JP2008500269A - 天然免疫グロブリン結合試薬とその作製及び使用方法 - Google Patents

Abstract

抗体を含む単離天然免疫グロブリン結合試薬と、前記天然免疫グロブリン結合試薬を含む製品、組成物及びキットを提供する。標識試薬と試料又は試薬を含む支持体も提供する。試薬のスクリーニング、作製及び使用方法も提供する。

Description

（関連出願とのクロスリファレンス）
本願はＵＳＳＮ６０／５０９，８５０（発明の名称“ＮＡＴＩＶＥ ＩＭＭＵＮＯＧＬＯＢＵＬＩＮ ＢＩＮＤＩＮＧ ＲＥＡＧＥＮＴＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＡＮＤ ＵＳＩＮＧ ＳＡＭＥ”発明者Ｓｅｅｄ及びＬｉ，出願日２００３年１０月８日）の非仮特許出願である。本願はＵＳＳＮ６０／５０９，８５０の優先権を主張し、その開示内容全体を参考資料として全目的で本明細書に組込む。

（発明の技術分野）
本発明は一般に変性免疫グロブリンよりも天然免疫グロブリンと優先的に結合する結合試薬に関する。本発明は一般にこれらの結合試薬の作製方法と、各種研究、診断及び治療背景におけるその使用方法にも関する。これらの方法と結合試薬は限定されないが、抗体に対する抗体に関するものを含めた広範な免疫相互作用の分析（例えばイムノブロットした蛋白質の分析）を実質的に改善及び強化する。本発明は新規抗体とその作製及び使用方法にも関し、限定されないが、天然免疫グロブリンと優先的に結合するモノクローナル抗体とポリクローナル抗体が挙げられる。本発明はこのようなモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマと、前記抗体をコードする核酸分子を発現する組換え宿主細胞にも関する。本発明はこれらの抗体と結合試薬を利用する研究、治療及び診断方法及び組成物、並びに前記組成物を含むキットにも関する。

モノクローナル抗体生産の最初の実証の１つは１９７５年にＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎにより行われた［２５６ ＮＡＴＵＲＥ ４９５−４９７（１９７５）］。以来、各種ハイブリッド細胞（「ハイブリドーマ」と言う）の作製と各種科学研究におけるこれらのハイブリドーマにより産生された抗体の使用に多大な労力が払われている。例えば、ハイブリドーマからモノクローナル抗体を生産する試みの成果、問題及び各種実例のいくつかを例証した米国特許第４，５１５，８９３号（発明の名称“Ｈｙｂｒｉｄ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｆｉｘｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌｓ”）参照。モノクローナル抗体の生産は使用する抗原の種類と所望ハイブリドーマの単離に使用する選択方法に影響される。

免疫系は蛋白質混合物中の多量の免疫優性エピトープに対して応答を発生する傾向があるため、これらの従来のモノクローナル抗体生産技術の多くは免疫優性エピトープに対するモノクローナル抗体を作製している。免疫原性が殆どないか又は弱い蛋白質に特異的な抗体を生産しようとすると、問題が生じることが多い。更に、他の蛋白質との間に有意な配列類似性をもつ蛋白質に特異的な抗体の単離も困難である。サブトラクティブ免疫は少量であるか、免疫原性が低いか、及び／又は他の蛋白質と配列又は構造が類似する抗原に特異的な抗体を作製するために利用されている定着技術である［Ｚｉｊｌｓｔｒａら，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ／Ｅｐｉｔｏｍｅ，Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ”，３０３（３）ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．，７３３−７４４（２００３）；Ｌｉａｎ−Ｊｕｎｅ Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｗｅｎ−Ｌｉａｎｇ Ｗａｎｇ，“Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｍａ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ”，８（５）ＷＯＲＬＤ Ｊ．ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬ，８０８−８１４（２００２）］。

細胞溶解液等の粗蛋白質混合物からの標的蛋白質の精製と同定は一般に免疫沈降法の後にイムノブロット法を実施することにより行われる。免疫沈降法は該当蛋白質を捕獲及び沈降させるために樹脂等の不溶性支持体に固定した特異抗体を利用するものである。未結合蛋白質を遠心により除去し、該当蛋白質を溶出用緩衝液により固体支持体から回収すると共に樹脂に結合した抗体を変性させて遊離させる。

細胞生物学研究で一般に使用されている古典的な免疫沈降法は免疫沈降した蛋白質バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により分離する。しかし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析される蛋白質は樹脂から遊離した変性抗体に由来する重鎖と軽鎖も含んでいる。従って、特にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後にイムノブロット法（例えばウェスタンブロット）を実施する場合には、ブロット抗体を検出するために使用される標識二次抗体は免疫沈降抗体の変性重鎖及び軽鎖とも反応するので精製蛋白質の分析が困難になる。該当蛋白質の分子量が抗体重鎖又は軽鎖に近いために蛋白質がそれらの存在によりマスクされる場合にはデータ解釈が更に困難になる。

