JP2008504816A - 臨床的に安全な脂肪組織由来再生細胞を単離し、使用するためのシステムおよび方法 - Google Patents

臨床的に安全な脂肪組織由来再生細胞を単離し、使用するためのシステムおよび方法 Download PDF

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Abstract

多種多様な組織から細胞を分離するために使用されるシステムおよび方法が記載される。特に、脂肪組織から、再生細胞、例えば、幹細胞および／または先駆細胞を分離する自動化システムおよび方法が記載される。本明細書に記載されるシステムは、被験体の体内において再環流させるのに好適な再生細胞を分離し、濃縮する、高速で信頼性の高い方法を提供する。

Description

（関連出願）
本出願は、２００１年１２月７日に出願された米国仮出願第６０/３３８，８５６号の利益を主張する、２００２年１２月９日に出願された、名称「処理した脂肪吸引細胞によって患者を治療するためのシステムおよび方法」なる米国特許出願第１０/３１６，１２７号の一部継続出願である。上述の特許出願すべての内容をここに参照することにより本出願に含めることを明言する。
（発明の背景）
１．発明の分野
本発明は、多種多様な組織から細胞、例えば、再生細胞を分離し、濃縮するためのシステムおよび方法に関する。本発明は特に、本発明のシステムおよび方法を用いて、脂肪組織から臨床的に安全な再生細胞を分離し、濃縮することに関する。
２．関連技術の説明
再生医学は、再生細胞、例えば、幹細胞および／または先駆細胞（すなわち、生体の特殊化していないマスター細胞）の、無限に自身を再生し、成熟特化細胞に発達する能力を、臨床的に標的を定めるやり方で制御する。幹細胞は、発達の初期段階の胚、胎児細胞、および、いくつかの成人器官および組織の中に認められる(Pera et al., 2000)。胚性幹細胞（以下“ESC”と呼ぶ）は、生体の細胞および組織タイプの全てとは言わないまでも、多くのものを形成することが知られる。ESCは、個人の遺伝情報を全て含むばかりでなく、生体の２００+の細胞および組織の内の任意のものに成る発生能力を含む。従って、これらの細胞は、再生医学にとって膨大な可能性を秘める。例えば、ESCは成長して、特定の組織、例えば、心臓、肺、または腎臓に分化することが可能で、次に、これらの組織を、障害および疾病組織を修復するのに使用することが可能である(Assady et al., 2001; Jacobson et al., 2001; Odorico et al., 2001)。しかしながら、ESC由来組織は臨床的限界を持つ。ESCは必然的に別個人、すなわち、胚から得られるものであるから、レシピエントの免疫系が、この新規の生物材料を拒絶する危険性がある。このような拒絶を阻止するための免疫抑制剤は利用可能であるけれども、そのような薬剤は、好ましい免疫反応、例えば、細菌感染およびウィルスに対する反応までも阻止することが知られる。さらに、ESCの供給源、すなわち、胚に関する倫理的議論は広く知られるところであり、恐らく近い将来、乗り越え難い障害になると考えられる。
成人幹細胞（以後、“ASC”と相互交換的に呼ばれる）は、ESC使用の代替となる。ASCは、多くの非胚性組織中に不活性な形で存在する。恐らくこれは、外傷またはその他の破壊的疾病過程に対して反応し、そうすることによって損傷組織の治癒を可能とするよう待機しているものと考えられる(Arvidsson et al., 2002; Bonner-Weir and Sharma, 2002; Clarke and Frisen, 2001; Crosby and Strain, 2001; Jiang et al., 2002a)。注目すべきことは、各個人は、細胞および組織の全てのタイプと言わないまでも多くのものに成る能力をESCと共に共有する、ある一定量のASCを抱えるということを示す科学的証拠が現れていることである(Young et al., 2001; Jiang et al., 2002a; Jiang et al., 2002b; Schwartz et al., 2002)。従って、ASCもESC同様、再生医学の臨床応用において膨大な可能性を持つ。
ASC集団は、骨髄、皮膚、筋肉、肝臓、および脳の内の１種以上に存在することが示されている(Jiang et al., 2002b; Alison, 1998; Crosby and Strain, 2001)。しかしながら、これらの組織におけるASCの出現頻度は低い。例えば、骨髄における間葉性幹細胞の発現頻度は、１０万の有核細胞の内の１から百万の有核細胞の内の１と推定されている(D'Ippolito et al., 1999; Banfi et al., 2001; Falla et al., 1993)。同様に、皮膚からのASCの抽出は、数週に渡る、一連の複雑な細胞培養工程を含み（Toma et al., 2001）、また、骨格筋由来ASCの臨床応用は、２から３週間の培養相を要する(Hagege et al., 2003)。従って、上記組織由来のASCを臨床的に応用しようという従来の提案はいずれも、細胞精製および細胞培養の過程による細胞数、純度、および成熟度の増大を必要とする。
細胞培養工程は、細胞の数、純度、および成熟度の増大を実現することがあるけれども、それにはコストがかかる。このコストは、下記の技術的困難の内の１つ以上を含む。すなわち、細胞老化による細胞機能の消失、潜在的に有用性を持つ非幹細胞集団の損失、患者に対する細胞の有効予想適用時期の遅れ、金銭コストの増大、および、培養中における環境微生物による細胞汚染の危険度の増大である。骨髄由来ASCの治療効果を調べる最近の研究は、細胞培養に関連する問題を回避するために事実上全骨髄を用いた(Horwitz et al., 2001; Orlic et al., 2001; Stamm et al., 2003; Strauer et al., 2002)。しかしながら、臨床効果は上々とは言えないものであった。これは、骨髄に内在的に存在するASC用量および純度の低さにおそらく関連する結果と思われる。
近年、脂肪組織がASCの供給源であることが示された(Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002)。骨髄、皮膚、筋肉、肝臓、および脳と違って、脂肪組織では、相対的に大きな量を比較的に容易に採取することが可能である(Commons et al., 2001; Katz et al., 2001b)。さらに、脂肪組織由来ASCは、複数の組織、例えば、骨、脂肪、軟骨、および筋肉を含む組織をインビトロで生成する能力を持つことが示された(Ashjian et al., 2003; Mizuno et al., 2002; Zuk et al., 2001; Zuk et al., 2002)。以上のことから、脂肪組織は、再生医学において使用されるASCの最適な供給源となる。
しかしながら、脂肪組織由来ASCを採取するための適当な方法は、従来技術に欠如しているようである。既存の方法にはいくつかの欠点がある。例えば、既存の方法は、脂肪組織を取り出すための吸引装置を最適な形で収容する能力に欠ける可能性がある。既存の方法はまた、組織相処理による脂肪組織相の採取において、その部分的または完全自動化を欠如する可能性がある(Katz et al., 2001a)。既存の方法はさらに、１００ mlを超える脂肪組織を容れる容量を欠く可能性がある。既存の方法はその上さらに、組織相の処理による脂肪組織相の採取において部分的にまたは完全に閉鎖されたシステムを欠く可能性がある。最後に、既存の方法は、一つのサンプルから別サンプルへ試料が移動する際の同時的交差汚染の危険を低減するための、成分の単一回使用後処分の可能性（ディスポーザビリティ）を欠く可能性がある。要約すると、脂肪組織からASCを採取するための従来技術の方法の多くは、前述の、皮膚、筋肉、肝臓、および脳からのASC採取に関連する技術的困難を克服してはいないようである。従って、高い収率、一貫性、および／または純度で、再生細胞集団、例えば、ASCを採取すること、しかもそれを高速で高い信頼性で実現しながら、抽出後操作の必要を低減させる、またはそのような必要を無くすることを可能とするシステムおよび方法に対しては従来技術において依然として需要がある。
理想的には、そのような装置、システム、または方法は、レシピエントに直接導入するのに好適なやり方で再生細胞を生成することが望ましい。この目的に向けて、本発明のシステムまたは方法は、再生細胞の、システムからレシピエントへの直接導入または再注入が、患者の体内で有害事象、例えば、安全を超えるレベルのエンドトキシン、感染仲介因子、細菌、およびその他の添加物の存在によってもたらされる有害事象を引き起こすことのないように最適化される。
（発明の要約）
本発明は、任意の組織を分離し、濃縮し、被験体に再注入するのに好適な、臨床的に安全な再生細胞、例えば、幹細胞および先駆細胞を生成することを可能とする、極めて融通性の高いシステムおよび方法に関する。ある好ましい実施態様では、本発明は、脂肪組織から、被験体に再注入するのに好適な、臨床的に安全な再生細胞を分離し、濃縮する自動化システムを提供する。本明細書の開示による、脂肪組織由来細胞を分離・濃縮するシステムは、一般に、１個以上の収集チェンバー、処理チェンバー、廃棄物チェンバー、出力チェンバー、およびサンプルチェンバーを含む。これら様々のチェンバーは、１本以上の導管によって結ばれ、そのために、生物材料を含む流体は、組織、細胞、生物および非生物材料の、汚染物質に対する暴露を最小とする、閉鎖された、または機能的に閉鎖された、無菌の流体／組織通路の中を一つのチェンバーから別のチェンバーに通過することが可能とされる。ある実施態様では、廃棄物チェンバー、出力チェンバー、およびサンプルチェンバーは任意に設けられる。ある好ましい実施態様では、システムは、臨床的に無関係な量のエンドトキシンを含む。
本システムはまた複数のフィルターを含む。これらのフィルターは、特に、コラーゲン、遊離脂質、脂肪細胞、および、脂肪組織の処理と関連して溶液中に存在する可能性のある組織脱凝集剤から、幹細胞および／または先駆細胞を分離するのに有効である。一つの実施態様では、フィルターアッセンブリは、中空線維ろ過装置を含む。別の実施態様では、フィルターアッセンブリは、沈渣過程と共に使用されても、使用されなくともよい、浸透ろ過装置を含む。ある好ましい実施態様では、フィルターアッセンブリは、エルトリエーション装置および過程と共に使用されても、使用されなくともよい遠心装置を含む。さらに別の実施態様では、システムは、上記ろ過装置の組み合わせを含む。本発明のろ過機能は二重である。すなわち、あるフィルターは、最終濃度から、物体、例えば、コラーゲン、遊離脂質、遊離脂肪細胞、および残留コラゲナーゼを取り除き、別のフィルターは、最終産物を濃縮するために用いられる。
別の実施態様では、システムの1個以上の成分が自動化され、処理機能の多くを制御する、内部的処理装置および関連ソフトウェアプログラムを含む。システムの成分は、システムの部分部分が単一使用後に廃棄可能となるようにディスポーザブルであってもよい。このシステムはまた、再使用可能な成分、例えば、処理装置（コンピュータおよび関連ソフトウェアプログラム）、および、その他の成分、例えば、モーター、ポンプ等を含む再使用可能成分を含む。
一つの実施態様では、患者を治療する方法であって、a)組織取り出しシステムを準備する工程；b)組織取り出しシステムを用いて、ある濃度の幹細胞を有する脂肪組織を患者から取り出す工程；c)脂肪組織の少なくとも一部を処理して、処理前の脂肪組織の再生細胞濃度とは異なる濃度の再生細胞を獲得することを含み、処理は、無菌の、閉鎖された、または機能的に閉鎖されたシステムで行われる工程、および、d)患者に投与する前に組織取り出しシステムから再生細胞を取り出すこと無く、再生細胞を患者に投与して患者を治療する工程を、前記方法は含む。
本明細書に記載される任意の特質、または複数の特質の任意の組み合わせは、任意のそのような組み合わせに含まれる複数の特質が、文脈から、本明細書から、また、当業者の知識から見て明白に相互に矛盾するものでない限り、本発明の範囲に含まれる。
本発明の、上記以外の別の利点および局面は、下記の詳細な説明と特許請求項から明らかである。
（好ましい実施態様の詳細な説明）
本発明は、例えば、脂肪、骨髄、血液、皮膚、筋肉、肝臓、結合組織、筋膜、脳およびその他の神経系組織、血管、およびその他の柔軟または液状組織、または組織成分、または組織混合物（例えば、皮膚、血管、脂肪、および結合組織を含む組織の混合物）を含むが、ただしそれらに限定されない多種多様な組織から、臨床的に安全な再生細胞、例えば、幹細胞および／または先駆細胞を分離し、濃縮するための、高速で、信頼性の高いシステムおよび方法に関する。ある好ましい実施態様では、システムは、臨床的に安全な再生細胞を脂肪組織から分離し、濃縮する。特に好ましい実施態様では、本発明のシステムおよび方法によって得られる臨床的に安全な再生細胞は、レシピエントの体内に導入するのに好適である。
本発明の臨床的に安全な再生細胞は、汚染物質、例えば、エンドトキシン、残留酵素、遊離脂質、および、ある実施態様ではコラーゲン断片を含まないこと、再生細胞集団、例えば、幹細胞、先駆細胞、内皮細胞等を含むこと、の両方によって特徴付けられる。従って、本発明のシステムおよび方法は、本発明のシステムおよび方法によって得られた臨床的に安全な再生細胞を患者に再注入することによって、有害事象の危険の可能性をはるかに上回る治療利益を実現する（すなわち、再生細胞は生存し、再生機能を保持する）ように最適化される。
例えば、本発明のシステムおよび方法の生物的、非生物的、およびその他の成分は、再生細胞においても、またはその他のいかなる再生細胞中間組成物においても、臨床関連レベルのエンドトキシンを生起することはない。従って、得られた再生細胞は、患者の体内に導入された場合有害事象を引き起こす可能性のあるレベルでエンドトキシンを含まない。さらに、得られた再生細胞におけるエンドトキシン感受細胞の性質は、前記細胞を患者の体内に注入した場合、エンドトキシン暴露が無かったならば起こらなかったであろうと思われる有害事象をもたらすように変更されることはない。
さらに、本発明のシステムおよび方法の生物的、非生物的、およびその他の成分は、再生細胞、または任意の再生細胞組成物中間体に対し細菌、またはその他の感染仲介因子を加えることは無い。従って、得られる再生細胞は、レシピエントの体内に導入された場合、有害事象を引き起こさない。さらに、得られる再生細胞中の感受性細胞の性質は、前記細胞の注入が、該仲介因子への暴露が無かったならば起こらなかったであろうと思われる有害事象をもたらすように変更されることはない。
同様に、本発明のシステムおよび方法の生物的、非生物的、およびその他の成分は、再生細胞を導入するよていのヒト以外の個人から得られた細胞、タンパク、流体、またはその他の材料によって、再生細胞またはその他の再生細胞組成物中間体で汚染することはない。「汚染物質」という用語は、細胞の効率的処理または搬送を増進するために添加される材料（例えば、血管内投与の前に添加される可能性のあるヒト血清アルブミン）を含まない。このような添加剤は汚染物質と見なされない。なぜならば、それは意図的に加えられているからであり、本明細書で用いる場合「汚染物質」とは、本発明のシステムおよび方法を用いて得られた再生細胞の中に、思いがけず（オペレータの設計または知識無しに）添加された、任意のタンパク、細胞、流体、介在因子、またはその他の物質であって、そのような物質が無かったならば起こらなかったと考えられるやり方で、得られた再生細胞の性質を変える物質を指す。
さらに、本発明のシステムおよび方法の生物的、非生物的、および他の成分の中に存在する、あるいはそれらの成分に添加されて、患者に有害作用をもたらす可能性のある添加剤は、それがどのようなものであれ、再生細胞から除去される。例えば、脂肪組織内の細胞外基質を分解するためにタンパク分解酵素が添加される。レシピエントの組織内にこのような酵素を導入するならば、それは、レシピエントの体内の細胞外基質材料の分解、およびその後の有害反応をもたらす可能性がある。さらに、血小板凝集およびそれに続く血栓事象を誘発する、あるいは、自己免疫反応を引き起こす能力を持つ、分解された、または部分的に分解された細胞外基質タンパクは除去される。さらに、遊離脂質も、実質的な塞栓症危険度を生み出すのに十分な量が存在しないよう除去される。
システムは、考えられる危険な汚染物質の有無に関し消化脂肪組織試料をサンプルするために、処理の様々な段階、例えば最後の再生細胞再懸濁段階を含むが、ただしそれに限定されない段階において、消化脂肪組織と直列に配置される、１個以上の自動化サンプリングプローブを含む。このプローブは、最終再生細胞調製の上清または細胞懸濁液を試験するのに用いられる。このプローブは、細胞懸濁液から上清を分離するために、細胞懸濁液を、直接試験チェンバーに、あるいは、細胞濃縮装置に投入し、次に上清を試験チェンバーに投入するように設計される。
最終再生細胞懸濁液をサンプルするための前述のサンプリングプローブは、脂肪細胞用試験チェンバーと共に使用してもよい。この試験チェンバーは、下記の成分から構成されていてもよい。すなわち、(１)顕微鏡スライドを保持するステージ、および、(２)自動カバースリップ・ユニット。サンプリングプローブは、主要区画から最終再生細胞懸濁液のサンプルを獲得し、次にそのサンプルを試験チェンバーの成分に搬送するように配置される。この試験チェンバーの動作は下記のように進行することになる。(１)オペレータは、あらかじめ顕微鏡スライドをステージに置いておく、(２)細胞サンプルがサンプリングプローブによって獲得される、(２)次に、プローブは自動的に顕微鏡スライドの上に移動する、（３）次に、ステージは側面にゆっくり動くように自動的に設定される、一方、(４)サンプリングプローブは、この細胞懸濁液の薄層を顕微鏡スライド全体に押し広げる、および、(５)自動化カバースリップ・ユニットは、サンプルがスライドの上に展開された後スライドの上にカバースリップを設置する。次に、スライドは所定の場所に保持され、その後、オペレータは、それを試験チェンバーから取り出し、オイル赤O、または、何か外の、脂肪組織選択性の、抗体による、または非抗体性の染料によって染色し、細胞を顕微鏡的に定量する。
最終再生細胞懸濁液をサンプルするための前述のサンプリングプローブはまた、細胞懸濁液中に遊離脂質の有無を検証するために、試験チェンバーと組み合わせて使用されてもよい。この試験チェンバーは、下記の成分から構成されてもよい。すなわち、(１)全体装置の外部を試験チェンバーと接続するポート、(２)細胞サンプルを収容するためのチューブ（単数または複数）またはウェル（単複）、および、トリグリセリド反応性発色源または蛍光源を保持するユニットを容れる分光光度計または蛍光測度計であって、かつ、全体装置の外側において、発色源または蛍光源信号を、トリグリセリド含量、すなわち、遊離脂質測定値に変換するディジタルディスプレイに接続される分光光度計または蛍光測度計である。この試験チェンバーの動作は下記のように進行すると考えられる。すなわち、(１)プローブは細胞懸濁液からサンプルし、(２)そのサンプルをチューブまたはウェルに投入する。(３)オペレータは、適当量の発色源または蛍光源をポートに注入し、溶液をチューブ（単複）またはウェル（単複）に投入する。(４)チューブまたはウェルおよびその内容物は、調節温度の下で、適当な指定期間インキュベートされる。(５)分光光度計または蛍光測度計は、チューブまたはウェルの含量を読み取る。および、(６)サンプル中の脂質含量が、装置の外側においてディジタル的に表示される。
最終再生細胞懸濁液と直列なサンプリングプローブは、細胞懸濁液の上清における、残留の、可溶性タンパク分解活性を検証するために試験チェンバーと組み合わせて使用されてもよい。このようなチェンバーは、下記の主要成分から構成されると考えられる。すなわち、(１)上清から細胞ペレットを分離する遠心器；(２)再生細胞サンプルを収容するためのチューブ（単複）またはウェル（単複）、および、発色性または蛍光性プロテアーゼ基質を容れる分光光度計または蛍光測度計であって、かつ、全体装置の外側において、発色源または蛍光源信号を、タンパク分解活性、例えば、それぞれゼラチンまたはカゼイン消化によって測定されるコラゲナーゼまたはサーモリシン活性に変換するディジタルディスプレイに接続される分光光度計または蛍光測度計。このような試験チャンバーの動作は下記のように進行すると考えられる。(１)プローブは、最終再生細胞懸濁液をサンプルし、(２)これを遠心器内部のチェンバーに投入し、遠心器は、指定のｇ力および時間にて自動的に回転を始め、細胞ペレットと上清を分離する。(３)次に、サンプリングプローブは、最終再生細胞懸濁液の上清からサンプルを得る。(４)オペレータは、適当量の発色源または蛍光源プロテアーゼ基質をポートに注入し、該溶液が、分光光度計または蛍光測度計のチューブ（単複）またはウェル（単複）に投入されるようにする。(５)チューブ（単複）またはウェル（単複）およびその内容物は、調節温度の下で、適当な指定期間インキュベートされる。(６)分光光度計または蛍光測度計は、チューブ（単複）またはウェル（単複）の含量を読み取る。および、(７)サンプル中のタンパク分解活性が、装置の外側においてディジタル的に表示される。
最終再生細胞懸濁液と直列なサンプリングプローブは、細胞懸濁液の上清における、または、最終再生細胞懸濁液の細胞における、血小板凝集を誘発する可能性のある可溶性因子の有無を検証するために試験チェンバーと組み合わせて使用されてもよい。このようなチェンバーは、下記の主要成分から構成されると考えられる。すなわち、(１)上清から細胞ペレットを分離する遠心器；(２)チューブ（単複）またはウェル（単複）を保持する、温度調節凝集測度計であって、全体装置の外側において、血小板凝集と関連する濁度量を、血小板凝集の単位に変換するディジタルディスプレイに接続され、かつ、二つの別々のポート、すなわち、(a)最終再生細胞調製物の上清を試験チェンバーに搬送するポート、および、(b)全体装置の外部を試験チェンバーに接続するポートを含む凝集測度計。このような試験チャンバーの動作は下記のように進行すると考えられる。(１)オペレータは、血小板富裕血漿（PRP）をチェンバーと装置の外部とを接続するポートに注入し、PRPが凝集測度計内のチューブ（単複）またはウェル（単複）に投入されるようにする。(２)サンプリングプローブは、最終再生細胞懸濁液のサンプルを獲得し、血小板凝集の可溶性作用剤を測定した場合は工程“３”を実行し、あるいは、血小板凝集の細胞作用剤を測定した場合は工程“4”を実行する。(３)サンプリングプローブは、サンプルを遠心器内部のチェンバーに投入し、遠心器は、指定のｇ力および時間にて自動的に回転を始め、細胞ペレットと上清を分離し、次にサンプリングプローブは、上清サンプルを獲得し、これを凝集測度計内のチューブ（単複）またはウェル（単複）中に投入する。(４)サンプリングプローブは、最終再生細胞懸濁液のサンプルを、凝集測度計内のチューブ（単複）またはウェル（単複）中に直接投入する。(５)チューブ（単複）またはウェル（単複）およびその内容物は、調節温度の下で、適当な指定期間インキュベートされる。(６)凝集測度計は、チューブ（単複）またはウェル（単複）の含量を読み取る。および、(７)サンプルの血小板凝集活性が、装置の外側においてディジタル的に表示される。
