JP2008502673A - プリンヌクレオチド誘導体 - Google Patents

Abstract

本発明は、新規な８−カルビル置換ｃＡＭＰＳおよび重要な出発原料である８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを調製するための新規な方法を提供する。

Description

本発明は、新規なプリンヌクレオチド誘導体、その製造のためのプロセス、その製造における中間体、それを含む組成物、医薬および診断薬におけるその使用、ならびにそれを使用する処置方法およびアッセイ方法に関し、特に、ここでは、プリンヌクレオチド誘導体がプリン環の８−炭素において炭素付加置換基によって置換されたプリン環状モノホスフェートホスホロチオエートである。

天然のプリン環状モノリン酸塩、環状アデノシンモノリン酸塩（ｃＡＭＰ）および環状グアノシンモノリン酸塩（ｃＧＭＰ）は、ホルモンの細胞機能に対する効果を媒介するために重要なメッセンジャー分子である。

そのような環状ヌクレオチドの類似体を免疫機能の低下または強化に関連する疾病状態の処置に使用し得ることが提案されてきた。そのような類似体の１つは、アデノシン環状一ホスホロチオ酸塩（ｃＡＭＰＳ）、より正確にはアデノシン３’，５’−環状一ホスホロチオ酸塩である（なお、リン原子からぶら下がった酸素の１つは硫黄によって置換されている）。その結果のリンはキラル中心であり、（リン原子における）Ｒｐ立体配置においてｃＡＭＰＳはｃＡＭＰアンタゴニストであり、他方（リン原子における）Ｓｐ立体配置においてｃＡＭＰＳはｃＡＭＰアゴニストである。ＨＩＶの処置の一部としてＲｐ−ｃＡＭＰＳをｃＡＭＰアンタゴニストとして使用することは、例えばＷＯ９８／４８８０９（特許文献１）において提案され、ｃＡＭＰＳを新生物（腫瘍）の増殖の阻害剤として使用することは米国特許第ＵＳ−Ａ−５８４３９１６号（特許文献２）において提案されている。

ＷＯ９８／４８８０９は、特に酵素であるｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＩ（ＰＫＡＩ）の活性を阻害するｃＡＭＰアンタゴニストの使用、およびこの点に関して、プリン環の８−炭素においてヘテロ原子（例えば、ＢｒまたはＣｌ）またはヘテロ原子付加基（例えば、ピペリジン）で置換されたＲｐ−ｃＡＭＰＳの使用を示唆した。さらに、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：２０５９９−２０６０７（１９９５）（非特許文献１）においてＧｊｅｒｔｓｅｎらは、８−クロロおよび８−ブロモＲｐ−ｃＡＭＰＳが８−非置換Ｒｐ−ｃＡＭＰＳよりもＰＫＡＩに対して高いアンタゴニスト活性を有することを実証した。

種々な８−置換ｃＡＭＰＳは、バイオログ・ライフ−サイエンス・インスティティート・オブ・ブレーメン(Ｂｉｏｌｏｇ−Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｍｅｎ）（ドイツ）から市販されている。これらは、特に、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳ、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ＭＢ−ｃＡＭＰＳ（ＭＢは、リボース環の２’位におけるモノブチリル置換基）、Ｒｐ−８−Ｃｌ−ｃＡＭＰＳ、Ｒｐ−８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰＳ（ここで、ＣＰＴ＝４−クロロフェニルチオ）、Ｒｐ−８−ＨＡ−ｃＡＭＰＳ（ここで、ＨＡ＝ヘキシルアミノ）、Ｒｐ−８−ＯＨ−ｃＡＭＰＳ、Ｒｐ−８−ＰＩＰ−ｃＡＭＰＳ（ここで、ＰＩＰ＝ピペリジノ）、Ｒｐ−８−ＡＥＡ−ｃＡＭＰＳ（ここで、ＡＥＡ＝２−アミノエチルアミノ）、Ｒｐ−８−ＡＨＡ−ｃＡＭＰＳ（ここで、ＡＨＡ＝６−アミノヘキシルアミノ）、Ｒｐ−８−Ｎ₃−ｃＡＭＰＳ（ここで、Ｎ₃＝アジド）、およびＲｐ−８−Ｉ−ｃＡＭＰＳである。また、バイオログ(Ｂｉｏｌｏｇ）は、Ｓｐ−ｃＡＭＰＳ化合物を供給するが、やはりこれらはすべて８−非置換、またはヘテロ原子もしくはヘテロ原子付加基による８−置換のいずれかである。

ＨＩＶ感染の現在の処置は、抗ＨＩＶ薬の強力な多剤併用療法である（高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ））。ＨＡＡＲＴは、ウイルスを標的にするプロテアーゼ阻害剤ならびにヌクレオシド類似体および非ヌクレオシド類似体を含み、ＨＩＶ感染患者の処置における主な構成要素である。しかし、ＨＡＡＲＴはＡＩＤＳの進展を停止させることによってＨＩＶ感染患者の生命を著しく延ばすが、Ｔ細胞の機能は低下したままのようである。実際に、ＨＩＶ特異的免疫応答がＨＡＡＲＴ中に増加するのではなく減退することが観察されてきた。さらに、ＨＡＡＲＴはウイルスを根絶せず、患者は処置を中止した際にウイルス学的な再発を示し、患者によってはウイルスが処置に対して抵抗性を発達する。加えて、多くの患者においては、重篤となり得る副作用とともに現在の薬に対して不耐性が生じる。

したがって、他の治療法が必要であることがますます認識されている。免疫調節に基づいた処置によって、ＨＩＶ患者のある程度「ノックダウン」された免疫系の機能を改善できれば、免疫系がウイルスを保有者から駆除する能力を有するので、ＨＩＶ患者において重要なアジュバント療法となり得る。ｃＡＭＰのレベルを上昇させ、したがってＰＫＡタイプＩの活性を増加させると、現在のＨＡＡＲＴに対して非依存性であるＨＩＶ感染患者からのＴ細胞の増殖が著しく阻害される。ＰＫＡタイプＩの選択的アンタゴニストを使用すると、ＨＩＶ感染患者からのＴ細胞の低下していた増殖が３００％まで改善される。上記の観察によると、ＰＫＡタイプＩが免疫調節療法のための可能性がある標的であることが示唆される。Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳなどのＰＫＡタイプＩ選択的アンタゴニストは、免疫不全においてＰＫＡタイプＩの不適切な活性を逆転させ、これによりＴ細胞機能および免疫応答性を回復する１つの可能性を提供する。大半のＲｐ−ｃＡＭＰＳ異性体は、ＲサブユニットのｃＡＭＰ結合部位に競合的に結合することによってＰＫＡのアンタゴニストとして作用するが、その酵素を解離および活性化しないことが示されてきた。

さらに、Ｒｐ−ｃＡＭＰＳの誘導体の特性評価によると、いくつかの化合物（例えば、Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳ）は、ＰＫＡタイプＩイソ酵素の選択的および完全なアンタゴニストとして、およびＰＫＡタイプＩＩイソ酵素の部分的アゴニストとして作用することが示されてきた。ほとんどの細胞および組織は、多くの細胞内部位につながれたＰＫＡタイプＩＩ（多くのｃＡＭＰ誘導効果を媒介する点で関係するとされる）を非常に大量に含む。
国際公開第９８／４８８０９号パンフレット 米国特許第５８４３９１６号明細書 Ｇｊｅｒｔｓｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９５年、２７０巻、ｐ２０５９９−２０６０７

これに対し、ＰＫＡタイプＩも広く分布するが、免疫細胞の機能の調整に対して必要かつ十分であることが主に示されてきた。これはある程度の組織／細胞選択性を提供し、ＰＫＡタイプＩ選択的アンタゴニストに基づく可能な処置にとって好都合であり得る。ＰＫＡタイプＩは興味深い薬剤標的であるにもかかわらず、薬剤として許容されるｃＡＭＰアンタゴニストは得られていない。ｃＡＭＰ作用を妨害する免疫刺激薬を開発すれば、Ｔリンパ球の免疫機能を改善し、ｃＡＭＰ作用を打ち消すＰＫＡタイプＩ選択的ｃＡＭＰアンタゴニストを開発することによって前臨床試験に持っていくことができる。行われた研究の特定の目的は、そのような化合物の開発、ならびにＨＩＶにおける免疫不全を逆転させる免疫刺激薬としても化合物を評価するための方法およびモデルの開発であった。

ここで本発明者らは驚くべきことを見出した。すなわち、特に高いＰＫＡＩ（より正確にはＰＫＡ ＲＩα）親和性（すなわち、ｃＡＭＰアゴニズムおよびより特別にはアンタゴニズム）が、プリン８−炭素がカルビル（carbyl）基（すなわち、炭素付加基）によって置換されたｃＡＭＰＳを使用して実現され得ることである。

したがって、１態様によると、本発明は、８−カルビル置換ｃＡＭＰＳまたはその誘導体を提供する。

本文中、誘導体という用語は、化学的に改変されるが、使用においては８−置換ｃＡＭＰＳの活性を発揮する能力を保持する化合物（例えば、塩、エステル、プロドラッグ（すなわち、生体前駆体）などの形態）を意味する。誘導体が、８−置換ｃＡＭＰＳとは別の成分（例えば、対イオンまたは開裂可能な保護基）を含むか、または使用中に生成する場合、この成分は好ましくは生理学的に許容される成分である。

８−置換基は、記載されるように炭素−炭素結合によってアデニン環の８位に結合される必要があり、典型的には２５個まで、より好ましくは２０個まで、殊には１５個まで、特には１０個までの非水素原子を含む。これらの非水素原子は、少なくとも１つの炭素を含むか、すべてが炭素であり得るが、好ましくは非水素原子の少なくとも１つ（例えば、６個まで）はヘテロ原子（例えば、ハロゲン、酸素、硫黄、窒素またはリン、特にＯ、ＮまたはＳ）であり得る。８−置換基は、直鎖、分岐鎖、もしくは環状、またはそれらの２つもしくは３つの組み合わせであり得、飽和または不飽和であってもよい。特に好ましくは、置換基は、環式基、特に同素または複素環式アリール基（例えば、５〜１０個の環状原子を含む）、最も特に５個の環状原子を含むヘテロアリール基またはフェニル基であるか、またはそれを含む。したがって、例えば、置換基は、カルボニルまたはチオカルボニル基を介して結合されてもよく、かつアシル、ハロ、ヒドロキシ、チオール、アミノ、カルボキシ（または他のオキシ酸）、シアノ、アジド、アルコキシ、エステル、エーテルまたはアルキルチオ基によって置換されてもよい、アリール、アラルキル、アルカリール、アルキル、環状アルキル、アルケニル、またはアルキニル基であってもよい。いずれのそのような置換基においても、アルキル基またはそれらの不飽和類似体は、好ましくは１０個までの炭素、特に６個までの炭素を含む。

本発明に係る典型的な８−置換基の例には、以下を含む。

アリール基、例えば
ベンゼン、ナフタレンおよび
環化カルボキシル系、および
ピリジン、ジ−およびトリアジン、フラン、チオフェンおよびピロール、およびアゾール、およびトリアゾール、およびオキサ−およびチアジアゾール、およびテトラゾールを含む環化複素環系；

ヘテロアリール基、例えば
６員環アジン、ピリジン、ジアジン、トリアジンおよび環化炭素環系、および
上記のような環化複素環系、および
５員環系（例えば、フラン、チオフェンおよびピロール、アゾール、およびトリアゾール、およびオキサ−およびチアジアゾール、およびテトラゾール）および
上記のような環化複素環系および炭素環系；

任意に置換されているアリールおよびヘテロアリール基、例えば以下により置換されている：
（ｉ）ＯＲ¹（ここでＲ¹＝Ｈ、Ｃ₁〜Ｃ₁₀のアルキル、Ｃ₂〜Ｃ₁₀のアルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₁₀のアルキニル、アリールまたはヘテロアリール基）、およびそれらの任意に置換された誘導体、
（ｉｉ）ＳＲ¹、ＳＯＲ¹およびＳＯ₂Ｒ¹（ここで、Ｒ¹は上記のとおり）、
（ｉｉｉ）ＮＲ¹Ｒ¹（ここで、各Ｒ¹は上記のとおりであり、同一または異なっていてもよい）、
（ｉｖ）ハロゲン、
（ｖ）ＣＯ₂Ｒ¹、ＣＯＲ¹、またはＣＯＮＲ¹Ｒ¹（ここで、各Ｒ¹は上記のとおりであり、同一または異なっていてもよい）、および
（ｖｉ）さらに任意に置換されているアリールおよびヘテロアリール基；

カルボニル、チオカルボニル、イミノカルボニルおよびシアノ誘導体（例えば、ＣＯ₂Ｒ¹、ＣＯＲ¹、ＣＯＮＲ¹Ｒ¹、Ｃ（ＮＲ¹）ＮＲ¹Ｒ¹、ＣＳＮＲ¹Ｒ¹およびＣＮ（ここで、各Ｒ¹は上記のとおりであり、同一または異なっていてもよい））；ならびに

任意に置換されてもよい非芳香族炭素置換基、例えば
Ｃ₁〜Ｃ₁₀のアルキル、
Ｃ₂〜Ｃ₁₀のアルケニル、
Ｃ₂〜Ｃ₁₀のアルキニル、例えば、ここで前記任意な置換には、
（ａ）Ｃ₂〜Ｃ₁₀のアルケニルまたはアルキニル基への、さらなる二重および三重結合の挿入、
（ｂ）ケトンまたはアルデヒドを形成するためのオキソ基の挿入、
（ｃ）アリールおよびヘテロアリール置換基による置換（アリールおよびヘテロアリール置換基自身は、ハロゲン（例えばＦおよび／またはＣｌ）、ＯＲ¹、ＳＲ¹、Ｓ−オキサイド（例えばＳＯＲ¹およびＳＯ₂Ｒ¹）、ＮＲ¹Ｒ¹、ＣＯ₂Ｒ¹、またはＣＯＮＲ¹Ｒ¹（ここで、各Ｒ¹は上記のとおりであり、同一または異なっていてもよい）によって置換されてもよい）を含む。

特に好ましい８−置換基には、フェニル、フリル、およびチエニル基、特に２−フリル基を含む。

８−置換基がアリール基である場合、所望であれば１以上の極性基、例えばＯＲ¹、ＳＲ¹、ＳＯＲ¹、ＳＯ₂Ｒ¹、ＮＲ¹ ₂、ハロゲン、ＣＯ₂Ｒ¹、ＣＯＲ¹、ＣＯＮＲ¹Ｒ¹、ＮＯ₂、Ｐ（ＯＲ¹）₂、およびＣＨ₂ＯＲ¹によって置換され得る。

本発明の８−カルビル置換ｃＡＭＰＳにおいて、所望ならば他の骨格位置も置換され得る（例えば、２’−酸素、６−アミノ基の窒素ならびに環状リン原子からぶらさがる酸素および硫黄）。これに関し、置換基は、８位に対する上記に定義したような置換基、または例えば、ｃＡＭＰおよびｃＡＭＰＳと合わせて公知の置換基（例えば、アシル、アルキルカルボニル、アリールなど）である。２’−酸素のシリル置換は、活性化合物を２’−保護化したものである本発明の化合物において特に好ましい。

プロドラッグを生成するための置換を除いて、本発明に係る化合物は、８位だけが置換される形態において使用されるのが望ましい。しかし、環状リン基の酸性度をマスクするためにリンからぶら下がった酸素または硫黄が置換されたプロドラッグ形態が特に好ましい。したがって、そのようなプロドラッグは、例えば典型的にはＳ−アルキル化される。Ｓ−アルキル化は好ましい選択肢であるが、導入される基は、典型的にはホスホロチオ酸の硫黄に結合されたメチレン基に直接または間接に結合されたエステル、またはチオエステル（すなわち、Ｒ−ＣＳ−Ｓ−Ｒ−、Ｒ−ＣＯ−Ｓ−Ｒ−またはＲ−ＣＳ−Ｏ−Ｒ−）基であり得る。間接結合の場合、リンカーは、好ましくは（チオ）エステル開裂が脱保護を引き起こすような（例えば、下記のスキーム２ｂにおけるようにＰ−アシル−ベンジル保護基を使用）非局在化電子構造を含む。あるいは、アデニン環の６位におけるアミノ基またはフリル環上のヒドロキシル基が投与後に除去可能な基（例えば、エステルまたは二重エステル保護基）によって保護されるプロドラッグ形態が使用され得る。同様に、６−アミノ基は、アシルオキシアルキル基（ピバリルオキシメチルなど）またはアルキルオキシメチル基によってＮ−保護化され得る。一般に、そのようなプロドラッグの生成において、アミンまたはヒドロキシル保護は、Ｏ−およびＮ−保護基の性質に応じて、チア化（ｔｈｉａｔｉｏｎ）の前または後のいずれにおいてもなされ得る。

リンにぶら下がった酸素または硫黄において置換された化合物は、調製プロセスが、例えばクロマトグラフィまたは結晶化によってＲｐおよびＳｐ異性体を分離することが必要な場合に特に有用であり得る。同様に、２’−位がシリル化された化合物は、精製を容易にする中間体として特に好ましくあり得る。

本発明の８−カルビル置換ｃＡＭＰＳは、ＲｐまたはＳｐ立体配置であるか、またはＲｐおよびＳｐ異性体の両方を含み得る。本発明に係る使用のためには、化合物は、好ましくは少なくとも９０％Ｒｐ（またはＳｐ）、殊に少なくとも９５％、特に少なくとも９８％である。化合物は、ｃＡＭＰアンタゴニストとして使用するためには、好ましくは主にＲｐ異性体の形態であり、ｃＡＭＰアゴニストとして使用するためには、好ましくは主にＳｐ異性体の形態である。

以下に、本発明の８−カルビル置換化合物が形成され得る４つのプロセススキームを特に詳細に記載する。第１において、８−ハロゲン化３’５’−環状ホスホラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）を８−カルビル化し、その後キラルなリンの立体配置を維持する反応において、リンが結合された窒素を硫黄で置き換える。第２および３において、アデノシンを８−カルビル化し、その後環状リン基を導入する。第４において、８−ハロ−ｃＡＭＰＳを８−カルビル化する。第１および第２プロセススキームは、第１の場合は柔軟性（および立体化学の維持）の理由で好ましく、第２の場合は経済性の理由で好ましい。すべてのこれらのプロセススキームは、本発明のさらなる態様を形成する。この態様によると、本発明は８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたはその誘導体を製造するためのプロセスを提供し、このプロセスは以下のステップの少なくとも１つを含む。
ａ）２’−保護化８−カルビル化−アデノシン３’，５’−環状ホスホラミデートを二硫化炭素と反応させること、および２’−ヒドロキシルを脱保護するステップ、
ｂ）８−カルビル化−アデノシンをＳＰＣｌ₃と乾燥溶媒中で反応させるステップ、
ｃ）８−カルビル化−アデノシンを亜リン酸塩と反応させ、その後硫黄と反応させるステップ、
ｄ）２’−任意に保護された８−ハロ−ｃＡＭＰＳをアルキル化剤と反応させ、および必要であれば、２’−ヒドロキシルを脱保護するステップと、
ｅ）８−カルビル化ｃＡＭＰＳをその塩に変換するステップと、
ｆ）８−カルビル化ｃＡＭＰＳを生物学的に開裂可能な保護基と反応させるステップ、および
ｇ）８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたはその誘導体のＲｐ／Ｓｐ異性体混合物のＲｐおよびＳｐ異性体を分離するステップ。