プロテオミクス研究は蛋白質発現パターン、蛋白質−蛋白質相互作用、翻訳後修飾及び蛋白質機能等の多数の研究のために古典的免疫沈降法／イムノブロット法に主に依存している。イムノブロットに及ぼす変性重鎖及び軽鎖の存在の影響を除去又は最小限にすることを目的とした現在利用可能な技術と製品は不十分であり、用途が限られており、これらの問題の良好な解答にはなっていない。Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬに所在のＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ製品「Ｓｅｉｚｅ Ｘ」は抗原結合部位がプロテインＡ又はＧ支持体側を向かないように抗体を正しく配向してビーズ上のプロテインＡ又はＧと一次抗体を架橋させるために架橋剤ＤＳＳを使用している。この固定化技術により研究者らは一次抗体を再使用することができ、その最終試料中の重鎖と軽鎖による汚染を低減することができる。しかし、Ｓｅｉｚｅ Ｘキットには、（ｉ）免疫沈降の強化のためにこれを使用するには更に１時間を要するという時間の問題と、（ｉｉ）操作に付加段階を要するという複雑さの問題等の欠点がある。
米国特許第４，５１５，８９３号 Ｚｉｊｌｓｔｒａら，"Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ／Ｅｐｉｔｏｍｅ，Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ"，３０３（３）ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．ＲＥＳ．ＣＯＭＭＵＮ．，７３３−７４４（２００３） Ｌｉａｎ−Ｊｕｎｅ Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｗｅｎ−Ｌｉａｎｇ Ｗａｎｇ，"Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｍａ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ"，８（５）ＷＯＲＬＤ Ｊ．ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬ，８０８−８１４（２００２）

本発明以前に、この目的で天然免疫グロブリンを優先的に認識する試薬は入手できなかった。本発明はこのような試薬と、以下の記載を精読することにより理解される他の特徴を提供する。

本発明は１態様において新規結合試薬と、天然免疫グロブリンを優先的に検出するためのその利用方法を提供する。これらの結合試薬とその作製及び使用方法は限定されないが、イムノブロットした蛋白質の検出法のように天然抗体分子の検出を伴う任意方法等の広範な研究、診断及び治療法で実質的に結果を強化する。本発明の結合試薬とその利用方法は抗体に対する抗体を使用する任意場合に広範な研究技術及び診断法でも有用である。

これらの結合試薬を本明細書では天然免疫グロブリン特異的結合試薬（ＮＩｇＳＢＲ）と言う。ＮＩｇＳＢＲは任意型の分子又は化合物とすることができ、限定されないが、有機及び無機小分子、蛋白質、ペプチド、抗体、核酸、多糖、又は天然免疫グロブリンと特異的に結合する他の任意分子が挙げられる。例えば、ＮＩｇＳＢＲはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体部分、抗体フラグメント、抗体変異体、組換え蛋白質、ポリマースカフォールド、組換え化合物、ポリペプチド、哺乳動物システムで作製されたポリマー、非哺乳動物システムで作製されたポリマー、ファージディスプレイにより大腸菌で作製されたポリマー等とすることができる。

これらのＮＩｇＳＢＲは例えば１種以上の化合物をスクリーニングし、天然免疫グロブリンと特異的に結合する化合物を同定することにより生産することができる。例えば、ＮＩｇＳＢＲは抗体ライブラリー、蛋白質スカフォールドライブラリー、ペプチドディスプレイライブラリー、特異的進化ライブラリー、蛋白質アレイライブラリー等のライブラリーから同定することができる。ＮＩｇＳＢＲを含む組成物はＮＩｇＳＢＲと、組成物の用途に応じて希釈剤、アジュバント、キャリヤー等の他の材料を含有することができる。ＮＩｇＳＢＲは例えば化学発光剤、放射性同位体、酵素、蛍光剤、発色剤等で標識することができる。同様に、ＮＩｇＳＢＲを含む製品（例えば研究又は診断用キット）は更にパッケージング材料と支持体に固定化した組成物を含む容器を含むことができる。

本発明は天然免疫グロブリンの検出及び／又は定量を可能にする結合特異性をもつＮＩｇＳＢＲを提供するＮＩｇＳＢＲの同定及び単離方法を含む。本発明のＮＩｇＳＢＲでは液相又は固相検出法を使用することができる。例えば、好ましい各種検出フォーマットにおいて、ＮＩｇＳＢＲ又はＮＩｇＳＢＲにより検出される試料は固体支持体（例えばビーズ、プレート、シート、ストリップ、ウェル、チューブ等）に固定することができる。あるいは、液相検出フォーマットを使用することができ、その後に例えば結合成分の電気泳動を実施することができる。

