JP2008501615A - カーボンナノチューブを含む非共有結合複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも1つを含んでおり、及び/又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は少なくとも1つの正電荷を含んでおり(但し、前記荷電分子がCl−とTFA−と異なるものとする)、
前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的である、前記複合体に関する。
前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電結合である、前記複合体に関する。
「TFA−」は、トリフルオロ酢酸に関する。
本発明における複合体の結束性を維持する力は、本質的には、静電気力である。例えば、前記複合体の結束性は、前記電荷を担持している基及び前記荷電分子のそれぞれに属している異極性電荷によって、もう一方の電荷に働きかける引力によって維持されている。本発明における静電結合は、特に、イオン結合に関する。前記電荷を担持している基に属する1又は数個の電荷が、前記荷電分子に属する1又は数個の電荷とそれぞれ互いに作用しあうことができることは、当業者によって明らかであろう。電荷を担持している基、又は荷電分子が1つより多い電荷を含む場合には、すべての電荷が必ずしも、荷電分子、又は電荷を担持している基にそれぞれ属している電荷と作用しあうわけではないこともまた明らかであろう。
条件、例えばpHによって、前記カーボンナノチューブの電荷、前記電荷を担持している基の電荷、又は前記荷電分子の電荷は変化する。
特に、前記複合体は、1・10−12〜1・10−2mol/l濃度で水中に溶ける。
水性溶媒は、特に、水、生理溶液、及び生体液、例えば血液、リンパ液又は細胞質を含む。
「毒性のない」ことによって、本発明の複合体は、細胞に対して、又は複合体を投与した個体に対して、本質的に有害性を生じないことを意味している。
特に、本発明の複合体は、1・10−2mol/lと同じ高濃度であっても毒性はない。
本発明の複合体を含む前記カーボンナノチューブは、好ましくは水性溶媒に可溶し、そして毒性がない。
前記複合体の溶解性は、前記荷電分子ばかりでなく、カーボンナノチューブの表面に共有結合している電荷を担持している基の存在にも起因している。
前記複合体の溶解性は、また、生物学的過程、特に細胞過程を害するカーボンナノチューブの疎水性凝集に起因する毒性を防ぐ。
前記複合体の溶解性及び毒性の欠如は、生体への、特に分子を細胞に運ぶ構成での前記複合体の投与を可能にする
前記結合エネルギーは、25℃で示されている。
85kJ/molの結合エネルギーは、約10−15mol/lの解離定数に相当している。
70kJ/molの結合エネルギーは、約10−12mol/lの解離定数に相当している。
50kJ/molの結合エネルギーは、約10−9mol/lの解離定数に相当している。
特に、前記結合エネルギーは、共有結合に相当する結合エネルギー、概ね420kJ/molよりも小さい。
前記荷電分子と前記カーボンナノチューブの前記結合エネルギーは、細胞外生体液、例えば血液又はリンパ液中での前記複合体の結束性を可能にし、そして、細胞液、例えば細胞質中での前記荷電分子の放出を可能にする複合体の解離ができるものが好ましい。本発明の前記複合体の解離を、例えば、pHの変化によって引き起こすことができる。
前記複合体のさらなる好ましい実施態様によれば、前記カーボンナノチューブが正電荷又は負電荷のいずれかを含み、そして前記荷電分子がそれぞれ負電荷少なくとも1つ、又は正電荷少なくとも1つのいずれかを含む。
この実施態様によれば、前記カーボンナノチューブは、正電荷のみ又は負電荷のみのいずれかを含み、反対の電荷をそれぞれ含んでいる荷電分子との結合を容易にする。
前記複合体のもう1つの好ましい実施態様によれば、前記カーボンナノチューブは、前記荷電分子の電荷当たり、約0.001〜約100電荷、特に、約1〜約20電荷を含んでいる。
従って、与えられる荷電分子及びカーボンナノチューブ間の相互作用の強さを、前記カーボンナノチューブの電荷密度を変更することによって調節することは可能である。故に、前記電荷密度を大きくすることによって、前記相互作用は強くなる結果となり、そして前記電荷密度を小さくすることによって、前記相互作用は弱くなる結果となる。
前記カーボンナノチューブと荷電分子との電荷比は、約0.001〜約100であり、特には約1〜約20である。約0.001より小さい電荷比においては、溶液中で遊離している前記荷電分子からの電荷が過剰量であり、これは前記カーボンナノチューブと相互作用しない荷電分子が過剰になりやすく、従って十分には複合しない。100より大きい電荷比においては、前記カーボンナノチューブ上の電荷が過剰量あり、従って前記荷電分子は、前記カーボンナノチューブ上で全てしっかりと複合しており、故に強く安定した複合体になりやすく、従って前記カーボンナノチューブ表面からの前記荷電分子の放出を困難にさせる。
前記単層カーボンナノチューブ(SWNT)は、例えば、アジャヤン及びイイジマ(Ajayan,PM&Iijima S.Nature(1993)361:333−334;Rao CNR.et al.Chem.Phys.Chem.(2001)2:78−105)によって、定義されている。