さらに新たな実施態様によれば、１種以上の上記試験は自動的に実行されず、むしろ、ユーザーに、その手動実行の選択肢を思い出させる、または促すように、システムによって自動的に表示される（または、その他のやり方でユーザーに搬送される）。
表示される試験は、ユーザーによる応用タイプ（例えば、血管内搬送、対、非全身的移植）入力に依存してもよい。すなわち、前述したように、システムは、その応用タイプに応じて、自動的に１群の試験を（例えば、システムが、収容する、促進する、あるいは少なくとも部分的に実行することが可能な、保存された１組の試験から）選択するようになっていて、その選択は、ユーザーによって入力される(i)応用のタイプ、および／または、(ii)組織のタイプに基づくものであってもよい。次に、システムは、自動的に、これらの試験を表示し（または他のやり方でユーザーに搬送し）、かつ要すれば任意に、その表示された試験の中から選択するようにユーザーに促す。
ユーザーは、処理される組織のタイプ、および応用（例えば、形成される組織のタイプ）を示す入力を提供することが可能である。この入力に基づいて、システムは、どのタイプの試験を実行すべきかを自動的に決める。これらの試験としては、エンドトキシン、例えば消化によってもたらされる残留酵素、遊離脂質、および、例えば消化によってもたらされる可能性のある残留細胞外基質の内の少なくとも一つの、エンドトキシン応用（例えば、誘発される組織形成のタイプ）に対する、臨床的危険レベルの測定を含んでもよい。ある修飾実施態様では、システムは、入力に基づいて、１群の試験を自動的に選択する（システムが実行することが可能な、保存された１組の試験から）。次に、システムはこれらの試験を自動的に表示し、表示された試験の内から選択するようにユーザーに促す。
組成物の少なくとも一部を患者の体内に血管内搬送する場合、一つの例では、組成物の少なくとも一部について、エンドトキシン、残留酵素、遊離脂質、および、血小板凝集作用剤の内の少なくとも一つの臨床的危険レベルの有無が自動的に検証可能とされる。例示の実施態様では、表示される試験は、上記三つの項目を含み、次に、ユーザーは、自動化システムによって実行されるのが好ましい、または実行されなければならない特定の試験を入力する。
組成物の少なくとも一部を患者の体内に非全身的移植する場合、血小板凝集作用剤は、その臨床的危険レベルの有無に関して自動的に検証されなくともよい。ある例示の実施態様では、表示される試験は、組成物の部分について、血小板凝集作用剤の有無について試験する選択肢を含まない。
別の実施態様では、組成物の少なくとも一部を患者の体内に非全身的移植する場合、遊離脂質は、その臨床的危険レベルの有無に関して自動的に検証されなくともよい。ある例示の実施態様では、表示される試験は、組成物の部分について、遊離脂質の有無について試験する選択肢を含まない。
別の好ましい実施態様では、システムは、臨床的に安全な再生細胞の分離から濃縮までの全方法が、最小のユーザー介入の下で、連続的順序で実行されるように自動化される。好ましくは、再生細胞の組織からの抽出、分離、濃縮、およびレシピエント内の設置に至る全過程は、全て同じ施設で、実際には、処置を受ける患者の居る同じ室内で実行される。再生細胞は、抽出・濃縮後比較的短時間に使用されてもよい。例えば、再生細胞は、患者の組織から収集後約１時間内に使用可能とされてもよく、ある状況では、組織の収集から約１０から４０分以内に使用可能とされてもよい。ある好ましい実施態様では、再生細胞は、組織の収集後約２０分内に使用可能とされてもよい。抽出から分離・濃縮までの過程の全長は、要因、例えば、患者プロフィール、収集される組織のタイプ、ある任意の治療応用に要求される再生細胞の量を含む要因の数に応じて変動してよい。細胞はまた、レシピエントに対し治療的、構造的、または美容的効果を得る意図の下に行う単一操作処置の背景において、他の細胞、組織、断片、支持体、または、他の細胞増殖および／または分化刺激因子と組み合わせてレシピエントの体内に設置してもよい。システムの分離・濃縮相以外にさらに再生細胞の操作を行う場合、その操作がいずれのものであれ、その操作は、その操作法と適合するさらに新たな時間を要することを理解しなければならない。
様々の疾病および障害を患う患者が、本発明の再生細胞から利益を受ける可能性がある。例えば、循環器病および障害、肝臓病および障害、腎臓病および障害、骨格筋障害、肺損傷および障害、糖尿病、腸管病および障害、神経系障害、パーキンソン病、アルツハイマー病、発作関連病および障害、造血系の病気と障害、創傷、皮膚の潰瘍およびその他の病気および障害、外傷傷害、火傷、放射性または化学的、またはその他のトキシン誘発性損傷または障害、および、骨および軟骨関連病および障害を患う患者は、本発明のシステムおよび方法によって得られた再生細胞を用いて治療することが可能である。
特定の実施態様では、脈管形成および動脈形成によって仲介される疾病および障害が、本発明のシステムおよび方法を用いて得られた再生細胞によって治療される。例えば、急性心筋梗塞、虚血性心筋症、末梢血管病、虚血性発作、急性管状壊死、虚血性創傷、敗血症、虚血性腸疾患、糖尿病網膜症、神経細胞障害、腎症、脈管炎、虚血性脳障害、勃起機能不全、虚血性および／または外傷性脊髄損傷、複数器官システム不良、虚血性歯肉病、および、移植関連虚血症の治療が可能である。
さらに、一つを超える生理システムを冒す疾病および障害、例えば、軟部および硬部組織の両方を含む外傷性損傷、加齢作用、複数器官障害等も、本発明のシステムおよび方法を用いて得られる再生細胞によって治療することが可能である。再生細胞はまた、腱および軟骨修復を増進したり、各種臨床的、および非臨床的美容的および構造的応用、例えば、自家脂肪転送応用を含む応用にも使用することが可能である。美容応用としては、例えば、顔面皺および小皺、唇、乳房とヒップの外、軟部組織の欠点の再構成が挙げられる。再生細胞はまた、従来技術で既知の組織工学的応用に使用することも可能である。
本発明がさらに容易に理解されるように、いくつかの用語を先ず定義する。詳細な説明全体を通じてさらに新たな定義が記載される。
本明細書で用いる「再生細胞」とは、本発明のシステムおよび方法を用いて得られる任意の異種の、または同種の細胞であって、器官、組織、または生理的単位またはシステムの構造または機能の、完全な、または部分的な再生、回復、または置換をもたらし、または、そのような再生、回復、または置換に貢献し、そうすることによって治療的、構造的、または美容的効果を実現する細胞を指す。再生細胞の例としては、ASC、内皮細胞、内皮前駆細胞、内皮先駆細胞、マクロファージ、線維芽細胞、周辺細胞、平滑筋細胞、前駆脂肪細胞、分化または脱分化脂肪細胞、ケラチノサイト、単能性および多能性先駆および前駆細胞（およびそれらの子孫）、およびリンパ球が挙げられる。
再生細胞が治療的、構造的、または美容的効果を実現する１つのメカニズムは、新規生成の、既存の、または修復された組織または組織成分の中に自身またはその子孫を取り込むことによる。例えば、ASCおよび／またはその子孫は、新規に生成された骨、筋肉、またはその他の構造的または機能的組織の中に取り込まれ、それによって治療的、構造的、または美容的改善をもたらす、あるいは貢献する。同様に、内皮細胞、あるいは、内皮前駆または先駆細胞、およびその子孫は、既存の、新規発生の、修復済みの、または拡張済みの血管に取り込まれ、それによって治療的、構造的、または美容的改善をもたらす、あるいは貢献する。
再生細胞が治療的、構造的、または美容的効果を実現するもう１つのメカニズムは、ある任意の組織、または組織成分の構造または機能の、創出、保持、回復、および／または再生を増進する分子、例えば、増殖因子を発現および／または分泌することによる。例えば、再生細胞は、直接または間接に構造または機能の改善に参与する組織または細胞の、増殖強化をもたらす分子を発現および／または分泌する可能性がある。再生細胞は、増殖因子、例えば、血管内皮増殖因子（VEGF）、胎盤増殖因子（PIGF）、bFGF、IGF-II、エオタキシン、G-CSF、GM-CSF, IL-12 p40/p70, IL-12 p70, IL-13, IL-6, IL-9, レプチン、MCP-1, M-CSF, MIG, PF-4, TIMP-1, TIMP-2, TNF-α、トロンボポエチン、およびそれらの異性体を含む増殖因子であって、下記の機能の内の１種以上を実行する因子を発現および／または分泌してもよい。その機能とはすなわち、新規血管の発達を刺激すること、すなわち、脈管形成を増進すること；既存の小血管（分岐血管）の酸素補給を、その血液搬送能力を拡大することによって改善すること；傷害部位から離れた部位からの再生細胞の移動を誘発し、該細胞の傷害部位への標的指向および移動を強化すること；傷害部位内における細胞の増殖を刺激し、および／または、細胞の生存率を増進し、それによって機能または構造の保持を増進すること；抗アポトーシス特性を持つ分子を配送し、それによって細胞の死亡率すなわち死亡確率、および機能の恒久的消失を低減すること；および、内因性再生細胞および／またはその他の生理的機構と相互作用を持つこと、である。
再生細胞は、組織中で存在していたままの、または、本発明のシステムおよび方法によって組織から分離・濃縮されたままの「本来の」形で使用してもよいし、あるいは、本明細書に後述するように、増殖因子またはその他の生物反応修飾剤による刺激または熟成によって、遺伝子移送（一過性または安定的移送）によって、得られた集団を物理的特性（例えば、サイズまたは密度）に基づいてさらに細かく分画することによって、固相材料に対する差別的接着、細胞表面または細胞内分子の発現、細胞培養、またはその他の体外または体内操作、修飾、または分画によって修飾されてもよい。再生細胞はまた、本明細書に後述するように、他の細胞または装置、例えば、合成または生物的支持体、因子、薬剤、薬品、または、細胞の関連特性を修飾または強化するその他の薬剤を搬送する材料または装置と組み合わせて使用してもよい。
本明細書で用いる「再生細胞組成物」とは、組織、例えば、脂肪組織を洗った後、通常ある容量の液体中に存在し、少なくとも部分的にばらばらに分離される細胞から成る組成物を指す。例えば、本発明の再生細胞組成物としては、異なる複数のタイプの再生細胞であって、例えば、ASC、内皮細胞、内皮前駆細胞、内皮先駆細胞、マクロファージ、線維芽細胞、血管周囲細胞、平滑筋細胞、前駆脂肪細胞、分化または脱分化脂肪細胞、ケラチノサイト、単能性および多能性先駆および前駆細胞（およびそれらの子孫）、およびリンパ球が挙げられる。再生細胞組成物はまた、１種以上の汚染物質、例えば、組織断片に存在する可能性のあるコラーゲン、または残留コラゲナーゼ、あるいは、本明細書に記載する組織解離過程において用いられる、あるいは、該過程から生じるその他の酵素または介在因子を含んでもよい。
本明細書で用いる「再生医学」は、被験者の体内に、再生細胞を直接または間接的に導入することによって得られる、任意の治療的、構造的、または美容的利益を指す。再生医学は、本明細書に記載される全ての疾病および障害を始め、従来技術で既知のものも含む。
本明細書で用いる「幹細胞」とは、１種以上の特異的機能を実行し、自らを更新する能力を持つ、他の各種細胞に分化する可能性を有する多能性再生細胞を指す。本明細書に開示する幹細胞の内のいくつかは多能性である。
本明細書に用いる「先駆細胞」は、１種を超える細胞タイプに分化する能力を持つ多能性再生細胞を指すが、自身を更新する能力はごく僅かに持つか、または全く持たない。本明細書で用いる「先駆細胞」はまた、単一の細胞タイプのみに分化する能力を持つ単能性細胞を指す。この細胞は、１種以上の特異的機能を実行するが自らを更新する能力はごく僅かに持つか、または全く持たない。特に、本明細書で用いる「内皮先駆細胞」は、血管内皮細胞に分化する能力を持つ多能性または単能性細胞を指す。
本明細書で用いる「前駆細胞」とは、１つの細胞タイプに分化する能力を持つ単能性再生細胞を指す。前駆細胞およびその子孫は、強力な増殖能力を保持することがある、例えば、リンパ球および内皮細胞は、適当な条件下では増殖することが可能である。
本明細書で用いる「幹細胞数」または「幹細胞頻度」とは、脂肪組織由来細胞（ADC）を、低い細胞密度（ウェル当たり<１０，０００細胞）で撒き、MSC増殖を支持する培養液（例えば、１０%ウシ胎児血清、５%ウマ血清、および抗生物質／抗真菌剤を添加したDMEM/F12培養液）で育成したクローン発生アッセイにおいて観察されるコロニー数である。細胞を2週間増殖し、その後培養体をヘマトキシリンで染色し、５０を超える細胞から成るコロニーをCFU-Fとして数える。幹細胞頻度は、撒かれた１００個の有核細胞当たり観察されるCFU-Fの数として計算される（例えば、１，０００個の有核再生細胞で始めたプレートにおいて１５個のコロニーが数えられた場合、それは、１．５%の幹細胞頻度を与える）。幹細胞数は、幹細胞頻度に、得られた有核ADC細胞の全数を掛けたものとして計算される。再生細胞から増殖されるCFU-Fの内高いパーセント（−１００％）のものが細胞表面分子CD105を発現する。この分子はまた骨髄由来幹細胞によっても発現される(Barry et al., 1999)。CD105はまた、脂肪組織由来幹細胞によっても発現される(Zuk et al., 2002)。
本明細書で用いる「脂肪組織」という用語は、脂肪を貯える結合組織を含む脂肪を指す。脂肪組織は、ASCおよび内皮前駆および先駆細胞を含む、複数の再生細胞タイプを含む。
本明細書で用いる「脂肪組織単位」とは、不連続な、または測定可能な量の脂肪組織を指す。1単位の脂肪組織は、単位の重量および／または容量を定めることによって測定される。上に指定したデータに基づくと、患者から取り出された、１単位の処理脂肪吸引物は、細胞成分の少なくとも０．１％が幹細胞である細胞成分を持つ。すなわち、該脂肪吸引物は、上に定めたところに従って少なくとも０．１％の幹細胞頻度を持つ。本明細書の開示を参照すると、１単位の脂肪組織とは、一人の患者から取り出された脂肪組織の全量、または、一人の患者から取り出された脂肪組織全量未満の量を指す。従って、1単位の脂肪組織を、別の1単位の脂肪組織と合わせて、個別の単位の合計である重量または容量である1単位の脂肪組織を形成してもよい。
本明細書で用いる「部分」という用語は、全体よりも少ない物質の量を指す。小部分とは、５０％未満の量を指し、大部分とは、５０％を上回る量を指す。従って、一人の患者から取り出された脂肪組織の全体量よりも少ない１単位の脂肪組織は、取り出された脂肪組織の一部である。
本明細書で用いる「処理脂肪吸引物」という用語は、成熟脂肪細胞および結合組織から活性細胞成分（例えば、再生細胞を含む成分）を分離するために処理される脂肪組織を指す。この分画は、本明細書では、「脂肪組織由来細胞」または“ADC”と呼ばれる。通常、ADCは、脂肪組織からの細胞を洗浄し、分離し、濃縮することによって得られる再生細胞のペレットを指す。このペレットは、通常、細胞懸濁を遠心し、遠心チェンバーまたは細胞濃縮器の底部に細胞を凝集させることによって得られる。
本明細書で用いる「投与する」、「導入する」、「配送する」、「設置する」、および、「移植する」という用語は、本明細書では相互交換的に使用され、本発明の再生細胞を被験体に導入し、それによって該再生細胞を、所望の部位に少なくとも部分的に局在させることを可能とする方法またはルートを通じて設置することを指す。再生細胞は、適当なルートであって、被験体が所望の部位へ運ばれ、そこにおいて細胞、または細胞成分の少なくとも一部が生存を保つことが可能とされるものであればいずれのものであってもよい適当なルートを通じて投与される。被験体に対する投与後における細胞の生存期間は、数時間という短時間から、例えば、２４時間、数日、または、数年の長期に至るまででもよい。
本明細書に用いる「処理する」という用語は、疾患または障害の、少なくとも１つの有害作用または症状を低減または緩和することを含む。
本明細書で用いる「治療的有効量の再生細胞」とは、有効な、または望ましい臨床作用をもたらすのに十分な再生細胞の量を指す。前記用量は、１回以上の投与を通じて投与される。一方、どれが有効用量と考えられるかの判断は、各患者の個別的要因、例えば、患者の年齢、サイズ、病気のタイプまたは程度、病気の段階、再生細胞の投与ルート、用いる補助療法のタイプまたは程度、病気の進行過程、および所望の治療タイプ（例えば、先端的対通例的治療）を含めた要因に基づいてもよいが、ただし要因は上記に限定されない。
本明細書で用いる「被験体」は、温血動物、好ましくはヒトを含む哺乳類を含む。好ましい実施態様では、被験体は霊長動物である。さらに好ましい実施態様では、被験体はヒトである。
本明細書において先述したように、再生細胞、例えば、幹細胞および先駆細胞は、各種組織から収集することが可能である。本発明のシステムは、これらの組織全てに対して用いてよい。しかしながら、脂肪組織は再生細胞の特に豊かな供給源である。従って、本発明のシステムを、再生細胞の供給源として、脂肪組織を、限定のためでなく、例示としてのみ用いて、本明細書において具体的に説明する。
脂肪組織は、当業者に既知の任意の方法で獲得することが可能である。例えば、脂肪組織は、脂肪吸引（注射器または、動力支援による）、または脂肪摘出術、例えば、吸引支援脂肪成形術、超音波支援脂肪形成術、および、切除による脂肪摘出術、またはそれらの組み合わせによって患者から取り出してもよい。脂肪組織は取り出され、集められ、本明細書に記載される本発明のシステムの複数の実施態様から選ばれる任意の実施態様に従って処理してよい。収集される組織の量は、多くの要因、例えば、ドナーの体質量指数および年齢、収集に利用できる時間、採取可能な脂肪組織収集部位の利用可能性、現在および従来服用の薬剤および状態（例えば、抗凝固療法）、および、組織が収集される臨床目的、を含む数多くの要因に依存する。例えば、痩せた個人から抽出される１００ mlの脂肪組織における再生細胞のパーセンテージは、肥満したドナーから抽出されるものよりも大きい（表１）。これは、恐らく、肥満した個人における脂肪含量増大による希釈効果を反映するものと思われる。従って、本発明の１つの局面に応じて、より痩せた患者から吸引される量に比べて、太りすぎのドナーからはより大量の組織を入手することが望ましい。この所見はまた、本発明の有用性は、大量の脂肪組織を持つ個人に限定されないことを示す。
Figure 2008504816
脂肪組織が処理された後では、得られた再生細胞は、実質的に遊離脂質、血液構成成分、成熟脂肪細胞および結合組織を含まない。従って、本発明のシステムは、研究および／または治療目的のために使用することが可能な、複数の異種の脂肪組織由来再生細胞を生成する。好ましい実施態様では、細胞は臨床上安全である、すなわち、レシピエントの体の中に設置、または再注入するのに好適である。他の実施態様では、細胞は研究のために使用されてもよい、例えば、細胞は、長期に渡って生存し、その後の研究に使用することが可能な、幹細胞または先駆細胞系統を確立するために使用することも可能である。
次に、現在本発明の好ましいとされる実施態様について詳細に述べる。その例は、添付の図面に図示される。可能な場合はいつでも、同じまたは類似の部品を言及するための図面および説明には、同じまたは類似の参照数字が用いられる。なお、図面は単純な形で表され、厳密な原寸ではないことに注意されたい。本明細書の開示の説明では、便利と明瞭のために、方向を示す用語、例えば、頂上、底部、左、右、上、下、上部、上方、下方、直下、後ろ、前、遠位、および近位は、添付の図面に対して使用される。このような方向用語を本発明の範囲を限定するものといかなるやり方でも考えてはならない。
本明細書の開示は、いくつかの例示の実施態様について言及するが、これらの実施態様は、例示のためであって、限定のために提示されるものではないことを理解しなければならない。下記の詳細な説明の意図するところは、例示の実施態様を論じてはいるけれども、特許請求の範囲によって定義される、本発明の精神および範囲内に含まれると思量される、該実施態様の全ての修飾体、別態様、および等価物をカバーするものと考えなければならないということである。本発明は、従来技術で通例の各種医学処置と共に利用されてもよい。
ここで図面を参照すると、本発明のシステム１０は、一般に、１個以上の組織収集チェンバー２０、処理チェンバー３０、廃棄物チェンバー４０、出力チェンバー５０、およびサンプルチェンバー６０を含む。各種チェンバーは、生物材料を含む流体が、閉鎖された、または機能的に閉鎖された、無菌的流体／組織経路を維持しながら、あるチェンバーから別のチェンバーへ通過できるように、１本以上の導管１２によって共に結合される。機能的に閉鎖された通路とは、その他の点では構造的に閉鎖される、バッグ、チューブ、およびその他の成分から成るシステムの製造が、唯一防腐的または無菌的に行われるシステムを指す。通常、これは、あらかじめアルコール、ポビドンヨード、または類似の薬剤で清拭された密封ゴム製中隔を通じて、無菌または防腐的環境下におけるルアーロック型嵌合を通じて、あるいは、無菌または防腐的環境内に、開放されながら維持される一時的開口を通じての、材料の添加を含む。無菌接続装置であって、一つの閉鎖システムが、第２閉鎖システムに、閉鎖された、無菌的または防腐的やり方で接続される装置を用いることも、機能的に閉鎖されたシステムの典型例である。
導管は、本明細書では相互交換的に用いられる、それぞれ腔および管と呼ばれる剛体または屈曲体を含んでもよい。ある実施態様では、導管は、屈曲性の管、例えば、通常臨床場面で用いられるポリエチレン管、シリコンまたは、従来技術で既知のその他の任意の材料から成る管の形を取る。導管１２は、流体または組織の通過を望むか否かに応じてサイズが変動してもよい。導管１２はまた、システムを循環する組織または流体の量に応じてサイズが変動してもよい。例えば、流体の通過のために、導管は、約０．０６０から約０．７５０インチの範囲の直径を持ってもよく、組織の通過のために、導管は、０．３１２から０．７５０インチの範囲の直径を持ってもよい。一般に、導管のサイズは、導管が収容できる容量と、前記導管を通る組織または流体を輸送するのに必要な時間をバランスさせるように選ばれる。本システムの自動化実施態様では、前記パラメータ、すなわち、容量と輸送時間は、システムの処理装置に対し適切な信号が送信されるよう特定されなければならない。これによって、装置は、あるチェンバーから別のチェンバーへ正確な容量の流体および組織を移動させることが可能になる。使用される屈曲性管は、扁平変形がなるべく起こらぬよう陰圧に耐えることができなければならない。使用される屈曲性管はまた、例えば、システムで使用される可能性のある陽動ポンプによって生成される陽圧にも耐えることができなければならない。
システムのチェンバーは全て、1個以上のポート、例えば、出口ポート２２または入口ポート２１を含む。これらのポートは、標準的IV、注射器、および吸引管接続を受け容れる。ポートは、密封ポート、例えば、ゴム中隔閉鎖注射針開通ポート５１であってもよい。入口ポートは、導管を通じて、1本以上のカニューレ（図示せず）と結合されてもよい。例えば、組織の入口ポート２１は、一体化された単一使用脂肪吸引カニューレと結合されてもよく、導管は屈曲管であってもよい。導管は、一般に、システムのあるチェンバーから別のチェンバーへ流体通路を提供するように配置される。このために、導管およびポートは、例えば、手動または自動的に操作される吸引装置（図示せず）に結合されてもよい。吸引装置は、例えば、注射器または電気ポンプであってもよい。吸引装置は、患者から組織を吸引するのに十分な陰圧を提供できるものでなければならない。一般に、当業者、例えば、外科医にとって既知の任意の吸引装置の使用が可能である。