上記のように、本発明は好適側面では新規抗体を含むＮＩｇＳＢＲと、天然免疫グロブリンを優先的に検出するための方法で使用するその作製方法を提供する。例えば、本発明は免疫グロブリン抗原に対する抗体をスクリーニングし、天然免疫グロブリンと特異的に結合する抗体を同定することにより、抗天然免疫グロブリン特異抗体（この場合に該当ＮＩｇＳＢＲは「抗ＮｉｇＳＡｂ」である）等の少なくとも１種の天然免疫グロブリン特異的結合試薬を生産する方法を提供する。抗体は本明細書に記載する任意形態をとることができ、ＮＩｇＳＢＲ一般について記載する任意検出フォーマットで使用することができる。これらの抗体は限定されないが、イムノブロットした蛋白質の検出法のように天然抗体分子の検出を伴う任意方法等の広範な研究、診断及び治療法で実質的に結果を強化する。本発明の方法と抗体は例えば抗体に対する抗体を使用する任意場合に広範な研究技術と診断法にも有用である。本発明の方法と抗体は天然免疫グロブリンと特異的に結合できるというユニークな特徴により、限定されないが、免疫沈降法やウェスタンブロット法を含む免疫法で使用する場合に実質的に結果を改善する。

従って、例えばその天然状態と変性状態の免疫グロブリンを区別する能力をもつ単離抗ＮＩｇＳＡｂを含む均質抗体製剤が提供される。本発明の抗体は例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体部分、抗体フラグメント、抗体変異体、抗ＮＩｇＳＡｂ、抗ＮＩｇＳＡｂ部分、抗ＮＩｇＳＡｂフラグメント、又は抗ＮＩｇＳＡｂ変異体とすることができる。抗体はヒト、霊長類、齧歯類、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ウマ、ロバ、ヒツジ、又はヤギ等の哺乳動物で産生させてもよいし、及び／又はキメラヒト化抗体でもよいし、及び／又はＣＤＲグラフト抗ＮｉｇＳＡｂでもよい。

例えば、抗体は変性免疫グロブリンの投与後に天然免疫グロブリンを免疫するサブトラクティブ免疫により哺乳動物で産生させることができる。得られたポリクローナル抗体を例えば不溶性支持体（例えばビーズ、プレート、ウェル、チューブ、膜又はシート）に固定した変性免疫グロブリンでサブトラクトすることができる。

抗ＮｉｇＳＡｂと適切な希釈剤、アジュバント、又はキャリヤーを含有する組成物も提供する。本明細書に記載し、実施可能になった切断産物と他のその特定部分及び変異体、抗ＮＩｇＳＡｂ組成物、コーディング又は相補的核酸、ベクター、宿主細胞、抗ＮｉｇＳＡｂ産生用細胞株、組成物、製剤、装置、製品（例えばキット）、トランスジェニック動物、トランスジェニック細胞、トランスジェニック植物、並びにその作製及び使用方法と、当分野で公知のものとのそれらの組み合わせも提供する。

例えば、本発明はパッケージング材料と少なくとも１種のＮＩｇＳＢＲ（例えば単離抗ＮＩｇＳＡｂ）を含む容器を含む例えば研究又は診断用製品を提供する。ＮＩｇＳＢＲ（例えば抗ＮｉｇＳＡｂ）は製品を使用し易くするために一般に検出可能に標識されている。入手可能な任意標識を使用することができ、例えば化学発光剤、放射性同位体、酵素、蛍光剤、発色剤等が挙げられる。１例では、標識は検出可能な生成物を生成する酵素を含む。例えば、酵素はＨＲＰ酵素とすることができる。キット形態の製品は更に例えば抗ＮｉｇＳＡｂ又は他のＮＩｇＳＢＲ、対照試薬、希釈剤等の使用説明書を含むことができる。

本発明の少なくとも１種の抗体は少なくとも１種の天然免疫グロブリン蛋白質、サブユニット、コンホメーション、フラグメント、部分又はその任意組み合わせに特異的な少なくとも１個の特定エピトープと結合し、このようなエピトープとしては限定されないが、任意クラス又はアイソタイプの免疫グロブリン分子に由来する天然重鎖又は軽鎖に存在する任意エピトープが挙げられる。少なくとも１個のエピトープは前記蛋白質の少なくとも一部を含む少なくとも１個の抗体結合領域を含むことができ、前記エピトープは線状でも立体構造でもよく、少なくともその一部の１〜５個又は５個以上のアミノ酸から構成することができ、限定されないが、前記免疫グロブリン蛋白質の天然形又はその任意部分に存在する少なくとも１個の線状又は立体構造のドメインが挙げられる。線状エピトープはアミノ酸の連続配列を含み、コンホメーションエピトープは連続でなくてもよいが、抗原の一次、二次、三次又は四次構造から形成されるアミノ酸を含む。本発明の少なくとも１種の抗体は非変性免疫グロブリンと結合することが好ましい。