前記多層カーボンナノチューブ(MWNT)は、例えば、イイジマ(Iijima S.Nature(1991)354:56−58;Rao CNR.et al.Chem.Phys.Chem.(2001)2:78−105)によって、定義されている。
[Cn]−Xm
(式中、Cnは、実質的に一定の直径である実質的に円筒形であるカーボンナノチューブの表面の炭素であり、前記直径が約0.5〜約50nmであり、特に、SWNTにおいて約0.5〜5nmであり、MWNTにおいて約20〜約50nmであり、
Xは、同一又は異なる、1又は数個の官能基であり、但し、X基少なくとも1つが、電荷を担持している基少なくとも1つを含み、
nは約3・103〜約3・106の整数であり、
mは約0.001n〜約0.1nの整数であり、
カーボンナノチューブ表面cm2当たり約2・10−11mol〜約2・10−9molの官能基Xが存在している)
で表される。
置換カーボンナノチューブにおいて、前記表面の原子Cnは、官能基と反応する。表層中のほとんどの炭素原子は、基底面炭素、例えばベンゼン環で構成されている炭素である。従来技術において、一般的に基底面炭素は、欠損部位にある基底面炭素、又はグラファイト層の先端炭素原子に類似の基底面炭素を除いては、相対的に化学攻撃に対して不活性であると考えられている。
有利な実施態様によれば、本発明は機能化カーボンナノチューブを含む水溶液又は有機溶液に関し、前記カーボンナノチューブの長さ範囲の分布は機能化前の前記カーボンナノチューブの長さ範囲の分布と本質的に同じである。
前記カーボンナノチューブの長さは、約20nm〜約20μmの範囲内で有利に選ばれる。
カーボンナノチューブの表面(cm2)当たりの官能基の分布、(有利なのは2・10−11mole〜2・10−9moleである)をDSC(示差走査熱量測定法)、TGA(熱重量分析)、滴定及び分光光度測定により、決定することができる。
その均質性を高分解能透過型電子顕微鏡(TEM)により決定することができる。但し、分解能が、前記カーボンナノチューブ表面の電子密度及び電子を担持している前記官能基の電子密度を見るには十分であるものとし、標識原子、例えば15N、13C又は2Hが、官能基中に含まれるものとする。
カーボンナノチューブ表面(cm2)当たりの官能基の分布範囲のより高い数値及びより低い数値に関与するパラメータは、カーボンナノチューブの曲率、反応時間、反応温度、試薬の化学安定性及び溶媒である。
官能基の量は、特には、カーボンナノチューブ1g当たり約0.4〜約1mmolの範囲であることが好ましい。
本発明の前記カーボンナノチューブは本質的には純粋であり、そして無定形炭素又は熱分解沈殿炭素(pyrolytically deposited carbon)、炭素粒子、又はフラーレンを含んでなく、そして、特には、カーボンナノチューブの生成において触媒として一般的に使用される金属、例えばFe、Ni、Coを含んでいない。
[Cn]−[X1 m1][X2 m2]
(式中、m1及びm2は、相互に独立し、約0.001n〜約0.1nの整数を示し、但し、X1又はX2少なくとも一方が、電荷を担持している基少なくとも1つを含むものとする)
で表されている。
(式中、Tは、カーボンナノチューブであり、R及びR’は、相互に独立し、−H、又は式−M−Y−(Z)a−(P)bで表される基であり、aは0又は1であり、そしてbは0〜8の整数であり、好ましくは0、1又は2であり、Pは、bが1より大きい場合に同一又は異なる基であり、但し、R及びR’は同時に水素原子とすることはできないものであり、そして、
Mは、約1〜約100原子のスペーサー基、例えば−(CH2)γ−又は−(CH2−CH2−O)γ−CH2−CH2−を含む群から選択される基、γは1〜20の整数であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、
Yは、a=b=0の場合の反応基、例えば−OH、−NH3 +、−COO−、−SH、−CHO、ケトン例えば−COCH3、アジ化物、又はハロゲン化物を含む群から選択される基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、
又は、a又はbが0と異なる場合に、反応基から誘導され、例えば−O−、−NH−、−COO−、−S−、−CH=、−CH2−、−CCkH2k+1=、kは1〜10の整数であり、特には−CCH3、又は−CHCkH2k+1−であり、kは1〜10の整数であり、特には−CHCH3−を含む群から選択される基であり、
Zは、リンカー基、例えばa=1、及びb=0の場合に以下の式の1つの基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含んでおり、P基少なくとも1つと結合する傾向があり、そして、必要な場合には前記P基を放出する傾向があり、
qは、1〜10の整数であり、又は、
a=1、及びb=1又は2の場合に、以下の式の1つで表され、
qは、1〜10の整数であり、
Pは、有効基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、前記機能化カーボンナノチューブの分光検出を可能にし、フルオロフォア、例えばFITC、キレート剤、例えばDTPA、又は生物学的作用を誘発する傾向がある活性分子、例えばアミノ酸、ペプチド、擬似ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、例えば酵素又は抗体、核酸、炭水化物又は薬であり、