導管１２はさらに、システムの各種成分の内材料の流れを調節するために１個以上のクランプ（図示せず）を含んでもよい。クランプは、システムの異なる領域を効果的に密封することによってシステムの無菌性を維持するのに有用である。別態様として、導管１２は、システムを環流する材料の流れを調節する１個以上のバルブ１４を含んでもよい。バルブ１４は、図面では白抜き丸として特定される。好ましい実施態様では、バルブは、電気機械的ピンチバルブである。別の実施態様では、バルブは空気圧バルブである。さらに別の実施態様では、バルブは油圧バルブまたは機械的バルブである。これらのバルブは、レバーと結合したコントロールシステムによって活性化されるのが好ましい。レバーは、活性化されるために手動で操作されてもよい。自動化実施態様では、コントロールシステムは、レバーの外に、指定の活性化条件においてバルブを活性化する処理装置に結合されてもよい。いくつかの自動化実施態様では、バルブの活性化は、一部は自動化され、一部は、過程が最適化されるようにユーザーの好みに合わせられるようになっていてもよい。さらに別の実施態様では、あるバルブは手動で活性化され、別のあるものは処理装置によって自動的に活性化されてもよい。バルブ１４はまた、１個以上のポンプ、例えば、ペリスタルチックポンプ３４、または陽動ポンプ（図示せず）と組み合わせて使用されてもよい。導管１２および／またはバルブ１４はまた、センサー２９、例えば、光学センサー、超音波センサー、圧力センサー、または、システムを環流する各種流体成分および流体レベルを識別することが可能な、他の形態の、従来技術で既知のモニターを含んでもよい。好ましい実施態様では、センサー２９は光学センサーである。
システムはまた複数のフィルター３６を含んでもよい。ある実施態様では、フィルターは、システム２８の１つのチェンバー内に収められてもよい。システム内部の様々なチェンバーは、異なるフィルターを含んでもよい。フィルターは、再生細胞、例えば、幹細胞および／または先駆細胞を、対象外の細胞および、本システムに従って使用される可能性のある脱凝集剤から分離するのに有効である。１つの実施態様では、フィルターアッセンブリ３６は、中空線維ろ過装置を含む。別の実施態様では、フィルターアッセンブリ３６は、沈降過程を含んで使用されても、含まずに使用されてもよい浸透式ろ過装置を含む。さらに別の実施態様では、フィルターアッセンブリ３６は、溶出装置および過程を含んで使用されても、含まずに使用されてもよい遠心装置を含む。さらに別の実施態様では、システムは、これらのろ過装置の組み合わせを含む。本発明のろ過機能は二重性であってもよい。すなわち、あるフィルターは、最終濃度から、物体、例えば、コラーゲン、遊離脂質、遊離脂肪細胞、および残留コラゲナーゼを除去するものであり、別のフィルターは、最終産物を濃縮するために使用される。システムのフィルターは、２０から８００μｍの範囲の直径および／または長さを持つ複数の孔を含む。ある好ましい実施態様では、収集チェンバー２０は、８０から４００μｍの範囲の複数の孔を持つあらかじめ固定されたフィルター２８を有する。別の好ましい実施態様では、収集チェンバー２０は、複数の、２６５μｍ孔を持つ、あらかじめ固定されたフィルター２８を有する。別の実施態様では、フィルターは、分離および／または処分可能であってもよい。
システムはまた、システムの１個以上のチェンバー内に含まれる材料の温度調節のために配置される、１個以上の温度調節装置（図示せず）を含んでもよい。温度調節装置は、ヒーター、クーラー、またはその両方であってもよい。すなわち、ヒーターおよびクーラーの間で切り換え可能であってもよい。温度装置は、システムを環流する材料、例えば、組織、脱凝集剤、再懸濁剤、濯ぎ剤、洗剤、または添加剤を含む任意の材料の温度を調節してよい。例えば、脂肪組織の加熱は、脱凝集を促進し、一方、再生細胞出力の冷却は、生存率を維持するのに望ましい。さらに、最適な組織処理のためにあらかじめ温めた試薬が必要な場合には、温度装置の役割は、温度を上げたり、または下げたりすることではなく、指定の温度を維持することになるであろう。
閉鎖された、無菌の流体／組織経路を維持するために、全てのポートおよびバルブは、システムの密閉構成を維持する閉鎖手段を含む。閉鎖手段は、流体、空気、およびその他の汚染物質に対して不透過な膜であってもよいし、あるいは、適当であれば、従来技術で既知の任意の他の閉鎖手段であってもよい。さらに、システムの全てのポートは、注射器、針、または、システムの無菌性を冒すことなくチェンバー内に材料を引き込むための他の装置を収容可能とするように設計される。
本明細書に記載されるように、組織は、従来技術で認識される任意の方法を通じて患者から抽出されてよい。処理のためにシステムに導入する前に、吸引組織を抽出してもよい。通常、吸引組織は、密封入口ポート、例えば、ゴム中隔閉鎖注射針開通ポート（収集チェンバーに図示せず）を通じて、導管１２から収集チェンバー２０に移送される。別態様として、組織抽出工程はシステムの一部であってもよい。例えば、収集チェンバー２０は、患者の体内に挿入される標準的カニューレによる組織の取り出しを促進する真空ライン１１を含んでもよい。従って、本実施態様では、全システムが患者に付着される。組織は、導管、例えば、閉鎖滅菌経路の一部である１２ａを通じて入り口ポート２１から収集チェンバー２０に導入されてもよい。収集チェンバー２０は、複数の屈曲性または剛性キャニスターまたはシリンダー、あるいはそれらの組み合わせを含んでもよい。例えば、収集チェンバー２０は、様々なサイズの１個以上の剛性キャニスターを含んでもよい。収集チェンバー２０はまた、１種以上の屈曲性バッグを含んでもよい。このようなシステムでは、バッグには、該バッグに対して吸引を施した場合潰れてしまう確率を減らすのに役立つ支持体、例えば、内部または外部フレームが設けられていてもよい。収集チェンバー２０は、処理チェンバー３０において実行される処理の洗浄および濃縮段階に先立って、組織を適切に洗浄、脱凝集させるために必要な量の生食液を保持するのに十分なサイズを持つ。収集チェンバー２０に存在する組織または流体の容量は、肉眼で簡単に確かめられることが好ましい。例えば、脂肪組織から再生細胞を得るためには、好適な収集チェンバーは、８００ｍｌの脂肪吸引物と１２００ｍｌの生食液を保持する容量を持つ。従って、１つの実施態様では、収集チェンバー２０は、少なくとも２リットルの容量を持つ。別の実施態様では、血液から赤血球を分離・濃縮するために、収集チェンバー２０は、少なくとも１．５リットルの容量を持つ。一般に、収集チェンバー２０のサイズは、患者から収集される組織のタイプおよび量に応じて変動する。収集チェンバー２０は、小は約５ｍｌの組織から約２リットルの組織まで保持することが可能なサイズを持ってもよい。比較的小さい組織容量、例えば、５ｍｌから１００ｍｌの容量では、組織は、収集チェンバー２０に移送する前に注射器に集められる。
収集チェンバー２０は、滅菌が可能な、任意の好適な生物適合材料を用いて構築されてよい。好ましい実施態様では、収集チェンバー２０は、ＩＳＯ１０９９３標準に記載されるように、静脈内接触において生体適合性要求を満たすディスポーザブルな材料から構成される。例えば、ポリカーボネート、アクリルまたはABSを使用してもよい。収集チェンバー２０の流体通路は、発熱物質非含有、すなわち、病気伝染の危険なく血液使用に好適なものであることが好ましい。１つの実施態様では、収集チェンバー２０は、チェンバー内に存在する組織の凡その容量をユーザーが眼で見て決めることのできる材料から構築される。別の実施態様では、収集チェンバー２０内の組織および／または流体の容量は、自動化センサー２９によって定められる。収集チェンバー２０は、自動化実施態様において、システムが、チェンバー内の組織および／または流体の容量を相当の正確さで決めることができるように設計されるのが好ましい。ある好ましい実施態様では、システムは、収集チェンバー内の容量を、プラスまたはマイナス１５パーセントの正確度で感受する。
例示としてのみ提供されるある特定の実施態様では、収集チェンバー２０は、剛性チェンバー、例えば、医用級ポリエステルから成り、２６５μｍのメッシュサイズを持つ、ほぼ円錐形のあらかじめ固定されたフィルター２８を含む、医用級ポリエステルから構築されるチェンバーである（図５参照）。剛性の、組織収集容器は、高さ約８インチおよび直径約５インチのサイズを持ってもよい。壁の厚みは約０．１２５インチであってもよい。シリンダーの内部への侵入は、例えば、吸引チューブ用の１個以上のポート、無菌結合技術による接続用チューブを持つ１個以上のポート、および／または、ゴム中隔を貫通する針開通用の１個以上のポートを通じて行われてもよい。収集チェンバー２０の内部にあらかじめ固定されるフィルター２８は、例えば、組織が患者から取り出される際に、脂肪組織を保持し非脂肪組織を通過させるような構造となっていることが好ましい。さらに詳細には、フィルター２８は、脂肪組織の最初の収集中、別の実施態様では収集後、遊離脂質、血液、および生食液は通過させ、一方、脂肪組織の断片を保持することを可能とする。このために、フィルター２８は、約２０μｍから５ｍｍの範囲を持つ、同じまたは異なるサイズの複数の孔を含む。好ましい実施態様では、フィルター２８は、複数の４００μｍの孔を含む。好ましい実施態様では、フィルター２８は、厚さ約２００μｍ、孔径約２６５μｍ、開放面積約４７％を持つ医用級ポリエステルメッシュである。この物質は、濯ぎの間組織を保持するが、組織の脱凝集後は、細胞をメッシュを貫通して通過させる。従って、組織が患者から吸引される際、非脂肪組織を脂肪組織から分離することが可能である。異なる物質、メッシュサイズ、およびポートの数・タイプであっても同じ機能性を実現することが可能である。例えば、１００μｍよりも小さいメッシュの孔サイズ、あるいは、数千ミクロンほどの大きさの孔サイズであっても、生食液と血球は通過させるが、一方、脂肪組織凝集体および断片は保持するという同じ目的を達成するとことが可能であると思われる。同様に、別の剛性プラスチック材料を用いても、あるいは、当業者には恐らく既知の他の多くの変法を用いても同じ目的を実現することが可能であろう。
システム１０はまた、１個以上の溶液供給源２２を含んでもよい。溶液供給源は洗液供給源２３、および、コラゲナーゼのような組織脱凝集剤供給源２４を含んでもよい。収集チェンバー２０は、洗液または脱凝集剤が無菌的に組織に添加されるのを可能とする閉鎖流体経路を含む。
洗液２３および脱凝集剤２４のための容器は、内容物を無菌的に保持することが可能なものであれば、いずれのものであってもよい適当な容器、例えば、扁平変形が可能なバッグ、例えば、臨床場面で使用されるIVバッグであってもよい。この容器は、導管１２、例えば、収集チェンバー２０に結合する導管１２ｅを有し、そのため、洗液および脱凝集剤が収集チェンバー２０の内部に配送されるようになっていてもよい。洗液および脱凝集剤は、従来技術で既知の任意のやり方で、例えば、生食液２３および／または脱凝集剤２４の容器の外側に印加される単純な重力圧を含むやり方、あるいは、導管、例えば、図４の導管１２ｄに陽圧移動ポンプを設置することによって、収集チェンバー２０の内部に配送してもよい。自動化実施態様では、システムの処理装置は、各種パラメータ、例えば、洗浄に必要な生食液の容量、サイクルの時間または数を始め、脱凝集剤の濃度または量、および脱凝集に要する時間を、ユーザーによって最初に入力された情報（例えば、処理される組織の量）に基づいて計算する。別態様として、量、時間等は、ユーザーによって手動で操作される。
収集チェンバー内の組織および／または流体は、摂氏３０度から摂氏４０度の範囲の温度に維持しなければならない。ある好ましい実施態様では、収集チェンバー内の懸濁液の温度は、摂氏３７度に維持される。いくつかの実施態様では、外科処置または治療適用を遅れさせる必要がある場合は、選択された組織は、後の使用のために収集チェンバーの中に保存してもよい。組織は、最大９６時間まで、室温に、約室温に、あるいは、約摂氏4度で保存してもよい。
洗浄液は、当業者に既知の任意の溶液、例えば、生食液、あるいはその他任意の、緩衝化された、または非緩衝の電解液であってもよい。処理される組織のタイプは、使用される洗浄液のタイプまたは組み合わせを指定する。通常、洗浄液、例えば、生食液は、脂肪組織が患者から取り出され、収集チェンバーに設置された後に収集チェンバー２０に入る。しかしながら、洗浄液は、脂肪組織が抽出される前に収集チェンバー２０に配送されてもよいし、あるいは、脂肪組織と同時に収集チェンバー２０に配送されてもよい。収集チェンバー２０において、洗浄液と抽出された脂肪組織とは、後述の方法を含む任意の手段によって混合されてもよい。
例えば、組織は、振とう（これは、細胞の生存率を最大とし、放出される遊離脂質の量を最小にする）によって洗浄してもよい。１つの実施態様では、組織は、収集チェンバー２０全体を、様々の角度の円弧を通して（例えば、約４５度から約９０度までの円弧）、様々の速度で、例えば、１分当たり約３０回転の速度で回転させることによって振とうさせる。別の実施態様では、組織は、収集チェンバー２０全体を、様々の角度の円弧を通して（例えば、約４５度から約９０度までの円弧）、様々の速度で、例えば、１分当たり約３０回転の速度で回転させることによって振とうさせる。その際、収集チェンバー２０は、該収集チェンバーの内壁に堅く付着される１個以上のパドルまたは突起を含む。前述の収集チェンバー２０の回転は、収集チェンバー２０に付着される、または近傍に設置される駆動機構によって実現される。駆動機構は、単純なベルトまたはギア、または、従来技術で既知の他の駆動機構であってもよい。回転速度は、例えば、１分当たり３０回転であってもよい。一般に、それよりも高い速度では、遊離脂質の量が大きくなるので、最適とはならないことが判明している。
別の実施態様では、組織は、収集チェンバー２０内に回転性軸２５を設置することによって振とうされる。その際、回転性軸は、軸が回転する間混合物の中を通過する、回転可能軸２５に堅く付着される１個以上のパドル２５ａまたは突起を含む。ある実施態様では、パドル２５ａを堅く取り付けた回転性軸２５は、収集チェンバー２０の底部に静止させてもよい。これは、例えば、パドル様装置を、回転磁界の中に設置することによって実現することが可能である（例えば、磁気スターラー）。別態様として、組織の振とうは、従来技術で既知の単純な振とう器、すなわち、回転させずに上下の振とうを実行する装置を用いて実現してもよい。組織はまた、従来技術で既知の、任意の他の手段、例えば、揺動、攪拌、逆転等を用いて洗浄してもよい。
所望の数の洗浄サイクルの後、再生細胞を残余の脂肪組織成分から分離するために、組織脱凝集剤を収集チェンバー２０に配送してもよい。この脱凝集剤は、当業者に既知の任意の脱凝集剤であってよい。使用してもよい脱凝集剤としては、中性プロテアーゼ、コラゲナーゼ、トリプシン、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、ブレンドザイム酵素混合物ファミリーの構成員、例えばリベラーゼH1、ペプシン、超音波またはその他の物理的エネルギー、レーザー、マイクロウェーブ、その他の機械的装置、および／または上記の組み合わせが挙げられる。本発明の好ましい脱凝集剤はコラゲナーゼである。好ましい実施態様では、使用される脱凝集剤は、関係当局（例えば、米国食品薬品局）によってヒトに対する使用が認可されている。全ての実施態様において、脱凝集剤は、生きている微生物および、その他の汚染物質、例えば、エンドトキシンを含まない。
脱凝集剤は、他の溶液と共に加えてもよい。例えば、生食液、例えば、前述の生食液供給源２３から配送される生食液を、脂肪組織に加え、それと同時に、またはその直後にコラゲナーゼを添加してもよい。一つの実施態様では、洗浄脂肪組織は、３７℃で、またはその周辺で約２０−６０分、コラゲナーゼ含有酵素液と混合される。一つの特定の実施態様では、組織は、無菌の等張バッファー生食液で洗浄され、複数の脱凝集剤、例えば、コラゲナーゼと中性プロテアーゼの混合液と、十分な脱凝集を実現するのに十分な濃度、温度、および時間においてインキュベートされる。入手可能で、好適な中性プロテアーゼは、F. Hoffmann-La Roche社、インディアナポリス、インディアナ州から購入することが可能である。好適なコラゲナーゼ調剤としては、組み換え、および非組み換えコラゲナーゼが挙げられる。非組み換えコラゲナーゼは、F. Hoffmann-La Roche社、インディアナポリス、インディアナ州、および／または、Advance Biofactures社、Lynbrook、ニューヨーク州より購入することが可能である。組み換えコラゲナーゼも、米国特許第６，４７５，７６４号の開示に従って入手することが可能である。
ある好ましい実施態様では、洗浄済み脂肪組織は、下記の濃度の酵素を生成するために酵素混合液、Blendzyme３（登録商標）（Roche Diagnostics）と合わせられる。すなわち、コラゲナーゼＩおよびII(０．５ Wunsch単位/ml)、およびサーモリシン(２４１カゼイナーゼ単位/ml)である。次に、組織は３７℃において１５−２５分インキュベートされる。これらのパラメータは、システムが適当な時間枠において所望の細胞集団を抽出するのに効果的であることの有効性を確保するために、経験的試験によって最適化され、コラゲナーゼ酵素の供給源に従って変えられる。ある特に好ましい実施態様では、使用される酵素（単複）は、関係当局（例えば、米国食品薬品局）によってヒトに対する使用が認可される。
別の実施態様では、消化時間を短縮するために、より高濃度のコラゲナーゼ、または類似の薬剤が加えられる。次に、洗浄脂肪組織および組織脱凝集剤は、前述の振とう法と同様のやり方で、洗浄脂肪組織が脱凝集されるまで振とうされる。例えば、洗浄脂肪組織および組織脱凝集剤は、収集チェンバー全体を約９０度の円弧を通じて回転させ、軸が回転するにつれて溶液の中を通過する１個以上のパドルまたは突起を含む軸を設け、および／または、収集チェンバーの内面にパドルまたは突起を含む収集チェンバー全体を回転させることによって振とうしてもよい。
脂肪組織由来細胞が使用される目的に応じて、脂肪組織は、部分的脱凝集されてもよいし、あるいは、完全に脱凝集されてもよい。例えば、脂肪組織由来細胞が、1単位の脂肪組織と結合される実施態様では、収集脂肪組織を部分的に脱凝集し、部分的に脱凝集された脂肪組織の一部を除去し、次に、収集チェンバーに残った脂肪組織の残余部分の脱凝集を続けることが好ましい。別態様として、洗浄脂肪組織の一部を取り出し、消化前にサンプル容器に入れて脇に置いておいてもよい。別の実施態様では、収集脂肪組織を部分的に脱凝集し、細胞を、患者に再導入する前に濃縮してもよい。１つの実施態様では、脂肪組織は、一般的には約２０分未満の期間組織脱凝集剤と混合される。次に、この部分的脱凝集組織の一部は収集チェンバーから除去され、残りの部分的脱凝集組織がさらに、その脂肪組織を組織脱凝集剤とさらに４０分混合されて脱凝集される。脂肪組織由来細胞が、再生細胞から成る事実上純粋な集団として使用される場合には、脂肪組織は完全に脱凝集されてよい。
消化後、組織と脱凝集剤液とは、溶液の浮遊成分と非浮遊成分とが、収集チェンバー内で区別されるのに十分な時間安静に置かれる。通常、この時間は約１５秒から数分であるが、修飾実施態様では別の時間が導入されてもよい。浮遊層は、さらに追加の洗浄・濃縮を要する再生細胞を含む。非浮遊層は、血液、コラーゲン、脂質、および、組織の、再生細胞以外の他の細胞成分を含む。非浮遊層は、廃棄物チェンバーに移動させなければならない。
従って、収集チェンバー２０は、血液、および組織の他の非浮遊成分が、１本以上の導管１２を通じて１個以上の廃棄物容器４０に向けて排出されるように、チェンバーの最低点に出口ポート２２を含むことが好ましい。収集チェンバー２０は、出口ポート２２が収集チェンバーの底部に配置されるように直立位置を取る（または該位置に設置されてもよい）。排出は受動的でもよいし、能動的であってもよい。例えば、前述の非浮遊性成分は、重力によって、陽圧または陰圧を印加することによって、ポンプ３４によって、あるいは、排気管３２によって排出することが可能である。自動化実施態様では、処理装置が、収集チェンバー２０から非浮遊層を排出するよういくつかのバルブおよび／またはポンプに信号を送信することも可能である。自動化実施態様はまた、浮遊液および非浮遊液の間に界面が実現された時点を検出することが可能なセンサー２９を含んでもよい。自動化実施態様はまた、センサー２９、例えば、収集チェンバーから出る導管を流れる流出液の光屈折率の変化を検出することが可能な光学センサーを含んでもよい。光屈折率における適切な変化は、流出導管における浮遊層の存在を送信し、これは、非浮遊層が排出されたことを示す。次に、センサー２９は、処理装置に次の工程に進むように信号を発することも可能である。
一方、いくつかの実施態様では、組織は、該組織の非再生細胞成分を回収するために処理されてもよい。例えば、ある治療または研究応用において、コラーゲン、タンパク、基質または支質成分、脂質、脂肪細胞、または、組織のその他の細胞成分が要求されることがある。そのような実施態様では、前述のように廃棄物チェンバーに移動されなければならないのは、再生細胞を含む浮遊層である。次に、非浮遊層は、必要に応じてさらにその後の処理を受けるためにシステム内に保持される。
非浮遊層が除去されたならば、再生細胞を含む浮遊層は、残留汚染物質を除くために１回以上洗浄されてもよい。従って、収集チェンバー２０は通常、洗浄液が収集チェンバー内部に配送されるのを可能とするための１個以上のポート２１、および、廃棄物およびその他の物質を収集チェンバー２０から排出することを可能とするための1個以上のポート２２を含む。例えば、収集チェンバーは、本明細書に記載する通り、１個以上の密封入口ポートを含んでもよい。収集チェンバー２０はまた、洗浄液が収集チェンバーに配送される間、および／または、廃液が排出される間、システムが無菌状態にあることをさらに確保するために、１個以上のキャップ（図示せず）、例えば、頂上キャップおよび底部キャップを含んでもよい。ポート２１は、収集チェンバーのキャップの上、または、収集チェンバーの側壁に設けられてもよい。
新鮮な洗浄液による洗浄過程は、溶液の中の非浮遊汚染物質の残留量が指定のレベルに達するまで繰り返えされる。言い換えれば、脂肪組織断片を含む、前述の混合物の浮遊物質を含む、収集チェンバー２０の残留物質は、不要な物質の量が所望の指定レベルに低下するまで、さらに1回以上洗浄されてもよい。洗浄の終末点を定める１つの方法は、組織液中の赤血球の量を測定することである。これは、５４０ nm波長において吸収される光を測定することによって実現することが可能である。好ましい実施態様では、約０．５４６と約０．８４２の間の範囲が受容可能とされる。
洗浄および／または脱凝集中、結果をさらに向上させるために、必要に応じて1種以上の添加物を各種容器に加えてもよい。添加物の例をいくつか述べるならば、洗浄および脱凝集を最適化する薬剤、処理中に活性細胞集団の生存率を強化する添加物、抗微生物薬（例えば、抗生物質）、脂肪細胞および／または赤血球を分解する添加物、または、興味の細胞集団を濃縮する添加物（固相反応基に対する差別的接着、あるいは、その他の、細胞集団を実質的低減または濃縮を促進する差別的方法によって）が挙げられる。その他可能な添加物としては、再生細胞の回復および生存性を高めるもの（例えば、カスパーゼ阻害剤）、あるいは、注入または移植の際有害反応の起こる確率を下げるもの（例えば、細胞または結合組織再凝集の阻害剤）が挙げられる。