本発明の別の態様における少なくとも１種の抗ＮＩｇＳＡｂは場合により少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば重鎖又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３）及び／又は少なくとも１個の定常又は可変フレームワーク領域又はその任意部分の少なくとも１個の特定部分を含むことができる。抗ＮＩｇＳＡｂアミノ酸配列は更に場合により本明細書に記載するか又は当分野で公知のように少なくとも１個の特定置換、挿入又は欠失を含むことができる。

本発明は本明細書に記載するような少なくとも１種の単離モノクローナル抗ＮＩｇＳＡｂを提供し、前記抗体は限定されないが、天然免疫グロブリン分子と優先的に結合する能力等の少なくとも１種の活性をもつ。従って、抗ＮＩｇＳＡｂはモノクローナル抗体であるかポリクローナル抗体であるかに関係なく、公知方法に従って対応する活性をスクリーニングすることができる。

本発明の別の態様では、（ｉ）前記抗体を産生するハイブリドーマと；（ｉｉ）ポリクローナル抗体と；（ｉｉｉ）天然免疫グロブリンと優先的に結合する他の結合試薬の作製方法を提供する。

関連態様では、本発明はハイブリドーマ又は組換え宿主細胞で少なくとも１種の抗ＮＩｇＳＡｂを発現させるための少なくとも１種の方法として、抗ＮＩｇＳＡｂが検出可能及び／又は回収可能な量で発現されるような条件下で本明細書に記載するようなハイブリドーマ又は組換え宿主細胞を培養する段階を含む方法も提供する。抗ＮＩｇＳＡｂを発現する組換え宿主細胞は抗ＮＩｇＳＡｂをコードする核酸分子を含む。

別の態様では、本発明は（ａ）本明細書に記載するような１種以上の単離抗ＮＩｇＳＡｂをコードする核酸、組換え宿主細胞、抗ＮＩｇＳＡｂ、ＮＩｇＳＢＲ、及び／又はハイブリドーマと；（ｂ）適切なキャリヤー又は希釈剤を含有する少なくとも１種の組成物も提供する。キャリヤー又は希釈剤は場合により公知キャリヤー又は希釈剤に準じて試薬グレードでも医薬的に許容可能でもよく、乾燥又は凍結乾燥形態でもよい。組成物は場合により更に少なくとも１種の付加化合物、蛋白質又は組成物を含有することができる。本発明の１態様では、これらの組成物の１種以上を含むキットも含む。

本発明のＮＩｇＳＢＲと方法を使用すると、例えば標準免疫沈降法から持ち込まれる可能性のある汚染性変性抗体により最終イムノブロット段階が妨害されない。本発明のＮＩｇＳＢＲ及び抗ＮＩｇＳＡｂはイムノブロット上の該当蛋白質の検出を実質的に強化し、データ解釈及び提示を実質的に改善する。本発明のＮＩｇＳＢＲ，抗ＮＩｇＳＡｂ、並びにその作製及び使用方法は限定されないが、天然免疫グロブリン分子と変性免疫グロブリン分子が介在し得る方法等の広範な研究、治療及び診断法に適している。

本発明の方法は一般に使用されているイムノブロットプロトコールに付加段階を加えず、細胞生物学及びプロテオミクス研究実験室で一般に使用されている方法に変更を必要としない。免疫沈降段階から持ち込まれる一次抗体の変性重鎖及び軽鎖がイムノブロット上に存在している可能性があるが、これらは本発明の又はＮＩｇＳＢＲ抗ＮＩｇＳＡｂにより全く又は殆ど検出されない。本発明のＮＩｇＳＢＲ、抗ＮＩｇＳＡｂ、及び方法は変性抗体の検出を省くことによりイムノブロットした蛋白質の分析を実質的に簡略にし、強化する。

本発明は１関連側面において、少なくとも１種の特定配列、ドメイン、部分又はその変異体を含む特定ＮＩｇＳＢＲ（例えば抗ＮＩｇＳＡｂ）をコードするポリヌクレオチドを含むか、これに相補的であるか、又はこれとハイブリダイズする単離核酸分子も提供する。本発明は更に前記抗ＮＩｇＳＡｂ核酸分子を含む組換えベクター、前記核酸及び／又は組換えベクターを含む宿主細胞、並びに前記抗体核酸、ベクター及び／又は宿主細胞の作製及び／又は使用方法も提供する。