あてはまる場合にはY、Z、又はP基少なくとも1つを、キャッピング基、例えばCH3CO−(アセチル)、メチル、エチル、ベンジルカルボニル、又は保護基、例えばメチル、エチル、ベンジル、tert−ブチル、トリチル、3−ニトロ−2−ピリジルサルフェニル、tert−ブチルオキシカルボニル(Boc)、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、ベンジルオキシカルボニル(Cbz)、ベンゾイル(Bz)、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル、フタルイミド、ジメチルアセタール、又は1,3−ジオキソランによって置換することができる)
の複合体である。
前記ピロリジン環は、安定で、そして強固な環状分子であり、反応基が存在又は挿入することができる末端においてスペーサー基をもつことができる窒素原子が存在しているという利点を持っている。
用語「Mはスペーサー基」は、Mが前記カーボンナノチューブ上の前記ピロリジンを前記反応作用基Yから引き離す直鎖状有機鎖であることを意味する。
用語「Yは反応基から誘導される」は、Yが新しい共有結合を引き起こす化学反応によって修飾させられるヘテロ原子又は官能基であることを意味する。
−O−は前記反応基−OHからの誘導体であり、−NHは前記反応基−NH2からの誘導体であり、−COO−は前記反応基−COOHからの誘導体であり、−S−は前記反応基−SHからの誘導体であり、−C=及び−CH2−は前記反応基−CHOからの誘導体であり、−CCkH2k+1及び−CHCkH2k+1は、前記反応基のケトンからの誘導体であり、そして特には−CCH3=及び−CHCH3−は反応基−COCH3−からの誘導体であることは、前記の説明から明らかである。
アジ化物に関しては、アジ化物は保護基である。
ハロゲン化物に関しては、相当する誘導基を−NH−、−O−、−S−、−COO−又はアジ化物とすることができる。
用語「Zはリンカー基である」は、ZがYに共有結合している化学物質であり、Pのカップリングを可能にし、そしてPのカップリングの条件において化学反応を妨害し、Pを放出することが可能であるが、Yから放出されることは可能ではないことを意味する。
好ましい実施態様によれば、Zは以下の式のリンカー基を意味する。
qは、1〜10の整数である。
リンカー基Zは、Zが遊離しているか、又は−Y−に結合しているか及び/又は−Pに結合しているか、又は−Pから開裂しているか、そしてZが保護されているかどうかに依存する変化する形状で存在している。本発明の好ましいリンカー基の主要形状は以下の通りである。
遊離非保護型
非保護Y結合型
保護Y結合型
非保護Y及びP結合型
保護Y及びP結合型
非保護Y及びP由来開裂結合型
非保護Y及びP由来開裂結合型
非保護P結合型
保護P結合型
遊離非保護型
遊離保護型
非保護Y結合型
保護Y結合型
Y及びP結合型
P結合型
マレイミドの遊離型
Y結合マレイミド型
Y及びP結合マレイミド型
P結合マレイミド型
「FITC」は、フルオロセイン・イソチオシアネートを示す。
Zが以下の2つの分子の1つを表す場合、そしてPが存在している場合には、Pを放出することができる。なぜならば、左の分子については、開裂はS原子に隣接する結合で起こることができ、又右の分子については、Pは右端−COO−から放出されることができるからである。
(式中、Tは、カーボンナノチューブであり、R1及びR2は、異なっており、そして相互に独立し、−H、又は式−M−Y−(Z)a−(P)bの基であり、M、Y、Z、P、a及びbは、前記定義されたものと同じ意味であり、R1及びR2少なくとも1つが電荷を担持している基を含んでいる)
の前記ピロリジン環少なくとも1つを、電荷を担持している基少なくとも1つによって置換されるものである。
前記定義された複合体の好ましい実施態様において、前記複合体は、以下の一般式(II):
(式中、Tは、カーボンナノチューブであり、Aは荷電分子であり、そしてRは、式−M−W基であり、そして、
Mは、約1〜約100原子のスペーサー基、例えば−(CH2)γ−、又は−(CH2−CH2−O)γ−CH2−CH2−を含む群から選択される基であり、γは1〜0の整数であり、
Wは、約1〜約400原子の電荷を担持している基、例えば−NH3 +、又は−COO−である)
で表されることを特徴とする。
(式中、Tは、カーボンナノチューブであり、Aは、荷電分子であり、そして
R1は、−M−Y−(Z)a−(P)b基であり、M、Y、Z、P、a及びbは、前記定義されたものと同じ意味であり、特にR1は、フルオロフォアを担持している基であり、そして
R2は、式−M−W基であり、Wは約1〜約400原子の電荷を担持している基、例えば、−NH3 +、又は−COO−である)
で表されることを特徴とする。
2〜106のヌクレオチドを含む核酸、例えばRNA又はDNA、特にはプラスミド又は人工染色体、
2〜5000、好ましくは50〜5000のアミノ酸を含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、
炭水化物、特には正電荷の炭水化物、例えばグルコサミン又はキトサン、
放射性核種、及び
細胞毒の分子を含む群から選択されている。
本発明の細胞傷害性分子を含む複合体は、悪性細胞を破壊する治療目的、特にガン治療の枠組みにおいて特に有用である。
(式中、Tは、カーボンナノチューブであり、そしてAは、荷電分子であり、負電荷少なくとも1つを含む、例えばDNAである)