十分な安静静止時間が経過した後、得られた、洗浄脂肪組織断片および組織脱凝集剤の混合物の内、その非浮遊分画は、再生細胞、例えば、幹細胞、およびその他の脂肪組織由来先駆細胞を含む。本明細書に論ずる通り、再生細胞を含む非浮遊分画は、処理チェンバー３０に転送され、そこにおいて、興味の再生細胞、例えば、脂肪組織由来幹細胞が、混合物の非浮遊分画中に存在する、他の細胞および物質から分離される。この非浮遊分画は、本明細書では再生細胞成分と呼ばれ、多種類の細胞、例えば、本明細書に記載する、幹細胞、先駆細胞、内皮前駆細胞、脂肪細胞、およびその他の再生細胞を含む細胞タイプを含む。再生細胞成分はまた、1種以上の汚染物質、例えば、脂肪組織断片中に存在するコラーゲン、およびその他の結合組織タンパクおよびその断片、あるいは、組織脱凝集過程で使用された残留コラゲナーゼ等を含むことがある。
本発明の処理チェンバー３０は、再生細胞組成物が、収集チェンバー２０から、チューブ１２、バルブ１４、およびポンプ３４を通じて、無菌的に処理チェンバー３０に移動するようにシステム内に配置されることが好ましい。処理チェンバーは、１０ mLから１．２ Lの範囲の組織／流体混合物を受容できる寸法とされる。好ましい実施態様では、処理チェンバーは、８００ mLを収容する寸法とされる。いくつかの実施態様では、収集チェンバー２０からの全再生細胞組成物が処理チェンバー３０に向けられる。一方、他の実施態様では、再生細胞組成物の一部が処理チェンバー３０に向けられ、別の一部は、システムの異なる領域、例えば、サンプルチェンバー６０に向けられ、後に処理チェンバー３０で処理される細胞と再結合される。
処理チェンバー３０は、滅菌可能な、生体適合性で好適なものであればいずれのものであってもよい材料から構築されてよい。ある好ましい実施態様では、処理チェンバー３０は、ＩＳＯ１０９９３標準に記載される通り、血管内接触における生体適合性要求に合致するディスイポーザブル材料によって構築される。例えば、ポリカーボネート、アクリル、ABS、エチレン酢酸ビニル、またはスチレン-ブタジエン・コポリマー(SBC)を用いてもよい。別の実施態様では、ディスポーザブル処理チェンバーの流体通路は、発熱物質非含有である。処理チェンバーは、プラスチックバッグ、例えば、血液銀行で血液を処理するために通例として使用されるバッグの形を取ってもよく、あるいは、別の実施態様では、該チェンバーは構造的に剛性であってもよい（図６）。１つの実施態様では、処理チェンバー３０は、それぞれ出願者が共通な、２００１年１２月７日登録の米国特許出願第１０/３１６，１２７号、２００２年１２月２０日登録の米国特許出願第１０/３２５，７２８号に開示される処理チェンバーと類似していてもよい。なお、これら特許文書の内容全体を参照することにより本明細書に含める。
処理チェンバー３０は、細胞を分離・濃縮するのに好適であれば、ろ過および遠心、および／または、それらの組み合わせを含む、いずれのやり方で構築されてもよい。いくつかの実施態様では、収集チェンバー２０で得られた再生細胞組成物は、処理チェンバー３０に導入され、そこにおいて組成物は、特定の再生細胞集団を分離および／または濃縮するためにろ過される。細胞ろ過は、特定の成分および細胞を、他の異なる成分または細胞タイプから分離する方法である。例えば、本発明の再生細胞組成物は、複数の異なるタイプの細胞、例えば、先駆細胞および脂肪細胞を含む細胞を始め、１種以上の汚染物質、例えば、脂肪組織断片中に存在するコラーゲン、または、組織脱凝集過程から生じた残留コラゲナーゼを含む。処理チェンバー３０内に存在するフィルター３６は、再生細胞の特定の下位集団、例えば、幹細胞または内皮先駆細胞等の分離・濃縮を可能とする。
液体から細胞をろ過採取することに関連するいくつかの変数としては、フィルター媒体の孔サイズ、孔の形状（形）、フィルターの表面積、ろ過される溶液の方向、膜横断圧、特定細胞集団の希釈率、粒子の大きさおよび形の外、細胞のサイズおよび生存率が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。本明細書の開示に従って、分離またはろ過することが望まれる特定の細胞は、通常は、脂肪組織由来幹細胞である。しかしながら、いくつかの実施態様では、特定の細胞は、脂肪組織由来先駆細胞、例えば、内皮前駆細胞単独、または幹細胞と組み合わせた内皮前駆細胞を含んでもよい。
再生細胞組成物は、フィルターアッセンブリ、例えば、フィルターアッセンブリ３６を通過させてもよい。いくつかの実施態様では、フィルターアッセンブリ３６は、様々の機能を実行し、再生細胞組成物を別々の部分または成分に分離するように構造化される複数のフィルターを含む。例えば、フィルターの内の１つは、再生細胞組成物からコラーゲンを分離するように構成され、フィルターの内の１つは、再生細胞組成物から脂肪細胞および／または脂質成分を分離するように構成され、および、フィルターの内の１つは、再生細胞組成物から、残留酵素、例えば、組織脱凝集剤を分離するように構成される。ある実施態様では、フィルターの内の１つは、二つの機能、例えば、組成物からコラーゲンおよび組織脱凝集剤を分離する機能を実行することが可能である。この複数のフィルターは、通常は、直列に配置される。しかしながらまた、フィルターの少なくとも一部は並列にも配置される。フィルターアッセンブリ３６の直列配置を図２に示す。フィルターアッセンブリ３６の並列配置を図３に示す。
１つの実施態様では、フィルターアッセンブリ３６は、第１フィルター、第２フィルター、および第３フィルターを含む。第１フィルターは、再生細胞組成物中に存在するコラーゲン粒子を除くように構成される。これらのコラーゲン粒子は、通常、直径が約０．１ミクロンであり、最大２０ミクロン長を持つことがあり得る。コラーゲン粒子は、消化に応じて様々のサイズを持つことがある。コラーゲンは小線維である場合もある。すなわち、捩れや折れ目を持つことがある。本明細書に記載されるフィルターはどれも、ポリエーテルスルフォン、ポリエステル、PTFE、ポリプロピレン、PVDF、またはセルロースによって製造されてもよい。コラーゲンをろ過除去するためには二つの可能性がある。１つは、先ず比較的大きい粒子を除き、細胞は貫通させようとすることであり、これは、例えば、１０ミクロン範囲のフィルターを必要とする。第二の方法は、コラーゲンは十分消化されているという意図の下に、細胞を捕捉し、コラーゲンは通過させるように比較的小さいサイズのフィルター、例えば、４．５ミクロンのフィルターを用いることである。これは、細胞を再度フィルターから離れて浮遊させる手段を必要とする。また、コラーゲン線維を惹きつけて保持するフィルターを導入する可能性もあってもよい。
第2フィルターは、再生細胞成分中の浮遊しない、遊離の未熟脂肪細胞を除去するように構成される。１つの実施態様では、第２フィルターは、ポリエステルから構成され、約３０と約５０ミクロンの間の孔径を持つが、好ましい孔径は約４０ミクロンである。第２フィルターと呼ばれているけれども、この装置の設置は、比較的大型の細胞および粒子を先ず除去することを助けるために、第２位置ではなく第１位置に対して行われる。第３フィルターは、組成物中の、無駄または残留コラゲナーゼ、またはその他の組織脱凝集剤を除去するように構成される。好ましい実施態様では、コラゲナーゼは時間と共に変性してもよい。１つの実施態様では、第３フィルターは、１ μm未満の直径または長さを持つ複数の孔を含む。いくつかの実施態様では、孔は、１ μm未満の直径を持ってもよい。別の実施態様では、孔は、１０ kD と５ミクロンの間の直径を持つ。いくつかの実施態様では、第３フィルターは、再生細胞集団を、少量の生食液、または、本明細書で論ずるその他の洗浄液において濃縮するように構成される。現在好まれるところでは、最終フィルターのみは中空線維ユニットである。線維の全てが中空線維タイプであることは必ずしも必要ではない。中空線維ユニットは、好ましい実施態様では最終フィルターにおいて使用される。なぜなら、それは、再生細胞に対する有害な作用を極小に留めながらコラゲナーゼを除去する点でもっとも効率的だからである。装置が、中古品の集合体である実施態様では、この３枚のフィルターは別々の筐体に収められる。中空線維ユニットを第３フィルターとして使用する場合、第１および第２フィルターは組み合わせ１つの筐体に収めることは実行可能である。最終フィルターが中空線維装置でない場合、３枚のフィルター全てを１つの筐体の中に含めることが可能である。
フィルターアッセンブリ３６のフィルターは、処理チェンバー３０内に配置されてもよいし、あるいは、処理チェンバー３０とは別の成分として設置されてもよい。さらに、フィルターアッセンブリ３６のフィルターは、複数の処理チェンバー内に、あるいは、直列形式で設けられてもよい。いくつかの実施態様では、導管またはチューブが、１つの、または複数の処理チェンバーとして働いてもよい。処理チェンバーは、フィルター同士を接続する導管の内部容量と成るほどにサイズが低減されてもよい。このタイプのシステムは、組織液の容量が適当なサイズを持つ場合適性に機能する。従って、導管は、流体がフィルターを通過する際に流体を細胞と共に含むことによって処理チェンバーとして働いてもよい。細胞／組織が、システムを準備し、運転する過程において不必要に失われることがないよう、導管の容量を最小にするように注意しなければならない。
前述の実施態様を参照すると、洗浄細胞、および残留コラーゲン、脂肪細胞、および／または、未消化の組織脱凝集剤は、第１フィルターを通過させられ、それによって、コラーゲン粒子の少なくとも一部、好ましくは実質的にその全てが組成物から除去され、そのため、ろ液にはほとんど、好ましくは全くコラーゲン粒子が存在しないようになる。脂肪細胞および／または未消化の組織脱凝集剤を含むろ過された再生細胞組成物は、次に第2フィルターを通過させられ、それによって、遊離脂肪細胞の少なくとも一部、好ましくは実質的にその全てが、ろ過された再生細胞組成物から除去される。次に、この２回ろ過された再生細胞組成物は、未消化の組織脱凝集剤を含んでいるが、第３フィルター、例えば、本明細書で論ずる中空線維ろ過装置を通過させられ、未消化の組織脱凝集剤が、再生細胞組成物から低減または除去される。
この３回ろ過再生細胞組成物（すなわち、第１、第２、および第３フィルターを通過した後に留まる組成物）は次に、複数の出口に向けられる。これらの出口は、複数の出口を含む処理チェンバー３０の一部を含む。これらの出口は、必要な圧を維持するのに役立つばかりでなく、導管を通じて他の容器への接続を提供するのにも役立つ。そのような容器としては、収集チェンバー２０、出口チェンバー５０、および／または廃棄物チェンバー４０がある。
１つの実施態様では、フィルターアッセンブリ３６のフィルターは、中空線維ろ過部材を含む。または言い換えれば、フィルターは、フィルター媒体で形成された、中空線維集合体を含む。開示のシステム１０と共に使用が可能なフィルターの例としては、ポリスルフォン、ポリエチレンスルフォン、または混合エステル材料等が挙げられる。フィルター媒体から成るこれらの中空線維または中空管は、フィルターアッセンブリ３６の円筒カートリッジの中に収められてもよい。フィルター媒体から成る個別の管または線維は、通常、約０．１ mmから１ mmの範囲の内径を持つが、好ましい値は約０．５ mmである。適当な円筒形カートリッジの直径および長さは、該カートリッジの内部に収められるフィルター部材による個別の管の数を決める。好適な中空線維フィルターカートリッジの１つの例は、FiberFlo（登録商標）接線フローフィルター、#M-C-050-K（Minntech、ミネアポリス、ミネソタ州）である。フィルター媒体の孔径は、約１０キロダルトンと約５ミクロンの間の範囲にあってよいが、好ましい孔径は約０．５ミクロンである。
中空線維フィルターにおいて、各中空管は、本体と、第１端、第２端、および、本体の中に配され、第1端と第2端の間に延びる腔を持つ。各中空管の本体は、複数の孔を含む。孔の本体における配置は、全体として、再生細胞組成物が、本体の腔の中を流れることによってろ過され、かつ、ろ過産物が、図１２Ａに示すように接線方向に孔を通過するように行われる。言い換えると、液中の比較的小型の粒子は、本体の腔を通過する液の流れに対し接線方向に孔を通過する。再生細胞を含む組成物は、該組成物がろ過される際、各中空管の腔を通過する。組成物の流れは、各中空管の本体の孔に対して接線方向であることが好ましい。
接線方向に流れる流体を用いることによって、幹細胞ろ過の効率は、他のろ過技術に比べ強化されるようである。例えば、いくつかのろ過技術によれば、フィルター媒体の孔は、フィルターが流体の流れに対して垂直な方向を取り、図１２Ｂに示すように、フィルターが、ろ過される流体の通路を阻止するようなやり方で設置される。このタイプのろ過では、再生細胞組成物からろ過される粒子、例えば、幹細胞は、フィルターの一側に蓄積し、孔を通過する流体の流れを阻止する傾向がある。この閉塞は、フィルターの効率を低下させる可能性がある。さらに、細胞は、流体の圧力によってばかりでなく、フィルターの上流側に蓄積する細胞の重みによっても絶えず圧迫される。これは、幹細胞壊死の増加を招く。従って、流体の流れが、フィルター中の孔の方向と平行である、このようなろ過技術においては、流体が孔を通過する際、大型細胞、小型細胞の両方共フィルター媒体に押し付けられるので好ましくない。従って、液中の大型産物、例えば、細胞が孔を塞ぎ、ろ過作用を下げ、細胞破裂または損傷の発生を増大させる可能性がある。
一方、本システム１０の中空線維構成では、ろ過される流体は、中空線維の腔の内部を流れる。フィルター本体の孔を通過することのできる流体部分は、本体内部における流体の陽圧ばかりでなく、本体外側に印加される陰圧にも助けられてろ過される。本実施態様では、細胞は通常、流体圧や他の細胞の重量の影響を受けないので、幹細胞に対するせん断力は低下する。従って、ろ過の効率と有効性は、閉塞率の低下と、再生細胞分解の低下によって改善される。ろ過の際、生食液および不要なタンパク分子は、そのサイズのために中空管本体の孔を通過し、中空管の外側に出、廃棄物容器４０の方に向かう。１つの実施態様では、ろ過は、中空管フィルター媒体の外側に真空を発生することによって強化される。再生細胞、例えば、幹細胞または先駆細胞は、そのサイズのため通常本体の孔を通過することができないので、中空管フィルターの内部（例えば、管の腔）に留まり、フィルターと処理チェンバーの間の導管を通じて再び処理チェンバー３０に戻されるか、あるいは、出力チェンバー５０に向けられる。
１つの特定実施態様では、中空線維フィルターは、約０．０５ミクロンの孔径を持ち、約５５０ cm2の表面積のフィルター媒体を含む。個別の媒体管は、通常、約０．５ mmの直径を持つ。１３０ mlの再生細胞組成物を処理するのに、さらに約１２０ mlの生食液が組成物に添加される。処理すなわちろ過時間は、約８分でよい。中空線維管本体の両側（例えば、本体腔の内部圧と、本体外側の圧）間の圧差は、膜横断圧と考えられる。膜横断圧は、約１ mmHgから約５００ mmHgの範囲にあってよいが、好ましい圧は約２００ mmHgである。中空線維ろ過による有核細胞の平均回収率および生存率は、生細胞の約８０％である。
通常このようなシステムにおいて取り除かれるコラゲナーゼの量は、３ログ低下に等しい。例えば、収集チェンバーから処理チェンバーに転送される、再生細胞組成物におけるコラゲナーゼの初期濃度が０．０７８ U/mlであるとすると、最終再生細胞組成物のコラゲナーゼ濃度は０．０００７８ U/mlとなる筈である。コラゲナーゼは、中空線維フィルターで除かれ、この中空線維フィルターは前述の第3フィルターに相当する。
前述の１種以上の細胞ろ過法を具体的に示す処理チェンバーが、図面に、特に図１−３に示される。図１−３を参照すると、処理チェンバー３０と、フィルターアッセンブリ３６のろ過チェンバーの間に、ポンプ、例えば、ポンプ３４が設けられる。さらに、通気および圧センサー、例えば、通気３２および圧センサー３９が、処理チェンバー３０およびフィルターアッセンブリ３６と直線的に設けられる。出力チェンバー５０に対する接続具も設けられてよい。これらの、要すれば任意に設けられてもよい選択成分（例えば、ポンプ３４、通気３２、圧センサー３９、および、出力チェンバー５０に対する接続具）は、処理チェンバー３０とフィルターアッセンブリ３６の間に設けられ、処理チェンバー３０の中に含まれる液体が、フィルターアッセンブリ３６に流れ着く前に、上記選択成分の１種以上に向かって流動するようになっていてもよい。例えば、液体は、フィルターアッセンブリ３６に至る前に、ポンプ３４を通過して流れるようになっていてもよい。あるいは、液体は、フィルターアッセンブリを通過する前に圧センサー３９を通過して、システムのフィルター前液圧を獲得可能としてもよい。ある状況下では、上記成分の内の１つ以上を、例えば、図６に示す通気３２を、処理チェンバー３０の要素として設けてもよい。図示の実施態様では、圧センサー３９は、再生細胞組成物がフィルターアッセンブリ３６のろ過チェンバーに入る際、ポンプ３４によって生みだされた、再生細胞組成物圧を決められるように配置される。この構成は、ろ過膜を横切る膜横断圧の監視をやり易くする。再生細胞組成物がフィルターアッセンブリ３６によってろ過される際、不要なタンパクの除去を助けるために、追加の生食液、または他のバッファーおよび洗浄液を該組成物に加えることが可能である。この反復洗浄は、再生細胞の純度を高めるために複数回実行することが可能である。いくつかの実施態様では、生食液は、ろ過を強化するために必要とされる任意の工程で添加することが可能である。
限定のためではなく、例示のために提供される１つの特定実施態様では、不要のタンパクおよび生食液または他の洗浄液は、下記のようにして取り除かれる。再生細胞を始め、コラーゲンおよび結合組織粒子または断片、脂肪細胞、およびコラゲナーゼを含む組成物は、一連のフィルターを通過しながら、最小容量が達成されるまで循環させられる。最小容量は、システムの総合保持容量、およびある指定の定数の関数である。保持容量とは、全ての処理チェンバーが空である場合の、チューブおよび導管に含まれる液体の容量である。１つの実施態様では、最小容量は１５ mlである。最小容量に達すると、指定容量の洗浄液がシステムに導入され、再生細胞組成物と混合される。この、洗浄液と再生細胞組成物との混合物は、再び最小容量に達するまでジフィルターを通過しながら循環させられる。この循環は、再生細胞の純度を高めるために、言い換えると、組成物中の他の物質に対する、組成物中の再生細胞の比率を増すために、複数回繰り返される。図１０および１１を参照されたい。
再生細胞組成物から、不要なタンパクが洗い落とされ、十分に濃縮されたこと（例示の実施態様では、約１ x １０5 から１ x １０7個／mlの範囲内の最小濃度が使用可能であるが、好ましい実施態様では、最小濃度は、約１ x １０7個／mlである）が確認された後、出力チェンバー５０、例えば、出力バッグが、特定の実施態様に応じて、処理チェンバー３０および／またはフィルターアッセンブリ３６の出口ポートに接続される。次に、通気、例えば、通気３２を開放し、濃縮再生細胞の出力を促進するようにしてもよい。１つの実施態様では、この最小濃度達成の確認は、あらかじめ実験を行い、装置の電子コントロールの中にプログラムとして導入した後経験的に行われる。確認は、生産が望まれるもの、すなわち、どれぐらいの数の幹細胞／先駆細胞が必要なのか、またはどの範囲の細胞濃度が必要なのかを実現する過程の中に導入される入力となることも可能である。所望の出力を実現するためには、科学的データに基づいて、あらかじめ定められた量の脂肪組織を獲得し、システムに設置する必要がある。通気３２を開放し、ポンプ、例えば、ポンプ３４を働かせることにより、濃縮再生細胞を出力バッグに転送することが可能である。１つの実施態様では、出力バッグ５０は、一端に接続具を含むチューブを有する空の血液バッグと似ている。出力バッグの接続具は出力ポートに取り付けられ、濃縮再生細胞がこの出力バッグに転送されてもよい。
図１−３に描かれるように、何よりもまずシステムの圧を変えるために、真空ポンプ２６がシステム１０に設けられてよい。例えば、真空ポンプ２６は、収集チェンバー２０内に圧の低下をもたらすために、導管、例えば、導管１２ｂを介して収集チェンバー２０に結合されてもよい。真空ポンプ２６はまた、導管、例えば、導管１２ｇを介して処理チェンバー３０に結合されてもよい。ポンプ３４と接続する真空ポンプ２６の動作に関しては、二つの別々のポンプまたは供給源が導入されてもよいし、あるいは、過程の特定の時点で必要とされる様々な導管に真空牽引を振り向けるバルブを用いることによって単一ポンプが導入されてもよい。さらに、真空ポンプ２６は、導管、例えば導管１２ｆを介して廃棄物容器４０に結合されてもよい。
図１０および１１を参照すると、真空ポンプ２６によって発生した圧を用いて、再生細胞を含む流体の流れを導管１２に向ける。この圧は、システム１０の１個以上のバルブ１４の位置を自動的に、または手動で調節することによって複数の方向に供給することが可能である。システム１０は、陽圧を用いることによって、または、陰圧を用いることによって、あるいはそれらを組み合わせることによって適切に機能するように製造することが可能である。例えば、再生細胞は、前述の第１および第２フィルターを介して牽引し、第３フィルターに接続される、側面の柔軟な容器に引き込むことが可能である。この柔軟側面容器は、第３フィルターの先で直線（直列）接続されてもよい。最終出力チェンバーは、第3容器の他側（例えば、下流側）にある柔軟側面容器であってもよい。この実施態様では、フィルターを介して１つの柔軟側面容器から第二の柔軟側面容器へ、圧力を用いて再生細胞を移動する。
システム１０の別の実施態様では、幹細胞および／または脂肪組織由来先駆細胞のろ過は、浸透ろ過および沈渣の組み合わせを用いて実現してもよい。例えば、このシステムは、組織再生細胞組成物（例えば、幹細胞および／または脂肪由来先駆細胞を含む組成物）を通過し、次にフィルターを通過する生食液を用いる。再生細胞組成物から細胞を浸透ろ過によって採取する場合に関連する変数のいくつかを挙げると、フィルター媒体の孔径、孔の広がりまたは形状、フィルターの表面積、ろ過される再生細胞組成物の流れる方向、注入生食液の流速、膜横断圧、細胞集団の希釈率、細胞のサイズと生存率があるが、これらに限定されない。
システム１０の１つの実施態様では、処理チェンバー３０は、再生細胞を分離・濃縮するために浸透ろ過と沈渣を実行するフィルターアッセンブリ３６を用いる。限定ではなく、例示として述べると、処理チェンバー３０は、図６に示すように、側壁３０ａ、頂上面３０ｂ、および底面３０ｃを有する全体として円筒形の本体と定義される。頂上面３０ｂに滅菌通気口３２が設けられる。