上記及びその他の広範な本発明の態様は本明細書の開示から当業者に容易に理解されよう。

本発明は抗ＮＩｇＳＡｂ等の単離ＮＩｇＳＢＲと、その作製方法、前記試薬を含有する組成物及びキット、並びに抗ＮＩｇＳＡｂをコードする核酸分子を提供する。本発明は更に限定されないが、研究、治療及び診断方法及び装置等の本発明のＮＩｇＳＢＲ及び抗ＮＩｇＳＡｂの使用方法も含む。本発明のＮＩｇＳＢＲ及び抗ＮＩｇＳＡｂは天然免疫グロブリンと特異的に結合する。

「特異的に結合する」とは抗体等の結合試薬が天然免疫グロブリン蛋白質の特定ポリペプチド（例えばエピトープ）と高いアビディティ及び／又は高い親和性で結合することを意味する。この特定ポリペプチド上のエピトープと抗体の結合は他の任意エピトープ、特に該当特定ポリペプチドと会合している分子中又は該当特定ポリペプチドと同一試料中に存在し得るエピトープと同一抗体の結合よりも強力であることが好ましく、例えば抗体は免疫グロブリンの変性形態又はフラグメントよりも天然免疫グロブリンと強力に結合するため、結合条件を調節することにより、抗体は天然免疫グロブリンとより高い優先度で結合し、免疫グロブリンの変性形態又はフラグメントとの優先度は低い。該当天然免疫グロブリンポリペプチドと特異的に結合する抗体は検出可能なレベルではあるが低レベル（例えば該当天然免疫グロブリンポリペプチドに対する結合の５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、又は０．１％以下）で変性免疫グロブリン等の他のポリペプチドと結合することが可能である。このような結合差、あるいはバックグラウンド結合は例えば適当な対照の使用による該当天然免疫グロブリンポリペプチドとの特異的抗体結合から容易に区別することができる。しかし、当業者に容易に理解される通り、天然免疫グロブリンと変性免疫グロブリンに対する結合に検出可能な差があるならば、該当天然免疫グロブリンと優先的に結合することが明らかである。一般に、約１０^６モル／リットル以上、又は約１０^７、又は約１０^８モル／リットル以上の結合親和性で天然免疫グロブリンと優先的に結合する本発明の抗ＮＩｇＳＡｂは天然免疫グロブリンと特異的に結合する。

抗ＮｉｇＳＡｂ等の「単離」生体成分は副生する生体成分から部分的又は完全に精製される成分である。例えば、抗ＮｉｇＳＡｂは抗ＮｉｇＳＡｂの生産に使用される細胞材料から部分的に精製することができる。単離なる用語は均質までの完全な精製を必要とせず、該当成分は一般に該当アッセイで有用であるために十分な程度まで精製される。本発明の抗ＮｉｇＳＡｂは抗ＮｉｇＳＡｂ又はそのコーディング材料（例えば組換え核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド等）が人的介入により生産又は改変されていることを意味する「組換え」とみなすこともできる。一般に、組換え分子の部分の配置は天然配置ではなく、組換えポリヌクレオチド又はポリペプチドの一次配列は何らかの方法で操作されている。組換え材料を生成する改変はその天然環境又は状態内で材料に実施してもよいし、あるいは外部に取り出してもよい。例えば、天然核酸はその起源である細胞内で実施される人的介入により改変されるか又は改変されたＤＮＡから転写される場合に組換え核酸となる。遺伝子配列オープンリーディングフレームはそのヌクレオチド配列がその天然背景から取り出されて任意型の人工核酸ベクターにクローニングされた場合に組換えである。組換え分子、特に組換え核酸を生産するためのプロトコールと試薬は当分野でよく知られており、日常的に行われている。「組換え」なる用語は組換え材料をもつ生物（例えば組換え核酸を含む細胞、植物又は動物）を意味する場合もある。所定態様では、組換え生物はトランスジェニック生物である。

本発明のＮＩｇＳＢＲ及び抗ＮＩｇＳＡｂは場合により検出可能に標識されたＮＩｇＳＢＲ又は検出可能に標識された抗ＮＩｇＳＡｂを提供するように検出可能に標識することができる。「検出可能に標識」、「検出可能に標識されたＮＩｇＳＢＲ」又は「検出可能に標識された抗ＮＩｇＳＡｂ」とは検出可能な標識を付着した任意物質（抗体もしくは抗体フラグメント又は天然免疫グロブリンに対する結合特異性を維持する他の任意化合物）を意味する。検出可能な標識は一般に化学結合により付着されるが、標識がポリペプチドである場合には、遺伝子組換え技術により付着することもできる。検出可能に標識された蛋白質の生産方法は当分野で周知である。検出可能な標識は当分野で公知の各種標識から選択することができるが、一般には放射性同位体、フルオロフォア、常磁性標識、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、又は検出可能なシグナル（例えば放射能、蛍光、発色）を発生するかもしくは標識をその基質に暴露した後に検出可能なシグナルを発生する他の部分もしくは化合物である。各種の検出可能な標識／基質対（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体等の化合物の標識方法、及び標識抗体の使用方法が当分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８８）参照）。