プリン８位におけるカルビル化は、８位において官能基化された物質を用いて特に容易になされ得る。プリン複素環の８位における簡便な官能化は、簡単な臭素化によって臭素原子を導入することによって実現できる。

本発明の化合物における８−カルビル置換基は、望ましくは電子供与または電子吸引基であってもよい。

アデノシンは、周囲温度で臭素をＮａＯＡｃ緩衝水溶液に添加することによって、８位において位置選択的に臭素化される。ｃＡＭＰは、同様な方法で臭素化できるが、市販でも入手可能である。あるいは、８位におけるハロゲン化は、対応のリチウム化種、およびハロゲンの添加によってなされ得、特にこの方法はアデノシンの臭素化およびヨウ化のために使用されてきた。この場合の基質は、完全にシリル−保護化（ＴＢＤＭＳ）されたアデノシンであった。８位におけるリチウム化は、標準の条件下でｎＢｕＬｉを用いてなされた。このアプローチは、８−ヨード誘導体を得るための最も良い方法を提供し得る。

カルビル化反応：
（ｉ）ヌクレオシドレベルまたは環状ヌクレオチドレベルの両方において、カルビル化は、遷移金属で触媒されたクロスカップリング反応によって実現できる。本発明者らは、一連のパラジウム触媒反応の調製に有用な方法を開発した。

（ｉｉ）中間の環状ホスホラミデートレベルにおいて、プリン８位におけるカルビル化は、遷移金属で触媒されたクロスカップリング反応によって実現できる。

（ｉｉｉ）また、カルビル化は、環状ホスホロチオ酸レベルにおいて実現できる。好ましくは、ホスホロチオ酸は、Ｏ−エステルまたはＳ−エステルの形態で存在する。その後、エステルは、対応のホスホロチオ酸誘導体に開裂され得る。

クロスカップリング反応において、簡単なアルキル化は、Ｐｄ−触媒条件下においてパーアセチル化（ｐｅｒａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）８−Ｂｒ−アデノシンとテトラアルキル水素化スズとの反応において実現されてきた。低級アルキルプリンヌクレオシドの合成のためのさらに簡便な方法は、ハロゲン化プリン（ｈａｌｏｇｅｎｏｐｕｒｉｎｅ）ヌクレオシドとトリアルキルアルミニウムのパラジウム触媒クロスカップリング反応によって得られ得る。ビニル化およびアリル化の両方は、Ｐｄ−触媒作用を使用して適切な水素化スズから実現されてきた。アルキン官能基は、８−ブロモ誘導体を介して、ソノガシラ（Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ）条件下でヨウ化Ｃｕ（Ｉ）の存在下でＰｄ−触媒作用を使用して、末端アルキンと結合され、導入されてきた。

以下に示す反応スキームは例示であり、他の試薬および最終生成物が類似に使用または生成され得る。

プロセスＩ
チレーション（ｔｈｉｙｌａｔｉｏｎ）のためのアミデート中間体：
（Ｒ_P）−８−置換アデノシンホスホロチオ酸の調製

スキーム１のホスホロチオエートＣの合成のためのこの方法において、ｃＡＭＰアミデート中間体は必須の基質である。ｃＡＭＰは、アデノシンについて記載したように臭素化され、またはその臭素化化合物は市販により得られる。３’，５’−環状ホスホラミデートのジアステレオ異性体混合物を調製するための方法が文献に記載されている（Ｓｔｅｃ、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１６：４１１−４１７（１９８３）およびＢｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５０：１２７１−１２７８（１９８５）を参照）。最初のステップは、Ｐｈ₃Ｐ／ＣＣｌ₄とのアップル（Ａｐｐｌｅ）タイプ反応を含み、対応の塩化ホスホリルを生じる。明らかに、リン原子における塩素化反応中の立体化学制御は小さい。したがって、アニリドのジアステレオ異性体混合物は、塩素のアミド化の後に生じる（スキーム２を参照）。アミデートは、多くの有機溶媒に可溶であり、クロマトグラフィ処理または分別晶析によって純粋なジアステレオ異性体に分離できうる中性な分子である。

スキーム２における本発明者らによる新規性かつ進歩性のある方法において、アンモニウム塩１としてのｃＡＭＰ−８−Ｂｒは、嵩高いシリル基によって２’−Ｏ−保護化される。ＴＢＤＭＳ−Ｃｌは、この目的のための簡便かつ効率的な試薬である（ＴＢＤＭＳ＝ｔ−ブチルジメチルシリル）。その後、シリルエーテル２は塩素化され構造体３を形成する。

嵩高いシリル基は、また合成シーケンスにおいて第２の重要な機能を有する。シリル基により、チア化後の生成物が水性反応混合物から効率的に析出することが可能になり、下記の精製において役立つ。同様な性質を有する他の保護基もまた使用され得る。

塩素化方法において、塩化オキサリルは、触媒量の、または過剰量のＤＭＦとともに良好に使用されてきた。リンの実際の塩素化剤は、塩化オキサリルおよびＤＭＦからその場で生成される中間体クロロ−イミノ誘導体である。所望の塩化ホスホリル立方異性体３は単離することができる。しかし、粗生成物をその後のアミド化ステップにおいて使用してもよい。

種々の第一アミン、またはマスクされたアミンを、アミン化のために用いてもよい。求核アミンは塩素と容易に反応する。しかし、アミデートは、アミノ基の残りの水素を引き抜くために十分に強酸でなければならない。いくつかの芳香族アミンが後者の要件を満足し得る。本発明者らは、この研究のためにアニリンを選択した。アニリンとの反応は、冷所においてジクロロメタン中で実現できる。これらの条件下で反応は立体特異的である、すなわち、アミデート立方異性体４が１つだけ反応混合物から得られる。

アミデートは、いくつかの通常の有機溶媒に容易に溶解する中性な分子である。したがって、これらの分子は、８位におけるカルビル化反応に適切である。いくつかの遷移金属はこのプロセスを触媒する。本発明者らは、パラジウムを触媒系において広く使用した。ほとんどの場合、スタンニル試薬を用いるスチレ（Ｓｔｉｌｌｅ）条件を予備研究において使用した。クロスカップリングされた生成物の収率は極めて良い。他の有機金属試薬（例えば、亜鉛およびホウ素化合物）が使用できる。スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）条件下のボロン酸のカップリングは、スキーム３に示したものと同じように進行する。したがって、多くの８−置換誘導体がこの方法で得られるようになる。

スキーム２、２ａおよび３における８−ブロモ誘導体４および８−カルビル化アミデート５および１１はその後チア化される。アミンの置換のため、二硫化炭素によるチレーションが推薦された。本発明者らは、ＴＨＦ中二硫化炭素および塩基としてカリウムｔ−ブトキシドを用いる場合、室温でのチア化に要する時間は３時間未満であることを見い出した。ホスホロチオエート６は、極めて良好な収率で得られる。置換は、リン原子においての立体配置を維持しながら立体選択的に進行する。しかし、正式な立体配置帰属は、命名法の優先規則によって変えられる。この研究により、ホスホロチオ酸標的分子においてＲｐ立体配置が得られる。

保護に加えて、嵩高いシリル基の存在は、チア化生成物６の単離のために非常に重要である。なぜなら、単離および精製プロセスにおける相対的な可溶性のためである。

生成物６の脱シリル化は、ＤＭＦ溶液においてフッ化アンモニウムによって実現される。脱シリル化は室温で５日間行われた後、目的の生成物７が極めて良好な収率で単離される。このように、８−カルビル化の目的の生成物および８−ブロモｃＡＭＰＳが得られる。所望ならば、８−ブロモｃＡＭＰＳは、酸官能基におけるＯ−またはＳ−保護の後のクロスカップリング反応のための基質であり得る（プロセスＩＶにおいて称す）。

アミデート（スキーム２における４）を立体選択的に形成することは、この欄で概略した合成において重要なステップである。アニリンアミデート水素は、後のチア化のための迅速な引き抜き（例えば、アルコキシド塩基を用いる）を引き起こすのに十分酸性である。しかし、また非常に効率的かつ立体選択的チア化は、アニリンの代わりに脂肪族または置換脂肪族アミン（例えば、ベンジルアミン）がアミデート形成のために使用される場合に達成できる。この場合、強塩基（例えば、ブチルリチウム）は脱プロトン化のために使用される（例えば、スキーム２Ａを参照）。

脂肪族または置換アミン（ベンジルアミンなど）が使用される場合、さらに、８−カルビル化は、有機亜鉛化合物、殊に有機基が小さな複素環であるもの、特に環ヘテロ原子に隣接する環炭素において結合されたものを、例えばパラジウム触媒と併用して使用することにより有利に実現され得る。一般に、環状基が８位に結合されるべきである場合、環炭素結合部位に隣接する原子は置換されないことが好ましい。

プロセスＩＩ
閉環反応によるチア化：
（Ｒｐ）−ｃＡＭＰＳは、対応のヌクレオシド５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）から酵素的に合成された。酵素技術は下記の実施例では使用されないが、別の方法を与え得る。

化学合成において、Ｏ−保護のないＮ−ベンゾイル−アデノシンをピリジン中でビス（ｐ−ニトロフェニル）ホスホロクロロチオエートで処理した。その後、生成物のアデノシン５’−ビス（ｐ−ニトロフェニル）ホスホロチオエートを、カリウムｔ−ブトキシドを塩基として用いて乾燥ＤＭＦ中で環化した。濃アンモニア水で非ブロック化した後、ジアステレオ異性体をクロマトグラフィによって分離した。

非保護化ヌクレオシドのシクロチオリン酸化によるヌクレオシド−３’，５’−環状ホスホロチオエートの合成は、三塩化チオスホスホリルを用いて実現された（スキーム４）。最初のリン酸化は、おそらく糖における５’−ＯＨ基において起きる。トリアルキルホスフェートは溶媒として推薦される。生成物は、アセトニトリル水中のアルカリ性水酸化物によって高希釈で直接環化され、ジアステレオ異性体ヌクレオシド−３’，５’−環状ホスホロチオエートｃＡＭＰを１：１の比で与えた。ジアステレオ異性体ヌクレオシド−３’，５’−環状ホスホロチオエートｃＡＭＰはクロマトグラフィ手法で分離する必要がある。スキーム４における親化合物１０のジアステレオ異性体は、８位において置換基を有さない。

本発明において、アデノシン８は、スキーム６に概略されるように（Ｒｐ）−８−置換−アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオエート７に変換された。本発明者らは、ほとんど排他的に所望の３’，５’−環状ホスホロチオエート７（ただし、立体化学混合物として）を与える方法を開発した。反応は、この点において、チオリン酸化および環化が冷所において乾燥ピリジン中で実現される場合、クリーンである。いずれの立方異性体もクロマトグラフィ分離後に純粋な状態で単離することができる。８−フェニル誘導体７ｅは、スキーム５に示される方法によって調製された。

所望であれば、（Ｓ_P）−ｃＡＭＰＳ誘導体は同様に得られ得る。

ピリジンおよび同様の溶媒が特に乾燥していなければならないという知見は、発明といえる。なぜなら、これらの条件下の環化反応は選択性および収率の両方について非常に改善されるからである。

プロセスＩＩおよびプロセスＩＩＩの研究について、本発明者らは、多くの８−カルビル化ヌクレオシドを調製した。ヌクレオシド中間体は、チオ塩化ホスホリルを使用して慣用の方法で環化した。アデノシンのカルビル化反応は、スキーム６に要約される。

スキーム７におけるヌクレオシドのカルビル化について、アデノシンの８−ブロモ誘導体１１を使用した。糖ヒドロキシル基の保護は、アセチル化によりトリアセチル化基質１２を提供するか、またはシリル化によってトリシリル化基質１３を提供するかのいずれによってもよい。いくつかのＰｄ−触媒系をクロスカップリング反応のために使用した。反応条件は変化させる必要があった。より良い条件のいくつかは、スキーム７において化合物１４〜１６を調製するために与えられる。スチレ条件はクロスカップリングされた生成物１４を調製するために使用され、メチル化（１５ａ）はネギシ（Ｎｅｇｉｓｈｉ）条件下でトリメチルアルミニウムから実現された。また、同じ条件を使用して、同じ化合物(番号１４ｂ）を与えるスチレ条件下で得られた収率と同じ収率で２−フリル誘導体１５ｂを調製した。

また、スズキ条件下のボロン酸からの反応は十分に進行して化合物１６を高収率で提供した。フェニル化合物１６ａは、スチレ条件下の１４ａとほぼ同じ収率で得られた。その後、８−置換アデノシンを、加水分解条件でエステル１４から、およびシリルエーテル１５および１６からフッ化テトラブチルアンモニウム脱シリル化によって調製した。すべての反応は良好に進行した。

スキーム８は、８−置換基中のα−炭素においてオキソ基およびヒドロキシル基を有するアデノシンの調製を示す。出発材料は、クロスカップリングされた８−（α−エトキシエテニル）アデノシン１７ｋであった。おだやかな酸条件で、ビニルエーテル官能基は開裂され、アセチル誘導体１７ｌが高収率で形成される。その後に水素化ホウ素ナトリウム還元により、対応のヒドロキシル誘導体１７ｍを与えた。エピ異性体アルコール炭素において立体選択性は見られなかった。等量で存在する立方異性体を分離することは試みなかった。

プロセスＩＩＩ
亜リン酸塩Ｐ（ＩＩＩ）アプローチ：
スキーム７および８における８−カルビル化ヌクレオシド１７およびそれらの誘導体は、プロセスＩＩ（上記参照）と同様にプロセスＩＩＩに対しても適切な基質である。これまでに、本発明者らは、親ホスホロチオ酸１９の調製により、プロセスＩＩＩについての原理を実証した。８−カルビル化類似体は、スキーム９において示される基質９における８−Ｒ置換基によって示される。

アデノシンは、３価リン試薬と反応して環状亜リン酸塩を形成する。位置選択的３’，５’−シクロ亜リン酸塩化を確実にするためには、二官能リン（ＩＩＩ）試薬からの第一級５’−ヒドロキシ基に対する最初の攻撃が必要である。したがって、最も良い試薬であれば非常に大きな立体的大きさを有する。文献によると、２’Ｏ−メチルアデノシンは、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィンとの反応において２’Ｏ−メチル−シス−アデノシン−３’，５’−環状メチルモノ亜リン酸塩に変換され得る。反応は１Ｈ−テトラゾールによって促進される。シス−およびトランス−シクロ亜リン酸塩エステルの両方が形成される。温度を上げると、トランス−ジアステレオ異性体はシス−異性体に反転する。

その後、各異性体は単独で、または混合物として、硫黄を用いてチア化できる。硫黄の酸化的付加は、リン原子上の電子の孤立電子対の部位において生じ、リン原子の相対的立体配置は維持される。酸化的チア化は、立方異性体混合物上または純粋な立方異性体上で行われる。前者のアプローチにおいて、ホスホロチオ酸立体異性体を分離することがさらに必要である。

本発明者らは、亜リン酸塩化が非保護化アデノシン上で等しく十分に行われ得ることを見い出した。最初に形成される生成物は、シス−（³¹Ｐ ＮＭＲδ１２３およびトランス−（³¹Ｐ ＮＭＲδ１２９）亜リン酸塩の混合物である。混合物は、原料を失わずにシス−異性体と平衡に達した。さらなる１Ｈ−テトラゾールが異性体変換を促進することが分かった。その後、各異性体は単独で、または混合物として、硫黄を用いてチア化された。硫黄の酸化的付加は、リン原子上の電子の孤立電子対の部位で生じ、リン原子における相対的な構成は維持される。本明細書中に記載の実施例において、酸化的チア化は、ホスフェートジアステレオ異性体の混合物上で行われた。この場合、ホスホロチオ酸ジアステレオ異性体はクロマトグラフィによって分離される。

プロセスＩＶ
カルビル化
クロスカップリング反応によるカルビル化は、スキーム１０に示すように最終のホスホロチオ酸レベルにおいて行われる。基質はプリン８位において離脱基を有する。反応シーケンスは、カルビル化反応が実現された後で純粋な立方異性体に分離される必要のあるジアステレオ異性体混合物または純粋な立方異性体のいずれかとして、従来スキームにおいて示された反応によって得られ得る２’−ＯＴＢＤＭＳ−８−ブロモ誘導体２０に対して例示される。

チオリン酸のＳ−またはＯ−原子のいずれかが保護化され、Ｓ−エステル２１または対応のＯ−エステルが提供される。スキーム１１に示されるように、Ｓ−エステル２１はスチレまたはスズキ条件のいずれかでクロスカップリングされるか、またはクロスカップリング反応において使用される別の修飾がなされ、８−カルビル化生成物２２が提供される。後者は、脱保護されてチオ酸６と、さらに目的化合物７となり得る。同様に、カップリング反応は、遊離２’−ＯＨ基を用いて基質上で実現され（シーケンス２３−＞２５）、さらに目的化合物７となり得る。

上記のように、本発明の化合物をプロドラッグ形態で使用することが望ましくあり得る。典型的なそのようなプロドラッグはＳ−アルキル化によって生成され得、Ｓ−アルキル化ための２つの反応スキームを以下にスキーム１１および１２として記載する。スキーム１１および１２は、ホスホロチオエートとハロゲン化アルキル（さらに具体的には、カルボン酸ハロアルキル）の反応を記載する。

上記のプロセススキームにおける種々の中間体は新規であり、それ自身が本発明のさらなる態様を形成する。

本発明の親水性の８−置換ｃＡＭＰＳ化合物は、好ましくは、可溶性のトリアルキルアンモニウム（例えば、トリブチルアンモニウム）塩に変換した後、フラッシュクロマトグラフィ（例えば、シリカゲル上で）を行うことによって精製される。そのようなアルキルアンモニウム塩は、アンモニウム塩をアルキルアミンと混合し、アンモニアを蒸発させることによって調製され得る。次いで、所望であれば、得られた生成物は、使用前に別の塩形態（例えば、ナトリウム塩形態）に変換され得る。

これらのプロセスで使用される条件および試薬は、一例にすぎない。他の試薬、溶媒および反応条件もまた使用できる（特に、これらのプロセスが産業的に使用されて薬剤を製造する場合）。当業者は、コスト、安全性、危険性、毒性、環境および規制面を考慮しつつ、条件、試薬および溶媒を選択することによって、慣行的にこれらのプロセスを改善し得る。

したがって、さらなる態様によると、本発明は、８−カルビル化アデノシン環状３’，５’−ホスホラミデートまたはその誘導体を提供する。

さらなる態様によると、本発明は、８−カルビル化−２’−保護化（例えば、シリル化）アデノシン環状３’，５’−ホスホロチオエートまたはその誘導体を提供する。

別の態様によると、本発明は、８−ハロ（および、好ましくは２’−保護化（例えばシリル化））アデノシン環状３’，５’−ホスホラミデートまたはその誘導体を提供する。

さらなる態様によると、本発明は、８−カルビル化アデノシン環状３’，５’−モノ亜リン酸塩またはその誘導体を提供する。

さらなる態様によると、本発明は、８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたはその誘導体を生理学的に許容可能な担体またはレシピエントとともに含む医薬組成物を提供する。