で表されることを特徴とする。
(式中、Tは、カーボンナノチューブであり、そしてAは、荷電分子であり、負電荷少なくとも1つを含む、例えばDNAである)
で表されることを特徴とする。
(式中、Tは、カーボンナノチューブであり、そしてAは、正電荷少なくとも1つを含む荷電分子である)
で表されることを特徴とする。
(式中、Tは、カーボンナノチューブであり、そしてAは、正電荷少なくとも1つを含む荷電分子である)
で表されることを特徴とする。
本発明は、又、前記荷電分子を細胞内に運ぶための複合体の使用に関する。
従って、前記複合体を個体に投与することができ、そして前記複合体は、個々人の輸送流体、例えば血液又はリンパ液中で運ばれる間は会合された形態のままであり、そして、複合体が細胞膜を通過する間、その後、細胞に浸透するとすぐに、複合体は解離し、前記荷電分子を遊離させることができる。
カーボンナノチューブは、アゾメチンイリドの1、3−双極子環状付加に基づく方法を用いて共有結合的に修飾されている(Georgakilas et al.(2202)J.Am.Chem.Soc.124:760−761)。単層カーボンナノチューブ及び多層カーボンナノチューブ(SWNT及びMWNT)の両方は、遊離アミノ末端トリエチレングリコール部分の窒素をもつピロリジン環で機能化された(図1)。カーボンナノチューブの周りの官能基(f)の量を、前記f−SWNT及び前記f−MWNTにおいて、それぞれ約0.55及び0.90mmol/gで計算した。リジンで機能化されたSWNTを、パンタロットら(Pantarotto et al.Chem.Biol.2003、10,961−966)の記載より、SWNT−NH3 +から調製した。チューブの周りのアミノ基の量は、約0.92mmol/gで計算した。前記の正電荷分布は、水溶液中に高度に可溶化する物質であることを示している。
f−SWNT:DNA複合体の形成において、アミノ機能化された単層カーボンナノチューブは、6mg/mL濃度で脱イオン水において水和された。プラスミドDNA、pEGFP−Luc(図6A)、又はpCMVβ(図6B)、(いずれもClontech)は、1mg/mL濃度で脱イオン水において水和された。アリコートは、必要になるまで−20℃で冷凍貯蔵された。インビトロの研究のため、適当な容量のナノチューブを、300μLの総容量のオプティメム(optimem)で希釈した。pCMVβ3μgは、300μLのオプティメムを含む別のチューブに加えた。次に、希釈されたナノチューブを、DNAに滴下し、そして混合物を簡単にピペットで採取した。複合体は、使用前の10分間で形成されることができる。この工程は、試験されるそれぞれの電荷比において繰り返された。インビボの研究のために、ナノチューブ600μgを、0.9%NaCl 750μL中に希釈した。0.9%NaCl 750μL中に希釈されたpEGFP−Luc50μgを、ナノチューブに滴下し、そして混合物を簡単にピペットで採取した。この工程を三回繰り返し、すべての場合においてナノチューブとDNA比が2:1のものを作り出した。
ビス機能化カーボンナノチューブの調製
第一手順を、以下の記載された反応工程で進行することができる。
ビス機能化カーボンナノチューブの調製
第二手順を、以下に記載された反応スキームで進行することができる。
第一手順及び第二手順でのBoc保護基の開裂を、以下に記載された方法により行うことができる。ジオキサン中の4MのHCl溶液をビス機能化カーボンナノチューブ(5mg)に添加し、そして混合物を常温で5時間撹拌する。溶媒を減圧下で除去し、生成物をメタノール/ジエチルエーテルから数回再沈殿する。機能化カーボンナノチューブをTEM及び1H−NMRにより明らかにする。定量カイザーテスト:0.35mmol/gの遊離NH2。
ビス機能化カーボンナノチューブの調製
第三手順において、ビス機能化カーボンナノチューブをフルオレセインイソチオシアネートと反応することができる。この方法は、以下の反応工程に示されている。
細胞内に透過する機能化カーボンナノチューブの能力を調べた。
以前に、発明者らは、蛍光プローブ(FITC)で標識したカーボンナノチューブで、細胞と相互作用し、そして細胞内へ摂取されるカーボンナノチューブを視覚化することができた。透過型電子顕微鏡(TEM)を使用する別の実験的なアプローチを、カーボンナノチューブの局在化が起こっている特定の細胞内区画を同定するために、今回行なった。
本発明によるアミノ機能化されたSWNTとプラスミドDNA複合体を、生体内の遺伝子送達の研究に使用した。
HBsAgをコードしたプラスミド(pRc/CMV−HBs、図7)と複合化したアミノ機能化SWNT(SWNT−NH3 + 1)をマウスにおけるワクチン実験に使用した。
−PBS;
−pRc/CMV−HBs(S)(10μg/マウス);
−pRc/CMV−HBs(S)(100μg/マウス);
−HBsが挿入されていないプラスミド(100μg/マウス);
を免疫された。
−PBS
−pRc/CMV−HBs(S)/f−SWNT 負電荷/正電荷 1:1
(10μg/マウスのプラスミド)、
−pRc/CMV−HBs(S)/f−SWNT 負電荷/正電荷 1:2
(10μg/マウスのプラスミド)、
−pRc/CMV−HBs(S)/f−SWNT 負電荷/正電荷 1:6
(10μg/マウスのプラスミド)、
−pRc/CMV−HBs(S)/f−SWNT 負電荷/正電荷 1:1
(100μg/マウスのプラスミド)、
−pRc/CMV−HBs(S)/f−SWNT 負電荷/正電荷 1:2