本発明のＮＩｇＳＢＲは任意型の物質とすることができ、蛋白質、抗体、ペプチド、核酸、炭水化物、多糖、及びその部分もしくはフラグメント、又は天然免疫グロブリンと特異的に結合する他の任意有機もしくは無機分子が挙げられる。

本発明の抗体は限定されないが、本発明の抗体に含むことができる重鎖もしくは軽鎖もしくはそのリガンド結合部分の少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、又はその任意部分等の免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含む任意蛋白質又はペプチドを含む。本発明の抗体は限定されないが、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、齧歯類、ヤギ、霊長類、又はその任意組み合わせ等の任意動物を含むか又はそれに由来することができる。

結合試薬又は抗体／抗原結合力
抗原と抗体（又は任意結合試薬）を結合する力は任意の２種の無関係の蛋白質（例えばヒト血清アルブミンやヒトトランスフェリン等の他の巨大分子）間に生じる非特異的相互作用と本質的に変わらない。これらの分子間力は一般に（１）静電力；（２）水素結合力；（３）疎水力；及び（４）ファンデルワールス力の主に４種類に分類される。静電力は２本の蛋白質側鎖上の逆電荷のイオン基間の吸引による。吸引力（Ｆ）は電荷間の距離（ｄ）の二乗に反比例する。水素結合力は−−ＯＨ、−−ＮＨ_２及び−−ＣＯＯＨ等の親水基間の可逆的水素架橋の形成により提供される。これらの力は主にこれらの基をもつ２分子の緊密配置に依存する。疎水力は水中の油滴が結合して大きな１個の液滴を形成すると同様に作用する。従って、バリン、ロイシン及びフェニルアラニン上の側鎖等の非極性疎水基は水性環境で会合する傾向がある。最後に、ファンデルワールス力は外部電子雲間の相互作用に依存する分子間に生じる力である。

各種力の各々に関するその他の情報はＩ．Ｍ．Ｒｏｉｔｔｉ編（６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）“Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９８８から得られる。本発明に関して、ＮＩｇＳＢＲ又は抗ＮＩｇＳＡｂはこれらの力の一部又は全部を示す。これらの力を大量に蓄積することにより、天然免疫グロブリン蛋白質に対して高度の親和性は結合力をもつＮＩｇＳＢＲ又は抗ＮＩｇＳＡｂを得ることができる。当業者は本明細書に記載する方法と当分野で一般に入手可能な方法を併用することにより天然免疫グロブリンに対する特異結合について広範な化合物又は抗体を容易にスクリーニングすることができる。

結合試薬又は抗体／抗原結合強度の測定
ＮＩｇＳＢＲ又は抗ＮＩｇＳＡｂと天然免疫グロブリンの結合親和性は測定することができ、上記全力の測定の蓄積である。このような測定を実施するための標準方法は当業者に周知であり、天然免疫グロブリンに対する本発明の任意化合物又は抗体の親和性を測定するために直接適用することができる。

抗体／抗原結合親和性を測定する標準方法の１つは抗原に浸透性であり且つ抗体に非浸透性の材料から構成される容器である透析チューブの使用である。この方法は本発明の非抗体ＮＩｇＳＢＲ等の抗体以外の他の結合試薬にも有用である。抗体と完全又は部分的に結合した抗原を水等の溶媒中で透析チューブに入れる。次に、抗体又は抗原を入れずに溶媒（例えば水）のみを入れた大型容器にチューブを移す。抗原のみがチューブの透析膜を通って拡散することができるので、透析チューブ内の抗原の濃度と外部の大型容器内の抗原の濃度は平衡し始める。透析チューブを大型容器に入れて平衡に達するまで経過させた後に、透析チューブ内と周囲容器内の抗原の濃度を測定した後、濃度差を決定することができる。こうして、透析チューブ内で抗体に結合したままの抗原量と抗体から解離して周囲容器内に拡散する量を計算することができる。周囲容器内に拡散する抗原を除去するように周囲容器内の溶媒（例えば水）を絶えず交換することにより、透析チューブ内で抗体を抗原から完全に解離させることができる。周囲溶媒が交換されないならば、システムは平衡に達し、反応の平衡定数（Ｋ）、即ち抗体と抗原の会合と解離を計算することができる。平衡定数（Ｋ）は透析チューブ内の抗原に結合した抗体の濃度を遊離抗体結合部位濃度で割り、遊離抗原濃度を掛けた値として計算される。平衡定数又は「Ｋ」値は一般に１モル当たりのリットル値として測定される。Ｋ値は抗原と抗体の複合体と比較した遊離状態の抗原と抗体の遊離エネルギーの差の尺度である。