図６の実施態様では、処理チェンバー３０は、２枚のフィルター、例えば、大孔フィルター３６ａと小孔フィルター３６ｂを含むフィルターアッセンブリ３６を含むものとして描かれる。フィルター３６ａおよび３６ｂの孔経は、約０．０５ミクロンと約１０ミクロンの間の範囲にある。大孔フィルター３６ａは、約５ μmの直径を持つ孔を含み、小孔フィルター３６ｂは、約１−３ μmの直径を持つ孔を含んでもよい。１つの実施態様では、フィルターは、約７８５ mm2の表面積を持つ。フィルター３６ａと３６ｂとは、処理チェンバー３０の内部を分割し、第１チェンバー３７ａ、第２チェンバー３７ｂ、および第３チェンバー３７ｃを含むようにする。図６に示すように、第１チェンバー３７ａは、第２チェンバー３７ｂと第３チェンバー３７ｃの間に配される。さらに、第１チェンバー３７ａは、入口ポート３１ａおよび出口ポート３１ｂを有する処理チェンバー３０の領域として示される。図示の処理チェンバー３０は、処理チェンバー３０の外部から、処理チェンバー３０の内部へつなぐ交通通路を供給する複数のポート、例えば、ポート３１ａ、３１ｂ、および３１ｃを含む。ポート３１ａ、３１ｂ、および３１ｃは、処理チェンバー３０の本体の側壁３０ａに配されるものとして描かれる。しかしながら、ポート３１ａ、３１ｂ、および３１ｃは、その他の領域にも配置することが可能である。ポート３１ａは、サンプル入口ポートとして描かれる。すなわち、再生細胞を含む組成物が処理チェンバー３０の内部に進入可能となるように導管に結合するように構築される。ポート３１ｂは、分離・濃縮された細胞が、処理チェンバー３０の内部から取り出されるように導管に結合・構築される出口ポートとして描かれる。ポート３１ｃは、新鮮洗浄液、例えば、生食液を処理チェンバー３０の内部に配送するための導管に結合・構築される入口ポートとして描かれる。
使用時、再生細胞は、入口ポート３１ａを通じて中央チェンバー３７ａに導入されてよい。生食液、または他のバッファーが、入口ポート３１ｃを通じて底部チェンバー３７ｂに導入される。生食液は、約１０ ml/分の速度で、チェンバー３７ａ中の再生細胞組成物の中を通過させられてもよい。生食液の流速は、重力に対向するように調節される。生食液の流れは、チェンバー中の細胞に対し、細胞の密度に応じて分離する能力を与える。通常、細胞が無理やり組成物の中を貫通させられるその度合いに応じて、組成物中の比較的大型の細胞は、中央チェンバー３７ａの底部に沈殿し、小型細胞およびタンパクは、第２フィルター３６ｂを貫いて頂上チェンバー３７ｃに運び去られる。このろ過作用は、大型細胞は場所に留まって転がされるが、小型の粒子は解放されて、生食液と共に運び去られるように生食液の流速を調節することによって実現される。チェンバー３０には、処理ユニット内の三つのチェンバーにおいて適正な圧勾配が維持されるように滅菌通気口３２が含まれる。上部チェンバー３７ｃは、吸収媒体３３を含んでもよい。この吸収媒体の目的は、溶液の中の不要のタンパクを捕捉し、それらが、例えば生食液の速度が低下した場合に、フィルター媒体を横切って元の処理液に戻らないようにすることを確保するためである。吸収媒体は、ろ過除去するために、吸収性のある、あるいは物質または成分を惹きつける1種のフィルター材料であってもよい。廃液の吸引を補助するために、頂上フィルターの上に出口ポートを加えてもよい。上記の別の実施態様は、頂上から穏やかな真空を印加して、廃液の吸引を促進することである。図示の実施態様のように、流速が比較的小さい場合吸収媒体を導入してもよい。次に、過剰な生食液およびタンパクが廃液容器に運び去られる。
大型細胞（例えば、脂肪組織由来幹細胞および／または先駆細胞）が、小型細胞およびタンパクから十分に分離された時点で、分離された細胞を含む組成物は、本明細書に論じられるやり方で濃縮される。組成物は、出口ポート３１ｂを通じてチェンバー３７ａから取り出されて後さらに濃縮してもよいし、あるいは、組成物がチェンバー３７ａにある間に濃縮してもよい。１つの実施態様では、組成物中の細胞の濃度は、下記のやり方で増大させられる。細胞が十分に分離された後、フィルター、例えば、フィルター３６ａおよび３６ｂが互いに近づけられてもよい。この移動は、二つのフィルターの間の容量（例えば、チェンバー３７ａの容量）を下げる効果を持つ。組成物中の細胞の濃縮を促進するために、処理チェンバー３０と結びつけて振動部材が設けられてもよい。１つの実施態様では、振動部材は、フィルター３６ｂ（例えば、小孔径フィルター）と結合されてもよい。振動は、細胞がフィルターに捕捉される頻度を低下させる可能性がある。組成物の容量の低下によって、過剰な生食液を廃液として除去し、細胞をより小さな容量の中に濃縮することが可能となる。
別の実施態様では、再生細胞の濃縮は下記のようにして実現される。細胞が十分に分離された後、再生細胞組成物を、重力を用いて過剰生食液をろ過除去する、別のチェンバー（図示せず）に転送することが可能である。好ましい実施態様では、沈渣が、浸透ろ過と同時に行われる。この沈渣は、約１０kDから約２ミクロンの範囲の孔径を持つフィルターの上に組成物を導入することによって実行される。１つの実施態様では、適切なフィルターは約１ミクロンの孔径を持つ。重力は、生食液および小型粒子はフィルターを通過するのを許し、一方、組成物中の細胞がフィルターを通過して流れるのを阻止する。所望の濃度の細胞が得られ、ろ過した小型粒子がフィルターの下から取り除かれた後、再生細胞組成物は振とうされ、細胞をフィルターから剥がされ、次いで、この濃縮再生細胞は出力バッグに転送される。小型粒子は、廃液として、出口から吸い出すことが可能である。
ある特定の実施態様では、収集チェンバー２０からの再生細胞組成物は処理チェンバー３０に輸送され、そこで該組成物は遠心されて再生細胞を分離・濃縮する。遠心原理は従来技術でよく知られているので、簡明のためにここでは繰り返さない。標準的で、従来技術で既知の遠心装置、成分、およびパラメータは本発明でも利用される。遠心装置の一部として使用される例示の処理室を図７および８に示す。通常、遠心装置は、遠心チェンバー（例えば、図７に示すもの）を軸の周りに回転させ、それによって、溶液中の細胞に加えられる力を、重力よりも大きくなるように増大させる。溶液中の比較的密度が高く、重たい物質は、遠心チェンバー、すなわち図７の出力チェンバー５０の一端に沈殿し、再生細胞ペレットを形成する。次に、ペレットを再懸濁し、所望の濃度の細胞、および／または、所望の容量の細胞および媒体を得てもよい。図７に示す処理チェンバーは、遠心力および重力の両方を用いて細胞を分離・濃縮するように構築される。具体的に言うと、遠心中、遠心力は、再生細胞組成物の比較的密度の高い成分、例えば、再生細胞を、遠心チェンバーの最外側端の方に向ける。遠心チェンバーが遅くなり最終的に停止すると、重力が、再生細胞が遠心チェンバーの最外側端に留まり、細胞ペレットを形成するのを助ける。従って、再生細胞組成物の不要成分、すなわち、廃棄物は、細胞ペレットを妨げることなく除去することが可能である。
本発明のさらに別の実施態様では、処理チェンバーは、回転膜フィルターの形を取る細胞濃縮器を含む。遠心過程のさらに別の実施態様では、遠心エルトリエーションを用いてもよい。この実施態様では、細胞は、個別の細胞沈降速度であって、遠心によって印加される方向力（例えば、外方）によって、細胞と溶質が異なる速度で沈降するように選ばれた速度に基づいて分離される。エルトリエーションでは、標的細胞集団の沈降は、遠心力に対して反対方向に溶液をくみ出すことによって適用される反対（例えば、内方）流速によって対向される。この対向流は、溶液内の細胞と粒子とが分離されるように調節される。エルトリエーションは、多くの細胞分離事例に応用されており(Inoue, Carsten et al., 1981; Hayner, Braun et al., 1984; Noga 1999)、流動および遠心パラメータを最適化するために用いられる原理および慣行は、当業者であれば、本開示に照らして、この状況に応用することが可能である。
図９は、本発明によるエルトリエーション実施に関連する原理を図示する。エルトリエーション実施態様は、力が回転ローターによって溶液に印加される程度までは、遠心実施態様と同様であってもよい。ここに実施されるエルトリエーション分離に関連する変数のいくつかを挙げると、回転チェンバーのサイズと形状、ローターの直径、ローターの速度、対向流チューブの直径、対向流の流速、および、溶液から取り出される粒子と細胞のサイズと密度があるが、ただしこれらに限定されない。遠心の場合と同様、再生細胞は、個別の細胞密度に基づいて分離される。
１つの実施態様では、再生細胞組成物、例えば、再生細胞およびコラゲナーゼを含む溶液は、図９．１に示すように、回転ローターのチェンバーに導入される。溶液がチェンバーに加えられると同時に、追加の生食液が、指定の流速でチェンバーに加えられる。生食液の流速は、ローターのスピード、細胞直径、および、経験的に定められるチェンバー定数の関数としてあらかじめ指定することが可能である。この流速は、例えば、IVポンプと同様の装置によって調節される。追加生食液に目的は、図９．２に示すように、ローターチェンバーにおいて、比較的大型の粒子はチェンバーの一側に移動し、比較的小型の粒子は他側に移動する条件を設けることである。この応用では、図９．３に示すように、小型の粒子はチェンバーを出て、廃棄物容器に移動するように流れが調節される。この移動によって、ローターチェンバーの溶液は、実質的に均一な細胞の集団、例えば幹細胞の集団を持つようになる。幹細胞が、溶液中の残余の要素から分離されたこと（不要なタンパクおよび遊離脂質がチェンバーから取り除かれて）が確認された後、対向流は停止される。次に、チェンバー内部の細胞は、チェンバーの外壁に濃縮ペレットを形成する。対向流は逆転され、細胞ペレットは、出力バッグに転送される。
本明細書に前述されるように、処理チェンバー３０または出力チェンバー５０は、１個以上のポート、例えば、ポート５１または５２を含んでもよい。これらのポートの内の１個以上は、前述の複数の方法の任意の組み合わせによって得られた再生細胞、またはその一部を、導管を通じて他の外科装置、細胞培養装置、細胞浸透圧調整装置、遺伝子療法装置、または精製装置に輸送するように設計されてもよい。これらのポートはまた、再生細胞を、前述のものと同じ目的のために、システム内の追加のチェンバーまたは容器、あるいは、別のシステムの一部としてのチェンバーまたは容器に、導管を通じて輸送するように設計されてもよい。ポートおよび導管はまた、１種以上の添加物、例えば、増殖因子、再懸濁流体、細胞培養試薬、細胞拡張試薬、細胞保存試薬、または、遺伝子を細胞に転送する試薬を含む細胞修飾試薬等の添加剤を加えるために使用してもよい。ポートおよび導管はまた、他の標的、例えば、インプラント材料（例えば、支持体または骨断片）を始め、他の外科インプラントおよびデバイスに向けて再生細胞を輸送するために用いてもよい。
細胞をさらに処理したい場合、既存のシステムのディスポーザブルセットの相互接続を再構成すること、既存のシステムと異なる、またはシステムに対する追加の容器および／またはチェンバーを設けること、細胞を１基以上の新たなシステムまたは装置に輸送すること、および／または、上記の任意の組み合わせを導入することによって実行してもよい。例えば、システムは、前述の手段の内から任意に選ばれる手段を用いて、システムによって得られた再生細胞が、下記の内の１個以上の応用に使用されるように再構成される。すなわち、細胞拡張（1種以上の再生細胞タイプの）および細胞維持（細胞シート洗浄および培養液交換）；継代培養；細胞播種；一過性トランスフェクション（大量支給の内から選ばれたトランスフェクト細胞の播種を含む）；収集（酵素的、非酵素的収集および機械的掻き落としによる収集）；細胞生存率の測定；細胞のプレート播種（例えば、マイクロタイタープレートに対するもの、拡張のために個々のウェルから細胞を取り出すこと、細胞を新鮮ウェルに投じて拡張することを含む）；高処理スクリーニング；細胞療法応用；遺伝子療法応用；組織工学応用；治療タンパク応用；ウィルスワクチン応用；預託またはスクリーニング、細胞増殖測定、分解、接種、感染または誘発のための再生細胞または上清の収集；細胞系統の生成（ハイブリドーマ細胞を含む）；浸透圧実験用細胞の培養；RNAiおよびウィルス耐性実験用細胞；ノックアウトおよびトランスジェニック動物実験用細胞；アフィニティー精製実験；構造生物学応用；アッセイ開発およびタンパク工学応用である。
例えば、ある特定の応用のためにある再生細胞集団の拡張が必要な場合、該集団を選択的に拡張するが、一方他の集団は維持されるか（そのために、増殖選択細胞による希釈によって減少させられる）、または、必要な増殖条件の欠如のために失われる培養条件を用いる対処法を用いることが可能である。Sekiya等は、このために、骨髄由来幹細胞について採用が可能な条件を記載している(Sekiya et al., 2002)。この方法（組織培養プラスチックに対する差別的接着を伴ってもよいし、伴わなくともよい）は、本発明のさらに別の実施態様に適用することが可能である。この実施態様では、最終的な再生細胞ペレットが出力チェンバーから取り出され、細胞培養成分を提供する第２システムに設置される。これは、通例の実験室用組織培養インキュベーター、または、バイオリアクタースタイルの装置、例えば、Tsao et al., 米国特許第６，００１，６４２号、Armstrong et al.米国特許第６，２３８，９０８号に記載されるものと同様の装置の形態を取ることも可能である。別の実施態様では、脂肪組織由来細胞集団の短期接着および／または細胞培養を可能とするために、細胞拡張または細胞培養成分を、既存のシステム、例えば、出力チェンバーに加えることも可能である。この別態様は、細胞培養物および／または細胞拡張成分の、システムに対する一体化を可能とするので、このシステムから該細胞を取り出して、別のシステム内に設置する必要が無くなる。
処理中、結果を強調するために、１種以上の添加剤を、各種チェンバーまたは容器と関連させて必要に応じて添加または供給してもよい。これらの添加剤はまた、既存のシステムと関連する別のシステム、または既存のシステムとは分離した別のシステムの一部として供給されてもよい。例えば、ある実施態様では、添加剤は、システムから再生細胞を取り出すことを要せず添加または供給される。別の実施態様では、添加剤は、添加剤を含む新規容器またはチェンバーを、システムの未使用ポートに無菌的に接続することによって添加または供給される。さらに別の実施態様では、添加剤は、本発明のシステムに接続されていない第２システムまたは装置に添加または供給される。添加剤の例としていくつか挙げると、本明細書に記載される、洗浄および脱凝集を最適化する薬剤、処理中に活性細胞集団の生存率を強化する添加物、抗微生物薬（例えば、抗生物質）、脂肪細胞および／または赤血球を分解する添加物、または、興味の細胞集団を濃縮する添加物（固相反応基に対する差別的接着、あるいは、その他の、細胞集団を実質的低減または濃縮を促進する差別的方法によって）が挙げられる。
例えば、均一な再生細胞集団を得るために、特定の再生細胞タイプを分離し、濃縮するために適当なものであれば、任意の方法、例えば、幹細胞、または先駆細胞例えば内皮先駆細胞の上に存在する抗原を認識・結合する細胞特異的抗体を使用する方法が採用されてよい。これらは、陽性選択（標的細胞を選択すること）、陰性選択（不要細胞の選択的除去）の両方、またはそれらの組み合わせを含む。さらに、最終細胞ペレットの中に含まれるある特定の再生細胞集団の差別的接着および／または溶出を可能とするように選ばれた接着性を持つ固相物質を、システムの出力チェンバーに挿入することが可能である。
この差別接着法の別の実施態様は、標的再生細胞と不要細胞において差別的に発現される表面分子を認識する抗体および／または抗体の組み合わせの使用を含む。特異的細胞表面マーカー（またはそれらの組み合わせ）の発現に基づく選択は、抗体を固相支持体構造に付着させる（直接的または間接的に）、さらに別の一般的に用いられる技術となる(Geiselhart et al., 1996; Formanek et al., 1998; Graepler et al., 1998; Kobari et al., 2001; Mohr et al., 2001)。
別の実施態様では、細胞ペレットは再懸濁し、連続的または非連続的密度勾配として形成された液体材料の上に（または下に）静置され、遠心器に移され、細胞密度に基づいて細胞集団が分離される。類似の実施態様では、連続流方法、例えば、成分輸血(Smith, 1997)、およびエルリエーション（対向流あり、または無し）(Lasch et al., 2000)(Ito and Shinomiya, 2001)を用いてもよい。
添加剤のその他の例としては、追加の生物学的または構造的成分、例えば、本明細書に論じられるもののような細胞差別因子、増殖増進剤、免疫抑制剤、医用装置、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、他の細胞、組織、組織断片、増殖因子、例えばVEGFおよび他の既知の脈管形成または動脈形成増殖因子、生物学的活性または不活性化合物、再吸収可能支持体、あるいは、再生細胞集団の輸送、効力、耐性、または機能の強化を意図して加えられる他の添加物を加えてもよい。再生細胞集団はまた、構造的または治療的目的物を誘導するために、DNAを挿入することによって、または、再生細胞の機能を変化、強化、または補充するようなやり方で細胞培養システム（本明細書に記載する通りに、または従来技術で既知のやり方で）に設置することによって修飾してもよい。例えば、幹細胞に関する遺伝子転送技術は、(Morizono et al., 2003; Mosca et al., 2000)に開示されるように当業者には既知であり、ウィルストランスフェクション技術を、さらに詳細には、(Walther and Stein, 2000)および(Athanasopoulos et al., 2000)によって開示されるようにアデノ関連ウィルス遺伝子転送技術を含んでもよい。非ウィルス系技術はまた、(Muramatsu et al., 1998)に開示される通りに実行してもよい。1種以上の細胞差別因子、例えば、増殖因子（単数または複数）またはサイトカイン（単複）を添加することも可能である。各種細胞差別剤の例が、(Gimble et al., 1995; Lennon et al., 1995; Majumdar et al., 1998; Caplan and Goldberg, 1999; Ohgushi and Caplan, 1999; Pittenger et al., 1999; Caplan and Bruder, 2001; Fukuda, 2001; Worster et al., 2001; Zuk et al., 2001)に開示されている。抗脂肪組織因子または介在分子をコードする遺伝子を添加することも可能である。遺伝子（または複数の遺伝子の組み合わせ）の添加は、従来技術で既知の任意の技術によって、例えば、アデノウィルス形質導入、「遺伝子ガン」、リポソーム仲介形質導入、およびレトロウィルスまたはレンチウィルス仲介形質導入、プラスミド、アデノ関連ウィルスを含む技術によって行うことも可能である。ただし、技術は上記に限定されない。次に、これらの再生細胞は、担体物質と共に埋め込むことが可能である。担体物質は、遺伝子を細胞に対し長期に渡って解放および／または提示し、そうすることによって形質導入が体内で続行、または起動されることを可能とする遺伝子輸送ベヒクルを担う。
細胞および／または細胞を含む組織を、その細胞および／または組織が得られた患者とは別の患者に投与する場合、その細胞および／または組織を受容する患者に対し、1種以上の免疫抑制剤を、好ましくは移植組織の拒絶を阻止するために投与されてもよい。本明細書で用いる「免疫抑制剤または仲介因子」とは、正常の免疫機能を抑制または干渉する薬剤を含むことが意図される。本明細書に開示される方法に好適な免疫抑制剤の例としては、T細胞／B細胞共同刺激経路を抑制する薬剤、例えば、米国特許公報第２００２０１８２２１１号に開示されるようにCTLA4およびB7経路を介して行われるT細胞およびB細胞の結合を干渉する薬剤が挙げられる。好ましい免疫抑制剤はシクロスポリンAである。その他の例としては、ミオフェニレート・モフェチル、ラパマイシン、および抗胸腺細胞グロブリンが挙げられる。１つの実施態様では、免疫抑制剤は、少なくとも１種の他の治療剤と共に投与される。免疫抑制剤は、投与ルートと適合する処方において投与され、所期の治療効果を実現するのに十分な用量において被験体に投与される。別の実施態様では、免疫抑制剤は、本発明の再生細胞に対する耐性を誘発するのに十分な期間一過性に投与される。
上記実施態様では、再生細胞は、装置、例えば、本明細書に記載される振とう装置および関連法を含む任意の従来技術で既知のやり方で、添加物と、接触、結合、混合、または該添加物に添加されてよい。例えば、揺動、逆転、圧迫型、パルス状または連続移動ローラーを用いてもよい。
別の局面では、細胞集団は、レシピエントに導入するのに、正当なプラスチック被覆、または、他の材料および関連成分、例えば、MacroPore Biosurgery社によって製造されるもの（例えば、米国特許第６，２６９，７１６号；５，９１９，２３４号；６，６７３，３６２号；６，６３５，０６４号；６，６５３，１４６号；６，３９１，０５９号；６，３４３，５３１号；６，２８０，４７３号を参照）によって被覆されていてもよい。
前記実施態様の全てにおいて、分離・濃縮された再生細胞の少なくとも一部は、２００２年９月１２日登録、名称「非造血組織由来非胎生細胞の保存」なる米国特許出願第１０/２４２，０９４号に記載されるように冷凍保存される。なお、該特許文書は、共通の出願人による２００１年９月１４日登録の米国特許仮出願第６０/３２２，０７０号の利益を主張する。また、これら特許文書の全体を参照することにより本明細書に含めることを明言する。
本明細書に記載する通り、本発明のシステムおよび方法によって得られる再生細胞は、再生細胞を含む多種多様な細胞タイプを含む。通常、多様な細胞タイプの範囲は、表ＩＩに示される。しかしながら、この範囲は、ドナーの年齢、医学的状態、組織の入手方法を含む要因に依存する。ただし要因は上記に限定されない。例えば、脂肪組織切除術（切除）によって取り出された組織は比較的血液含量が少なく、従って、最終産物の含む残留成熟血球、例えば、リンパ球の数は比較的少ない。同様に、補強処置、例えば、対向流エルトリエーション、密度遠心、差動接着、および本明細書に概説されるその他の処置は、設計および意図を通じて、この範囲を相当に変更させる。
Figure 2008504816
前記に加えてさらに、活性細胞集団をさらに精製するために用いられる多くの、洗浄後方法がある。そのような方法として、陽性選択（標的細胞の選択）、陰性選択（不要細胞の選択的除去）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。本明細書に記載される陽性および陰性選択の全てを通じて、使用される選択材料は、エンドトキシンを含まず、浸透して活性細胞集団の中に入りこまず、活性細胞集団の中に存在する食細胞タイプ、例えば、脂肪前駆細胞、組織マクロファージ、または単球を全く活性化しない。さらに、この処置がその内部で実行されるシステムは、無菌で、汚染物質を含まないまま閉鎖、または機能的に閉鎖される。このシステムは、製造の初期段階で用いられるシステムと完全に一体化されてもよいし、あるいは、本明細書に記載される前述のシステムからの無菌流路の創出によって、あるいは、該システムからの、物質の無菌的または防腐的転送によって接続される別々のモジュールであってもよい。
処理の終わりに、再生細胞は、出力チェンバーから手動で回収される。細胞は、輸送装置、例えば、注射器に負荷されてもよい。これは、レシピエントに対し、皮下、筋肉内、あるいは、患者の内部の標的部位に該細胞を搬送するのを可能とするその他の技術によって導入するためである。言い換えれば、細胞は、当業者に既知の任意の手段によって患者に導入されてよい。好ましい実施態様としては、針またはカテーテルによる導入、または、直接的外科的埋め込みによる導入が挙げられる。他の実施態様では、細胞は、該細胞を患者に導入するのに使用されてもよい容器、注射器、またはカテーテル等の形を取る出力チェンバーに自動的に輸送されてもよい。容器はまた、その後の使用または冷凍保存のために細胞保存用に使用されてもよい。回収法は全て無菌的に行われる。外科的埋め込みの実施態様では、細胞は、添加物、例えば、本明細書で記載する、あらかじめ形成された基質または支持体と転結させて投与することも可能である。