本発明の組成物は、いずれの都合のよい投与形態を採用し得る（例えば、錠剤、カプセル、粉末、シロップ、スプレー、溶液、分散液、座剤、など）。活性剤は、適当な担体または賦形剤（例えば、溶媒（注射剤のための水など）、希釈剤、安定剤、粘度調整剤、ｐＨ調整剤、香料、ブレーバー、酸化防止剤、など）と混合され、および組成物は、従来の方法で調製され得る。

さらなる態様によると、本発明は、ヒトまたは非ヒト動物（好ましくは、哺乳動物）の体を処置する方法であって、その体内でｃＡＭＰアゴニストまたはアンタゴニスト効果を達成する方法を提供する。この方法は、本発明に係る８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたは誘導体の有効量をその体内に投与するステップを含む。

特に好ましくは、処置方法は、新生物疾病、免疫不全およびウイルス感染（特に、ＨＩＶ感染）の処置のためのものである。

さらなる態様によると、本発明は、ヒトまたは非ヒト動物（好ましくは、哺乳動物）の体を処置する方法であって、その体内でｃＡＭＰアゴニストまたはアンタゴニスト効果を達成する方法において使用するための薬剤を製造するための、本発明に係る８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたは誘導体の使用を提供する。

８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたは誘導体の用量は、処置される状態の性質、およびレシピエントの大きさ、性別および種に依存し得る。一般に、ヒトである対象に対する１日の用量は、特に、体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇ程度であり得る。好ましくは、投与は経口または静注である。

本発明の８−カルビル化ｃＡＭＰＳおよび誘導体は、それらのｃＡＭＰアゴニスト／アンタゴニスト性質のために、ｃＡＭＰのための競合的結合アッセイ（例えば、生物学的サンプルにおいて）において使用され得る。１つのそのようなアッセイは、ＷＯ２００４／０２７０７４に記載される。そのようなアッセイにおいて、８−カルビル化ｃＡＭＰＳは、好ましくは標識され（例えば、放射性標識または発色団標識）、簡便には基質結合され得る。

したがって、さらなる態様によると、本発明は、サンプル（一般に、生物学的サンプル）中のｃＡＭＰを決定するためのアッセイ方法を提供する。この方法は、サンプルをｃＡＭＰ−類似体およびｃＡＭＰ結合試薬と接触させるステップを含む。ここで、その類似体は８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたはその誘導体であることを特徴とする。

本発明は、アデノシン以外の他のプリンヌクレオチドに利用できる（特にグアノシン、およびアデノシンおよびグアノシン類似体（それらのジ−およびトリ−アザ類似体を含む（例えば、１−デアザプリン、３−デアザプリン、７−デアザプリンおよび１，３−デアザプリンなどの環状ジ−およびトリ−アザ類似体（例えば、環化イミダゾ−ピリジン、ベンズイミダゾールおよび環化ピロロ−ピリミジンおよびピロロ−ピリジン））））、および本発明のさらなる態様において、本明細書中に含まれる定義および実験の教示は、上記の８−カルビル化ｃＡＭＰＳに対して他の骨格位置で類似的にもちろん置換され得るそのような他のプリンヌクレオチドに対して必要な変更を加えて準用され得る。そのような８−カルビル化非アデノシンプリン環状３’，５’ホスホロチオエートは、例えば、ウイルス感染、免疫不全および新生物疾病の処置のために、特定のヌクレオチドに利用可能な用途において治療的に使用され得る。

本発明の１つの態様は、本ｃＡＭＰアンタゴニスト／アゴニストと、免疫系に効果を有する他の薬物との組み合わせの使用である。

本発明の別の態様は、本ｃＡＭＰアンタゴニスト／アゴニストと、ＨＩＶ感染および新生物疾病の処置に有用な他の薬物との組み合わせに関する。

本発明に係る化合物の多くの調製において重要な試薬は８−Ｂｒ−ｃＡＭＰである。これまでの文献の報告では、酢酸／酢酸塩媒質におけるｃＡＭＰの希釈（０．１Ｍ）溶液を使用して、この物質の小規模な調製（例えば＜１００ｍｇ）のみが示されている。同様の希釈条件をより大きな規模の研究で使用することを試みたが、必要な溶媒が大量であるので問題が生じた。本発明者らは、その方法が、ｃＡＭＰと臭素の反応中のＨＢｒを除去するためにｃＡＭＰの濃縮溶液を濃縮緩衝液とともに使用して、スケールアップされ得ることを見い出した。濃縮ｃＡＭＰ溶液を使用することによって、二重の恩恵も達成される。すなわち、形成するように沈殿する８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ生成物の割合が最適化されること（したがって、生成物の収集がより容易となる）、およびｃＡＭＰ（Ｈ）出発原料が緩衝系に寄与することである。したがって、例えば０．２ＭのｃＡＭＰ（Ｈ）および０．４Ｍの酢酸ナトリウムは、臭素化中に約４．７で安定するｐＨを有する０．２ＭのＮａＯＡｃ／ＡｃＯＨに等価な緩衝系を生成する。

そのようなプロセスは、本発明のさらなる態様を形成する。この態様によると、本発明は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの調製ためのプロセスであって、ｃＡＭＰと臭素を緩衝化溶液（好ましくは、水性）中で反応させるステップ、還元剤（例えば、亜硫酸ナトリウム）と反応させて余剰の臭素を除去するステップ、生成された８−Ｂｒ−ｃＡＭＰを収集するステップ、および必要に応じて、収集された８−Ｂｒ−ｃＡＭＰから遊離臭素を除去するステップを含み、ここでｃＡＭＰは濃縮溶液の形態（例えば、０．１５〜０．６Ｍ、好ましくは０．１６〜０．３Ｍ、特に０．１７〜０．２５Ｍ）で使用され、および緩衝液（例えば、酢酸緩衝液）は十分に濃縮されて溶液ｐＨを３．５〜５．５、特に４〜５の範囲に維持する、プロセスを提供する。このプロセスにおいて、臭素は、好ましくはゆっくりと加えられ、その後還元剤もまたゆっくりと加えられる。このプロセスは下記の実施例４７に例示される。

ここで、本発明をさらに以下の非限定的な実施例を参照して説明する。

８−ブロモ−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスフェートトリブチルアンモニウム塩（２）
ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（２．７２ｇ、１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３０ｍｌ）中の８−ブロモ−ｃＡＭＰトリブチルアンモニウム塩（１）（７．０ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（２．４５ｇ、３６ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加えた。混合物を５０℃で４８時間アルゴン下で攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物を水（１５０ｍｌ）中に懸濁し、１．２ＭのＨＣｌ（７６ｍｌ）を加えた。沈殿物をろ過して取り出し、水で洗浄し、真空下で乾燥させた。酸をＭｅＯＨ（８０ｍｌ）中に懸濁し、Ｂｕ₃Ｎ（５ｍｌ）を加えた。混合物を室温で３時間攪拌し、溶媒を蒸留して除去し、生成物を真空下で乾燥させた。収率 ６．５０ｇ（７８％）の白色固体。

ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー））：観察された陰イオン：Ｍ ５２０．０４２７。計算値 ５２０．０４２２。

（Ｓ_p）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’、５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）
ＣＨ₂Ｃｌ₂（７ｍｌ）中の８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状ホスフェートトリブチルアンモニウム塩（２）（５００ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）の溶液を、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍｌ）中の塩化オキサリル（０．２４ｍｌ、２．８ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１滴）の溶液に０℃で滴下して加えた。混合物を室温で３０分間攪拌した後、溶媒を真空下で除去した。粗生成物をＣＨ₂Ｃｌ₂（２０ｍｌ）中に再溶解し、アニリン（０．５ｍｌ、４．２６ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して加え、混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ（３：９７および５：９５）を溶出のために使用したフラッシュクロマトグラフィによって精製した。収率 １２５ｍｇ（２９％）の白色固体。

（Ｓ_p）−８−（２−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’、５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ａ）
ＤＭＦ（１５ｍｌ）中のＰｄ（ＯＡｃ）₂（９９ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ₃（２５３ｍｇ、０．８１ｍｍｏｌ）の溶液を５０℃で１５分間攪拌した後、トリ−ｎ−ブチル（２−フリル）スタンナン（１．４ｍｌ、４．４ｍｍｏｌ）を加えた。その後、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の（Ｓ_p）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）（２．２ｇ、３．７ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を８０℃で１時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ（３：９７および５：９５）を溶離液として使用したフラッシュクロマトグラフィによって精製した。収率 １．９３ｇ（９０％）の白色固体。

ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー、ＴＯＦ ＥＳ）−陽イオン：Ｍ ５８５．２０２３。計算値 ５８５．２０４１。

（Ｓ_p）−８−（２−チエニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｂ）
ＤＭＦ（１５ｍｌ）中のＰｄ（ＯＡｃ）₂（１１７ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ₃（２９９ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）の溶液を５０℃で３０分間攪拌した後、トリ−ｎ−ブチル（２−チエニル）スタンナン（２．２ｍｌ、６．８ｍｍｏｌ）を加えた。その後、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の（Ｓ_p）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）（２．７２ｇ、４．６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を８５℃で１時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ（３：９７および５：９５）を溶離液として使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィによって精製した。収率 １．９１ｇ（７１％）の白色固体。

（Ｓ_p）−８−（３−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｃ）
ＤＭＦ（２０ｍｌ）中のＰｄ（ＯＡｃ）₂（１３３ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ₃（３４２ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液を５０℃で３０分間攪拌した後、トリ−ｎ−ブチル（３−フリル）スタンナン（２．６７ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を加えた。その後、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の（Ｓ_p）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）（３．００ｇ、５．０ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を８５℃で２時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ（３：９７および５：９５）を溶離液として使用したフラッシュクロマトグラフィによって精製した。収率 ２．７０ｇ（９２％）の白色固体。

（Ｓ_p）−８−（３−チエニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｄ）
ジオキサン（３ｍｌ）中のＰｄ（ＯＡｃ）₂（０．００８ｇ、０．０３ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ₃（０．０２ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン下でフラッシュした。混合物を５０℃で２５分間攪拌すると、反応混合物は赤味がかった茶色になった。水中の（Ｓ_p）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）（０．１０ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）、３−チオフェンボロン酸（０．０３ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）およびＣｓ₂ＣＯ₃（０．１６ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。温度を９５℃に上げ、４．５時間攪拌した。得られた溶液を冷却し、ＴＨＦ（１５ｍｌ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ₃（１０ｍｌ）で洗浄した。有機相を分離し、ＭｇＳＯ₄で乾燥させた。ろ過液を減圧下で蒸発させて乾燥させ、ＥｔＯＡｃ中の３％ＭｅＯＨを使用したフラッシュクロマトグラフィを行って残留物質から生成物を単離した。収率 ５０％の黄褐色固体。

（Ｒ_p）−８−（２−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸（６ａ）
ＴＨＦ中のｔ−ＢｕＯＫの１．０Ｍ溶液（３．６ｍｌ、３．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３０ｍｌ）中の（Ｓ_p）−８−（２−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ａ）（１．５１ｇ、２．６ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加えた。混合物をこの温度で１時間攪拌した後、ＣＳ₂（０．４７ｍｌ、７．８ｍｍｏｌ）を加え、混合物をさらに３時間室温で攪拌した。溶媒の体積を約１０ｍｌに減らした後、ヘキサン（９０ｍｌ）を加えた。沈殿物が形成され、ろ過によって収集し、水（５５ｍｌ）中に懸濁し、１．２ＭのＨＣｌ（９ｍｌ）を加えた。生成物をろ過によって収集し、水で洗浄し、乾燥させた。収率 １．２３ｇ（９１％）の淡黄褐色固体。

ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ ５２６．１３２６。Ｃ₂₀Ｈ₂₈Ｎ₅Ｏ₆ＰＳＳｉに対する計算値：５２６．１３３９。

（Ｒ_p）−８−（２−チエニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸（６ｂ）
ＴＨＦ中のｔ−ＢｕＯＫの１．０Ｍ溶液（３．８ｍｌ、３．８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３５ｍｌ）中の（Ｓ_p）−８−（２−チエニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｂ）（１．８７ｇ、３．１ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加えた。混合物を１時間攪拌した後、ＣＳ₂（０．５７ｍｌ、９．５ｍｍｏｌ）を加え、混合物をさらに３時間室温で攪拌した。溶媒の体積を約１０ｍｌに減らした後、ヘキサン（９０ｍｌ）を加えた。沈殿物が形成され、ろ過によって収集し、水中に懸濁し（５５ｍｌ）、１．２ＭのＨＣｌ（１０ｍｌ）を加えた。生成物をろ過によって収集し、水で洗浄し、乾燥させた。収率 １．５４ｇ（９１％）の淡黄褐色固体。

（Ｒ_p）−８−（３−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸（６ｃ）
ＴＨＦ中のｔ−ＢｕＯＫの１．０Ｍ溶液（５．３ｍｌ、５．３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３５ｍｌ）中の（Ｓ_p）−８−（３−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｃ）（２．５８ｇ、４．４ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加えた。混合物を１時間攪拌した後、ＣＳ₂（０．８０ｍｌ、１３．３ｍｍｏｌ）を加え、混合物をさらに３時間室温で攪拌した。溶媒の体積を約１０ｍｌに減らした後、ヘキサン（９０ｍｌ）を加えた。沈殿物が形成され、ろ過によって収集し、水中に懸濁し（５５ｍｌ）、１．２ＭのＨＣｌ（１０ｍｌ）を加えた。生成物をろ過によって収集し、水で洗浄し、乾燥させた。収率 １．９５ｇ（８４％）の淡黄褐色固体。

（Ｒ_p）−８−（２−フリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸アンモニウム塩（７ａ）
ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の（Ｒ_p）−８−（２−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸（６ａ）（１．１５ｇ、２．７ｍｍｏｌ）およびＮＨ₄Ｆ（２２５ｍｇ、６．０ｍｍｏｌ）の溶液を室温で５日間攪拌した。その後、ＴＭＳＯＭｅ（１ｍＬ）を加え、２４時間攪拌を続けた。溶媒を減圧下で蒸留して除去し、ＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中で粗生成物を懸濁し、Ｅｔ₂Ｏ（８０ｍｌ）を加えた。淡黄褐色の固体をろ過して取り出し、乾燥させた。収率 ８４７ｍｇ（９０％）。

ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー、ＴＯＦ ＥＳ）−陰イオン：Ｍ ４１０．０３３０。計算値 ４１０．０３２９。

（Ｒ_p）−８−（２−チエニル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸アンモニウム塩（７ｂ）
ＤＭＦ（１５ｍｌ）中の（Ｒ_p）−８−（２−チエニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸（６ｂ）（１．３３ｇ、２．５ｍｍｏｌ）およびＮＨ₄Ｆ（２８１ｍｇ、７．５ｍｍｏｌ）の溶液を室温で５日間攪拌した。その後、ＴＭＳＯＭｅ（１ｍｌ）を加え、２４時間攪拌を続けた。溶媒を減圧下で蒸留して除去し、粗生成物をＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中に懸濁し、Ｅｔ₂Ｏ（８０ｍｌ）を加えた。淡黄褐色の固体をろ過して取り出し、乾燥させた。収率 ９３４ｍｇ（８６％）の淡黄褐色固体。

（Ｒ_p）−８−（３−フリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸アンモニウム塩（７ｃ）
ＤＭＦ（２０ｍｌ）中の（Ｒ_p）−８−（３−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸（６ｃ）（１．９ｇ、３．６ｍｍｏｌ）およびＮＨ₄Ｆ（４０４ｍｇ、１０．８ｍｍｏｌ）の溶液を室温で５日間攪拌した。その後、ＴＭＳＯＭｅ（１ｍｌ）を加え、２４時間攪拌を続けた。溶媒を減圧下で蒸留して除去し、粗生成物をＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中に懸濁し、Ｅｔ₂Ｏ（８０ｍｌ）を加えた。淡黄褐色の固体をろ過して取り出し、乾燥させた。収率 １．３８ｇ（８９％）の淡黄褐色固体。

（Ｒ_p）−８−フェニルアデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸（７ｅ）
８−フェニルアデノシン（１７ｅ）（０．３４３ｇ、１ｍｍｏｌ）をピリジンを用いた共沸蒸留を繰返すことによって乾燥させ、次いでアルゴンガス下で連続蒸留器上で水素化カルシウムから新しく蒸留されたピリジン（１０ｍｌ）中に溶かした。乾燥ＴＨＦ（２ｍｌ）中の塩化チオホスホリル（０．１６９ｇ、１ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で−１２℃において１０分間にわたり、上記ピリジン溶液に加えた。混合物を−１２℃で１５分間攪拌した後、反応混合物を、水（４０ｍｌ）中の水酸化ナトリウム（０．２４０ｇ、６ｍｍｏｌ）の激しく攪拌した溶液に６０℃で加え、その後すばやく破砕ドライアイス上に注いだ。二酸化炭素の発生が止まってから、溶媒を減圧下で蒸留して除去した。蒸留中の浴温度は、３５℃を超えないようにした。固体残留物をジエチルエーテルで繰返し洗浄し、メタノール（５ｍｌ）中に抽出し、混合物をろ過し、ろ過液を激しく攪拌しながらゆっくりとＴＨＦ（１００ｍｌ）に加えた。セライトを通してろ過し、ろ過液を減圧下で蒸発させると、固体物質が残った。生成物は、（Ｒ_P）−および（Ｓ_P）−８−フェニルアデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸ジアステレオ異性体の１：１の混合物であった。混合物に対して溶離剤（水：メタノール：ギ酸＝８０：２０：０．５）を使ったＣ１８−官能化シリカゲルカラム上の分取逆相クロマトグラフィを行って異性体をクロマトグラフィで分離した。表題の化合物の物理データ：ＭＳ（エレクトロスプレー、負ＥＳＩ、ｍ／ｚ）：８６３．１（８％、２Ｍ＋Ｎａ−２Ｈ）、４２０（１００％、Ｍ−１）２１０．１（３５％）。³¹ＰＮＭＲ（ＣＤ₃ＯＤ）（ナトリウム塩）：５７．８ｐｐｍ。