結合試薬又は抗体アビディティ
上記のように、「親和性」なる用語は抗体等の結合試薬と単一抗原決定基の結合を意味する。しかし、多くの場合には抗体と多価抗原の相互作用が問題となる。「アビディティ」なる用語はこの結合を表すために使用される。アビディティに寄与する因子は複雑であり、抗原上の２個以上の決定基と決定基自体の不均質性に対するポリクローナル試料中の抗体の不均質性が挙げられる。大半の抗原は多価であるため、２個の抗原分子と抗体の結合は個々の抗体相互作用の算術的合計よりも大きくなり、場合によっては何倍にもなる。従って、抗血清と多価抗原の間のアビディティ測定値は抗体と単一抗原決定基の間のアビディティよりも多少大きいと理解することができる。

本明細書で使用する「エピトープ」なる用語は抗原結合領域の１個以上で結合試薬又は抗体により認識されて結合することが可能な任意分子の部分を意味する。エピトープは任意分子又はその基とすることができ、限定されないが、アミノ酸と糖側鎖が挙げられ、特定三次元構造又はコンホメーションをもつことができる。エピトープは当分野で一般に使用されている用語としての一次、二次、三次又は四次構造を含む蛋白質分子の任意部分を含むことができる。

本明細書で使用する「抗ＮＩｇＳＡｂ」、「抗ＮＩｇＳＡｂ部分」、又は「抗ＮＩｇＳＡｂフラグメント」及び／又は「抗ＮＩｇＳＡｂ変異体」等は限定されないが、重鎖もしくは軽鎖もしくはそのリガンド結合部分の少なくとも１個の相補性決定領域（ＣＤＲ）、重鎖もしくは軽鎖可変領域、重鎖もしくは軽鎖定常領域、フレームワーク領域、又はその任意部分等の免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含む分子を含む任意蛋白質又はペプチドを含む。非限定的な例として、本発明の適切な抗ＮＩｇＳＡｂ、特定部分又は変異体は少なくとも１種の天然免疫グロブリン分子、又はその特定部分、変異体もしくはドメインと結合することができる。抗ＮＩｇＳＡｂ又は「抗体」なる用語は更に抗体、抗体消化フラグメント、特定抗体部分及びその変異体（抗体ミメティクス、あるいは抗体又は１本鎖抗体とそのフラグメント等の特定フラグメントもしくはその部分の構造及び／又は機能に似た抗体部分を含む）を含む。機能的フラグメントとしては、非変性免疫グロブリン分子と結合する抗原結合フラグメントが挙げられる。例えば、天然免疫グロブリン分子又はその部分と結合することができる抗体フラグメントが本発明に含まれ、限定されないが、（例えばパパイン消化による）Ｆａｂ、（例えばペプシン消化と部分還元による）Ｆａｂ’及び（例えばペプシン消化による）Ｆ（ａｂ’）_２、（例えばプラスミン消化による）ｆａｃｂ、（例えばペプシン又はプラスミン消化による）ｐＦｃ’、（例えばペプシン消化、部分還元及び再凝集による）Ｆｄ、（例えば分子生物学技術による）Ｆｖ又はｓｃＦｖフラグメントが挙げられる。その開示内容全体を本明細書に組込むＰａｕｌ（ｅｄ．）ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＦＯＵＲＴＨ ＥＤＩＴＩＯＮ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，ＮＹ，ＮＹ（１９９９）も参照。

このようなフラグメントは当分野で公知のように及び／又は本明細書に記載するように酵素切断、合成又は組換え技術により生産することができる。１種以上の終止コドンを天然終止部位の上流に導入した抗体遺伝子を使用して各種短縮形の抗体を生産することもできる。例えば、重鎖のＣＨ_１ドメイン及び／又はヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むようにＦ（ａｂ’）_２重鎖部分をコードする組み合わせ遺伝子を設計することができる。抗体の各部分を従来技術により化学的に結合することもできるし、遺伝子工学技術を使用して連続蛋白質として作製することもできる。