本発明の好ましい実施態様では（例えば、図４に示す実施態様）、システムは自動化される。別の実施態様では、システムは、自動化成分と手動成分の両方を持つ。システムは、再生可能成分またはモジュールに取り付けられた、１種以上のディスポーザブル成分を含んでもよい。本発明の自動化システムは、システムの適正な操作を促すスクリーンディスプレイ（図１６を参照）を提供する。自動化システムはまた、過程の状態、および／または、システムのディポーザブル成分の適切な設定に関する工程毎の指示を提供するスクリーンを設ける。スクリーンはまた、システムの問題点または故障を、それが起こった場合に示し、適当であれば「修理」ガイダンスを提供してもよい。１つの実施態様では、スクリーンは、ユーザーが、例えば、タッチスクリーンを介してシステムにパラメータを入力することを可能とするユーザーインターフェイス・スクリーンである。
部分的および完全自動化システムは、処理装置（例えば、マイクロプロセッサーまたはパーソナルコンピュータ）、および、システムの動作、および、処理の1個以上の工程をユーザーの入力に基づいて自動化するための調節ロジックを提供する関連ソフトウェアを含んでもよい。いくつかの実施態様では、システムの1個以上の局面が、処理装置に搭載されるソフトウェアを介してユーザーによるプログラミングが可能とされていてもよい。処理装置は、読み取り専用メモリ（ROM）の中に1種以上のあらかじめプログラムされたソフトウェアプログラムを持っていてもよい。例えば、処理装置は、血液を処理するために特別設計された、指定プログラムソフトウェア、小容量の再生細胞を獲得するよう脂肪組織を処理するための別プログラム、および、さらに大容量の再生細胞を獲得するよう脂肪組織を処理するためのさらに別のプログラムを持っていてもよい。処理装置はまた、ユーザーの関連情報入力、例えば、必要な再生細胞の量、処理される組織のタイプ、必要とされる処理後操作のタイプ、治療用途のタイプ等の入力に基づいて、過程を最適化するために好適なパラメータをユーザーに提供する、指定プログラム造成ソフトウェアを持っていてもよい。
ソフトウェアはまた、複数の工程、例えば、特定のチューブ経路に沿う流体および組織の流入および流出を、システムのポンプおよびバルブを調整することによって調節する工程；活性化の適切な順序および／または方向の調節；圧センサーによる閉塞の検出；容量測定機構によるある特定経路にそって移動される組織および／または流体の量の測定；加熱調節装置による各種成分の温度の維持；および、分離・濃縮過程とタイミングおよびソフトウェア機構との統合等の工程の自動化を可能としてもよい。処理装置はまた、処理される組織のタイプ、および／または、収集される細胞集団または下位集団、および実行される手順のタイプ（例えば、再生細胞増大脂肪組織による組織強化、または、再生細胞被覆骨移植片による骨修復用途のための細胞処理）に基づいて遠心速度の調節を可能とする。処理装置はまた、標準的パラレルまたはシリアル・ポート、または、他のコンピュータまたはネットワークと交信するための他の手段を含んでもよい。従って、処理手段は、スタンドアローン型ユニットであってもよいし、あるいは、本明細書に記載されるさらに別の処理法のために、1個以上の付加的装置と連結されてもよい。
ソフトウェアは、「操作データ」、例えば、ディスポーザブル成分のロット番号、温度および容量測定値、組織容量および細胞数パラメータ、与えた酵素の用量、インキュベーション時間、オペレータ名、日付および時間、患者名等を含むデータの自動化収集を実行可能としてもよい。本装置の好ましい実施態様では、文字認識システム、例えば、バーコード読み取りシステムが組み込まれており、これによって上記変数（例えば、ディスポーザブルセットのロット番号および使用期限、コラゲナーゼのロット番号および使用期限、患者／サンプル特定符号等）のデータ入力が処理の文書化の一部として可能とされる。これは、データ入力間違いの機会を減らすことになろう。このようなバーコード読み取りシステムは、USB、およびその他の、従来技術で既知のポートおよびシステムを用いて処理装置の中に簡単に取り込むことが可能である。このようにして、装置は、データ入力および過程の文書化の統合的制御を実現する。これらのパラメータのプリントアウト報告は、システムのプログラム化操作のユーザー定義パラメータの一部となる。もちろん、これは、プリンター成分（ハードウェアおよびドライバー）、またはソフトウェアにおけるプリンタードライバー、プラス、装置のハードウェアにおけるプリンター用インターフェイス出力コネクター（例えば、USBポート）の統合を必要とする。
いくつかの実施態様では、システムは完全に自動化されたシステムである。例えば、ユーザーは、最初、処理される組織の量を選択し、システムを患者に接続すると、システムは自動的に、それ以上のユーザーの入力無しに流れるように順番に、要求された組織を吸引し、再生細胞を分離・濃縮する。ユーザーはまた、必要とされる再生細胞の量を入力し、システムに、組織の必要量を吸引させ、さらに該組織を処理させてもよい。完全自動化システムもまた、ユーザーの入力パラメータ、例えば、洗浄サイクルの数、遠心速度等の数（例えば、２個以上）に基づいて再構成可能なシステムを含んでもよい。システムはまた半自動的モードで操作することも可能である。その場合、システムは、ユーザーの介入無しにいくつかの工程を実行するが、しかし、ある過程が起こる前にユーザーの介入を必要とする。別の実施態様では、システムは、ユーザーに対し指定の操作を指定の時間に実行するように導く指示を表示する単一の統合システムである。例えば、処理装置は、システムのチューブ、チェンバー、および他の成分の適切な挿入のために必要な工程を通じてずっとユーザーにプロンプトを提示して案内をしてもよい。従って、ユーザーは、適切な順序の操作が行われることを確かめることが可能である。このようなシステムはさらに、処理過程における不慮の工程の活性化または停止を防ぐために、操作工程毎に、ユーザーによる確認を要求することも可能である。さらに別の実施態様では、システムは、チューブ、チェンバーの適正な挿入、閉塞の不在等を確認するために自動化試験を起動してもよい。さらに別の実施態様では、本発明のシステムは、システムを環流する組織の流れを自動調節することによって複数の分離・濃縮過程を実行するようにプログラムされる。この特性は、ある患者において、他のやり方では失われたかも知れない組織を収集しシステムに導入し、該組織からの再生細胞を濃縮・分離して該患者に戻す手術の際には重要となろう。
前述したように、システムの成分は、システムの部分が単一の使用後処分可能となるように、ディスポーザブル（本明細書では「ディスポーザブルセット（単複）」と呼ぶ）であってもよい。この実施態様は、患者の組織に接触した表面は全て、使用後適正に処分することを確実にするのに役立つ可能性がある。例示のディスポーザブルセットを図１３に示す。好ましい実施態様では、システムのディスポーザブル成分はあらかじめ滅菌され、「棚卸し」で使用可能となるように包装される。このため、使用および負荷は簡単であり、かつ、数多くのチューブ接続およびチューブ接続の複雑な行程決定の必要がなくなる。このようなディスポーザブル成分は、製造するのに比較的安価であり、従って、それらを処分することよって実質的な出費を生じることはない。１つの実施態様では、ディスポーザブルシステム（本明細書では、「ディスポーザブルセット（単複）」と相互交換的に呼ばれる）は、収集チェンバー２０、処理チェンバー３０、廃棄物チェンバー４０、出力チェンバー５０、フィルターアッセンブリ３６、サンプルバッグ６０、および関連導管１２またはチューブを含む、事実上上記成分から成る、または、上記成分から成る。システムのディスポーザブルセットの好ましい実施態様では、収集チェンバー２０と処理チェンバー３０とは、剛体フレームの中に収容される導管１２を通じて接続される。処理チェンバー３０の回転密封ネットワーク（図７と８）も同じ剛体フレームの中に収容されてよい。別の好ましい実施態様では、ディスポーザブルセットの各種チェンバーおよび容器は、システムの処理装置と通信が可能な必要インターフェイスを含み、そのために、システムを自動操作するポンプ、バルブ、センサー、および他の装置は、ユーザーの介入無しに、必要に応じて適当に活性化、または脱活性化されるのが可能である。インターフェイスはまた、システムをセットアップするのに必要な時間を短縮し、熟練度を下げ、さらにシステムの適正な設定法を示し、かつ、誤った設定が生じた場合にユーザーに注意を促すことによって誤操作を低減する。
本発明のディスポーザブルセットの大部分は、多くの共通要素を持つ。しかしながら、当業者であれば、システムの様々な応用は、ディスポーザブルセットの一部となる、さらに別の成分を要求することを認識するであろう。従って、ディスポーザブルセットは、患者から脂肪組織または他の組織を獲得し、再生細胞を該患者に戻すために好適な1個以上の針または注射器をさらに含んでもよい。含まれる針または注射器の数と種類は、処理された組織の種類と量によるであろう。ディスポーザブルセットは、システム中で使用される洗浄液およびその他の処理試薬を保持するための、１個以上の、剛性または屈曲性容器をさらに含んでもよい。例えば、ディスポーザブルセットは、過程に必要な生食液、酵素、およびその他任意の処理または前処理液を保持する容器を含んでもよい。さらに、適当な洗浄液、再懸濁液、添加剤、介在因子、または移植材料は、本発明のシステムおよび方法と結合して用いられるディスポーザブルセットによって提供されてもよい。
本明細書に記載される、または、その他本発明を実行するのに必要な、システム成分、装置、または支給物同士の任意の組み合わせは、キットの形で提供されてもよい。例えば、本発明のあるキットは、例えば、注射器による脂肪組織吸引に最適な長さと直径を持つ針、および、小容量組織の処理を可能とする好ましいフィルター媒体を含む滅菌注射器を含んでもよい。本発明に従って使用してもよく、本発明のキットに含めてもよい、その他の例示の装置および支給物を表IIIおよびIVに列挙する。
下記の表IIIは、本発明のシステムおよび方法に従って脂肪組織由来再生細胞を得るために用いることの可能な支給物の例を特定する。
Figure 2008504816
下記の表IVは、本明細書に開示されるシステムおよび方法と共に使用してもよい装置を特定する。
Figure 2008504816
システムの再使用可能成分は、収集チェンバー用振とう機構、ポンプ、バルブおよびポンプ調節器を活性化する各種センサー、遠心モーター、遠心モーターの回転フレーム、ユーザーインターフェイス・スクリーンおよびUSBポート、ディスポーザブルセットを、再使用可能ハードウェア成分およびその他の関連装置にしっかりと取り付け、その界面形成を可能とする、ディスポーザブルセット接続用相互締め付けまたはドッキング装置または構成を含む、該装置または構成から事実上成る、あるいは該装置または構成から成る。例示の再使用可能成分を図１４に示す。好ましい実施態様では、再使用可能成分は、再生細胞組成物から再生細胞を分離・濃縮するための手段、例えば、回転遠心器を含む。この実施態様では、再使用可能成分は、図１５Ａに示すディスポーザブルセットの処理チェンバー（遠心チェンバーを含む）の一部と接続および界面形成するように設計される。再使用可能成分において再生細胞を分離・濃縮する手段は、回転遠心器に限定されず、回転膜フィルターを含む、本明細書に記載される任意の他の構成を含んでもよいことが理解される。再使用可能成分はまた、本明細書に記載される処理装置であって、いくつかの異なる組織処理手順を実行し、それぞれの手順に従って、システムの各種ポンプおよびバルブを選択的に活性化するための指定プログラムを含む処理装置を含んでもよい。このプロセッサーはまた、ドナー／患者情報、処理または収集情報、および、その後のダウンロードまたは編集用の他のデータを保存するためのデータ保存能力を含んでもよい。再使用可能成分は、様々のディスポーザブルセットと共に使用してよい。ディスポーザブルセットは、再使用可能成分に対し、例えば、相互締め付け装置または構成を介して接続される。その際、該装置または構成は、ディスポーザブルセットを再使用可能成分にしっかりと付着させ、界面形成させるので、再使用可能成分の上に存在する処理装置は、ディスポーザブルセットの各種成分のみならず、再使用可能成分および他の関連装置およびシステムの各種成分の制御を可能とする、すなわち、それらの成分からの信号の授受を可能とする。
一つの実施態様では、システムで使用されるディスポーザブルセットは、約８００ mLの組織を収容することが可能な収集チェンバー２０；収集チェンバー２０で洗浄・消化される約８００ mLの組織によって生成される再生細胞組成物を処理することが可能な処理チェンバー３０；少なくとも０．５ mLの再生細胞を収容することが可能な出力チェンバー５０；および、約１０ Lの廃液を収容することが可能な廃棄物容器４０を含む。この実施態様では、ハードウェア装置は、長２４'' x 幅１８'' x 高３６''を超えない。ディスポーザブルセット並びにハードウェアの各種成分について、上記以外の寸法も必要に応じて構築が可能であり、限定されることなく本発明の範囲に含まれると判断される。
システムのディポーザブル成分は、装置の所定の位置に簡単に設置される。利用され、対応する再使用可能成分と共に組み立てられたディポーザブルセットの具体的例を図１５Ａに図示する。システムは、不適切に負荷されたディスポーザブル成分を検出可能となるように設計されるのが好ましい。例えば、各ディスポーザブルセットの成分は、チューブ、チェンバー等を、システムの適当な部位に適切に軸合わせし、挿入するための色ガイド付きマークを持っていてもよい。さらに別の実施態様では、本明細書に開示されるシステムは携帯用ユニットである。例えば、この携帯用ユニットは、脂肪組織採取を行ったある場所から、脂肪組織採取のために別の場所に移動することが可能となっていてもよい。ある実施態様では、携帯用ユニットは、患者のベッドサイドにおいて脂肪組織を採取・処理するのに好適である。従って、携帯用ユニットは、患者から患者へ移動することが可能な、システムの一部であってもよい。それ故、携帯用ユニットは、所定の位置でロックされる車付きであってもよい。そうなれば、処置を通じ、都合のよい場所に安定で確実な位置に留まって使用することが可能である。他の実施態様では、携帯用ユニットは、平坦な面、例えば、机上において設定、操作されるように設計される。携帯用ユニットはまた、筐体ユニットの中に収められてもよい。携帯用ユニットは、ハンガー、フック、ラベル、スケール、および、その他の、処置を支援する装置をさらに含んでもよい。本明細書に記載される、システムの再使用可能成分、例えば、遠心器、処理装置、ディスプレイスクリーン等は全て、システムの携帯用ユニットに取り付けてもよい。
別態様として、再生細胞を獲得するための手動実施態様があるが、これも本発明の範囲内に含まれる。例えば、一つの実施態様では、本明細書に記載されるシステムの成分、装置、および／または支給物の内から任意に選ばれる組み合わせを用いて処理されてよい。
本発明のシステムの手動実施態様は、下記の工程および情報に従って実行される。なお、これらの工程および情報は、例示のために提供されるのであって、限定のためではない。先ず、脂肪組織が患者から収集される。組織回収ライン、すなわち、サンプリング部位結合器が開かれ、スパイクが、６００ mlの血液バッグの側部ポートに挿入される。約１０ mlの脂肪組織が、先端鈍なカニューレを通じて１０ ml注射器に収集される。この先端鈍なカニューレは、比較的鋭利な針(１４G)と交換される。サンプリング部位はヨウ素清拭で拭う。脂肪組織は、サンプリング部位から６００ mlバッグに注入される。次に、注射器と針を刃物片チェンバーに廃棄する。上記工程を繰り返して、十分な組織をバッグに導入する。十分な組織は、患者と用途の臨床的特定事項に基づいてケースバイケースに判断される。
第２に、吸引脂肪組織は洗浄される。あらかじめ温めておいた(３７℃)生食液バッグを、作業面の上に吊るす。青色の止血クランプを、６００ mlバッグとスパイクの間のチューブに設置する。クランプは閉鎖されてチューブを密封する。６００ mlバッグ上のスパイクを用いて生食液バッグに進入させる（この設定では、生食液バッグにゴムの中隔を介して進入するために６００ mlバッグ上の針を用いる、針の挿入前にヨウ素で中隔を拭う）。青色クランプを解除し、約１５０ mlの生食液を６００ mlバッグに進入させる。所要量の生食液が６００ mlバッグに入った時点で青色クランプを閉鎖する。６００ mlバッグを約１５秒間１０−１５回反転する。第２の青色クランプを、３L廃棄物バッグからスパイクへ導くチューブに適用する。３Lバッグ上のスパイクを用いて６００ mlバッグに進入させる。６００ mlバッグを作業表面の上に反転して吊るし、約１分静置させる。３Lバッグに至る青色クランプを解除する。廃液を３Lバッグに流れさせる。組織がチューブに入る前に、青色クランプを適用して流れを止める。６００ mlバッグを作業表面に下ろす。上記工程をさらに２回繰り返す。生食液廃液がはっきりと赤色を呈している場合、追加の第３サイクルが適応とされる。加熱封印器を用いて、３L廃棄物バッグと６００ mlバッグの間のチューブを密封する。このシールは、チューブの約中間地点に行われる。３L廃棄物バッグを外して廃棄する。６００ mlバッグを作業表面に戻す。
第３で、洗浄脂肪組織は消化される。生食液と６００ mlバッグの間のチューブにおける青色クランプを解除して、約１５０ mlの生食液を６００ mlバッグに進入させる。６００ mlバッグのサンプリング部位はヨウ素清拭で拭う。コラゲナーゼを、サンプリング部位を通じて６００ mlバッグに注入する。コラゲナーゼは、３７℃水浴、または、マイクロウェーブ加熱以外の等価物において、瓶入りコラゲナーゼを解凍することによって調製する。２２G針を付けた１ ml注射器を瓶に挿入する。コラゲナーゼを針で吸引する。この針を外し、０．２μmフィルターおよび第２の２２G針と交換する。次に、コラゲナーゼを、０．２μmフィルターおよび針を介して注射器から駆出する。脂肪組織の消化は、最終コラゲナーゼ濃度０．１−０．２ Wunsch単位／mlにおいて行われる。加熱パッドを搖動器の上に設置する。この間、生食液バッグは、依然として付着した状態で、搖動器の傍に置かれる。生食液バッグに至るチューブが、運動中の搖動器に絡みつかないように配置することに注意する。加熱パッド調節器を３７℃に設定する。６００ mlバッグを搖動器上に設置する。搖動器を最大に設定する。バッグを観察し安定であることを確認し、約１時間(５５±１０分)揺動させる。
第４で、再生細胞組成物が回収される。バッグを搖動器から外す。青色クランプを、以前廃棄物バッグに導いた閉鎖チューブに適用する。滅菌接続装置を用いて、４重バッグセットを（下記の指示によりあらかじめ調製されたもの）、以前廃棄物バッグに付着されたチューブに付着する。４重パックは、二つが結合した４重バックと見なすことができる。二つのパックに分割するチューブ分岐を特定し、該チューブを自身の上に折り返し、折り返したチューブの上に（両チューブ片の上に）金属ループを滑らせる。ループを約０．５インチ滑らせる。折り曲げ部分に形成される皺が、チューブを密封する作用をする。止血クランプを用いて閉鎖ループに部分的に皺を形成する。ループの皺はきつすぎてはならない。なぜなら、ループは処理時に外す必要がかるからである。６００ mlバッグは、作業表面の上に反転して吊り下げられ、約３分間静置される。４重セットに至るチューブ上の青色クランプが解除され、細胞分画（黄色／橙色脂肪層の下の層）が4重セットに排出される。脂肪層がチューブに入ることのないように注意する。この処理過程中、脂肪層がチューブに近づくにつれて、チューブを指で折って流れを遅くすることも可能である。次に、４重バッグセットに至るチューブを青色クランプで閉鎖し、６００mlバッグを作業表面に戻し、生食液バッグを吊るす。生食液バッグと６００mlバッグの間のチューブの上に設けた青色クランプを解除して、約１５０ mlの生食液を６００mlバッグに進入させる。６００mlバッグを約１５秒間約１０−１５回反転する。次に６００mlバッグを作業表面上で反転し、約３−５分静置させる。４重セットに至るチューブ上の青色クランプを解除して、細胞分画（黄色／橙色脂肪層の下の層）を４重セットに排出させる。脂肪層がチューブに入ることのないように注意する。例えば、脂肪層がチューブに近づくにつれて、チューブを指で折ることによって流れを遅くすることも可能である。４重バッグセットに至るチューブを青色クランプで閉鎖する。４重セットから６００mlバッグに至るチューブを加熱封印する。次に、６００mlバッグを外して廃棄する。
第５では、再生細胞組成物が洗浄される。二つの充満バッグの間のチューブに金属クリップを設置して該チューブを密封する。この４重セットを天秤の上に置く。水を第２「ダミー」４重セットに加えて、４重セットとバランスさせる。４重セットとバランスセットを、遠心器の対向バケットに設置する。中空線維において、細胞は洗浄され、バッグに入れられ、バッグと、前述の中空線維フィルターアッセンブリの間のチューブが密閉される。ペリスタルチックポンプを用いて、流体をフィルターアッセンブリ中に流し、細胞濃縮物を下流末端のバッグに集める。４重セットバッグは圧迫されず直立するように注意する。遠心は４００ x gで１０分動作させる。４重セットを遠心器から外し、血漿浸出器に設置する。バッグを浸出器に対し、バッグ頂上の硬いチューブが後面プレートのちょうど真上に来るよう、置くように注意する。バッグが高すぎると、保持される生食液が多くなりすぎるし、低すぎると、チューブが前面プレートの閉鎖能力を妨げ、この場合も保持される生食液が多くなりすぎる。４重セットから空のセットへ至る各ラインに対して青色クランプを適用する。金属ループと青色クランプを外し、上清が空の４重セットに流れるようにする。できるだけたくさんの生食液が浸出されるようにするが、細胞ペレットがずれ動くことのないように注意する。上清を含む、各バッグに至るチューブを加熱封印する。上清を含む廃棄物バッグを外す。青色クランプを、細胞を含む、４重セットバッグのそれぞれに至るチューブに適用する。次に、バッグを、血漿浸出器から取り出す。滅菌接続装置を用いて、４重バッグに至るチューブを生食液バッグに接続する。４重セットバッグの内の一つに至る青色クランプを外して、約１５０mlの生食液をこのバッグに流し、次にクランプを再度適用して生食液の流れを停止する。次に、この充満４重セットバッグを約１５秒間約１０−１５回反転する。次に、空の４重セットに至る青色クランプを外し、充満バッグの全ての内容物を廃棄物バッグに排出させる。金属ループクランプを再度適用して、二つの４重セットバッグの間のチューブを密封する。次に、このチューブを加熱封印し、生食液バッグを外す。次に、この充満４重セットバッグを約１５秒間約１０−１５回反転する。別のダミー４重セットを天秤の上に置き、細胞入り４重セットに対して再度バランスさせる。これらの４重セットバッグ（一方は充満、一方は空）を、４重セットバッグが圧迫されることのないよう、直立するように遠心器に設置する。