(100μg/マウスのプラスミド)、
−pRc/CMV−HBs(S)/f−SWNT 負電荷/正電荷 1:6
(100μg/マウスのプラスミド)、
−f−SWNTのみ(1:6比の投与量に相当する量)、
−f−SWNTに複合化したHBsが挿入されていないプラスミド(対照実験に基づいて作られた1つの負電荷/正電荷比)、
を免役された。
本実施例において、真核細胞にDNAをトランスフェクトする、複合化された機能化カーボンナノチューブ(f−CNT)の能力を検証した。
総則
図1に示している、アンモニウム機能化単層カーボンナノチューブ(SWNT−NH3 + 1)、アミノ機能化多層カーボンナノチューブ(MWNT−NH3 + 2)、及びリジンにより機能化単層カーボンナノチューブ(SWNT−Lys−NH3 + 3)は、実施例1に記載されている方法により調製した。
機能化カーボンナノチューブ(f−CNT):DNA複合体を調製するために、適当な量のそれぞれの型のナノチューブを、総容量200μLの脱イオン化された水で希釈し、その後、それぞれの濃度のf−CNT用に、50μLずつの4つのアリコートに分割した。前記ナノチューブの型及び必な電荷比に応じて、f−CNT濃度は16.5μg/mLから300μg/mLの範囲とした。次に、同じ容量の5μg/mLDNA溶液を、3つの前記f−CNTアリコートに添加し、その後、素早く10回ピペッティングすることより混合し、250ng/mLの最終DNA濃度を作成した。50μL脱イオン化された水を、ナノチューブのみの対照として、それぞれのグループの第4のf−CNTアリコートに添加した。複合体は、使用前に室温、30分間で形成させることができた。前記の工程は、試験されるそれぞれの電荷比で繰り返しされ、相当する濃度で条件当たり、ナノチューブのみのサンプルに加え、3つのサンプルを作成した。
SEMを使用し、プラスミドと複合化されたSWNT−NH3 +1及びMWNT−NH3 +2の像を取得する。画像の作成は、前記6:1(CNT:DNA)電荷比の複合体サンプル、又は同じ濃度のナノチューブのみのサンプル30μLを、SEMスタブ(stub)に置くことによって実行し、そして金のコーティング前に室温で乾燥させた。この工程は、20mAで2分間、エミテックK550スパッタ−・コーター(Emitech K550 Sputter Coater)で行なった。画像の作成は、20−25KV間の加速電圧でFEIフィリップスXL30(FEI/Philips XL 30)走査電子顕微鏡(Eindhoven、The Netherlands)の下で実施した(それぞれの像も参照)。像を補足し、そしてデジタル化し保存した。
BIAcore3000システム、センサーチップCM5、界面活性剤P20、N−ヒドロキシサクシニミド(NHS)及びN−エチルN’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド(EDC)を含むアミンカップリングキットは、BIAcore(Uppsala、Sweden)のものである。すべてのバイオセンサー試験は、泳動バッファーとしてHBS(20mM HEPES、20mM酢酸ナトリウム、140mM酢酸カリウム、3mM酢酸マグネシウム、0.02%界面活性剤P20、pH7.3)で実行した。ナノチューブの固定化は、ナノチューブ(酢酸緩衝液中の100μg/mL、pH4.0)35μLをEDC/NHSで活性化したセンサーチップCM5の表面に注入することによって行なった。これを、マトリックスの活性化されたフリーの部位を飽和させるために、続いて20μLエタノールアミン塩酸塩pH8.5を注入した。チップ上に非共有結合的に固定化されているナノチューブを除去するために、100mMH3PO4溶液を使用した。すべての結合実験は、25℃、30μL/minの一定流速で行なった。pCMV−BGalを前記泳動バッファー中に溶解した。各種の濃度のプラスミド(6.3から100μg/mL)を90秒間注入し、そして2分間の解離フェイズを続けた。すべての実験において、センサーチップを15μLの3MMgCl2で再生した。速度パラメータは、BIAeval3.1ソフトフェアを使用し計算した。分析は、簡易ラングミュア結合モデルを用いて行った。特異結合プロファイルは、チャンネルコントロールから応答シグナルを引いた後、得られた。それぞれのモデルの適合性は、カイ二乗値、及び理論モデルと比較した残留分布のランダム性によって判断した。
f−CNTとの複合化した後のDNAの近接性の程度を、二本鎖DNA結合試薬であるピコグリーン(PicoGreen:Molecular Probes、OR、U.S.A.)によって評価した。簡単には、カーボンナノチューブ:DNA複合体を、脱イオン化された水で10倍希釈し、250ng/mLの最終DNA濃度を作成した。次に、サンプル100μLをコースター96ウエルスペシャルオプティクスブラックプレート(CoStar 96−well special optics black プレート:Coming、NY、USA)の3つのウエルに添加した。本研究で使用されるプラスミド、pCMV−Bgalは、そもそもスーパーコイルの状態であり、アッセイキットを含まれるコントロールよりむしろ、前記プラスミドを用いて1000ng/mL〜31.25ng/mLの範囲の標準曲線を作成した。2xTE緩衝液(20mMTris/HCl/2mMEDTA、pH7.5)中のピコグリーン試薬100μLを、それぞれのウエル中に添加し、そして、プレートを3分間暗所でインキュベートし、その後、ワラックビクター(Wallac Victor:Wallac、UK)マルチウエルプレートリーダーを用いて、それぞれ485nm及び530nmの励起及び放射波長で測定した。測定される波長において、カーボンナノチューブのみでも自己蛍光を発するため、カーボンナノチューブのみの第2の標準曲線を作成し、バックグラウンドの蛍光を定量化した。その後、これをそれぞれのサンプルから引いた。パーセント遊離DNAは、それぞれの複合体のバックグラウンド補正されたPicoGreenカウントを、pBgal250ng/mLのみのバックグラウンド補正された測定値(100%遊離DNAを示す)で割ることによって決定した。データを3つのサンプルの平均で示し、プラス又はマイナスの標準偏差を示す。