同様に、（Ｓ_p）−８−フェニルアデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸（７ｅ）異性体は、ＨＰＬＣ−分離の後で得られ得る。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−ブロモアデノシン（１２）
無水酢酸（５．６６ｍｌ、６０ｍｍｏｌ）をピリジン（５０ｍｌ）中の８−ブロモアデノシン（１１）（３．４６ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加え、その後ＤＭＡＰ（１ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で５時間攪拌した。メタノール（１０ｍｌ）を加えることによって反応を停止した。溶液を減圧下で蒸発させて乾燥させ、残留物質を酢酸エチル（２５０ｍｌ）に溶かし、ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ）、水（３×５０ｍｌ）を加えて溶液を振り、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、溶液を減圧下で濃縮した。生成物は固体であった。収率 ３．２１ｇ、（６８％）。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−ブロモアデノシン（１３）
ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（２．３０ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍｌ）中の８−ブロモアデノシン（１１）（１．３２ｇ、３．８２ｍｍｏｌ）およびイミダゾール（２．０８ｇ、３０．５ｍｍｏｌ）の溶液に加え、溶液を室温で２４時間攪拌した。飽和ＮＨ₄Ｃｌ水溶液（３５ｍｌ）を加え、混合物をＥｔＯＡｃ（２×４０ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を水で洗浄し（２×１５ｍｌ）、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させて表題の化合物を生じた。収率 ２．１６ｇ（８２％）。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−フェニルアデノシン（１４ａ）
２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−ブロモアデノシン（１２）（０．８９ｇ、１．８８ｍｍｏｌ）、ＴＦＰ（０．１７ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）およびＰｄ₂ｄｂａ₃＊ＣＨＣｌ₃（０．１０ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）をアルゴン下でＤＭＦ（１４ｍｌ）中に溶かし、Ｂｕ₃ＳｎＰｈ（０．６１ｍｌ、１．８８ｍｍｏｌ）を滴下して加えながら溶液を５０℃に加熱した。反応混合物を１１０℃で２０時間加熱し、減圧下で蒸発させて乾燥させた。生成物をＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９９：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィを行って残留物質から単離した。収率 ０．７５ｇ（８５％）。ＨＲＭＳ：Ｍ ４６９．１５８１。Ｃ₂₂Ｈ₂₃Ｎ₅Ｏ₇に対する計算値：４６９．１５９７。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−（２−フリル）アデノシン（１４ｂ）
２−（トリブチルスタンニル）フラン（１２）（１．５２ｍｌ、４．８４ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で５０℃において、ＤＭＦ（３０ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−ブロモアデノシン（１．９０ｇ、４．０３ｍｍｏｌ）、ＴＦＰ（０．３７ｇ、１．６１ｍｍｏｌ）およびＰｄ₂ｄｂａ₃＊ＣＤＣｌ₃（０．２１ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合物１１０℃で一晩加熱し、溶液を減圧下で蒸発させ、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９９：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィを行って残留物質から表題の物質を単離した。収率 １．６１ｇ（８７％）。ＨＲＭＳ：Ｍ ４５８．１４０２。Ｃ₂₀Ｈ₂₁Ｎ₅Ｏ₈に対する計算値：４５９．１３９０。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−（３−フリル）アデノシン（１４ｃ）
３−トリブチルスタンニルフラン（１．３６ｇ、３．８１ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で５０℃においてＤＭＦ（２２．５ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−ブロモアデノシン（１２）（１．５０ｇ、３．１８ｍｍｏｌ）、ＴＦＰ（０．３０ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）およびＰｄ₂ｄｂａ₃＊ＣＨＣｌ₃（０．１６ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の溶液に室温で滴下して加えた。温度を１１０℃上げ、反応混合物をこの温度で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物質をＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９９：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 １．２５ｇ（８６％）。ＨＲＭＳ：Ｍ ４５９．１３８４。Ｃ₂₀Ｈ₂₁Ｎ₅Ｏ₈に対する計算値：４５９．１３９０。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−（２−チエニル）アデノシン（１４ｄ）
２−（トリブチルスタンニル）チオフェン（０．４０ｍｌ、１．２７ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で５０℃において、ＤＭＦ（９ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−ブロモアデノシン（１２）（０．５０ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）、ＴＦＰ（０．１０ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）およびＰｄ₂ｄｂａ₃＊ＣＨＣｌ₃（０．０５ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して加えた。得られた混合物を一晩攪拌しながら１１０℃で加熱した。混合物を減圧下で蒸発させて乾燥させ、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９９：１）を使用した残留物質のフラッシュクロマトグラフィを行って表題の化合物を単離した。収率＞８０％。ＨＲＭＳ：Ｍ ４７５．１１５８。Ｃ₂₀Ｈ₂₁Ｎ₅Ｏ₇Ｓに対する計算値：４７５．１１６２。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−（１−メチル−２−ピロリル）アデノシン（１４ｅ）
２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−ブロモアデノシン（１２）（１．５０ｇ、３．１８ｍｍｏｌ）、トリス（２−フリル）ホスフィン（０．２９ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）およびＰｄ₂ｄｂａ₃＊ＣＨＣｌ₃（０．１６ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をアルゴン下でフラッシュし、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中に溶かした。混合物を５０℃に加熱し、１−メチル−２−（トリブチルスズ）ピロール（１．４１ｇ、３．８１ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１１０℃で一晩加熱した。溶媒を減圧下で除去し、残留物質をＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９９：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 １．１５ｇ（７７％）。ＨＲＭＳ：Ｍ ４７２．１７１６。Ｃ₂₁Ｈ₂₄Ｎ₆Ｏ₇に対する計算値：４７２．１７０６。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−エチルアデノシン（１４ｆ）
Ｅｔ₄Ｓｎ（０．８４ｍｌ、４．２４ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（２５ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−ブロモアデノシン（１２）（１．０ｇ、２．１２ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ₃）₄（０．２４ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で室温において滴下して加えた。混合物を１３０℃に加熱し、混合物をこの温度で２０時間加熱した。ＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）を冷却した反応混合物に加え、溶液を水（４×５０ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍｌ）で洗浄した。有機溶液を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、溶媒を蒸留して除去し、残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂中１０％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ０．５１ｇ（５７％）。ＨＲＭＳ：Ｍ ４２１．１５８５。Ｃ₁₈Ｈ₂₃Ｎ₅Ｏ₇に対する計算値：４２１．１５９７。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−（１−エトキシビニル）アデノシン（１４ｇ）
（１−エトキシビニル）トリブチルスズ（０．６０ｍｌ、１．７８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１４ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−ブロモアデノシン（１２）（０．７０ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）、ＴＦＰ（０．１４ｇ，０．５９ｍｍｏｌ）およびＰｄ₂ｄｂａ₃＊ＣＨＣｌ₃（０．０８ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で５０℃において滴下して加えた。反応混合物を８０℃で１７時間攪拌した。反応混合物を減圧下で蒸発させて乾燥させ、残留物質をＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９９：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ０．５２ｇ（７６％）の白色固体。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−メチルアデノシン（１５ａ）
ＡｌＭｅ₃（トルエン中２Ｍ、０．４４ｍｌ、０．８７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍｌ）中の８−ブロモ−２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン（１３）（０．３０ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ₃）₄（０．０３ｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で滴下して加えた。混合物を７０℃で４時間加熱したとき、ＴＬＣは反応が完了したことを示した。溶液を減圧下で蒸発させ、ＣＨ₂Ｃｌ₂中１０％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上での残留物質のフラッシュクロマトグラフィを行って生成物を単離した。収率 ０．２７ｇ（＞９８％）。

２’、３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−（２−フリル）アデノシン（１５ｂ）
ＮＭＰ（２５ｍｌ）中の８−ブロモ−２’，３’，５’−トリス−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン（１３）（３．４４ｇ、５．０ｍｍｏｌ）、Ｐｄ₂ｄｂａ₃・ＣＨＣｌ₃（６５ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）、トリ（２−フリル）ホスフィン（１１５ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）および２−トリブチルスタンニルフラン（１．９ｍｌ、６．０ｍｍｏｌ）の溶液を８０℃で２５時間加熱した。ＥｔＯＡｃ（３００ｍｌ）を冷却した反応混合物に加え、溶液を水（３×５０ｍｌ）を加えて振り、有機溶液を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させ、残留物質をＥｔＯＡｃ：ヘキサン（最初に１：４、次に１：２）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。生成物は白色固体であった。収率 ２．９４ｇ（８７％）。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−フェニルアデノシン（１６ａ）
フェニルボロン酸（０．０９ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）およびＣｓ₂ＣＯ₃（０．４９ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）をジオキサン（５ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−ブロモアデノシン（１３）（０．３５ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ₃）₄（０．０６ｇ、０．０５ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で室温において加えた。混合物を１００℃に加熱し、すべてのＣｓ₂ＣＯ₃が溶けるまで水を加え、溶液を還流下で一晩加熱した。ＥｔＯＡｃ（１５ｍｌ）を冷却した反応混合物に加え、その後水（１０ｍｌ）を加えて振った。有機溶液を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させ、ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９９：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィを行って残留物質から表題化合物を単離した。収率 ０．３１ｇ（８９％）。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−（３−チエニル）アデノシン（１６ｂ）
３−チオフェンボロン酸（０．１４ｇ、１．０９ｍｍｏｌ）およびＣｓ₂ＣＯ₃（０．７１ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）をジオキサン（７ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−ブロモアデノシン（１３）（０．５０ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ₃）₄（０．０８ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で加えた。混合物を１００℃に加熱し、水（１ｍｌ）を加えてすべてのＣｓ₂ＣＯ₃を溶かした。溶液を還流下で一晩加熱し、室温に冷却し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍｌ）を加えた。溶液を水（１５ｍｌ）を加えて振り、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、減圧下で蒸発させた。ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９９：１）使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィを行って生成物を残留物質から単離した。収率 ０．４３ｇ（８６％）。ＨＲＭＳ：Ｍ ６９１．３４２５。Ｃ₃₂Ｈ₅₇Ｎ₅Ｏ₄ＳＳｉ₃に対する計算値：６９１．３４３９。

２’，３’，５’−トリス−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−（３−ピリジニル）アデノシン（１６ｃ）
ピリジン−３−ボロン酸（０．５９ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）およびＣｓ₂ＣＯ₃（３．１１ｇ、９．５７ｍｍｏｌ）をジオキサン（５０ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−ブロモアデノシン（１３）（２．２０ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ₃）₄（０．３７ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で加えた。水（１０ｍｌ）を加えてすべてのＣｓ₂ＣＯ₃を溶かした。溶液を還流下で一晩加熱した。ＥｔＯＡｃ（２００ｍｌ）を冷却した反応混合物に加え、得られた溶液を水（１００ｍｌ）を加えて振り、有機溶液を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、蒸発させ、残留物質をＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９９：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 １．７６ｇ（８０％）。ＨＲＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ６８７．３９００。Ｃ₃₃Ｈ₅₈Ｎ₆Ｏ₄Ｓｉ₃＋Ｈに対する計算値：６８７．３９００。

２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−（４−ピリジニル）アデノシン（１６ｄ）
水（１１ｍｌ）中のピリジン−４−ボロン酸（０．２７ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）およびＣｓ₂ＣＯ₃（１．４２ｇ、４．３５ｍｍｏｌ）の溶液をジオキサン（２５ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−ブロモアデノシン（１３）（１．０ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）およびＰｄ（ＰＰｈ₃）₄（０．１７ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）の溶液に加え、反応混合物を１００℃で一晩加熱した。ＥｔＯＡｃ（８０ｍｌ）を冷却した反応混合物に加え、得られた混合物を水（５０ｍｌ）を加えて振った。乾燥させた（ＭｇＳＯ₄）溶液を蒸発させ、残留物質をＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ（９９：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ０．５８ｇ（５８％）。ＨＲＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ６８７．３８８３。Ｃ₃₃Ｈ₅₈Ｎ₆Ｏ₄Ｓｉ₃＋Ｈに対する計算値：６８７．３９００。

８−（２−フリル）アデノシン（１７ａ）（エステル加水分解）
ＭｅＯＨ（５０ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−（２−フリル）アデノシン（１４ｂ）（１．３９ｇ、３．０３ｍｍｏｌ）およびＫ₂ＣＯ₃（０．１４ｇ、１．０１ｍｍｏｌ）の溶液を室温で一晩攪拌した。シリカゲルを溶液に加え、懸濁液を攪拌し、蒸発させて乾燥させ、残留物質をシリカゲルを有するカラムの最上部に加えてフラッシュクロマトグラフィを行った。カラムは、ＣＨ₂Ｃｌ₂中１５％のＭｅＯＨで展開した。収率 ０．６８ｇ（６７％）。

８−（２−フリル）アデノシン（１７ａ）（脱シリル化）
ＴＨＦ（７０ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−（２−フリル）アデノシン（１５ｂ）（２．７８ｇ、４．１ｍｍｏｌ）およびＴＢＡＦ×３Ｈ₂Ｏ（５．３０ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２時間攪拌した。溶媒を蒸留して除去し、ＭｅＯＨ：ＣＨ₂Ｃｌ₂（１：９）を使用したフラッシュクロマトグラフィによって生成物を精製し、少量のＭｅＯＨを加えて生成物を粉砕した。収率 １．２４ｇ（９０％）の淡黄褐色固体。

８−（２−チエニル）アデノシン（１７ｂ）
ＭｅＯＨ中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−（２−チエニル）アデノシン（１４ｄ）およびＫ₂ＣＯ₃の溶液を室温で一晩攪拌し、減圧下で蒸発させて乾燥させ、ＣＨ₂Ｃｌ₂中１０％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィを行って残留物質から表題化合物を単離した。収率＞６０％。ＨＲＭＳ：Ｍ ３４９．０８３２。Ｃ₁₄Ｈ₁₅Ｎ₅Ｏ₄Ｓに対する計算値：３４９．０８４５。

８−（３−フリル）アデノシン（１７ｃ）
ＭｅＯＨ（３５ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−（３−フリル）アデノシン（１４ｃ）（０．９５ｇ、２．０７ｍｍｏｌ）およびＫ₂ＣＯ₃（０．１０ｇ、０．６９ｍｍｏｌ）の溶液を室温で一晩攪拌した。シリカゲルを加え、懸濁液を攪拌し、溶媒を減圧下で蒸発させて除去した。残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂中１５％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ０．５０ｇ（７２％）。ＨＲＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ３５０．０９０２。Ｃ₁₄Ｈ₁₅Ｎ₅Ｏ₄Ｓ＋Ｈに対する計算値：３５０．０９１７。Ｍ＋Ｎａ：３７２．０７４７。Ｃ₁₄Ｈ₁₅Ｎ₅Ｏ₄Ｓ＋Ｎａに対する計算値：３７２．０７３６。

８−（３−チエニル）アデノシン（１７ｄ）
ＴＨＦ（６７ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−（３−チエニル）アデノシン（１６ｂ）（１．２１ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）およびＴＢＡＦ（１．８３ｇ、６．９９ｍｍｏｌ）の溶液を室温で一晩攪拌した。溶媒を蒸留して除去し、残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂中１０％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ０．５１ｇ（８４％）。ＨＲＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ３５０．０９０２。Ｃ₁₄Ｈ₁₅Ｎ₅Ｏ₄Ｓ＋Ｈに対する計算値：３５０．０９１７。Ｍ＋Ｎａ ３７２．０７４７。Ｃ₁₄Ｈ₁₅Ｎ₅Ｏ₄Ｓ＋Ｎａに対する計算値：３７２．０７３６。

８−フェニルアデノシン（１７ｅ）
ＭｅＯＨ（２３ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル−８−フェニルアデノシン（１４ａ）（０．７３ｇ、１．５６ｍｍｏｌ）およびＫ₂ＣＯ₃（０．０７ｇ、０．５２ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２４時間攪拌した。シリカゲル（約２ｇ）を加えた。懸濁液を攪拌し、減圧下で蒸発させて乾燥させた。残留物質をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィカラムの最上部に加え、カラムをＣＨ₂Ｃｌ₂中１０％のＭｅＯＨで展開した。収率 ０．４８ｇ（９１％）。ＨＲＭＳ：Ｍ ３４３．１２８７。Ｃ₁₆Ｈ₁₇Ｎ₅Ｏ₄に対する計算値：３４３．１２８１。

８−（３−ピリジニル）アデノシン（１７ｆ）
ＴＨＦ（３１ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−（３−ピリジニル）アデノシン（１６ｃ）（０．５６ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）およびＴＢＡＦ（０．８５ｇ、３．２６ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン下で室温において一晩攪拌した。溶媒を蒸留して除去し、残留物質をＭｅＯＨ（１０ｍｌ）中に溶かした。溶液を０℃で一晩放置し、表題化合物をろ過によって単離した。

８−（４−ピリジニル）アデノシン（１７ｇ）
ＴＢＡＦ（７．３９ｍｌ、１Ｍ、７．３９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（２８ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）−８−（４−ピリジニル）アデノシン（１６ｄ）（１．２７ｇ、１．８５ｍｍｏｌ）の溶液に加え、溶液を室温で一晩攪拌した。溶液を減圧下で蒸発させて乾燥させ、残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂中１５％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ０．４６ｇ（７２％）。ＨＲＥＳＩ：Ｍ＋Ｈ ３４５．１３１３。Ｃ₁₅Ｈ₁₆Ｎ₆Ｏ₄＋Ｈに対する計算値：３４５．１３０５。

８−（１−メチル−２−ピロリル）アデノシン（１７ｈ）
ＭｅＯＨ（３７ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−（１−メチル−２−ピロリル）アデノシン（１４ｅ）（１．０４ｇ、２．２０ｍｍｏｌ）およびＫ₂ＣＯ₃（０．１０ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）の溶液を室温で一晩攪拌し、溶液を減圧下で蒸発させ、残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂中１５％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ０．６４ｇ（８４％）。ＨＲＭＳ：Ｍ ３４６．１３７１。Ｃ₁₅Ｈ₁₈Ｎ₆Ｏ₄に対する計算値：３４６．１３９０。

８−メチルアデノシン（１７ｉ）
ＴＨＦ（３０ｍｌ）中の８−ブロモ−２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）アデノシン（１５ａ）（１．４１ｇ、２．２６ｍｍｏｌ）およびＴＢＡＦ（２．３７ｇ、９．０５ｍｍｏｌ）の溶液を室温で一晩攪拌した。溶媒を蒸留して除去し、残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂中１５％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ０．５９ｇ（９３％）。

８−エチルアデノシン（１７ｊ）
ＭｅＯＨ（１９ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−エチルアデノシン（１４ｆ）（０．６３ｇ、１．５ｍｍｏｌ）およびＫ₂ＣＯ₃（０．０７ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１８時間攪拌した。シリカゲルを加え、懸濁液を攪拌し、溶媒を減圧下で蒸発させて除去した。残留物質を、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィカラムの最上部に加え、カラムをＣＨ₂Ｃｌ₂中１５％のＭｅＯＨで展開した。収率 ０．２３ｇ、５２％。

８−（１−エトキシビニル）アデノシン（１７ｋ）
ＭｅＯＨ（１７ｍｌ）中の２’，３’，５’−トリス−（Ｏ−アセチル）−８−（１−エトキシビニル）アデノシン（１４ｇ）（０．５３ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）およびＫ₂ＣＯ₃（０．０５ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）の溶液を室温で２４時間攪拌した。このとき、ＴＬＣは完全な変換を示した。シリカゲルを溶液に加え、懸濁液を攪拌し、減圧下で蒸発させて乾燥させた。残留物質をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィカラムの最上部に加え、カラムをＣＨ₂Ｃｌ₂中１０％のＭｅＯＨで展開した。収率 ０．３７ｇ（＞９５％）。ＨＲＭＳ：Ｍ ３３７．１３９５。Ｃ₁₄Ｈ₁₉Ｎ₅Ｏ₅に対する計算値：３３７．１３８６。

８−アセチルアデノシン（１７ｌ）
１ＭのＨＣｌ（１０ｍｌ）を、ＴＨＦ（４０ｍｌ）中の８−エトキシビニルアデノシン（１７ｋ）（１．４８ｇ、４．３７ｍｍｏｌ）の溶液に加え、溶液を室温で２０時間攪拌した。Ｋ₂ＣＯ₃水溶液を加えて中性ｐＨにし、混合物を直接フラッシュクロマトグラフィシリカゲルカラムに加え、カラムをＣＨ₂Ｃｌ₂中１５％のＭｅＯＨで展開した。収率 １．１７ｇ（８７％）。

８−（１−ヒドロキシエチル）アデノシン（１７ｍ）
ＮａＢＨ₄（０．１９ｇ、５．０５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３５ｍｌ）およびＭｅＯＨ（４ｍｌ）中の８−アセチルアデノシン（１７ｌ）（０．７８ｇ、２．５２ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で加え、混合物を室温で１８時間攪拌した。混合物を中性ｐＨになるまで１ＭのＨＣｌを滴下して処理し、混合物をフラッシュクロマトグラフィカラムの最上部に加え、カラムをＣＨ₂Ｃｌ₂中３０％のＭｅＯＨで展開した。収率 ０．４６ｇ（５９％）。生成物は２つのアルコールエピマーの混合物であった（比１：１）。