遠心は約４００ x gで１０分動作させる。次に、４重セットを遠心器から外し、血漿浸出器に、バッグ頂上の硬いチューブが後面プレートのちょうど真上に来るよう注意して設置する。バッグが高すぎると、保持される生食液が多くなりすぎるし、低すぎると、チューブが前面プレートの閉鎖能力を妨げ、この場合も保持される生食液が多くなりすぎる。再生細胞ペレットをずれ動かすことのないように注意しながら、金属ループを外して、充満バッグから全ての上清を空のバッグに排出させる。バッグの間のチューブを密封し、充満（廃液）バッグを外して廃棄する。次に、新規サンプリング部位結合器を残余バッグに挿入する。次に、細胞ペレットの細胞を残留生食液（もしあれば）に再懸濁し、再生細胞の濃縮液を得る。この再懸濁は、バッグを穏やかに手動操作（例えば、揉んだり、擦ったり）することによって実行することが可能である。
本発明を体現するシステムの特定例を図４に示す。図４は、組織、例えば、脂肪組織から、患者の体内に再注入するのに好適な再生細胞を分離・濃縮するための自動化シシテムおよび方法を図示する。図４に示すシステムのいくつかの実施態様では、システムはさらに、患者から任意の量の組織を吸引する自動化工程を含む。図４に示すシステムは、図１５Ａに示すシステムの自動化実施態様を実現するために、図１４に示すシステムの再使用可能成分に接続される、図１３に示すディスポーザブルセットを含む。このディスポーザブルセットは、再使用可能成分に対し、例えば、相互締め付けまたはドッキング装置または構成を介して接続される。その際、該装置または構成は、ディスポーザブルセットを再使用可能成分にしっかりと付着・連結するので、再使用可能成分の上に存在する処理装置は、ディスポーザブルセットの各種成分のみならず、再使用可能成分および他の関連装置およびシステムの制御、界面の形成を可能とする、すなわち、それらの成分、装置およびシステムとの信号の授受を可能とする。
ユーザーは、再使用可能成分にディスポーザブルセットを接続し、ユーザーインターフェイスを用いていくつかのパラメータ、例えば、収集される組織の容量を入力し、システムを患者に繋いでもよい、すると、システムは、あらかじめプログラムされた、および／または、ユーザーのインプットパラメータを用い、途切れなく連続的に図４の工程の全てを自動的に実行する。一つのこのような順序を図１５Ｂに示す。別態様として、組織はユーザーによって患者から手動で吸引され、処理、例えば、再生細胞の分離・濃縮のためにシステムに輸送されてもよい。
具体的に言うと、図４に示すように、組織、例えば、脂肪組織が、導管１２を通じて患者から吸引され、収集チェンバー２０に導入される。図４の収集チェンバーの詳細図が図５に示される。図５に示すように、収集チェンバー２０は、標準的カニューレによる組織の取り出しを助ける真空ライン１１を含んでもよい。ユーザーはこの時点で、収集チェンバー２０に向けられる組織の推定量を入力してもよい。組織は、入口ポート２１を通じて収集チェンバー２０に導入される。入口ポートは、組織、生食液、およびその他の仲介因子が無菌的に組織に加えられるのを可能とする閉鎖流路の一部である。システムの光学センサー、例えば、センサー２９は、組織のユーザー入力容量が収集チェンバー２０に存在する時点を検出することが可能である。いくつかの実施態様では、収集チェンバーに存在する組織がユーザー入力よりも少ない場合、ユーザーは、収集チェンバー２０に存在する組織の容量で処理を開始する選択を有する。いくつかの実施態様では、患者から取り出した組織の一部は、ポンプ、例えばペリスタルチックポンプによって、ユーザーインターフェイスを用いユーザー入力を介し活性化された導管を通じてサンプルチェンバー６０に向けられてもよい。
センサー２９は、組織を洗浄し、脱凝集するのに必要な工程を活性化するよう、再使用可能成分中に存在する処理装置に送信する。例えば、処理装置は、自動化バルブおよびポンプを用い、収集された組織の容量に基づいて指定量の洗剤を導入してもよい。収集チェンバーにおいてこのサイクルは、光学センサーが、溶出液が十分に透明であり、不要の物質を含まないと判断するまで繰り返されてもよい。例えば、収集チェンバー１２ｂまたは１２ｄから導出される導管に沿う光学センサー２９は、不要の物質が排除されたことを検出し、処理装置に、必要なバルブを閉鎖し、次の工程を始めるよう発信することも可能である。
次に、処理装置は、収集された組織の容量に基づいてあらかじめプログラムされた量の脱凝集剤を導入してもよい。処理装置はまた、収集された初回組織容量に基づいて、またはユーザー入力に基づいて、指定の期間収集チェンバー内の組織の振とうを活性化してもよい。図４に示す実施態様では、脱凝集剤、例えば、コラゲナーゼが、コラゲナーゼ供給源２４を通じて収集チェンバー２０に加えられると、収集チェンバー２０のモーターが処理装置を通じて活性化される。モーターは、磁気スターラー含む回転軸２５、および、収集チェンバー２８にあらかじめ固定されたフィルターのフィルターケージ２７に１本以上のパドル２５aが硬く付着したパドル様装置を活性化する。パドルは、脱凝集剤の存在下に、再生細胞が組織から分離するように振とうする。
収集チェンバー２０内の溶液は指定の期間沈殿させられる。溶液の浮遊部分は、溶液の頂上に上昇させられる。指定時間が過ぎると、非浮遊部分を廃棄物チェンバー４０に排除するように、必要なバルブおよびポンプが処理装置によって活性化される。廃棄チェンバー４０への転送は、収集チェンバーから出る導管１２ｂまたは１２ｄに沿うセンサー２９が、溶液の浮遊部分が廃棄物チェンバー３０に転送されていることを検出するまで継続する。例えば、収集チェンバーから出る導管１２ｂまたは１２ｄに沿うセンサー２９は、不要の物質が排除されたことを検出し、処理装置に必要バルブを閉鎖するように発信することが可能である。
この時点で、溶液の非浮遊分画、すなわち、再生細胞組成物は処理チェンバー３０に移動させられる。これは、必要バルブとペリスタルチックポンプによって実現される。いくつかの実施態様では、再生細胞組成物の処理チェンバー３０への転送前に、追加のある容量の生食液を、収集チェンバー２０に残留する溶液の浮遊分画に加えてもよい。さらに新たな洗浄サイクルを繰り返してもよい。このサイクルの後、溶液を沈殿させ、非浮遊分画（再生細胞を含む）を処理チェンバー３０に転送し、浮遊分画は、廃棄物チェンバー４０に排出する。この追加の洗浄サイクルを使って、全ての分離再生細胞の処理チェンバー３０への転送を最適なものとする。
再生細胞組成物が、導管１２を通じて処理チェンバー３０に輸送されたならば、濃縮相の開始前に、さらに１回以上の洗浄工程を受けてもよい。これによって、収集チェンバー２０からの廃棄物および残留汚染物が確実に排除される。同様に、濃縮工程後、再生細胞組成物は、残留汚染物を排除するためにさらに１回以上の洗浄工程を受けてもよい。不要物質は、前述と同様にして、すなわち、処理装置からの信号に基づくバルブとポンプの調節によってチェンバー３０から廃棄物チェンバー４０に移動させられてもよい。
図４に示す処理チェンバー３０の各種実施態様を下記に詳述する。図４に示す処理チェンバー３０は遠心チェンバーの形を取る。図４の処理チェンバーの詳細図を図７および８に示す。この処理チェンバー３０は、全体として、外部筐体３０．２、１個以上のシール３０．３、１個以上のベアリング３０．４、および、該処理チェンバーをシステムの再使用可能成分中に存在する遠心器に接続するための付着ポイント３０．６；回転シールから外方に延び、各端で遠心チェンバーで終わる導管の形を取る１本以上の流路３０．５を含む回転シールネットワーク３０．１を含む。遠心チェンバーは、フレーム５３の中に収容される出力チェンバー５０の形を取り、フレームは、１個以上のポート５２と、出力チェンバー５０を手動で配置を改めるための１個以上のハンドルを含む。
回転シールネットワーク３０．１は、処理チェンバーの流路が無菌状態に確実に維持されるように含まれる。さらに、処理チェンバーの流路は、いつでも、例えば、処理チェンバーの遠心チェンバーが回転中でも、無菌的に近づくことが可能である（例えば、試薬または洗浄液を加えるために）。
図７および８に示す回転シールネットワーク３０．１は、２個以上のベアリング３０．４を含む回転軸、３個以上のリップシール３０．３、および外部筐体３０．２を含む。この実施態様では、ベアリング３０．４は、本明細書ではレースと呼ばれる外部軸および内部軸（図示せず）をさらに含む。これらのレースは、精密研磨球によって隔てられてもよい。ベアリングを含むレースと球は、体液と接触するのに適した材料によって製造するか、あるいは、体液と接触するのに適した材料によってコートされるのが好ましい。ある好ましい実施態様では、レースと球は、例えば、窒化シリコンまたはジルコニアを用いて製造される。さらに、この実施態様では、３枚のリップシールは、円形“U”型のチャンネル（図示せず）の外に、円形バネ（図示せず）を含む。円形“U”型チャンネルは、回転シールネットワーク３０．１の回転軸に対し漏洩防止接合部が形成されるよう、屈曲性材料で製造されるのが好ましい。さらに、リップシールは、処理チェンバーを流通する再生細胞組成物からの圧が、シールアッセンブリに対し、緊張の増大を通じて回転軸との接合部を締め付けさせる方向に置かれることが好ましい。シールは、回転シールネットワーク３０．１の外部筐体３０．２の溝に嵌合するために、必要に応じて、拡張する、および／または、潰れることが可能な１個以上の円形クリップ（図示せず）によってその位置に固定される。回転シールネットワーク３０．１によって生成される、またはその近傍に生じる熱は、通路を移動する溶液中の細胞の分解を防ぐために調節される。このことは、例えば、回転軸を構築する硬質材料の選択、シールと接触する回転軸領域の研磨、および、回転軸とシールとの間の接触の最小化によって実現されてもよい。
別の実施態様では、回転シールネットワーク３０．１は、単一のゴムシール３０．３および空気ガスケット（図示せず）を含む。このシールとガスケットは、システムの無菌性を脅かす可能性のある任意の生物材料に対し曲折通路を提供する。別の実施態様では、回転シールネットワーク３０．１は、個々の流路を隔離する、複数個のバネ負荷シール３０．３を含む。シール３０．３は、滅菌可能であり同時に、潤滑剤無しに回転軸を密封することが可能な材料から製造される。別の実施態様では、回転シールネットワーク３０．１は、異なる流路を形成し、システムの回転に耐えることができ、かつ、細胞分解を引き起こさない一対のセラミック円板（図示せず）を含む。別の実施態様では、流路は屈曲性を持ち、処理チェンバーに対して巻かれたり、解かれたりする。これは、屈曲性流路を、処理チェンバー３０の各２回の回転に対して1回回転させることによって実現される。これによって、回転シールがまったく不要になる。
再生細胞組成物は、収集チェンバー２０からくみ出され、回転シールネットワーク３０．１の回転軸を通る流路にそって流れ、分かれて最低２本の流路３０．５に入る。これらの流路はそれぞれ、処理チェンバー３０の中心軸から外側に向かって放射状に延び、処理チェンバー３０の外側端の近傍、すなわち、出力チェンバー５０を収容する遠心チェンバー内に終止する（図７および８）。従って、好ましい実施態様では、処理チェンバー３０は、図７および８に示すように、２個以上の出力チェンバー５０を含む。これらの出力チェンバー５０は、処理中は一方向に向くように３０．７、かつ、濃縮再生細胞の回収の際には別方向に向くように３０．８配置される。例えば、出力チェンバーは、処理中はある角度傾けられ、細胞回収の際には別の角度傾けられる。細胞回収角度は、処理角度よりもより垂直に近い。出力チェンバー５０のこの二つの位置は、処理チェンバー３０から突出するハンドル５３を介して手動で操作される。再生細胞は、出力チェンバー５０が回収方向３０．８に向いた時に、注射器を用いて手動で回収される。別の実施態様では、流路３０．５は、処理チェンバーの外側で分岐し、次に、処理チェンバー３０の外側端と接続、すなわち、出力チェンバー５０（図示せず）を収容する遠心チェンバー内で接続するように構築される。この実施態様では、大量の再生細胞組成物および／または添加物、溶液等が、遠心チェンバーおよび／または出力チェンバーに直接輸送されることがある。
図４および７−９を参照すると、収集チェンバー２０と処理チェンバー３０の間に、ポンプ３４と１個以上のバルブ１４が設けられる。ある好ましい実施態様では、バルブ１４は電気機械的バルブである。さらに、センサー、例えば圧センサー２９が、処理チェンバー３０および収集チェンバー２０に対して直列に設けられる。これらのバルブ、ポンプ、およびセンサーは、再使用可能成分（図１４）上の処理装置と一致して活動し、システムの濃縮工程を自動化する。
センサーは、遠心チェンバーにおける再生細胞組成物の存在を検出し、システムの処理装置との通信を通じて遠心装置を活性化する。次に、再生細胞組成物は、初めに収集された組織の量および／またはユーザーインプットに基づいて、あらかじめプログラムされた時間、あらかじめプログラムされた負荷とされる。いくつかの実施態様では、この工程は、自動的に、またはユーザーインプットを介して繰り返される。例えば、組成物は、約５分間、重力の約４００倍の負荷とさせられる。出力チェンバー５０は、チェンバーの最外側部が、密な粒子と細胞のための小さな溜まり場を形成するように構築される。出力チェンバー５０は、密な粒子を所謂「細胞ペレット」という形で保持し、一方、より軽い上清は、流路、例えば、回転シールネットワーク３０．１の回転軸に沿う流路を通じて排除されるようにする。従って、上清は、処理チェンバー３０の中心の低点から、回転シールネットワーク３０．１を通じて廃棄物容器４０へ移動する。バルブ１４およびポンプ３４は、処理デバイスに対し、出力チェンバー５０内に存在する細胞ペレットを乱すことなく、上清を廃棄物容器４０に排除する工程を活性化するよう発信する。
図４に示すシステムを用いて得られた細胞ペレットは、本発明の濃縮再生細胞を含む。ある実施態様では、上清が排出され、廃棄物チェンバー４０に向けられた後、流路３０．５を用いて、遠心後に形成された細胞ペレットを、追加の溶液および／または他の添加物によって再懸濁させる。このようにして細胞ペレットを再懸濁させると、再生細胞をさらに洗浄することが可能となり、不要なタンパクおよび化学的化合物の除去を始め、細胞に対する酸素の流れを増大させる。得られた再懸濁液は、さらに約５分間重力の４００倍の負荷を課せられる。第２の細胞ペレットが形成され、得られた上清が廃棄物チェンバー４０に排出された後、前述のやり方で最終洗浄を、生食液または何か他の適当なバッファー液によって実行してもよい。このような反復洗浄を、再生細胞液の純度を強調するために複数回実行することが可能である。ある実施態様では、処理を強調するために、必要とされる任意の工程で生食液を加えることが可能である。図４に示すシステムを用いて得られた再生細胞の濃度は、収集組織の量、患者の年齢、患者の病歴等に応じて変動することがある。表１に例示の収率を掲げる。
次に、出力チェンバー５０を細胞取り出しのために適当な方向に配置した後、出力チェンバー５０内の最終ペレットを適当な注射器を用いて無菌的に回収してもよい。別の実施態様では、最終ペレットは、出力チェンバー５０内の容器に自動的に移動され、この容器は取り出され、保存され、必要に応じて使用される。この容器は任意の適当な形またはサイズであってよい。例えば、容器は注射器であってもよい。ある実施態様では、出力容器５０そのものが密封したまま加熱され（自動的、または手動で）、その後の回収、および、本明細書に記載される治療応用、例えば、患者に対する再注入を含む応用における再生細胞の使用に備えて、処理チェンバーの他の成分から隔離される。細胞はまた、出力チェンバーからの回収前に、または、第２システムまたは装置への転送後に、本明細書に記載する通りにさらに処理されてもよい。図１４に示す再使用可能成分は、必要に応じてさらに処理するための１種以上の追加のシステムまたは装置に接続可能となるように構築される。
本明細書に記載する通り、脂肪組織由来再生細胞は、再生医学の一般的背景において治療的、構造的、または美容的効果を得るために使用することが可能ないくつかの細胞タイプを含む。従来技術では問題にされなかった固体器官から得られる細胞の臨床的使用に関しては堅固な実施上の問題がある。脂肪組織から生細胞を単離することは、タンパク分解酵素、特に、組織内の細胞外基質分子を標的とする酵素（すなわち、コラゲナーゼ）による細胞解離を必要とする。従って、これらの細胞は、ヒトまたは家畜細胞の治療剤として使用する前に臨床的に安全でなければならない。
具体的に言うと、本発明のある局面によれば、治療的、構造的、または美容効果を得るという意図をもって脂肪組織由来細胞をレシピエントに投与する前に、有害事象を引き起こす可能性が最小とされる。要するに、レシピエントに対する最終的利益を最大とするためには、有害の可能性を最小とする。安全と利益の両方を最大化することに関連して起こる問題は、最終細胞産物が導入される部位、該産物が導入されるルート、および、レシピエントに特異的な要因（例えば、年齢、合併症、および、併用薬剤）に依存して異なる。本発明のある特性によれば、（例えば、組織消化後に回収されたADCの最終洗浄後、消化後洗浄後、生食液洗浄後）に得られた細胞懸濁液および／または上清は、本明細書に記載される１種以上の臨床的関連パラメータに関して定量される。
しかしながら、いくつかの定数については、前述の変数とは無関係に、対処しなければならない。そのような定数の一つは、感染性、有毒性、または発熱性物質または介在因子が無いことである。このような危険成分が再生細胞中に存在する可能性を最小とするためには、細胞、および、細胞を抽出する脂肪組織に接触する、全ての非生物的、および生物的材料は、使用中、無菌であるか、防腐的でなくてはならない。例えば、そのような生物的および非生物的材料は、エンドトキシン、これは、動物およびヒト起源の材料に稀ではなく存在するグラム陰性菌の産物であるが、そのようなエンドトキシンを無視できるほどの量しか、あるいは、全く含んではならない。一つの特定の実施例では、消化過程中および後に脂肪組織に接触する全ての非生物的材料は、あらかじめ試験するか、および／または、販売業者によって、米国薬局方USP;NF１９の処方に従って、装置当たり≦２０．０米国薬局方(USP)エンドトキシン単位(EU)を含むという定義に基づいて発熱源非含有とされる、および／または、（例えば、組織消化後に回収されたADCの最終洗浄後、消化後洗浄後、生食液洗浄後）に得られた細胞懸濁液および／または上清は、本明細書に記載される1種以上の臨床的関連パラメータに関して定量される（例えば、サンプル上清は、FDAの装置および放射線保健センター（CDRH）によって臨床的使用のために受容可能と告示されるエンドトキシンレベル≦０．５EU/mlに関して定量することが可能である）。ヒトではエンドトキシン暴露は敗血症および、それに続く多数臓器不全をもたらす。エンドトキシンの外にさらに、タンパク分解酵素によって脂肪組織から脱凝集された細胞は、最終的細胞集団中の残留タンパク分解活性の有無に関して評価しなければならない。なぜなら、そのような活性があると、ヒトまたは動物において、不要で、不快な組織破壊をもたらす可能性があるからである。
しかしながら、活性細胞集団を、元の脂肪組織の中に存在していた細胞外基質成分と共に導入すると効果が強調される可能性のある、本発明の実施態様がいくつかある。そのような一つの実施態様は、美容的または構造的効果を実現するために実行される細胞増殖性脂肪転送過程の設定において見られる。この設定では、結合組織基質は、再生細胞が増殖するための、そして時間経過につれて、再構成のための支持構造となり、効果をもたらす。例えば、１種以上の酵素において、それらの酵素が、完全に組織を脱凝集するようにそのまま残されたならば要したであろう時間量に対して、該酵素を、脂肪組織の少なくとも一部から早期に取り除くことによって部分的脱凝集を実行してもよい。このような過程は、要する処理時間は短く、血管内搬送には不適な産物を生成する可能性があるが、ただし、局所の、非血管輸送を用いるある種の応用には、さらに完全に脱凝集された産物よりも優れる可能性がある。このような応用の例としては、美容または構造用途における軟部組織充填が挙げられる。
一方、残留細胞外基質材料の存在は、利益よりもむしろ重大な問題を引き起こす場合が外にたくさんある。例えば、コラーゲンは、血小板凝集の古典的刺激因子である。コラーゲンまたはコラーゲンの大きな断片を血管内輸送することによって血管内でこの過程を誘発すると、血栓症および／または血栓・塞栓事象が発生し、これは、局所の虚血を引き起こす可能性がある。これは、脳の場合であれば卒中、心臓では心臓発作によってその存在が裏付けられる。従って、血管内輸送の場合、または、物質が偶発的に血管内スペースに輸送された状況下では、または、コラーゲン基質の存在が不要な場合においても、そのような細胞調製品の血小板凝集に及ぼす作用を評価しなければならない。例えば、注意を払うべき汚染物質は、細胞懸濁液における可溶性作用剤の外に、組織消化後に残留するコラーゲンの破片である。一つの実施態様によれば、検出可能なレベルの存在は、それがどのようなものであれ臨床的に関連するか、望ましくない。
同様に、脂肪組織由来再生細胞調製品の中の残留脂肪細胞および遊離脂質は、血管内または全身輸送（意図的なものであれ、偶発的なものであれ）の場合には、最小化されなければならない。なぜなら、脂肪細胞または脂質の全身投与は、脂肪塞栓症をもたらし、末端器官虚血性傷害ばかりでなく、肺換気／還流不適合ももたらす可能性があるからである。
もちろん、臨床的または獣医学的使用に相応しい再生細胞の厳密な性質は、いくつかの要因に依存する。しかしながら、一般的に言って、輸送される細胞は、二つのカテゴリーのいずれかに入る。すなわち、一つは、血管内輸送、第二は非全身性移植である。両実施態様とも本発明に含められる。
一つの実施態様では、本明細書に記載される本発明のシステムおよび方法は、閉鎖された、または機能的に閉鎖された流体／組織通路において使用される、無菌の、または防腐の非生物性および生物性成分であって、該通路において、組織、細胞、生物性、および非生物性材料の汚染物質、脱凝集剤に対する暴露が阻止されるか、または最小化され、かつ、無視できるレベルのエンドトキシンを含む非生物性および生物性材料、および、再生細胞から脂肪細胞および遊離脂質を除去し、そうすることによって、再生細胞を、患者に再環流させるのに好適とする方法をさらに含む。再生細胞からの脂肪細胞および遊離脂質の除去は、本明細書に記載される再生細胞を分離し、濃縮するための方法の内から選ばれる任意の方法によって実行される。
前述のシステムおよび方法は、本明細書において、ある程度の特異性をもって記載されたけれども、本開示はただ例示のために提示されるものであること、および、システムの構造および詳述される方法の順序に対する変更は、当業者にとって可能であると共に、本発明に含まれることが意図されることを理解しなければならない。
いくつかの出版物および特許文献が上に引用された。これら引用出版物および特許文献のそれぞれについて、その全体を、引用することによって本明細書に含める。
下記の実施例は、本発明の技法が適用される特定の状況および背景を例示するために提供されるものであって、本発明および本開示に含まれる特許請求項の範囲を限定することを意図するものではない。
（実施例）
（実施例１．ヒト脂肪組織からの、臨床的に安全な再生細胞の単離）
材料および方法
再生細胞の調製
ヒト再生細胞を収集し、下記のように脂肪組織を酵素的に消化することによって採集した。
