアレイである、請求項12記載のポリ核酸構造物。
- 相補的な二重接着性末端で互いに連結されて三角形格子を形成する2つの異なる三角形単位のアレイである、請求項12記載のポリ核酸構造物。
- 前記アレイが、相補的な二重接着性末端で互いに連結された平行四辺形単位のアレイである、請求項12記載のポリ核酸構造物。
- 各々が、自己相補的であるように、および/または別の一本鎖ポリヌクレオチドと相補的であるように設計されていて、多角形単位への自己アニーリングが可能である一本鎖ポリヌクレオチドを合成する工程;
一本鎖ポリヌクレオチドを混合してポリヌクレオチド混合物を形成し、混合物を熱変性させる工程;および
一本鎖ポリヌクレオチドの熱変性された混合物をアニーリングして、自己集合により多角形単位を形成する工程、
を含む、請求項1記載のポリ核酸構造物を生産するための方法。 - アニーリングされた多角形単位を熱して、接着性末端を確実に露出させる工程;および
複数のアニーリングされた多角形単位の露出した相補的接着性末端をアニーリングして、多角形単位のアレイを形成する工程、
をさらに含む請求項16記載の方法。 - 請求項16記載の方法であって、2つの異なる多角形単位が別々に形成され、またさらに:
2つの異なるアニーリングされた多角形単位を熱し、接着性末端を確実に露出させる工程;および
露出した相補的な接着性末端をアニーリングして、2つの異なる多角形単位のアレイを形成する工程、
を含む方法。
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