（Ｒ_p）−アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸Ｏ−メチルエステル（１９）
乾燥ＤＭＦ（７ｍｌ）中のアデノシン（９）（０．１０６ｇ、０．４ｍｍｏｌ）の溶液を（０．４５ｍｌ、０．２ｍｍｏｌ）アセトニトリル中の０．５Ｍテトラゾールに加え、溶液をアルゴン雰囲気下で６０℃に加熱した。次いで、ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソアミノ）メトキシホスフィン（０．１０５ｇ、０．４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、反応混合物をこの温度で１５分間放置した。反応混合物を室温に冷却し、硫黄（０．０１３ｇ、０．４ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で８時間攪拌した。反応混合物を減圧下で蒸発させて乾燥させた。残留固体は（Ｒ_p）−アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸およびその（Ｓ_P）−異性体の混合物（比２：３）であった。異性体を逆相Ｃ１８−官能シリカゲル上の分取ＨＰＬＣによって分離した。単離された表題化合物の収率は０．０１８ｇ（１２％）であった。

（Ｒ_P）−８−（２−チエニル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸Ｓ−メチルピバレート（２６）
（Ｒ_p）−８−（２−チエニル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸アンモニウム塩（７ｂ）（０．２ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍｌ）に溶かし、トリエチルアミン（０．３ｍｍｏｌ）を加えた。真空下で混合物を蒸発させると、（Ｒ_p）−８−（２−チエニル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリエチルアンモニウム塩が残った。この生成物の一部（７４ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）およびＮａＩ（２０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍｌ）中にアルゴン下で溶かし、クロロメチルピバレート（２０ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で４８時間攪拌した。溶媒を減圧下で蒸留して除去し、残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ（最初に３：９７、次いで５：９５）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ３０ｍｇ（４０％）の白色固体。

（Ｒ_P）−および（Ｓ_P）−８−フェニルアデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸Ｓ−メチルピバレート（２７）
（Ｒ_P）−および（Ｓ_P）−８−フェニルアデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸（７ｅ）（そのナトリウム塩として）の粗製１：１ジアステレオ異性体混合物（１５０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍｌ）中に溶かし、ヨウ化ナトリウム（５１ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ ｍｇ）を加え、その後クロロメチルピバレート（６１ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をアルゴン下で保持し、還流下で６時間加熱した。混合物を減圧下で蒸発させて乾燥させ、固体残留物をジクロロメタンで数回抽出した。抽出物を収集し、蒸発させて、茶色がかった固体（１４２ｍｇ）を得た。リンＮＭＲから、粗生成物が約１：１の比で表題化合物のみからなることが明らかであった。次いで、ジアステレオ異性体をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ（９５：１）を使用したシリカゲルフラッシュクロマトグラフィによって分離した。

（Ｒ_P）−８−フェニルアデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸Ｓ−メチルピバレート（２７）
固体生成物を１６％の収率（２８ｍｇ）で単離した。

（Ｓ_P）−８−フェニルアデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸Ｓ−メチルピバレート（２７）
固体生成物を２０％の収率（３６ｍｇ）で単離した。

ＰＫＡ Ｉα酵素活性
公知のＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳに対するＰＫＡタイプＩα酵素活性のための結合クック比色アッセイ（ｃｏｕｐｌｅｄ Ｃｏｏｋ ｃｏｌｏｒｉｍｅｒｉｃ ａｓｓａｙ）においてＲｐ−８−カルビル化ｃＡＭＰＳをそれらの効力についてテストした。結果を以下の表１に記載する。

８−ブロモアデノシン−３’，５’−環状リン酸（１）
臭素（１５．４ｍｌ、０．３０ｍｏｌ）を水（１．５ｌ）中のｃＡＭＰ（９８．８ｇ、０．３０ｍｏｌ）および酢酸ナトリウム三水和物（８１．６ｇ、０．６０ｍｏｌ）の溶液に１時間にわたり室温で攪拌しながら加えた。２４時間後、暗赤色の消えるまで亜硫酸ナトリウムをゆっくりと加えた。沈殿物をろ過によって収集し、固体を水、イソプロピルアルコールおよびジエチルエーテルで洗浄し、その後減圧下で乾燥させた。生成物を水（５００ｍｌ）中に分散させ、重炭酸ナトリウム（１当量）をゆっくりと加えて溶かした。すべての物質が溶けてから、少量の亜硫酸ナトリウムを加えて溶液の暗赤色を除去した。激しく攪拌しながら１．０Ｍ臭化水素酸を滴下して生成物を沈殿させた。沈殿物を収集し、水、イソプロピルアルコール、ジエチルエーテルで洗浄し、明黄色粉末を高真空下で乾燥させた。収率 ９２．０ｇ（７６％）。¹ＨＮＭＲは文献と一致していた。

（Ｓｐ）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）
乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）中の乾燥ＤＭＦ（０．２８９ｇ、３．９６ｍｍｏｌ）をアルゴンガスの雰囲気下に置き、０℃に冷却し、その後ジクロロメタン中の塩化オキサリル（２ｍｌ、２Ｍ、４ｍｍｏｌ）をゆっくりと加えた。冷却槽を除き、懸濁液を攪拌しながら室温で３０分間放置し、反応混合物を−７℃に冷却し、乾燥ジクロロメタン（８ｍｌ）中のトリブチルアンモニウム８−ブロモアデノシン−２Ｏ−ＴＢＤＭＳ−３，５−環状モノホスフェート（１）（２．５５ｇ、３．６０ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。混合物をこの温度で１時間攪拌し、放置して室温にし、乾燥（ＣａＨ₂）アニリン（３．３５ｇ、３６ｍｍｏｌ）を加えた。３時間後、混濁した反応混合物をジクロロメタンで１００ｍｌに希釈し、冷たい飽和炭酸水素ナトリウム（３×２５ｍｌ）で洗浄した。次いで、有機相をＭｇＳＯ₄で乾燥させ、溶媒を減圧下で除去し、残留物質をシクロヘキサン（１００ｍｌ）に激しく攪拌しながらゆっくりと加えた。沈殿物を乾燥させ、ジクロロメタン中７％のメタノールを溶離剤として使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 １．４６ｇ（６８％）。¹ＨＮＭＲは文献と一致していた。

（Ｓｐ）−８−（５−メチル−２−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｅ）
乾燥脱気ＤＭＦ（６ｍｌ）、酢酸パラジウム（０．０１６９ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（０．０４１ｇ、０．１５８ｍｍｏｌ）を深赤色の均質溶液となるまで（約１５分）５０℃においてアルゴン下でともに加熱した。２−トリブチルスタンニル−５−メチルフラン（０．９０４ｍｍｏｌ）および（Ｓｐ）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（０．４５０ｇ、０．７５３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を８０℃で４時間加熱した。溶媒を蒸留して除去し、残留物をジクロロメタン（３ｍｌ）に溶かし、溶液をヘキサン（５０ｍｌ）に激しく攪拌しながら加えた。ジクロロメタン中７％のメタノールを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィに沈殿物をかけて生成物を得た。収率：０．４０５ｇ（９０％）。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：（Ｍ＋Ｈ） ５９９．２１８１。Ｃ₂₇Ｈ₃₅Ｎ₆Ｏ₆ＰＳｉ＋Ｈに対する計算値：５９９．２１９７。

（Ｓｐ）−８−（５−メトキシ−２−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｆ）
乾燥脱気ＤＭＦ（６ｍｌ）中の酢酸パラジウム（１６．９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（４１．５ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ）の溶液を５０℃においてアルゴン下で１５分間加熱し（深赤色）、その後２−（トリブチルスタンニル）−５−メトキシフラン（０．３８７ｇ、１．００ｍｍｏｌ）および（Ｓｐ）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）（０．４５０ｇ、０．７５３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を８５℃で４時間加熱した。溶媒を真空下で除去し、残留物質をジクロロメタン（３ｍｌ）に溶かし、溶液を激しく攪拌したヘキサン（５０ｍｌ）にゆっくりと加え、沈殿した物質をジクロロメタン中７％のメタノールを使用したシリカ上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ３１０ｍｇ（６７％）。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：（Ｍ＋Ｈ） ６１５．２１１８。Ｃ₂₇Ｈ₃₅Ｎ₆Ｏ₇ＰＳｉ＋Ｈに対する計算値：６１５．２１４６。

（Ｓｐ）−８−（５−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル）−２−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｇ）
乾燥脱気ＤＭＦ（６ｍｌ）中の酢酸パラジウム（１６．９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（４１．５ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ）の溶液を５０℃においてアルゴン下で１５分間加熱し（深赤色）、その後２−トリブチルスタンニル−５−（ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル）フラン（０．４７８ｇ、０．９０４ｍｍｏｌ）および（Ｓｐ）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）（０．４５０ｇ、０．７５３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を８５℃で４時間加熱した。溶媒を真空下で除去し、残留物質をジクロロメタン（３ｍｌ）に溶かし、溶液を激しく攪拌したヘキサン（５０ｍｌ）にゆっくりと加え、沈殿した物質をジクロロメタン中７％のメタノールを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ４６１ｍｇ（８４％）。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：（Ｍ＋Ｈ） ７２９．３００１。Ｃ₃₃Ｈ₄₉Ｎ₆Ｏ₇ＰＳｉ２＋Ｈに対する計算値：７２９．３０１１。

（Ｓ_P）−８−（２−ベンゾフリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホロアミデート（５ｈ）
乾燥脱気ＤＭＦ（６ｍｌ）中の酢酸パラジウム（１６．９ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（４１．５ｍｇ、０．１５８ｍｍｏｌ）の溶液を５０℃においてアルゴン下で１５分間加熱し（深赤色）、その後２−（トリブチルスタンニル）ベンゾフラン（０．３８１ｇ、０．９３６ｍｍｏｌ）および（Ｓｐ）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）（０．４５０ｇ、０．７５３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を８５℃で４時間加熱した。溶媒を真空下で除去し、残留物質をジクロロメタン（３ｍｌ）に溶かし、溶液を激しく攪拌したヘキサン（５０ｍｌ）にゆっくりと加えた。沈殿物をジクロロメタン中７％のメタノールを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率：４３９ｍｇ（９２％）。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：（Ｍ＋Ｈ） ６３５．２１７１。Ｃ₃₀Ｈ₃₅Ｎ₆Ｏ₆ＰＳｉ＋Ｈに対する計算値：６３５．２１９７．

（Ｓ_P）−８−（２−Ｎ−メチルピロリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｉ）
ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＰｄ（ＯＡｃ）₂（３７ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ₃（９１ｍｇ、０．３４８ｍｍｏｌ）の混合物を溶液が暗赤色に変るまで５０℃で攪拌した。ＤＭＦ（２ｍｌ）中の（Ｓ_P）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニル−ホスホラミデート（４）（０．５００ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、および２−（トリブチルスタンニル）−Ｎ−メチル−２−ピロール（０．４６１ｇ、１．２４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を９０℃で４時間攪拌した。ＤＭＦを減圧下で除去し、残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂中７．５％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。生成物は、微量の有機スズ残留物が混じった白色固体であった。有機スズ残留物はＣＨ₂Ｃｌ₂中に生成物を溶かすことによって除去し、ヘキサンで再沈殿させた。収率 ０．３５０ｇ（７０％）。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ＋Ｈ ５９８．２３３９。Ｃ₂₇Ｈ₃₆Ｎ₇Ｏ₅ＰＳｉ＋Ｈに対する計算値：５９８．２３５７。

（Ｓ_P）−８−（３−ピリジニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｊ）
ＮＭＰ（４ｍｌ）中のＰｄ（ＯＡｃ）₂（３７ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ₃（９１ｍｇ、０．３４８ｍｍｏｌ）の混合物を溶液が暗赤色に変るまで５０℃で攪拌した。ＮＭＰ（２ｍｌ）中の（Ｓ_P）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）（０．５００ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、および３−（トリブチルスタンニル）ピリジン（０．６１０ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を１１０℃で１０時間攪拌した後、ＮＭＰを減圧下で除去し、残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂中７．５％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。生成物は、微量の有機スズ残留物が混じった白色固体であった。有機スズ残留物はＣＨ₂Ｃｌ₂中にカップリング生成物を溶かすことによって除去し、ヘキサンで再沈殿させた。収率 ０．２８０ｇ（５７％）。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ＋Ｈ ５９６．２２１１。Ｃ₂₇Ｈ₃₄Ｎ₇Ｏ₅ＰＳｉ＋Ｈに対する計算値：５９６．２２０１。

（Ｓ_P）−８−（フェニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｋ）
ＤＭＦ（４ｍｌ）中のＰｄ（ＯＡｃ）₂（３７ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ₃（９１ｍｇ、０．３４８ｍｍｏｌ）の混合物を５０℃で溶液が暗赤色に変るまで攪拌した。ＮＭＰ（２ｍｌ）中の（Ｒ_P）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）（０．５００ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、およびフェニルトリブチル水素化スズ（０．６０９ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を１３５℃で７時間攪拌した後、ＮＭＰを減圧下で除去し、残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂中７．５％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。生成物は、微量の有機スズ残留物が混じった白色固体であった。有機スズ残留物はＣＨ₂Ｃｌ₂中に生成物を溶かすことによって除去し、ヘキサンで再沈殿させた。収率 ０．３１０ｇ（６３％）。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ＋Ｈ ５９５．２２７５。Ｃ₂₈Ｈ₃₅Ｎ₆Ｏ₅ＰＳｉ＋Ｈに対する計算値：５９５．２２４８。

（Ｓ_P）−８−（４−メトキシフェニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｌ）
ＤＭＦ（４ｍｌ）中のＰｄ（ＯＡｃ）₂（３７ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ₃（９１ｍｇ、０．３４８ｍｍｏｌ）の混合物を溶液が暗赤色に変るまで５０℃で攪拌した。ＮＭＰ（２ｍｌ）中の（Ｓ_P）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）（０．５００ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、および４−（トリブチルスタンニル）アニソール（０．６６６ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を１２０〜１２５℃で１０時間攪拌した後、ＮＭＰを減圧下で除去した。残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂中７．５％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。生成物は、微量の有機スズ残留物が混じった白色固体であった。有機スズ残留物はＣＨ₂Ｃｌ₂中に生成物を溶かすことによって除去し、ヘキサンで再沈殿させた。収率 ０．３１５ｇ（６１％）。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ＋Ｈ ６２５．２３６８。Ｃ₂₉Ｈ₃₇Ｎ₆Ｏ₆ＰＳｉ＋Ｈに対する計算値：６２５．２３５４。

（Ｓ_p）−８−（２−チアゾリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｍ）
ＤＭＦ（５ｍｌ）中のＰｄ（ＯＡｃ）₂（２７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ₃（６２ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の溶液を５０℃で３０分間攪拌し、その後２−（トリブチルスタンニル）チアゾール（２６０ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）を加え、その後（Ｓ_p）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（４）（３４０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を８５℃で３時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ（３：９７および５：９）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィによって精製した。収率：１６０ｍｇ（４７％）の黄褐色固体。ＭＳ（エレクトロスプレー）６０２．２。

（Ｒ_p）−８−（２−チアゾリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸アンモニウム塩（７ｍ）
ＴＨＦ（０．２９ｍｌ、０．２９ｍｍｏｌ）中のｔ−ＢｕＯＫの１．０Ｍ溶液をＴＨＦ（３ｍｌ）中の（Ｓ_p）−８−（２−チアゾリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニル−ホスホラミデート（５ｍ）（１３６ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液に室温で加えた。混合物を１時間攪拌した後、二硫化炭素（０．０４ｍｌ、０．７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をさらに３時間室温で攪拌した。溶媒の体積を約１ｍｌに減らした後、ヘキサン（３０ｍｌ）を加えた。形成した沈殿物をろ過によって単離した。粗生成物をＤＭＦ（２ｍｌ）に溶かし、ＮＨ₄Ｆ（５２ｍｇ、１．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物をアルゴン下で４０℃において４８時間攪拌した。溶媒を蒸発させて除去し、粗生成物をｉＰｒＯＨ：ＥｔＯＡｃ：Ｈ₂Ｏ：ＮＨ₃（水溶液）（７：７：１：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィによって精製した。収率 ５４ｍｇ（５３％）の白色固体。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）Ｍ ４２７．００４７。Ｃ₁₃Ｈ₁₂Ｎ₆Ｏ₅ＰＳ₂に対する計算値：４２７．００４８。

（Ｒ_p）−８−（５−メチル−２−フリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩（８ｅ）
乾燥ＴＨＦ（７ｍｌ）中の１Ｍナトリウムｔ−ブトキシド（０．６０ｍｌ）を（Ｓｐ）−８−（５−メチル−２−フリル）−アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｅ）（０．３５０ｇ、０．５５２ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴンガス下で加えた。混合物を３０分間攪拌した後、二硫化炭素（０．１２６ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）を加え、攪拌を３時間続けた。反応混合物をヘキサンにゆっくりと加え、沈殿物をろ過して取り出し、水（１０ｍｌ）に溶かした。１ＭのＨＣｌをｐＨ３になるまで激しく攪拌しながら氷冷した反応混合物に滴下して加えた。沈殿したチオ酸６ｅをろ過して取り出し、冷水で洗浄し、高真空下で乾燥させた。０．２７０ｇの黄色固体を生じた。次いで、酸（６ｅ）をＤＭＦ（３ｍｌ）中にアルゴン下で溶かし、フッ化アンモニウム（０．０５６ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３日間４０℃で攪拌した。このとき、過剰のトリブチルアミンを加えた。すべての揮発性物質を減圧下で蒸留して除去し、残留物質をジクロロメタン中１％のトリブチルアミンおよび５％のメタノールを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。チオエート生成物は遊離トリブチルアミンを含んでいた。ヘキサンで繰返し洗浄して遊離トリブチルアミンを除去した。収率：０．２７６ｇ（８２％）。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ ４２４．０４８８。Ｃ₁₅Ｈ₁₅Ｎ₅Ｏ₆ＰＳ^-に対する計算値：４２４．０４８７。

（Ｒ_p）−８−（５−メトキシ−２−フリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩（８ｆ）
乾燥ＴＨＦ（６ｍｌ）中の１Ｍナトリウムｔ−ブトキシド（０．５０ｍｌ）を（Ｓｐ）−８−（５−メトキシ−２−フリル）−アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｆ）（０．２８０ｇ、０．４５６ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴンガス下で加えた。混合物を３０分間攪拌した後、二硫化炭素（０．１０４ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を加え、攪拌を３時間続けた。反応混合物をヘキサンにゆっくりと加え、沈殿物をろ過して取り出し、水（１０ｍｌ）に溶かした。１ＭのＨＣｌをｐＨ３になるまで激しく攪拌しながら氷冷した反応混合物に滴下して加えた。沈殿したチオ酸６ｆをろ過して取り出し、冷水で洗浄し、高真空下で乾燥させた。０．１２７ｇの茶色固体を生じた。チオ酸６ｆを乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）にアルゴン下で溶かし、フッ化アンモニウム（０．０３７ｇ、１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を３日間４０℃で攪拌した後、過剰のトリブチルアミンを加えた。減圧下で蒸発させてすべての揮発性物質を除去した。残留物質をジクロロメタン中１％のトリブチルアミンおよび５％のメタノールを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。チオエート生成物中に存在する遊離トリブチルアミンをヘキサンで繰返し洗浄して除去した。収率：０．１０９ｇ（２９％）。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ ４４０．０４２７。Ｃ₁₅Ｈ₁₅Ｎ₅Ｏ₇ＰＳ^-に対する計算値：４４０．０４３６。