異なる電荷比の3つの型のカーボンナノチューブに複合化されているDNA(pBgal)0.2μg、又は対照としての遊離DNA0.2μgを、臭化エチジウムを含むTAE緩衝液中の1%アガロースゲルに添加した。ゲルを90Vで2時間、泳動し、その後UVPゲルドキュメンテーションシステム(UVP Gel Documentation System:Upland、CA、USA)を使用し、紫外光の下で撮影した。それぞれの検体は、2検体ずつ泳動した。
A549細胞(ATCC、Middlesex、UK)を96ウエルプレートにほぼ密集するまで、10%FBS及び1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM(すべてInvitrogen/Gibco、Paisley、UK)で培養した。複合体は、無血清DMEMで0.75μgのpCMV−BGalを希釈し、そして、75μLの無血清DMEM中で適当量のSWNT−NH3 +1、MWNT−NH3 +2又はSWNT−Lys−NH3 +3を希釈することにより形成し、DNA0.75μgを有する目的の電荷比を作成した。DNA溶液は、迅速なピペッティングにより、f−CNTと混合し、そして30分間で安定化させた。完全培地を前記A549細胞から取り除き、そして各種のf−CNT:DNA複合体150μLに置換した。コントロールとして、培地のみで処理した細胞、又はDNA0.75μgを含む培地で処理した細胞を、使用した。細胞を37℃で90分間、複合体と培養し、そして、次にトランスフェクション培地を除去し、完全培地に置き換えた。細胞を48時間置き、PBS中で1回洗浄し、溶解し、そしてトロピックス・ガラクトライト・プラスキット(Tropix Galactolight Plus kit:Applied Biosystems、CA、U.S.A.)及びルマットLB(Lumat LB)9507照度計(Berthold、Technologies、Bad Wildbad、Germany)を使用しβ−ガラクトシダーゼの発現を分析した。データは、DNAのみの群を引いた後、3つのサンプルの平均として示し、平均のプラス/マイナスの標準偏差を示した。
プラスミドDNAとf−CNTとの相互作用の後に形成される複合体を視覚化するために、SWNT−NH3 +1とMWNT−NH3 +2との両方を走査電子顕微鏡(SEM)によりβ−gal発現プラスミドの存在下(図8A〜8F)で、分析した。
5μg/mL濃度のプラスミドDNAと複合化されている水溶液中の180μg/mL濃度のSWNT−NH3 +1(6:1電荷比を生じる)が、生体内での遺伝子発現のピークレベルを作り出すことを、前記の観察は(実施例2)は証明した。本実験において、SEMにより得られる複合体の物理的特性及び形態特性を調べるために、前記と同じ条件を使用した。同じDNA濃度と複合化される場合、利用可能な機能化アミノ基(0.90mmol/g NH2)の使用量が相違するので、MWNT−NH3 +2を99μg/mL濃度で可溶化し、同等の電荷比を作成した。カーボンナノチューブ:DNA複合体を6:1の電荷比で形成した場合、塊状の構造の非常に鮮明な像が、前記SEMサンプルグリッド(図8A〜8F)を通じて観察された。
また、図12A〜図12Cのデータは以前の実験と著しく一致していることがわかる。SWNT−NH3 +:DNAの場合において、強い蛍光シグナルは、1:1電荷比(図12A)に相当するレーン2中で観察され、多量の遊離DNAが存在していることを示している。電荷比が6:1まで増加するにつれて、蛍光強度の強い減少、及び前記遊離DNAバンドの上方へのシフトの増加が起こるが、前記+/−電荷比が10:1に更に増加しても、相違はほとんど見られない。複合化したDNAの量がこの範囲ではプラトーに達していることをピコグリーンデータは示していたので、これは予想されることである(図11Aも参照)。SWNT−NH3 +:DNAの複合化と比較した場合、SWNT−Lys−NH3 +3及びDNAの複合化(図12B)はより強いものであり、それは、遊離DNAバンドの総体的により弱い蛍光強度、及び電荷比の増加に伴う蛍光の漸進的な消失により観察されるものである。それは、挿入に利用可能な遊離DNA量が、更にもっと減少していることを示している。MWNT−NH3 + 2の場合において、存在する遊離DNAの量がとても小さいために、前記1:1電荷比でかすかな蛍光シグナルのみを見ることができる(lane 2、図12C、また図11C参照)。同じレーンにおいて、検出されたかすかなスメアーは、前記MWNT−NH3 +2と相互作用するDNAによるものであるが、完全に凝縮されていないものであると我々は信じており、いくらかのEtBr挿入を許し、またこれらの複合体の広く大量な分布を示している。より高いMWNT−NH3 +:DNA比においては、DNAの全体の量は完全に凝縮されているので、蛍光バンドは消失する。