ヒト脂肪組織は、外来通院形成外科診察室において、真空支援または非支援脂質吸引によって、先端鈍なカニューレを用い注射器の中に取った。先端鈍なカニューレは、脂質吸引後、鋭利な針（１４ゲージ）に交換した。スパイク付き（現在は代わりに針を用いている）、６００ mlの単一血液パックユニットで、本明細書では「組織バッグ」と呼ぶバッグを、サンプリング部位カップラー、およびバッグの側面ポートのスパイクを開き、ヨウ素清拭によってサンプリング部位を消毒して準備を整える。次に、脂肪組織をサンプリング部位を通じてバッグの中に注入し、その後、ヨウ素綿棒で清拭する。この過程を、所望の組織が全て収集されるまで繰り返した。次に、バッグ（単複）をMacroPore Cell Laboratoryに輸送した。該検査室では、このバッグは、注射用生食液のバッグで、あらかじめ３７℃に温めたバッグの下流に、直列に配置された。次に、組織バッグのスパイクと生食液バッグの間にチューブが直列に確保され、止血クランプがこのチューブの上に設置され、該クランプは閉鎖された。次に、スパイクを、組織バッグの針を介して用い、ゴム製中隔から生食液バッグの中に進入させた。なお、ゴム製中隔は、針の挿入前にヨウ素であらかじめ清拭してある。次に、クランプを解除し、約１５０ mlの生食液を組織バッグに進入させる。その後、クランプを再度閉鎖した。次に、バッグを約１５秒内に１０−１５回反転させた。次に、チューブを３Lの廃棄物バッグと直列に設置し、スパイクは組織バッグに付いたままとした。第２クランプをこのチューブに設けた。次に、廃棄物バッグのスパイクを用いて６００ mlバッグに進入させ、組織バッグを作業表面の上に反転して吊り下げ、バッグを安静に維持することによって組織を約１分沈渣させた。次に、クランプを解除し、流体を、組織バッグから廃棄物バッグに流し、組織がチューブに入る直前にチューブをクランプで閉鎖した。次に、組織バッグを作業面から下ろした。この洗浄工程全体を、組織の赤色の発色によって肉眼で検出しながら、大多数の赤血球の除去にはどれだけの数のサイクルが必要なのかに応じて繰り返した。加熱シーラーを用いて、廃棄物バッグと組織バッグの間において、チューブのほぼ真ん中の点でチューブを密封した。次に、廃棄物バッグを外して廃棄し、サンプリング部位をヨウ素清拭によって消毒した。次に、新鮮な生食液バッグと組織バッグの間のクランプを開放し約１５０ mlの生食液を組織バッグに進入させた。
次に、下記の濃度の酵素を生成するために酵素混合液、Blendzyme３（登録商標）（Roche Diagnostics）と数分調製された。すなわち、コラゲナーゼＩおよびII(０．５Wunsch単位/ml)、およびサーモリシン(２４１カゼイナーゼ単位/ml)である。これは、市販のバイアルから、注射器に付けた２２ゲージ針を介して１mlのBlendzymeを取り出し、それを、あらかじめ３００ mlの注射用生食液で満たした容器に投下することによって実現される。この針を０．２μmフィルターおよび第２の２２G針と交換する。次に、この作業液を４℃でインキュベートした。次に、この酵素作業液を、サンプリング部位を通じて組織バッグに加え、３７℃の水浴中で約１時間(５５±１０分)揺動しながらインキュベートした。バッグを作業面の上に反転して吊るし、約３分静置した。以前、廃棄物バッグに至るチューブの閉鎖に用いられていたクランプをこのチューブに付けた。この６００ mlバッグを作業面の上に反転し、−３分静置させた。
分析
安全性分析
次に、単離細胞について、その臨床的安全性を、エンドトキシンレベル、血小板凝集を誘発する可溶性因子、ヒト血清における残留タンパク分解酵素活性、および、脂肪細胞頻度を測定することによって評価した。
生食液洗浄液および最終ADC懸濁液中のエンドトキシンレベルを、Infinity Laboratories(Littleton、コロラド州)において同社のプロコール#LOP-426によって測定した。手短に言うと、アッセイは、９６ウェルプレートにて行った。試験サンプルまたは標準(０．１ ml)をウェルに加えた。プレートを、加熱ブロックにて３７±１℃で１０分インキュベートした。細胞分解液(０．１ ml)を各ウェルに加え反応を開始させた。試験当たりのエンドトキシン量は標準曲線から計算した。試験サンプルが、分解反応に干渉しないことを示すために陽性産物コントロールを実行した。試験サンプルに０．５０ EU/mlを加えた。抑制または強化の欠如を示すためには、発熱源結果は-５０％から+２００％ (０．２５ １．０ EU/ml)の範囲になければならない。
組織を消化するために用いたBlendzyme（登録商標）液から得られるタンパク分解活性は、それぞれ、コラゲナーゼIとIIおよびサーモリシン活性を検出する、蛍光測定によるゼラチナーゼおよびカゼイナーゼアッセイによって測定した。
コラゲナーゼ活性は、市販のキット（EnzChekゼラチナーゼ／コラゲナーゼ・アッセイキット（カタログ番号E-12055、分子プローブ; Invitrogen Detection Systems, Eugene、オレゴン州）を用いて測定した。手短に言うと、ゼラチンを、９６ウェルプレートのウェルにおいて、最終の、消化後の、生食液ADC洗浄後に得られたサンプル上清か、あるいは、連続希釈した既知濃度のBlendzyme（登録商標）（標準曲線を得るため）と合わせた。アッセイサンプルは、暗黒中で２４時間インキュベートし、次に、Gemini XSマイクロプレート・リーダーを用いて平均蛍光度を測定した（４９５ nm励起、および５１５ nm発光）。ADC洗浄液から得られたサンプルにおけるコラゲナーゼ活性は、Blendzyme（登録商標）標準曲線から既知のコラゲナーゼ濃度に基づいて計算した。
サーモリシン活性は、市販のキット（EnzChekゼラチナーゼ／コラゲナーゼ・アッセイキット（カタログ番号E-6638、分子プローブ; Invitrogen Detection Systems, Eugene、オレゴン州）を用いて測定した。手短に言うと、カゼインを、９６ウェルプレートのウェルにおいて、最終の、消化後の、ADCの生食液洗浄後に得られたサンプル上清か、あるいは、連続希釈した既知濃度のBlendzyme（登録商標）（標準曲線を得るため）と合わせた。アッセイサンプルは、暗黒中で１時間インキュベートし、次に、Gemini XSマイクロプレート・リーダーを用いて平均蛍光度を測定した（４９５ nm励起、および５１５ nm発光）。ADC洗浄液から得られたサンプルにおけるサーモリシン活性は、Blendzyme（登録商標）標準曲線から既知のサーモリシン濃度に基づいて計算した。
ADCの最終調製品による血小板凝集は、Scripps Clinic Medical Laboratories（ラホヤ、カリフォルニア州）において臨床的に標準とされる血小板凝集反応プロトコールを用いて定量した。手短に言うと、血小板富裕血漿（prp）および血小板欠乏血漿(ppp)を、アスピリンまたはイブプロフェンを２週間服用しなかった患者の血液収集によって得た。各患者のPRPサンプルは、PPPを添加することによって、２５０Kから３５０K/mm3の間の最終血小板カウントを実現するように調整した。次に、調整済みPRPサンプルを、最終の、消化後の、ADCの生食液洗浄後に得られた上清か、あるいは、既知の血小板凝集作用剤、キュベットに容れたコラーゲン、ADP、またはリストセチンと合わせ、３７℃に設定された凝集測度計によって５分から１０分の間で読み取った。ADCサンプルの上清における可溶性因子によって誘発される凝集は、既知の作用剤によって誘発された凝集曲線との比較に基づいて定量した。
脂肪細胞は、浮遊細胞を除去し、その後遠心、再懸濁してさらに細胞を濃縮した後、脂肪組織由来細胞の最終出力において測定した。１０ μlの細胞懸濁液を、あらかじめ標識したガラススライドにピペットで移した。もう一枚のガラススライドを用い、先の１０ μl細胞懸濁液を、そのガラス表面に塗布し、薄く広げ、空気乾燥させた。この空気乾燥スライドを、５０％アセトン／０．０１５ Mクエン酸ナトリウム液中で３０分固定し、水道水で１０秒洗浄し、再び空気乾燥した。次に、スライドを、ヘマトキシリンエオジンにて標準的染色プロコールを用いて染色した。染色後、スライドを明視野顕微鏡にて分析した。脂肪細胞は、細胞の側面に青色の核をもつ５０−１００ μmサイズの細胞と認識され、他の有核細胞は、細胞の中央に青色の核を持つ５−１５μmサイズの細胞と認識された。脂肪細胞のパーセント汚染度は、６回の別々のキャニスター処理によって得られた５種類のランダム視野の平均に基づいて決めた。
ADC表面マーカーの特徴解明
単離細胞は、下記に従って細胞表面マーカーによって特徴分類した。フローサイトメトリー分析を、４８８ nm固相レーザーおよび６３３ nm空冷レーザーを備えたBecton-DickinsonのFACSAria装置を用いて行った。データは、FACSDiVaソフトウェアを用いて獲得・分析し、非培養ADCを、CD31, CD34, CD45, CD151, CD9, CD184, ABCG2, CD133, CD146, CD105, CD36, CD13, CD29, CD71, CD106, CD104, CD117, CD49d, CD44, CD151, およびCD90に対するモノクロナール抗体で染色し、その蛍光強度を、細胞原形質の顆粒性（側方散乱）の関数として分析した。非特異的抗体を陰性コントロールとして用いた。個別の集団の頻度を、有核細胞領域(R1)（側方散乱プロットに対する前方散乱プロットとして定義される）に出現する陽性事象のパーセントとして表した。
結果
細胞懸濁液、または、最終の、消化後の、組織消化後に回収されたADCの生食液洗浄後に得られたサンプル上清を、前述の臨床関連パラメータについて定量した。サンプル上清は０．０２％のエンドトキシンを含んでいたが、これは、FDAの装置および放射線保健センター（CDRH）によって臨床的使用のために受容可能と告示されるエンドトキシンレベル≦０．５ EU/mlよりも実質的に低い。
脂肪組織を消化するために用いられたBlendzyme（登録商標）液から得られるコラゲナーゼおよびサーモリシン活性は、最終細胞調製品の上清において測定された。この活性は、ヒト血清において定量された。なぜなら、血清は、ADC治療が患者において接触することが予想される主要成分だからである。さらに、ヒト血清は、組織特異的プロテアーゼの阻害剤を含むので、ヒトにおけるそれらの活性は関連評価となる。サンプル上清における残留コラゲナーゼ活性は、血清によって９９．９％抑制された。同様に、残留サーモリシン活性も血清によって９９．９％抑制された。ヒト血清におけるサンプル上清コラゲナーゼ活性は、１．５ x １０-2 単位/mlであり、これは、ヒトに導入した場合の最小希釈度が４−５桁の大きさであることを考えると、１．５ x １０-6, -7単位/mlなると考えられる。比較として、我々は、ヒト血清における内因性コラゲナーゼ活性を測定したところ２．２ x １０-6 単位/mlであった。同様に、血清におけるサンプル上清のサーモリシン活性は１．７単位/mlであり、これも、ヒトに導入した場合の最小希釈度が４−５桁の大きさであることを考えると、１．５ x １０-4, -5単位/mlとなると考えられる。比較として、我々は、ヒト血清における内因性サーモリシン活性を測定したところ２．７ x １０-4 単位/mlであった。
全ADC細胞懸濁液において、脂肪細胞含量は、０．０１％から０．０４％（平均０．０２±０．０１％，n=６）の範囲にあった。最後に、コラーゲン、ADP、およびレストセチンに対して、それぞれ、８３．７％±９．６，７４％±８．２，８３．３±８．１％であるのに比べて、ADC上清中の可溶性因子に対して反応して凝集する血小板のパーセントは、０％ から１．６７％ (n=３)の範囲にあった。
まとめ
前述の結果は、本発明のシステムおよび方法の手動的実施態様によって得られる再生細胞は臨床的に安全であることを示す。従って、あらかじめ滅菌された成分、および、閉鎖された、または機能的に閉鎖された無菌／流動組織通路による自動化実施態様は、手動的実施態様によって生成された再生細胞に比べ、より安全とは言わないまでも、等しく安全な再生細胞を生成すると考えられる。
等価物
当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定の実施態様に対し、多くの等価物を認め、あるいは、それらの等価物を僅かに通例の実験を用いるだけで確かめることができるであろう。そのような等価物は、頭書の特許請求項の被う範囲内に含まれることが意図される。
１個のフィルターアッセンブリを含む、組織から再生細胞を分離及び濃縮するためのシステムを示す図面である。 直列形式で複数のフィルターアッセンブリを有する、図１と同様のシステムを示す図面である。 並列形式で複数のフィルターアッセンブリを有する、図１と同様のシステムを示す図面である。 遠心チェンバーを含む、組織から再生細胞を分離及び濃縮するためのシステムを示す図面である。 組織から再生細胞を分離及び濃縮するためのシステムにおいて利用される、あらかじめ固定されたフィルターを含む収集チェンバーの断面図である。 浸透式ろ過システムを用いて組織から再生細胞を分離及び濃縮するシステムの処理チェンバーの断面図である。 再生細胞を濃縮するために遠心装置を利用する、再生細胞を分離及び濃縮するシステムの処理チェンバーの断面図である。 図７の処理チェンバーの別の断面図である。 図(A)〜(C)は、本発明のシステムにおいて用いられるエルトリエーション成分を図示する。 システムの中で流体を移動させるために真空圧を利用することによって組織から再生細胞を分離及び濃縮するシステムを示す図面である。真空システムは、真空ポンプまたは真空供給源をシステムの出口に設けることによって構築され、真空ポンプまたは真空供給源は、流れの方向とタイミングを調節するためにストップコック系、通気口、およびクランプを用い、指定の速度で組織および流体を牽引循環するように調節される。 システムの中で流体を移動させるために陽圧を利用することによって組織から再生細胞を分離及び濃縮するシステムを示す図面である。陽圧システムは、流れの方向とタイミングを調節するために、バルブ、ストップコック、通気口、およびクランプを用い、システムの中を組織および流体を指定の速度で駆出または駆動するために、機械的手段、例えば、ペリスタルチックポンプを用いる。 流体入力流が、フィルターの孔に対して接線方向に流れるろ過過程を示す。 流体入力流が、フィルターの孔に対して垂直方向に流れるろ過過程を示す。 本発明のシステム用の例示ディスポーザブルセットを示す図面である。 本発明のシステム用の例示の再使用可能成分を示す図面である。 図１３のディスポーザブルセットおよび図１４の再使用可能成分を用いて組み立てた、本発明の例示装置を示す図面である。 ソフトウェアプログラムを通じて実行される、例示の、指定プログラム工程であって、本発明のシステムの自動化実施態様を制御する工程を示すフローチャートである。システムの万能性を示すために、２種類の選択処理パラメータが提示される。

Claims (38)

  1. 硬または軟組織形成を誘発する方法であって、
    (１)組織からの再生細胞を濃縮して組成物を形成するに際し、該組成物の少なくとも一部は試験されて患者において有害事象を引き起こすことがないことが実証される組成物を形成すること、および、
    (２)組成物を患者に導入して硬または軟組織の形成を誘発すること、
    を含む前記方法。
  2. 請求項１の濃縮および試験工程を実行するように構築される装置。
  3. 請求項１の濃縮および試験工程に従って形成される組成物。
  4. 前記試験が、導入前に自動的に実行されることを特徴とする、請求項１の方法。
  5. 前記試験は、
    実行される移植のタイプおよび誘発される硬または軟組織形成のタイプの内の少なくとも１つを特定する入力を受容すること、
    入力に基づいて保存された一群の試験の内から複数の試験を選択すること、および、
    選択された試験をユーザーに通信すること、
    を含むことを特徴とする、請求項４の方法。
  6. 組成物の少なくとも一部の前記試験が、導入前に自動的に実行されることを特徴とする、請求項５の方法。
  7. 前記試験は、
    実行される移植のタイプおよび誘発される硬または軟組織形成のタイプの内の少なくとも１つを特定する入力を受容すること、
    複数の試験の内から少なくとも１つの試験を選択すること、および、
    入力に基づいて、組成物の少なくとも一部に対して前記少なくとも１つの試験を行うこと、
    を含むことを特徴とする、請求項４の方法。
  8. 組成物の少なくとも一部に対する前記試験が、導入前に自動的に実行されることを特徴とする、請求項７の方法。
  9. 前記選択は複数の試験を選択することを含み、その後、ユーザーに選択された試験を示し、
    少なくとも１つの試験の前記実行は、その前に、ユーザーから、該少なくとも１つの試験を実行せよという入力を受容する、
    ことを特徴とする、請求項７の方法。
  10. ユーザーからの入力である、前記少なくとも１つの試験は、前記複数の試験の内の１つであることを特徴とする、請求項９の方法。
  11. 請求項７の方法を実行するように構築される装置。
  12. 前記導入は、組成物の少なくとも一部を患者の体内に向ける血管内輸送を含み、
    前記組成物の少なくとも一部は、エンドトキシン、濃縮時に導入される可能性のある残留酵素、遊離脂質、および、血小板凝集作用剤の内の少なくとも１つについて、それが臨床的に危険なレベルで存在するか否かに関して試験される、
    ことを特徴とする、請求項７の方法。
  13. 前記導入は、前記組成物の少なくとも一部を患者の体内に向けた非全身的移植を含み、かつ、
    前記組成物は、血小板凝集の作用剤を含む、
    ことを特徴とする、請求項７の方法。
  14. 前記導入は、前記組成物の少なくとも一部を患者の体内に向けた非全身的移植を含み、かつ、
    前記組成物は、遊離脂質を含む、
    ことを特徴とする、請求項７の方法。
  15. 請求項１の濃縮および試験工程を実行するように構築される装置であって、
    前記試験は、
    実行される移植のタイプおよび誘発される硬または軟組織形成のタイプの内の少なくとも１つを特定する入力を受容すること、
    複数の試験の内から少なくとも１つの試験を選択すること、および、
    入力に基づいて、組成物の少なくとも一部に対して前記試験を行うこと、
    を含むことを特徴とする、前記装置。
  16. 請求項１の濃縮および試験工程を自動的に実行するように構築される装置であって、
    実行される移植のタイプおよび誘発される硬または軟組織形成のタイプの内の少なくとも１つを特定する入力を受容すること、
    複数の試験の内から少なくとも１つの試験を選択すること、および、
    前記入力に基づいて、前記組成物の少なくとも一部に対して前記少なくとも１つの試験を行うこと、
    をさらに自動的に実行するように構築される、前記装置。
  17. 実行される移植の前記タイプは非全身的移植であり、かつ、
    前記濃縮は、組織を単に部分的に脱凝集することを含む、
    ことを特徴とする、請求項１６の装置。
  18. 前記少なくとも１つの選択された試験は、遊離脂質に関する試験を含まないことを特徴とする、請求項１７の装置。
  19. 請求項１の濃縮および試験工程を自動的に実行するように構築される装置であって、
    実行される移植のタイプおよび誘発される硬または軟組織形成のタイプの内の少なくとも１つを特定する入力を受容すること、
    前記入力に基づいて保存された１群の試験の内から複数の試験を選択すること、および、
    前記選択された試験をユーザーに通信すること、
    をさらに自動的に実行するように構築される、前記装置。
  20. 実行される移植の前記タイプは非全身的移植であり、かつ、
    前記濃縮は、組織を単に部分的に脱凝集することを含む、
    ことを特徴とする、請求項１９の装置。
  21. 前記選択された複数の試験は、遊離脂質に関する試験を含まないことを特徴とする、請求項２０の装置。
  22. 前記組成物の少なくとも一部は、(２)において誘発される硬または軟組織形成に対し、エンドトキシン、濃縮時に導入される可能性のある残留酵素、遊離脂質、および、濃縮時に存在する可能性のある残留細胞外基質の内の少なくとも１つについて、それが臨床的に危険なレベルで存在するか否かに関して試験される、
    ことを特徴とする、請求項１の方法。
  23. 前記導入は、前記組成物の少なくとも一部を患者の体内に向けた血管内または全身性輸送を含み、
    前記試験は、濃縮において用いられた酵素による残留タンパク分解酵素活性のレベルに関し、前記導入後に患者において有害事象を引き起こす可能性が考えられるレベルかどうかを試験することを含む、
    ことを特徴とする、請求項２２の方法。
  24. 前記導入は、組成物の少なくとも一部を患者の体内に向けた血管内または全身性輸送を含み、
    前記試験は、遊離脂質のレベルに関し、前記導入後に患者において有害事象を引き起こす可能性が考えられるレベルかどうかを試験することを含む、
    ことを特徴とする、請求項２２の方法。
  25. 前記導入は、組成物の少なくとも一部を患者の体内に向けた血管内または全身性輸送を含み、
    前記試験は、コラーゲン断片を含む血小板凝集の作用剤のレベルに関し、前記導入後に患者において有害事象を引き起こす可能性が考えられるレベルかどうかを試験することを含む、
    ことを特徴とする、請求項２２の方法。
  26. 前記濃縮中および後において組織に接触する実質的に全ての非生物体について、前記濃縮前に、装置当たり約２０．０米国局方(USP)エンドトキシン単位(EU)以下を含むかどうか試験することを特徴とする、請求項２２の方法。
  27. 前記試験は導入前に自動的に実行されることを特徴とする、請求項２２の方法。
  28. 前記濃縮は、前記組織を単に部分的に脱凝集することを含むことを特徴とする、請求項１の方法。
  29. 前記脱凝集は、１種以上の酵素によって実行され、該酵素は、完全に組織を脱凝集するためにそのまま放置された場合に要する時間量に対して早期に、組織の少なくとも一部から取り出されることを特徴とする、請求項２８の方法。
  30. 前記組織は脂肪組織を含むことを特徴とする、請求項２８の方法。
  31. 前記濃縮は、自動化システムであって、
    a.患者から取り出された組織を受容するチェンバーアッセンブリであって、再生細胞が該組織から分離されるように組織の脱凝集を促進するチェンバーアッセンブリ、
    b.チェンバーアッセンブリからの再生細胞を濃縮するために接続される濃縮装置、
    c.チェンバーアッセンブリおよび濃縮装置と通信し、それらを制御することができるプログラム可能な処理装置、
    を含む自動化システムを供給することを含むことを特徴とする、請求項１の方法。
  32. 前記濃縮装置は遠心装置を含むことを特徴とする、請求項３１の方法。
  33. 前記チェンバーアッセンブリは、収集チェンバーおよび処理チェンバーを含むことを特徴とする、請求項３１の方法。
  34. 前記供給は、収集チェンバーに処理チェンバーを結合することを含み、かつ、
    前記遠心装置は、収集チェンバーに接続し、収集チェンバーから脱凝集組織を受容するように構成される、
    ことを特徴とする、請求項３３の方法。
  35. 前記組織は脂肪組織であることを特徴とする、請求項１のシステム。
  36. 前記再生細胞は幹細胞であることを特徴とする、請求項１のシステム。
  37. 前記再生細胞は先駆細胞であることを特徴とする、請求項１のシステム。
  38. 前記再生細胞は、幹細胞と先駆細胞の混合であることを特徴とする、請求項１のシステム。
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