（Ｒ_p）−８−（２−ヒドロキシメチル−５−フリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩（８ｇ）
１Ｍナトリウムｔ−ブトキシド（０．６２ｍｌ）を乾燥ＴＨＦ（７ｍｌ）中の（Ｓｐ）−８−（５−ｔ−ブチルジメチルシリルオキシメチル）−２−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｇ）（０．４１０ｇ、０．５６３ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で加えた。混合物を３０分間攪拌した後、二硫化炭素（０．１２８ｇ、１．６９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を３時間攪拌した後、滴下してヘキサンに加えた。形成した沈殿物を再度水に溶かした。１ＭのＨＣｌをｐＨ３になるまで氷冷の激しく攪拌した水溶液にゆっくりと加え、チオ酸６ｇを沈殿させ、これをろ過して取り出し、冷水で洗浄し、高真空下で乾燥させ、チオ酸を茶色固体（０．２９４ｇ）として得た。生成物を乾燥ＤＭＦ（３ｍｌ）にアルゴン下で再溶解し、フッ化アンモニウム（０．０９７ｇ、２．６３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４０℃で３日間攪拌した後、過剰のトリブチルアミンを加えた。減圧下で蒸留してすべての揮発性物質を除去し、残留物質をジクロロメタン中１％のトリブチルアミンおよび５％のメタノールを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。生成物はいくらかの遊離トリブチルアミンを含んでいた。遊離トリブチルアミンをヘキサンで繰返し洗浄して除去した。収率 ０．２４３ｇ（６９％）。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ ４４０．０４３。Ｃ₁₅Ｈ₁₅Ｎ₅Ｏ₇ＰＳ^-に対する計算値：４４０．０４３６。

（Ｒｐ）−８−（２−ベンゾフリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩（８ｈ）
１Ｍナトリウムｔ−ブトキシド（０．６９ｍｌ）を、乾燥ＴＨＦ（８ｍｌ）中の（Ｓｐ）−８−（２−ベンゾフリル）−アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｈ）（０．４００ｇ、０．６３１ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で加えた。混合物を３０分間攪拌した後、二硫化炭素（０．１４３ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を加え、攪拌を３時間続けた。反応混合物をヘキサンにゆっくりと加え、沈殿物をろ過して取り出し、水（４ｍｌ）に溶かした。１ＭのＨＣｌをｐＨ３になるまで氷冷の激しく攪拌した水溶液にゆっくりと加えて、チオ酸６ｈを沈殿させ、ろ過して取り出し、冷水で洗浄し、高真空下で乾燥させ、茶色固体（０．２２１ｇ）を得た。生成物を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）にアルゴン下で再溶解し、フッ化アンモニウム（０．０４３ｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を４０℃で３日間攪拌し、過剰のトリブチルアミンを加えた。揮発性物質を減圧下で蒸留によって除去し、残留物質をジクロロメタン中１％のトリブチルアミンおよび５％のメタノールを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。生成物をヘキサンで繰返し洗浄して遊離トリブチルアミンを除去した。収率 ０．１５５ｇ（３８％）。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ ４６０．０４６１。Ｃ₁₈Ｈ₁₅Ｎ₅Ｏ₆ＰＳ^-に対する計算値：４６０．０４８７。

（Ｒ_P）−８−（２−Ｎ−メチルピロリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩（８ｉ）
乾燥ＴＨＦ（６ｍｌ）中の（Ｓ_P）−８−（２−Ｎ−メチルピロリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニル−ホスホラミデート（５ｉ）（０．３００ｇ、０．５ｍｍｏｌ）、およびカリウムｔ−ブトキシド（ＴＨＦ中１Ｍ、０．６２ｍｌ、０．６２ｍｍｏｌ）の混合物をアルゴン下で室温において１時間攪拌した後、二硫化炭素（０．０９ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間攪拌した後、ほとんどの溶媒を減圧下で蒸留して除去した。ジエチルエーテルを加えると、固体沈殿物を得た。固体沈殿物を水（９ｍｌ）に溶かし、０℃で１．２ＭのＨＣｌ（１．２５ｍｌ）を加えた。沈殿物は、シリル化（Ｒ_P）−８−（２−Ｎ−メチルピロリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸６ｉであった。生成物を真空中で十分に乾燥させた後、固体（０．１７０ｇ、０．３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．５ｍｌ）にアルゴン下で溶かし、フッ化アンモニウム（０．０７５ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で５日間攪拌した後、トリブチルアミン（０．１１１ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を加えて透明な溶液を生成した。揮発性物質を減圧下で除去し、残留物をヘキサンで粉砕してトリブチルアミンがあれば除去し、残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＣＨ₃ＯＨ：ＮＢｕ₃（１００：１０：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。いくらかの遊離トリブチルアミンを含むアンモニウム塩をＣＨ₂Ｃｌ₂中に溶かし、ヘキサンで沈殿させてさらに精製した。収率 ０．１０５ｇ（５ｉから３４％）の白色固体。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ−ＮＨＢｕ₃４２３．０６４７。Ｃ₂₇Ｈ₄₄Ｎ₇Ｏ₅ＰＳ−ＮＨ（Ｃ₄Ｈ₉）₃に対する計算値：４２３．０６４６。

（Ｒ_P）−８−（３−ピリジニル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩（８ｊ）
ＴＨＦ（６ｍｌ）中の（Ｓ_P）−８−（３−ピリジニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｊ）（０．３００ｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびカリウムｔ−ブトキシド（ＴＨＦ中１Ｍ、０．６２ｍｌ、０．６２ｍｍｏｌ）の混合物をアルゴン下で室温において１時間攪拌した後、二硫化炭素（０．０９ｍｌ、１．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間攪拌した。溶媒を部分的に減圧下で除去し、沈殿が完了するまでヘキサンを加えた。沈殿物を水（９ｍｌ）に再溶解し、０℃で１．２ＭのＨＣｌ（１．２５ｍｌ）を加えた。沈殿したシリル化（Ｒ_P）−８−（３−ピリジニル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸６ｊをろ過によって収集し、高真空において一晩乾燥させた。この物質（０．１８０ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）のほとんどを乾燥ＤＭＦ（１．５ｍｌ）にアルゴン下で溶かし、フッ化アンモニウム（０．０７５ｇ、２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で５日間攪拌し、ろ過した。トリブチルアミン（０．１１１ｇ、０．６ｍｍｏｌ）をろ過液に加えた後、減圧下で蒸発させた。残留物質をヘキサンで粉砕して過剰のトリブチルアミンを除去し、ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＣＨ₃ＯＨ：ＮＢｕ₃（１００：１０：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。微量のトリブチルアミンを含むアンモニウム塩を、ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶かし、ジエチルエーテルを加えて沈殿させることによってさらに精製した。収率 ０．１００ｇ（５ｊから３４％）の白色固体。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ−ＮＨＢｕ₃ ４２１．０４９２。Ｃ₂₇Ｈ₄₂Ｎ₇Ｏ₅ＰＳ−ＮＨ（Ｃ₄Ｈ₉）₃に対する計算値：４２１．０４８９。

（Ｒ_P）−８−フェニルアデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩（８ｋ）
ＴＨＦ（６ｍｌ）中の（Ｓ_P）−８−（フェニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｋ）（０．２５０ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）およびカリウムｔ−ブトキシド（０．５２ｍｌ、０．５２ｍｍｏｌ、１Ｍ）の混合物をアルゴン下で室温において１時間攪拌した後、二硫化炭素（０．０８ｍｌ、１．２６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間攪拌し、ほとんどの溶媒を蒸発させて除去した。沈殿が完了するまでヘキサンを残留物に加えた。固体沈殿物を水（９ｍｌ）に溶かし、０℃で１．２ＭのＨＣｌ（１．０５ｍｌ）を加えた。生成物は、シリル化（Ｒ_P）−８−フェニルアデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸であった。この物質（０．２１０ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の一部を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）にアルゴン下で溶かし、フッ化アンモニウム（０．１００ｇ、２．７３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で５日間攪拌した。反応混合物をろ過し、ろ過液にトリブチルアミン（０．１４４ｇ、０．７８ｍｍｏｌ）を加えた。揮発性物質を減圧下で蒸留して除去し、残留物質をヘキサンで粉砕して遊離トリブチルアミンがあれば除去した。残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＣＨ₃ＯＨ：ＮＢｕ₃（１００：１０：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。トリブチルアミンを含むアンモニウム塩を、ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶かし、ヘキサンで沈殿させることによってさらに精製した。収率 ０．１００ｇ（５ｋから３９％）の白色固体。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ−ＮＨＢｕ₃４２０．０５３４。Ｃ₂₈Ｈ₄₃Ｎ₆Ｏ₅ＰＳ−ＮＨ（Ｃ₄Ｈ₉）₃に対する計算値：４２０．０５３７。

（Ｒ_P）−８−（４−メトキシフェニル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩（８ｌ）
ＴＨＦ（６ｍｌ）中の（Ｒ_P）−８−（４−メトキシフェニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−フェニルホスホラミデート（５ｌ）（０．３００ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）およびカリウムｔ−ブトキシド（ＴＨＦ中１Ｍ、０．６ｍｌ、０．６ｍｍｏｌ）の混合物をアルゴン下で室温において１時間攪拌した後、二硫化炭素（０．０９ｍｌ、１．４４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３時間攪拌した。このとき、ほとんどの溶媒は減圧下で蒸留して除去し、沈殿が完了するまでジエチルエーテルを加えた。沈殿物を水（９ｍｌ）に再溶解し、０℃で１．２ＭのＨＣｌ（１．２ｍｌ）を加えた。シリル化（Ｒ_P）−８−（４−メトキシフェニルアデノシン）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸６ｌをろ過によって収集し、一晩高真空において乾燥させた。乾燥させた生成物（０．２５０ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の一部を乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）にアルゴン下で溶かし、フッ化アンモニウム（０．１０４ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で５日間攪拌し、ろ過した。トリブチルアミン（０．１６３ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）をろ過液に加え、溶媒を減圧下で除去した。残留物質をヘキサンで抽出して、過剰のトリブチルアミンがあれば除去し、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＣＨ₃ＯＨ：ＮＢｕ₃（１００：１０：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。いくらかの遊離トリブチルアミンを含むアンモニウム塩を、ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶かし、ヘキサンで沈殿させることによって、さらに精製した。収率 ０．１３０ｇ（５ｌから４２％）の白色固体。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ−ＮＨＢｕ₃ ４５０．０６４８。Ｃ₂₉Ｈ₄₅Ｎ₆Ｏ₆ＰＳ−ＮＨ（Ｃ₄Ｈ₉）₃に対する計算値：４５０．０６４２。

（Ｒ_P）−８−（２−Ｎ−メチルピロリル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸ナトリウム塩（９ｉ）
（Ｒ_P）−８−（Ｎ−メチル−２−ピロリル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸アンモニウム塩（５ｉ）（０．１００ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ中０．１ＭのＮａＯＨ（１．７ｍｌ）に溶かした。ジエチルエーテルを加えてナトリウム塩を沈殿させ、ろ過によって収集した。収率 ０．０６０ｇ（８４％）の白色固体物質。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ−Ｎａ ４２３．０６３０。Ｃ₁₅Ｈ₁₆Ｎ₆Ｏ₅ＰＳ−Ｎａに対する計算値：４２３．０６４６。

（Ｒ_P）−８−（３−ピリジニル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸ナトリウム塩（９ｊ）
（Ｒ_P）−８−（３−ピリジニル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩（８ｊ）（０．１００ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ中０．１ＭのＮａＯＨ（１．７ｍｌ）に溶かした。ジエチルエーテルを加えてナトリウム塩を沈殿させた。収率 ０．０５７ｇ（８０％）の白色固体物質。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ−Ｎａ ４２１．０４９５。Ｃ₁₅Ｈ₁₄Ｎ₆Ｏ₅ＰＳ−Ｎａに対する計算値：４２１．０４８９。

（Ｒ_P）−８−フェニルアデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸ナトリウム塩（９ｋ）
（Ｒ_P）−８−フェニルアデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩（８ｋ）（０．１００ｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ中０．１ＭのＮａＯＨ（１．７ｍｌ）に溶かした。ジエチルエーテルを加えてナトリウム塩を沈殿させた。収率 ０．０５３ｇ（７５％）の白色固体。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ−Ｎａ ４２０．０５２９。Ｃ₁₆Ｈ₁₅Ｎ₅Ｏ₅ＰＳ−Ｎａに対する計算値：４２０．０５３７．

（Ｒ_P）−８−（４−メトキシフェニル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸ナトリウム塩（９ｌ）
（Ｒ_P）−８−（４−メトキシフェニル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩（８ｌ）（０．０９０ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ中０．１ＭのＮａＯＨ（１．５ｍｌ）に溶かした。ジエチルエーテルを加えてナトリウム塩を沈殿させた。収率 ０．０５０ｇ（７５％）の白色固体。ＨＲＭＳ（エレクトロスプレー）：Ｍ−Ｎａ ４５０．０６４８。Ｃ₁₇Ｈ₁₇Ｎ₅Ｏ₆ＰＳ−Ｎａに対する計算値：４５０．０６４２。

（Ｓ_p）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−ベンジルホスホラミデート（１０）
ＣＨ₂Ｃｌ₂（５ｍｌ）中の８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチル−ジメチルシリル）−３’，５’−環状リン酸トリブチルアンモニウム塩（２）（２．１４ｇ、３．０ｍｍｏｌ）の溶液をＴＨＦ（１５ｍｌ）中の塩化オキサリル（０．３１ｍｌ、３．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（０．２８ｍｌ、３．６ｍｍｏｌ）の溶液に０℃で滴下して加えた。３０分後ベンジルアミン（１５ｍｍｏｌ、１．６４ｍｌ）を加え、混合物を１０分間０℃でおよび２時間室温で攪拌し、ＣＨＣｌ₃（５０ｍｌ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ₃（水溶液）（２×１５ｍｌ）で洗浄した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、溶媒を蒸留して除去し、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ（３：９７および５：９５）を使用したフラッシュクロマトグラフィによって精製した。収率 １．２８ｇ（６７％）の白色固体。ＭＳ（エレクトロスプレー）：６１１．２／６１３．２。

（Ｓ_p）−８−（２−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−ベンジルホスホラミデート（１１ａ）
ＤＭＦ（８ｍｌ）中のＰｄ（ＯＡｃ）₂（６０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ₃（１４２ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン下で５０℃において１５分間攪拌した後、２−（トリ−ｎ−ブチルスタンニル）フラン（０．６３ｍｌ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた。その後、ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の（Ｓ_p）−８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−ベンジルホスホラミデート（１０）（８００ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。混合物を８５℃で２．５時間攪拌した。溶媒を蒸留して除去し、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ（３：９７および５：９５）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィで精製した。収率 ６３６ｍｇ（８０％）の白色固体。ＭＳ（エレクトロスプレー）：５９９．２。

（Ｒ_p）−８−（２−フリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸アンモニウム塩（７ａ）
ヘキサン中のＢｕＬｉの１．６Ｍ溶液（０．２５ｍｌ、０．３９ｍｍｏｌ）を、ＴＨＦ（４ｍｌ）中の（Ｓ_p）−８−（２−フリル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−ベンジルホスホラミデート（１１ａ）（２００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の溶液に−７８℃で加えた。混合物を１０分間この温度で攪拌した後、二硫化炭素（０．０６ｍｌ、１．０ｍｍｏｌ）を加え、冷却槽を除去した。混合物を３時間室温で攪拌した。溶媒の体積を約１ｍｌに減らした後、ヘキサン（４０ｍｌ）を加えた。沈殿物を収集し、乾燥ＤＭＦ（２ｍｌ）に溶かし、フッ化アンモニウム（７５ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をアルゴン下で４０℃において４８時間攪拌した。溶媒を蒸留して除去し、粗生成物をｉＰｒＯＨ：ＥｔＯＡｃ：Ｈ₂Ｏ：ＮＨ₃（水溶液）（７：７：１：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィで精製した。収率：１０６ｍｇ（７４％）の白色固体。分光データは従来に記録されるとおり。

Ｓ−４−（イソブチルオキシ）ベンジル（Ｒ_p）−８−（３−フリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオエート（１２）
（Ｒ_p）−８−（３−フリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸アンモニウム塩（７ｃ）（０．２ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍｌ）に溶かし、トリエチルアミン（０．３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を真空下で蒸発させると、（Ｒ_p）−８−（３−フリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリエチルアンモニウム塩が残った。この生成物（７０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の一部およびＤＭＦ（２ｍＬ）中のヨウ化４−（イソブチリルオキシ）ベンジル（７３ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を室温で４８時間攪拌した。溶媒を蒸発させて除去し、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ（３：９７および５：９５）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィで精製した。収率：３８ｍｇ（４０％）の白色固体。ＭＳ（エレクトロスプレー）：５８８．２。

（Ｒ_P）−８−（４−フルオロフェニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−ベンジルホスホラミデート １１ｍ
ＮＭＰ（４ｍｌ）中のＰｄ（ＯＡｃ）₂（０．０３７ｇ、０．１６３ｍｍｏｌ）およびＰＰｈ₃（０．０９１ｇ、０．３４８ｍｍｏｌ）の混合物を溶液が暗赤色に変るまで５０℃で攪拌した。ＮＭＰ（２ｍｌ）中の８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−ベンジルホスホラミデート（１０）（０．５００ｇ、０．８１ｍｍｏｌ）、および１−トリブチルスタンニル−４−フルオロベンゼン（０．６２３ｇ、１．６２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を１３０〜１３５℃で８時間攪拌し、放置して室温に冷却し、ＮＭＰを減圧下で除去し、残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂中７．５％のＭｅＯＨを使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。生成物は、微量の有機スズ残留物を含む白色固体物質であった。ＣＨ₂Ｃｌ₂に生成物を溶かし、ヘキサンを加えて再沈殿させて有機スズ残留物を除去した。収率 ０．２４８ｇ（４９％）。

（Ｒ_P）−８−（４−フルオロフェニル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩 ８ｍ
ヘキサン（０．２７ｍｌ、０．４３ｍｍｏｌ）中の１．６ＭのｎＢｕＬｉをＴＨＦ（６ｍｌ）中の（Ｒ_P）−８−（４−フルオロフェニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−ベンジルホスホラミデート（１１ｍ）（０．２５０ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の溶液に−７８℃で加えた。混合物をアルゴン下で−７８℃において１０分間攪拌した後、ＣＳ₂（０．０８ｍｌ、１．２４ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を−７８℃で２０分間および室温で２時間攪拌した。ほとんど溶媒を蒸留して除去し、沈殿が完了するまでヘキサンを加えた。沈殿物を水（９ｍｌ）に溶かし、０℃で１．２ＭのＨＣｌ（１．１ｍｌ）を加えた。（Ｒ_P）−８−（４−フルオロフェニル）−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸（６ｍ）が沈殿した。乾燥させたチオ酸（０．１５０ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（１．５ｍｌ）に溶かし、フッ化アンモニウム（０．０７０ｇ、１．９ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で５日間攪拌した。反応混合物をろ過し、溶液が透明になるまでトリブチルアミンをろ過液に加えた。ろ過液から揮発性物質を蒸留して除去し、残留物質をヘキサンで抽出して過剰のトリブチルアミンを除去し、残留物質をＣＨ₂Ｃｌ₂：ＣＨ₃ＯＨ：ＮＢｕ₃（１００：１０：１）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。トリブチルアミンを含むアンモニウム塩を、ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶かし、ヘキサンを加えて再沈殿させてさらに精製した。収率 ０．０６５ｇ（１１ｍからの３８％）の白色固体物質。