水中で10と100μg/mLとの間の濃度のDTPAをもつ機能化カーボンナノチューブを、PBSバッファー中の0.1と1μMとの間の濃度でタンパク質と2時間混合する。タンパク質は、例えば、ストレプトアビジン、プロテインA、ウシ血清アルブミン、チトクロームCを含む。特に、7より大きい等電点をもつタンパク質が静電相互作用を完全に有効に利用できるために理想的である。前記複合体はTEM及びAFMによって特性を明らかにされ、そしてその後に細胞に供給される。
Claims (23)
- 正電荷及び/又は負電荷を含むカーボンナノチューブの使用であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも1つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面に共有結合しており、前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的であり、そして前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも1つを含んでおり、及び/又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも1つを含んでいるものとする、前記カーボンナノチューブと荷電分子少なくとも1つ(但し、前記荷電分子はCl−とTFA−と異なっている)との複合体の製造への、前記使用。
- 正電荷及び/又は負電荷を含む前記カーボンナノチューブの使用であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも1つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的であり、そして前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも1つを含んでおり、及び/又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも1つを含んでいる、前記カーボンナノチューブと約115より大きい分子量を有する荷電分子少なくとも1つとの複合体の製造への、前記使用。
- 正電荷及び/又は負電荷を含んでいるカーボンナノチューブと荷電分子少なくとも1つとを含む複合体であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも1つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、
前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子は負電荷少なくとも1つを含んでおり、及び/又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は少なくとも1つの正電荷を含んでおり(但し、前記荷電分子がCl−とTFA−と異なるものとする)、
前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電的である、前記複合体。 - 正電荷及び/又は負電荷を含んでいるカーボンナノチューブと約115より大きい分子量を有する荷電分子少なくとも1つを含む複合体であって、前記電荷が電荷を担持している基少なくとも1つによって担持され、前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面において共有結合しており、そして、前記カーボンナノチューブが正電荷を含む場合は、前記荷電分子が負電荷少なくとも1つを含んでおり、及び/又は前記カーボンナノチューブが負電荷を含む場合は、前記荷電分子は正電荷少なくとも1つを含んでおり、
前記カーボンナノチューブと前記荷電分子との結合が本質的に静電結合である、前記複合体。 - 複合体が、水性溶媒に可溶であり、そして毒性がないことを特徴とする、請求項3又は4に記載の複合体。
- 荷電分子と前記カーボンナノチューブの結合エネルギーが約90kJ/mol未満であり、特に約12kJ/molから約85kJ/molであり、より特には約20kJ/molから約70kJ/molであり、そして好ましくは約20kJ/molから約50kJ/molであることを特徴とする、請求項3〜5のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記カーボンナノチューブが正電荷又は負電荷のいずれかを含み、そして前記荷電分子がそれぞれ負電荷少なくとも1つ、又は正電荷少なくとも1つのいずれかを含む、請求項3〜6のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記カーボンナノチューブが、前記荷電分子の電荷当たり約0.001〜約100電荷、特に約1〜約20電荷を含む、請求項7に記載の複合体。
- 前記カーボンナノチューブが、前記荷電分子の存在する又は存在しない有機溶媒及び/又は水性溶媒中において、実質的に無傷であり、そして可溶であり、及び前記電荷を担持している基が前記カーボンナノチューブの表面上に均一に分布している、請求項3〜8のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記カーボンナノチューブが、単層カーボンナノチューブ(SWNT)又は多層カーボンナノチューブ(MWNT)である、請求項3〜9のいずれか一項に記載の複合体。
- 前記カーボンナノチューブが、下記の一般式:
[Cn]−Xm
(式中、Cnは、実質的に一定の直径で、実質的に円筒形であるカーボンナノチューブの表面の炭素であり、前記直径が約0.5〜約50nmであり、特に、SWNTにおいて約0.5〜5nmであり、MWNTにおいて約20〜約50nmであり、
Xは、同一又は異なる、1又は数個の官能基であり、但し、X基少なくとも1つが、電荷を担持している基少なくとも1つを含み、
nは約3・103〜約3・106の整数であり、
mは約0.001n〜約0.1nの整数であり、
カーボンナノチューブ表面cm2当たり約2・10−11mol〜約2・10−9molの官能基Xが存在している)
で表される、請求項3〜10のいずれか一項に記載の複合体。 - Xが、2つの異なる官能基X1及びX2であり、そして前記カーボンナノチューブが下記の式:
[Cn]−[X1 m1][X2 m2]
(式中、m1及びm2は、相互に独立し、約0.001n〜約0.1nの整数を示し、但し、X1又はX2少なくとも一方が、電荷を担持している基少なくとも1つを含むものとする)
で表されている、請求項11に記載の複合体。 - Xが、同一又は異なる、1又は数個の置換されたピロリジン環であり、但し、前記置換されたピロリジン環少なくとも1つが電荷を担持している基少なくとも1つによって置換されている、下記の一般式(I):
(式中、Tは、カーボンナノチューブであり、R及びR’は、相互に独立し、−H、又は式−M−Y−(Z)a−(P)bで表される基であり、aは0又は1であり、そしてbは0〜8の整数であり、好ましくは0、1又は2であり、Pは、bが1より大きい場合に同一又は異なる基であり、但し、R及びR’は同時に水素原子とすることはできないものであり、そして、
Mは、約1〜約100原子のスペーサー基、例えば−(CH2)γ−又は−(CH2−CH2−O)γ−CH2−CH2−を含む群から選択される基、γは1〜20の整数であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、
Yは、a=b=0の場合の反応基、例えば−OH、−NH3 +、−COO−、−SH、−CHO、ケトン例えば−COCH3=、アジ化物、又はハロゲン化物を含む群から選択される基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、
又は、a又はbが0と異なる場合に、反応基から誘導され、例えば−O−、−NH−、−COO−、−S−、−CH=、−CH2−、−CCkH2k+1=、kは1〜10の整数であり、特には−CCH3、又は−CHCkH2k+1−であり、kは1〜10の整数であり、特には−CHCH3−を含む群から選択される基であり、
Zは、リンカー基、例えばa=1、及びb=0の場合に以下の式の1つの基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含んでおり、P基少なくとも1つと結合する傾向があり、そして、必要な場合には前記P基を放出する傾向があり、
qは、1〜10の整数であり、又は、
a=1、及びb=1又は2の場合に、以下の式の1つで表され、
qは、1〜10の整数であり、
Pは、有効基であり、あてはまる場合には電荷を担持している基を含み、前記機能化カーボンナノチューブの分光検出を可能にし、フルオロフォア、例えばFITC、キレート剤、例えばDTPA、又は生物学的作用を誘発する傾向がある活性分子、例えばアミノ酸、ペプチド、擬似ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、例えば酵素又は抗体、核酸、炭水化物又は薬であり、
あてはまる場合にはY、Z、又はP基少なくとも1つを、キャッピング基、例えばCH3CO−(アセチル)、メチル、エチル、ベンジルカルボニル、又は保護基、例えばメチル、エチル、ベンジル、tert−ブチル、トリチル、3−ニトロ−2−ピリジルサルフェニル、tert−ブチルオキシカルボニル(Boc)、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、ベンジルオキシカルボニル(Cbz)、ベンゾイル(Bz)、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル、フタルイミド、ジメチルアセタール、又は1,3−ジオキソランによって置換することができる)
の、請求項11又は12に記載の複合体。 - 前記荷電分子が、
2〜106のヌクレオチドを含む核酸、例えばRNA又はDNA、特にはプラスミド又は人工染色体、
2〜5000、好ましくは50〜5000のアミノ酸を含むペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、
炭水化物、特には正電荷の炭水化物、例えばグルコサミン又はキトサン、
放射性核種、及び
細胞毒の分子を含む群から選択されている、請求項3〜16のいずれか一項に記載の複合体。 - 荷電分子を細胞内に運ぶための、請求項3〜21のいずれか一項に記載の複合体の使用。
- 薬剤学的に許容可能な担体と共に、複合体、例えば請求項3〜21のいずれか1項と同じ意味である複合体を、活性物質として含む、医薬組成物。
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