（Ｒ_P）−８−（４−フルオロフェニル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸ナトリウム塩（９ｍ）
（Ｒ_P）−８−（４−フルオロフェニル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸トリブチルアンモニウム塩（８ｍ）（０．０５０ｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ中０．１ＭのＮａＯＨ（１．１ｍｌ）に溶かした。ヘキサンを加えてナトリウム塩を沈殿させた。収率 ０．０２７ｇ（５１％）の白色固体物質。

（Ｓ_p）８−（２−チエニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−ベンジルホスホラミデート（１１ｂ）
ＴＨＦ（２ｍｌ）中の塩化２−チエニル亜鉛（０．３ｍｌ、１Ｍ、０．３００ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＨＦ（２ｍｌ）中の（Ｓ）８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−ベンジルホスホラミデート（１０）（０．１２２ｇ、０．２００ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．０４６ｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で加えた。反応混合物をおだやかな還流下に３時間加熱した。塩化アンモニウムの飽和水溶液（３ｍｌ）およびジクロロメタン（１０ｍｌ）を冷却した反応混合物に加え、有機相を飽和ブライン（２×３ｍｌ）で抽出し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、溶媒を蒸留して除去した。残留物質をＭｅＯＨ：ＣＨ₂Ｃｌ₂（１：２０）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ０．０５９ｇ（４８％）。

その後の反応（例えば、二硫化炭素および強塩基によるチア化ならびに脱シリル化）によりチオ酸７ｂが生じる。

経口投与のためのカプセルの調製
（Ｒ_p）−８−（２−フリル）アデノシン−３’，５’−環状ホスホロチオ酸アンモニウム塩（実施例７３） − ５０ｍｇ
ラクトース − 適量
粉末を混合し、カプセル（カプセルサイズＯ）に充填した。

注射調製物の調製
（Ｒｐ）−８−（４−フルオロフェニル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸ナトリウム塩（実施例７７） − ２５ｍｇ
塩化ナトリウム − 適量
精製水 − ５ｍｌまで
この化合物および塩化ナトリウムを水に溶かして（Ｒｐ）−８−（４−フルオロフェニル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸ナトリウム塩の等張溶液を調製した。溶液を５ｍｌバイアルに充填し、オートクレーブした。生成物は、１ｍｌ当たり５ｍｇの（Ｒｐ）−８−（４−フルオロフェニル）−３’，５’−環状ホスホロチオ酸ナトリウム塩を含む。

インビトロでのＰＫＡタイプＩα酵素活性化アッセイ（クック（Ｃｏｏｋ）キナーゼアッセイ）における新規なＲｐ−ｃＡＭＰＳ類似体のＩＣ₅₀値の決定
以下の分析の目的は、新規なＲｐ−ｃＡＭＰＳ類似体をｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼのタイプＩ（ＲＩα／Ｃα）ホロ酵素複合体のアンタゴニストまたはアゴニストとして分類し、クックによる分光測光アッセイに基づいた抑制または活性化アッセイを使用してＥＣ₅₀値を決定することである。

アンタゴニストおよびアゴニストについてのＲｐ−ｃＡＭＰＳ類似体スクリーニング：
第一に、新規なＲｐ−ｃＡＭＰＳ類似体を１０ｎＭのＲＩαホロ酵素および各Ｒｐ−ｃＡＭＰＳ類似体の１０μＭを使用した活性化アッセイにおいてスクリーニングして、活性化についてテストした。Ｒｐ−ｃＡＭＰＳ類似体のアンタゴニスト性質を詳細に特徴づけるために抑制アッセイを使用した。１μＭのＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳを加えることによって（３分間のアッセイ混合）、１０ｎＭのＲＩαホロ酵素を部分的に（８０％）活性化した。次いで、Ｒｐ−ｃＡＭＰＳアンタゴニストを加えることによって（濃度を増加、５分間のインキュベーション時間の後、ケンプチド（ｋｅｍｐｔｉｄｅ）でアッセイを開始）、ホロ酵素を再構成する。次いで、アンタゴニストは、Ｓｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳによるＰＫＡの結合および活性化を競合的アンタゴニズムにより妨害し、その結果キナーゼ活性が低下する。

Ｒｐ−ｃＡＭＰＳ類似体対ＰＫＡタイプＩαについてのＥＣ₅₀の決定：
アンタゴニストに対するＥＣ₅₀値を、クックによる分光測光アッセイおよびｐＭからｍＭの範囲のＲｐ−ｃＡＭＰＳ類似体の異なる濃度に基づく抑制アッセイを使用して決定した。１類似体当たり少なくとも１０回の二重測定を、１μＭのＳｐ−８−Ｂｒ ｃＡＭＰＳ（複合体の８０％活性化）における部分的に活性化されたＲＩαホロ酵素（１０ｎＭ）を使用して行った。５分間の前インキュベーションを行った後、ケプチドを加えてアンタゴニスト性質を有する化合物に対してホロ酵素複合体の再構成を可能にした。新規な化合物をテストにおいてＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳと比較した。

ｃＡＭＰを用いたＲＩαホロ酵素の活性化定数を決定した。アッセイ混合物における１０ｎＭのＲＩαホロ酵素によるｃＡＭＰの濃度を増加する３分間の前インキュベーションの後、２００μＭケプチドを加えて反応を開始した。ＯＤ₃₄₀を１分間監視し、傾き（ΔＯＤ₃₄₀／分）を、活性化された触媒サブユニットの相対活性に対する直接的な相関としてプロットした。ＥＣ₅₀は８８ｎＭであった。

Ｒｐ−８−（２−フリル）−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−（２−フリル）−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系における３つの実験において２３８、３３７および３６０ｎＭであった。

Ｒｐ−８−（２−チエニル）−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−（２−チエニル）−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において４４９ｎＭであった。

Ｒｐ−８−（３−フリル）−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−（３−フリル）−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において６０７ｎＭであった。

Ｒｐ−８−（３−チエニル）−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−（３−チエニル）−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において７３９ｎＭであった。

Ｒｐ−８−フェニル−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−フェニル−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において１０５８μＭであった。

Ｒｐ−８−アセチル−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−アセチル−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において１．５８μＭであった。

Ｒｐ−８−エトキシビニル−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−エトキシビニル−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において２．４μＭであった。

Ｒｐ−８−（２−Ｂｒ−５−フリル）−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−（２−Ｂｒ−５−フリル）−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において２．９μＭであった。

Ｒｐ−８−エチル−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転。Ｒｐ−８−エチル−ｃＡＭＰＳ−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において６．１３μＭであった。

Ｒｐ−８−メチル−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−Ｍｅ−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において８．７６μＭであった。

従来公知化合物Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において１２０２ｎＭであり、およびいくつかの実験（ｎ＝３）の平均は１３５０ｎＭであった。

Ｒｐ−８−（３−ピロル）−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−（３−ｐｙｒ）−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において３．６１μＭであった。

Ｒｐ−８−（５−メチル−２−フリル）−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−（５−Ｍｅ−２−フリル）−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において１．１６μＭであった。

Ｒｐ−８−ベンゾフリル−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−Ｍｅ−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において２．７８μＭであった。

Ｒｐ−８−（５−ヒドロキシメチル−２−フリル）−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−（５−ＭｅＯＨ−２−フリル）−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において１．９８μＭであった。

インビトロでＰＫＡタイプＩＩα酵素活性化アッセイ（クックキナーゼアッセイ）における新規なＲｐ−ｃＡＭＰＳ類似体のＩＣ₅₀値の決定
好ましい薬物標的（ＰＫＡタイプＩα）対、免疫刺激のためにＰＫＡタイプＩαを標的にする際に阻害されるべきでない他のＰＫＡ酵素についてのアンタゴニスト化合物の選択性プロファイルを特徴づけるために、いくつかの選択された化合物対ＰＫＡタイプＩＩαについてのＥＣ₅₀値を、クックによる分光測光アッセイに基づいた抑制アッセイを使用して決定した。

Ｒｐ−ｃＡＭＰＳ類似体対ＰＫＡタイプＩＩαについてのＥＣ₅₀決定：
１類似体当たり少なくとも１０回の二重測定を、１μＭのＳｐ−８−Ｂｒ ｃＡＭＰＳ（複合体の７５％活性化）における部分的に活性化されたＲＩＩαホロ酵素（１０ｎＭ）を使用して行った。５分間の前インキュベーションを行った後、ケプチドを加えてホロ酵素複合体の再構成を行った。

アゴニストＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳを用いたホロＲＩＩαの活性化定数を決定した。アッセイ混合物における１０ｎＭのホロＲＩＩαによるｃＡＭＰの濃度を増加する３分間の前インキュベーションの後、２００μＭケプチドを加えて反応を開始した。ＯＤ₃₄₀を１分間監視し、傾き（ΔＯＤ₃₄₀／分）を、活性化された触媒サブユニットの相対活性に対する直接的な相関としてプロットした。ＥＣ₅₀は２９４ｎＭであった。

Ｒｐ−８−（２−フリル）−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡタイプＩＩ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−（２−フリル）−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系における２つの実験において１１．６および１６．７μＭであった。

Ｒｐ−８−フェニル−ｃＡＭＰＳによるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介ＰＫＡタイプＩＩ活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−フェニル−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において４８．６μＭであった。

従来公知化合物であるＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳによるＰＫＡタイプＩＩのＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ−媒介活性化の反転を調べた。Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳの半値アンタゴニスト効果（ＩＣ₅₀またはＥＣ₅₀）は、このテスト系において１４．９μＭであった。

インビトロにおける競合的リガンド結合アッセイ（ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイ）における、ＰＫＡタイプＩαに結合する新規なＲｐ−ｃＡＭＰＳ類似体のＥＣ₅₀値の決定
実験の目的は、ビアコア技術に基づいた表面結合および競合アッセイにおいてｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼのタイプＩ（ＲＩα／Ｃα）ホロ酵素複合体のアンタゴニストとして作用するｃＡＭＰ類似体の性質を評価し、酵素活性アッセイに依存しないこのリガンド結合方法によってアンタゴニスト効果に関するＥＣ₅₀値を決定することである。

ホロＲＩαのアンタゴニストを用いた表面競合アッセイ：
ビアコア表面競合アッセイを、クックによるアッセイに基づく活性に対する別の方法として設計した。このアッセイは、ホロ酵素複合体内の異なるｃＡＭＰ−結合領域に特異的に結合するｃＡＭＰ類似体に対するＥＣ₅₀値を決定するために、キナーゼ活性に依存しないアンタゴニスト結合の測定を可能にする。したがって、活性または結合のいずれかに基づく両方のアッセイは、アンタゴニスト結合がどのようにホロ酵素複合体の活性化を妨げるかというメカニズムについての補完的な情報を与える。

これらの研究に対して、アゴニストセンサ表面（すなわち８−ＡＨＡ ｃＡＭＰ）上への調節サブユニットの捕捉だけでなく、アンタゴニストリガンド（すなわち、Ｒｐ−８ＡＨＡ ｃＡＭＰＳ）を介して方向づけられるホロ酵素複合体部位全体を固定する必要がある。これにより、ホロ酵素複合体または調節サブユニットの単独部位のいずれかに対するアンタゴニスト結合についてのＥＣ₅₀値を決定することが容易になる。ホロ酵素複合体は、チップ表面に注入される前に異なる量のアンタゴニストを用いてインキュベートされる。アンタゴニストの結合によりアンタゴニストに対するＥＣ₅₀値を与えるチップ表面（表面競合）上の結合信号が低下する。しかし、ホロ複合体がリガンドの部分的なアゴニスト性質のためにリガンド表面に結合した際に解離すると、得られる結合信号は期待される値よりも低くなり、解離は観察されるアンタゴニストに対するＥＣ₅₀値を変更し得る。したがって、種々の実験を行って、ホロＲＩαまたはＲＩαのみが会合する間にＲｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳまたは８−ＡＨＡ ｃＡＭＰ表面に結合するかどうかを確認する必要があった。

その理由のために、ホロＲＩαを異なる２つの異なる条件を使用して２つの異なる表面（８−ＡＨＡ ｃＡＭＰおよびＲｐ ８ＡＨＡ−ｃＡＭＰＳ表面）上の結合についてテストした。ＡＴＰおよびＭｇの存在下では調節および触媒サブユニットは強固に結合しホロ酵素複合体を形成するが、Ｍｇイオンをキレート化するＥＤＴＡの存在下では親和性は著しく低くなり、複合体の解離が容易になる。１０ｎＭのＲＩαホロ酵素溶液の会合の間、Ｒｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳ表面上で９００ＲＵの応答信号が達成された。８−ＡＨＡ ｃＡＭＰ表面上ではこの信号の半分に達しない。このことは、ホロ酵素のＲＩαサブユニットだけが８−ＡＨＡ ｃＡＭＰ表面に結合されるか、またはホロ酵素の結合中にチップ表面に結合されたＲＩαサブユニットだけを残して複合体が解離することを示す。注入前に１０ｍＭのＥＤＴＡをホロ酵素に加えて複合体の解離を容易にした場合、２５０ＲＵだけがＲｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳおよび８−ＡＨＡ ｃＡＭＰ表面の両方に結合した。これは、ＲＩαサブユニットだけが結合したためであり得る。過剰のアンタゴニスト（１０μＭのＲｐ−８−Ｂｒ ｃＡＭＰＳまたは１０μＭのＲｐ−８−（２−フリル）ｃＡＭＰＳ）をホロ酵素に加えた場合、ホロ複合体の結合はＲｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳ表面において完全に妨害されるが、８−ＡＨＡ ｃＡＭＰ表面への結合には影響が見られなかった。

アンタゴニストのＥＣ₅₀値を決定するために、異なる濃度のアンタゴニストを１０ｎＭのホロＲＩαとともにインキュベートし、２つの検出表面に注入した。Ｒｐ−８−（２フリル）ｃＡＭＰＳおよびＲｐ−８−Ｂｒ ｃＡＭＰＳの競合効果はＲｐ−８ＡＨＡ ｃＡＭＰＳ表面において検出可能であったが、８−ＡＨＡ ｃＡＭＰへの結合はいずれの濃度のアンタゴニストによっても影響されなかった。得られたＥＣ₅₀をＲｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳ表面上で決定した。Ｒｐ−８−（２−フリル）ｃＡＭＰＳについてＥＣ₅₀は３７７ｎＭであり、Ｒｐ−８−Ｂｒ ｃＡＭＰＳについてＥＣ₅₀は２．９μＭであり、これらのデータは、従来の研究においてクックアッセイにより推定されたＥＣ₅₀値（Ｒｐ−８−（２−フリル）ｃＡＭＰＳについてＥＣ₅₀＝３４９ｎＭおよびＲｐ−８−Ｂｒ ｃＡＭＰＳについてＥＣ₅₀＝１．３μＭ）と同様である。Ｒｐ−８−（３フリル）ｃＡＭＰＳを同じ方法で分析したところ、ＥＣ₅₀は７４３ｎＭ（クックアッセイ ６０７ｎＭ）であった。したがって、ビアコア上のリガンド結合アンタゴニストアッセイは活性アッセイに基づくデータと同等の結果を与えると結論できる。

１０ｎＭのホロＲＩα、１０ｍＭのＥＤＴＡ中のホロＲＩα、および１０μＭのアンタゴニストＲｐ−８−Ｂｒ ｃＡＭＰＳまたはＲｐ−８−２−フリルｃＡＭＰＳの存在下でのホロＲＩαを用いたＲｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳおよび８−ＡＨＡ ｃＡＭＰ表面についての競合結合アッセイを行った。１０μｌ／分の流量での５分の会合および解離時間を記録した。

Ｒｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳおよび８−ＡＨＡ ｃＡＭＰセンサ表面に結合した３．９ｎＭ〜８μＭのＲｐ−８−（２−フリル）ｃＡＭＰＳおよび１９ｎＭ〜３８．４μＭのＲｐ−８−Ｂｒ ｃＡＭＰＳとともに１０ｎＭのホロＲＩαを注入して、１０μｌ／分の流量において５分の会合および解離時間を与えた。

Ｒｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳ表面上のアンタゴニストＲｐ−８−（２フリル）ｃＡＭＰＳのＥＣ₅₀値を決定した。１０μｌ／分の流量での５分の会合時間後のホロＲＩαの結合信号をアンタゴニスト濃度の対数に対してプロットした。ＥＣ₅₀を３７７ｎＭとして決定した。

Ｒｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳ表面上のアンタゴニストＲｐ−８−（３フリル）ｃＡＭＰＳのＥＣ₅₀値を決定した。１０μｌ／分の流量での５分の会合時間後のホロＲＩαの結合信号をアンタゴニスト濃度の対数に対してプロットした。ＥＣ₅₀を７４３ｎＭとして決定した。

Ｒｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳ表面上の従来公知のアンタゴニストＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳのＥＣ₅₀値を決定した。１０μｌ／分の流量での５分の会合時間後のホロＲＩαの結合信号をアンタゴニスト濃度の対数に対してプロットした。ＥＣ₅₀を２．６μＭとして決定した。

インビトロでの生物学的特徴づけ結果の要約
表１は、ＰＫＡタイプＩα酵素活性についてのクックアッセイからのデータの概略を与える。

表２は、選択された化合物に対するＰＫＡタイプＩαについての活性化データと比較されたＰＫＡタイプＩＩα酵素活性についてのクックアッセイからのデータの概略を与え、選択性プロファイルを示す。

表３は、選択された化合物を用いたリガンド結合競合アッセイ（ビアコアアッセイ）からのデータと比較したＰＫＡタイプＩα酵素活性についてのクックアッセイからのデータを示す。

ヒトＴ細胞における前臨床テスト、ＨＩＶ＋Ｔ細胞における生体外臨床テスト。

ｃＡＭＰ類似体に対し、Ｔリンパ球増殖に対する化合物の効果を評価可能であるアッセイを使用して、アゴニストまたはアンタゴニスト性質、効力および毒性効果について特徴づけた。ＣＤ３表面マーカをクロスリンクさせてヒト末梢Ｔリンパ球を活性化し、ポリクローナルに増殖させた。ＰＫＡタイプＩアゴニストであるＳｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳの非存在下または存在下で細胞を増加する濃度の種々の新規なｃＡＭＰ類似体にさらした。増加する濃度のｃＡＭＰ類似体はＨＩＶ感染患者からのＴリンパ球におけるｃＡＭＰの上昇するレベルを模倣するために加えられた。

それらのキラルリンのＲｐ立体配置に基づいて、化合物はアンタゴニスト性質を呈すると予想された。テストした化合物は、アデニン環の８位において置換を有するＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳの誘導体であった。この位置は、薬物標的選択性を与える電子吸引中心である。この位置における変更は、ＰＫＡタイプＩのＲサブユニット上の部位Ｂに対するより強い親和性（したがって、より高い効力および改善された選択性）を有する化合物を与えると期待された。

表４は、ヒト第一Ｔリンパ球を使用してテストされたｃＡＭＰ類似体化合物の性質を要約する。ｃＡＭＰ分子のいくつかの変更を種々の位置で行ったが、Ｔリンパ球増殖アッセイを使用して検出して、出発化合物であるＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳと比較して、効力および選択性の点でなんらかの改善を与えたものはなかった。しかし、いくつかの化合物（表４を参照）は、酵素アッセイを使用してＰＫＡタイプＩホロ酵素について直接テストした場合、基準化合物であるＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰＳよりも効力が高いことが示された（表４を参照）。

マウスレトロウイルス誘発免疫不全（ネズミのＡＩＤＳ）における原理実験の証明
図１。感染マウスをＰＫＡタイプＩアンタゴニストで処置すると、ＴＮＦ−α産生ＣＤ４ Ｔ細胞の頻度が低下する。ＴＮＦ−αポシティブ細胞の頻度を細胞質内染色によって評価した。細胞をブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＢ）後、または基本状態で分析した。ＳＥＢ刺激産生に対するＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの効果は有意であった（ｐ＝０．００１２）。Ｒｐ−８−フリルの効果も有意であった（ｐ＝０．００４１）。

Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの処置により、感染マウスのＣＤ４ Ｔ細胞によるＴＮＦ−α産生が劇的に低下する（図１）。ＭＡＩＤＳは、ＣＤ４⁺ Ｔ細胞がＴＮＦ−αを産生する頻度が自発的にまたはＳＥＢの刺激後に非常に上昇するという特徴を有する。処置されたマウスにおいては、この頻度が正常値近くに低減される。Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの場合、このことは毒性効果に帰することができなかった。なぜなら、抗ＣＤ３ｍＡｂに対する増殖応答が実際に増加するからである。Ｒｐ−８−フリル−ｃＡＭＰは、感染動物からのＣＤ４⁺ Ｔ細胞によるＴＮＦ−α産生を阻害した。これらの実験において、Ｒｐ−８−フリル−ｃＡＭＰおよびＲｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰは、ＣＤ４⁺ Ｔ細胞によるＴＮＦ−αの自発的およびＳＥＢ誘発産生に対して同様の効果を有した（図１）。Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰおよびＲｐ−８−（２−フリル）−ｃＡＭＰＳの処置により、感染マウスからのＣＤ４⁺ Ｔ細胞の産生プロファイルは変更された（ＩＦＮ−γがわずかに増加し（図示せず）およびブドウ球菌エンテロトキシンＳＥＢで刺激した後のＴＮＦ−α産生を低減した）。このことは、このクラスの剤を用いた処置によって、症候群の炎症徴候を低減するのに役立ちながら日和見細胞内病原体に対して向けられたＴｈ１免疫応答を改善し得ることを示す。

実施例８１〜８５についての実験の詳細
ＰＫＡに対するクック結合酵素アッセイ
ＲＩαホロ酵素複合体の調製
ホロ酵素の形成は、ＰＫＡ ＲＩαおよびＰＫＡ Ｃαを１．２対１．０のモル比で一晩透析することにより行った。３回の１ｌ緩衝液の交換（透析緩衝液：２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ β−メルカプト−エタノール）を行ってｃＡＭＰを調節サブユニットから除去した。

ホロ酵素複合体形成のテストおよびアッセイ条件：
ホロ酵素を１μＭのストック溶液に希釈し（希釈緩衝液：１００ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ）、クックアッセイ（アッセイ混合物：１００ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭホスホエノールピルビン酸、１ｍＭ ＡＴＰ、２００μＭ ＮＡＤＨ、１ｍＭ ＤＴＴ、１５Ｕ／ｍｌ乳酸デヒドロゲナーゼ、７０Ｕ／ｍｌピルビン酸キナーゼ）において活性についてテストした。総体積が１００μｌのアッセイ混合物において１μｌの２５ｍＭケプチド（最終濃度が２００μＭの活性ペプチド）を１μｌのホロ酵素（１０ｎＭの最終濃度）に混合することによって反応を開始させた。ＯＤ₃₄₀を１分間監視し、Ｃαの相対活性をＯＤ減衰／分の傾きとしてプロットした。Ｃαのほんの小さな残留活性（＜活性化複合体の８％）は、不活性ホロ酵素複合体の完全に近い形成を示した。

ｃＡＭＰの活性化定数の決定は、アッセイ混合物において１０ｎＭのホロ酵素を用いた３分間前インキュベーションにおいてｃＡＭＰの濃度を増加することによって行った（ＥＣ₅₀＝８８ｎＭ）。

ＲＩＩαホロ複合体の調製：
ホロ酵素の形成は、ＰＫＡ ＲＩＩαおよびＰＫＡ Ｃαを１．２対１．０のモル比で一晩透析することにより行った。ホロＲＩＩαの形成にＡＴＰ／Ｍｇは必要ないが、ホロＲＩａ形成のための透析緩衝液と同じもの（２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂）を再度使用した。なぜなら、ＡＴＰはクックよるアッセイに必要であり、この緩衝液はインビボ状態に似ているからである。完全なホロ形成および１μＭのｃＡＭＰによるホロ活性化は、滴定実験の前後にチェックした。氷上４週間後でも、ホロＲＩＩαは同じＰＫＡ Ｃａ残留活性（２１％）を示し、新たに調製されるのと同様にｃＡＭＰによって完全に活性化できた。

Ｒｐ−ｃＡＭＰＳストック溶液の調製：
すべてのＲｐ−ｃＡＭＰＳ類似体を最終濃度が１０ｍＭとなるように２０％ＤＭＳＯを有する希釈緩衝液に溶かし、λ_maxでのモル吸光係数を使用して分光測光的に濃度を決定した。希釈緩衝液において１：１０倍希釈を繰返してＲｐ−ｃＡＭＰＳ類似体のさらなる希釈を調製した。好ましくは１μｌであるが５μｌ以下のＲｐ−ｃＡＭＰＳ類似体をアッセイ混合物に加えた。したがって、最終アッセイ混合物のＤＭＳＯ濃度は１％以下であった。ＤＭＳＯのアッセイ酵素に対する効果をテストし、その結果、１％以上のＤＭＳＯ濃度はアッセイ酵素（ＡＤＰカラム）およびホロＲＩα（Ｃα、ホロＲＩαおよびｃＡＭＰ活性化ホロＲＩαカラム）に効果がないことを示した。

ｃＡＭＰアンタゴニスト（ビアコアアッセイ）についてのインビトロ競合的リガンド結合アッセイ
ＲＩαおよびＲＩＩαホロ複合体の調製：
ホロ酵素形成は、ＰＫＡ ＲＩαまたはＲＩＩαおよびＰＫＡ Ｃαを１．２対１．０のモル比で一晩透析することによって行った。３回の１ｌ緩衝液の交換（透析緩衝液：２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ β−メルカプト−エタノール）を行って、調節サブユニットからｃＡＭＰを除去した。両方のホロ酵素複合体は従来の研究で使用およびテストされた。

Ｒｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳおよび８−ＡＨＡ ｃＡＭＰ表面の調製：
両方のヌクレオチドを濃度が３ｍＭとなるように１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶かし、ＥＤＣ／ＮＨＳを使用する標準のアミノカップリングによってＣＭ５センサチップに共有結合させた。未処置のＣＭデキストラン表面を空表面として使用した。

表面競合アッセイのための実験条件：
機器：ビアコア２０００、ビアコアＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン
温度：２５℃
ＣＭ５チップ（０１．１２．０３）：ＦＣ１：ＣＭデキストラン（基準）
ＦＣ２：３ｍＭ Ｒｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳ
ＦＣ３：ＣＭデキストラン
ＦＣ４：３ｍＭ ８−ＡＨＡ ｃＡＭＰ
表面： ＦＣ１−ＦＣ２−ＦＣ３−ＦＣ４、連続フロー
基準： ＦＣ１
ランニング緩衝液１： ２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００μＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ろ過および脱気
ランニング緩衝液２：２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０、ろ過および脱気
アッセイ条件：１０または２ｎＭのホロ複合体を解離時間５分のキンジェクトコマンド（ｋｉｎｊｅｃｔ ｃｏｍｍａｎｄ）を使用して５分間注入した。ホロＲＩαについてはランニング緩衝液１、ホロＲＩＩαについてはランニング緩衝液２を使用した。適切な範囲内にある１０〜１４の異なる濃度のＰＫＡアゴニストまたはアンタゴニストを使用してこれらのｃＡＭＰ類似体のＥＣ₅₀値を決定した。したがって、５分間の会合時間の後のＲｐ−８−ＡＨＡ ｃＡＭＰＳおよび８−ＡＨＡ ｃＡＭＰ表面上の両方の結合信号を化合物濃度の対数に対してプロットした。
注入体積： ５０μｌ
流量： １０μｌ／分
再生： ０．１％ＳＤＳ、３Ｍ塩酸グアニジウム。

ヒトＴ細胞における前臨床テスト、ＨＩＶ＋ Ｔ細胞における生体外臨床テスト。

末梢血ＣＤ３＋ Ｔ細胞の陰性選択：
リンパ調製（ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ）溶液を用いた密度勾配遠心分離を介して軟膜から慣用方法でヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣとともに単離された血小板の多くをＰＢＳでの洗浄を介して除去した。ＰＢＭＣからのＴリンパ球の単離は、ＣＤ１４表面マーカを有する単球およびＣＤ１９表面マーカを有するＢリンパ球を、それぞれの細胞特異的マーカに対する抗体をコーティングされた単分散磁気ビーズを使用して除去することに基づく。

１０ｍＬの軟膜および２５ｍＬのＰＢＳを各５０ｍＬチューブに加え、混合した。１０ｍＬのリンパ調製溶液をチューブの底に層状に置き、それらを８００×ｇで２５分間４℃において遠心分離した（ブレーキは最小限におさえた）。ＰＢＭＣの層を単離し、ＰＢＳ中で２度洗浄した（３００×ｇで７分間４℃において遠心分離）。ペレットをＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ／ＰＳ中に懸濁し、ＰＢＭＣの数をカウントした。ダイナビーズＣＤ１４およびＣＤ１９をＭＰＣを使用しＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ／ＰＳ中で６度洗浄し、次いでビーズ対細胞比５：１でＰＢＭＣ（３×１０⁷細胞／ｍＬ）と混合し（ＰＢＭＣは２０％の単球および２０％のＢリンパ球を含むと推定された）、４℃において揺動台に載せた。４５分後、陽性選択された細胞（単球およびＢリンパ球）をＭＰＣを使用して細胞混合物から除去し、Ｔリンパ球の懸濁液を残した。Ｔリンパ球の数をカウントし、細胞を実験に使用するか、または１ｍＬ当たり１〜２×１０⁶細胞の懸濁液中（ＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ／ＰＳ、３７℃および５％ＣＯ₂）で培養した。

増殖アッセイ：
増殖アッセイを行ってＴリンパ球の増殖の阻害剤またはエンハンサーとしての種々のｃＡＭＰ類似体の効力を調べた。数十万の陰性選択されたＴリンパ球を平底９６穴マイクロタイタープレートの各穴に総体積１００μＬのＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ／ＰＳ中でインキュベートした。細胞の活性化は、最終希釈度１：１０⁴（５０ｎｇ／ｍＬ）で抗ＣＤ３抗体を加え、その後羊抗マウスＩｇＧでコーティングした磁気ビーズをビーズ対細胞比１：１で加えてＴＣＲ／ＣＤ３複合体のクロスリンクを行って達成した。ビーズをＭＰＣを使用してＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳ／ＰＳ中で６度洗浄した後、細胞懸濁液に加えた。細胞を６５時間３７℃でインキュベートし（５％ＣＯ₂）、この期間の４８時間後に５μＣｉ［メチル−³Ｈ］チミジンを加えて増殖を調べた。細胞をマルチサンプルハーベスタを使用してフィルタプレートに取り出し、フィルタプレートをヒートインキュベータにおいて５０℃で２時間乾燥させた。２０μＬシンチレーション液を各穴に加え、その後増殖をβシンチレーションカウントによって測定した。すべての分析は３回行った。

ｃＡＭＰ類似体を用いた活性化Ｔリンパ球の処置：
Ｔリンパ球を増加する濃度の種々のｃＡＭＰ類似体で処置した。ｃＡＭＰ類似体を加えた３０分後に抗ＣＤ３抗体を加えて化合物が細胞中へ拡散できるようにして細胞を活性化させた。細胞増殖を阻害または刺激する各類似体の効力を、［メチル−³Ｈ］チミジン取り込みをｃＡＭＰ類似体濃度の関数として測定することにより決定した。

マウスレトロウイルス誘発免疫不全（ネズミＡＩＤＳ）についての実験原理：
動物：
Ｃ５７ＢＬ６マウスを、ＭＡＩＤＳを起す検出可能なウイルスを含有するウイルス調製物を用いて感染させ（ＸＣプラークアッセイを用いて滴定したところ１０³ＰＦＵエコトロピックウイルスを含んでいる）、感染後約１０週目に異なる薬剤で処置した。

処置：
異なる化合物を１０日間、繰返しＩＰ注射するかまたは浸透圧ポンプを挿入することによって投与した。以下の剤をテストした：
Ｒｐ−８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ：１ｍｇ／日／マウス
Ｒｐ−８−フリル−ｃＡＭＰ：２つの用量をテストした（１ｍｇ／日／マウスおよび２．５ｍｇ／日／マウス）
ロフェコキシブ：６０μｇ／日／マウス
感染マウスにロフェコキシブまたはＲｐ−Ｂｒ／フリル−ｃＡＭＰのニセモノとしてそれぞれイントラリピッド（ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ）またはＰＢＳ注射剤を与えた。通常、各実験グループは６〜９動物を含んだ。動物を屠殺した後、細胞を培養し、異なる剤を培地に加えた。

増殖およびサイトカインアッセイ：
動物を屠殺した後、細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂ（２Ｃ１１：４μｇ／ｍｌ）の存在下で７２時間培養した。培養の最後に三重水素化チミジンを加え、放射能をシンチレーション分析器で測定した。

抗ＣＤ３Ａｂに応答するリンパ節リンパ球に対して行った増殖アッセイに加え、細胞質内染色方法を使用してＳＥＢで６時間活性化した後、ＣＤ４⁺ Ｔ細胞におけるＴＮＦαの産生を測定した。

（Ｓｐ）８−（２−チエニル）アデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−ベンジルホスホラミデート（１１ｂ）
ＴＨＦ（２ｍｌ）中の塩化２−チエニル亜鉛（０．３ｍｌ、１Ｍ、０．３００ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＨＦ（２ｍｌ）中の（Ｓ）８−ブロモアデノシン−２’Ｏ−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−３’，５’−環状Ｎ−ベンジルホスホラミデート（０．１２２ｇ、０．２００ｍｍｏｌ）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．０４６ｇ、０．０４０ｍｍｏｌ）の溶液にアルゴン下で加えた。反応混合物をおだやかな還流下で３時間加熱した。塩化アンモニウムの飽和水溶液（３ｍｌ）およびジクロロメタン（１０ｍｌ）を冷却した反応混合物に加え、有機相を飽和ブライン（２×３ｍｌ）で抽出し、乾燥させ（ＭｇＳＯ₄）、溶媒を蒸留して除去した。残留物質をＭｅＯＨ：ＣＨ₂Ｃｌ₂（１：２０）を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィにかけた。収率 ０．０５９ｇ（４８％）。

図１は、種々の化合物によるＴＮＦ−アルファ−正ＣＤ４Ｔ細胞の％を示す。

Claims (15)

1. ８−カルビル置換ｃＡＭＰＳ化合物またはその誘導体。
2. 前記８−置換基が、２５個までの非水素原子を含む請求項１に記載の化合物。
3. 前記８−置換基が、５〜１０個の環状原子を含む環状基を含む請求項１または２に記載の化合物。
4. 前記８−置換基が、任意に置換されているアリール基及び任意に置換されているヘテロアリール基から選択され、
   前記任意に置換されているアリール基が、例えば
   ベンゼン、ナフタレンおよび
   環化カルボキシル系、および
   ピリジン、ジ−およびトリアジン、フラン、チオフェンおよびピロール、およびアゾール、およびトリアゾール、およびオキサ−およびチアジアゾール、およびテトラゾールを含む環化複素環系であり、
   前記任意に置換されているヘテロアリール基が、例えば、
   ６員環アジン、ピリジン、ジアジン、トリアジンおよび環化炭素環系、および
   前記のような環化複素環系、および
   ５員環系（例えば、フラン、チオフェンおよびピロール、アゾール、およびトリアゾール、およびオキサ−およびチアジアゾール、およびテトラゾール）および
   環化複素環系および炭素環系である請求項１または２に記載の化合物。
5. 前記８−置換基が、フェニル、フリルまたはチエニル基を含む請求項１から４のいずれか１つに記載の化合物。
6. ホスホロチオ酸硫黄、アデノシンアミン基およびフリルヒドロキシル基の１つ以上において保護化される、請求項１から５のいずれか１つに記載の化合物。
7. 少なくとも９０％モルが、ＲｐまたはＳｐ形態である請求項１から６のいずれか１つに記載の化合物。
8. ８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたはその誘導体の製造のためのプロセスであって、
   ａ）２’−保護８−カルビル化−アデノシン３’，５’−環状ホスホラミデートを二硫化炭素と反応させ、２’−ヒドロキシルを脱保護するステップ、
   ｂ）８−カルビル化−アデノシンを乾燥溶媒中でＳＰＣｌ₃と反応させるステップ、
   ｃ）８−カルビル化−アデノシンを亜リン酸塩と反応させ、その後硫黄と反応させるステップ、
   ｄ）２’−保護化されてもよい８−ハロ−ｃＡＭＰＳをアルキル化剤と反応させ、必要ならば２’ヒドロキシルを脱保護するステップ、
   ｅ）８−カルビル化ｃＡＭＰＳをその塩に変換するステップ、
   ｆ）８−カルビル化ｃＡＭＰＳを生物学的に開裂可能な保護基と反応させるステップ、および
   ｇ）８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたはその誘導体のＲｐ／Ｓｐ異性体混合物のＲｐおよびＳｐ異性体を分離するステップ
   のうちの少なくとも１つのステップを含むプロセス。
9. ８−カルビル化アデノシン環状３’，５’−ホスホラミデートまたはその誘導体。
10. ８−カルビル化−２’−保護化（例えばシリル化）アデノシン環状３’，５’−ホスホロチオエートまたはその誘導体。
11. ８−ハロ（および好ましくは２’−保護化（例えばシリル化）された）アデノシン環状３’，５’−ホスホラミデートまたはその誘導体。
12. ８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたはその誘導体を生理学的に許容可能な担体またはレシピエントとともに含む医薬組成物。
13. ヒトまたは非ヒト動物（好ましくは哺乳動物）の体を処置して前記体内でｃＡＭＰアゴニストまたはアンタゴニスト効果を達成するための方法であって、請求項１から７のいずれか１つに記載の８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたはその誘導体の有効量を前記体に投与するステップを含む方法。
14. ヒトまたは非ヒト動物（好ましくは哺乳動物）の体を処置して前記体内でｃＡＭＰアゴニストまたはアンタゴニスト効果を達成するための方法において使用するための薬剤を製造するための請求項１から７のいずれか１つに記載の８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたはその誘導体の使用。
15. サンプル（一般に生物学的サンプル）中のｃＡＭＰを決定するためのアッセイ方法であって、前記サンプルをｃＡＭＰ−類似体およびｃＡＭＰ結合試薬に接触させるステップを含み、前記類似体が、８−カルビル化ｃＡＭＰＳまたはその誘導体である、アッセイ方法。

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