少なくとも２種の異なる抗原に結合特異性をもつモノクローナル抗体である２価、異種特異的、ヘテロコンジュゲート又は同様の抗体を使用することもできる。本発明の場合には、結合特異性の一方は少なくとも１種の天然免疫グロブリン分子又はその部分に対する特異性であり、他方は他の任意抗原に対する特異性である。２価抗体の作製方法は当分野で公知である。従来、２価抗体の組換え生産は２本の重鎖が異なる特異性をもつ２個の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づくものであった（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，３０５ ＮＡＴＵＲＥ，５３７（１９８３））。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖のランダム組み合わせにより、これらのハイブリドーマ（カドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、そのうちの１個だけが正しい２価構造をもつ。類似方法は例えば各々参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込むＷＯ９３／０８８２９、米国特許第６，２１０，６６８号、６，１９３，９６７号、６，１３２，９９２号、６，１０６，８３３号、６，０６０，２８５号、６，０３７，４５３号、６，０１０，９０２号、５，９８９，５３０号、５，９５９，０８４号、５，９５９，０８３号、５，９３２，４４８号、５，８３３，９８５号、５，８２１，３３３号、５，８０７，７０６号、５，６４３，７５９号、５，６０１，８１９号、５，５８２，９９６号、５，４９６，５４９号、４，６７６，９８０号；ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／００３７３、ＥＰ０３０８９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら，１０ ＥＭＢＯ Ｊ．，３６５５（１９９１）、Ｓｕｒｅｓｈら，１２１ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，２１０（１９８６）に開示されている。

本発明の抗体
本発明の少なくとも１種の抗ＮＩｇＳＡｂは当分野で周知のように、場合により細胞株、混合細胞株、不死化細胞又は不死化細胞のクローン集団により産生させることができる。例えば各々参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込むＡｕｓｕｂｅｌら（Ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７−２００１））；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））及びＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と総称する）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））；Ｃｏｌｌｉｇａｎら（Ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２００１））；Ｃｏｌｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７−２００１））参照。

抗ＮＩｇＳＡｂ又はそのフラグメント、部分及び変異体は単離免疫グロブリン蛋白質又はその部分（合成ペプチド等の合成分子を含む）等の適当な免疫原性抗原に対して産生させることができ、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。他の特定又は一般哺乳動物抗体も同様に産生させることができる。免疫原性抗原の作製とポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体生産は当業者に公知の適切な任意技術を使用して実施することができる。

モノクローナル抗体を作製するための１アプローチでは、限定されないが、Ｓｐ２／０、Ｓｐ２／０−ＡＧ１４、Ｐ３／ＮＳ１／Ａｇ４−１、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＭＣＰ−１１、Ｓ−１９４等の適切な不死細胞株（例えば骨髄腫細胞株）、又はヘテロミエローマ、その融合産物、又はそれらに由来する任意細胞もしくは融合細胞、又は当分野で公知の適切な他の任意細胞株等を融合することによりハイブリドーマを作製する。例えばｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ，ｗｗｗ．ｌｉｆｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ等を参照でき、抗体産生細胞としては限定されないが、単離又はクローン化脾臓、末梢血、リンパ、扁桃、又は他の免疫もしくはＢ細胞含有細胞が挙げられ、あるいは内在又は異種核酸として重鎖又は軽鎖定常又は可変又はフレームワーク又はＣＤＲ配列を発現する他の任意細胞が挙げられ、例えば組換え又は内在のウイルス、細菌、藻類、原核、両生類、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳類、齧歯類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ヒツジ、霊長類、真核、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ又はＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡ又はＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、１本鎖、２本鎖又は３本鎖形態、ハイブリダイズ形態等又はその任意組み合わせが挙げられる。例えば参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込むＡｕｓｕｂｅｌ，前出、及びＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，前出，第２章参照。

抗体産生細胞は該当抗原を免疫した適切な任意動物の末梢血又は好ましくは脾臓又はリンパ節から得ることもできる。抗体、その特定フラグメント、部分、又は変異体をコードする異種又は内在核酸を発現するのに適した他の任意宿主細胞も使用することができる。融合細胞（ハイブリドーマ）又は組換え細胞は選択培養条件又は他の適切な公知方法を使用して単離し、限界希釈法又は細胞ソーティング、又は他の公知方法によりクローニングすることができる。所望の特異性をもつ抗体を産生する細胞は当業者に公知の適切なアッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）により選択することができる。

必要な特異性の抗体を生産又は単離する他の適切な方法も使用することができ、限定されないが、ペプチド又は蛋白質ライブラリー（例えば限定されないが、例えばＣａｍｂｒｉｄｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ；ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ，Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ／Ｐｌａｎｅｇｇ，ＤＥ；Ｂｉｏｖａｔｉｏｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ；ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ；Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐ．，Ｅｎｚｏｎ，Ａｆｆｙｍａｘ／Ｂｉｏｓｉｔｅ；Ｘｏｍａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ；Ｉｘｓｙｓから入手可能なバクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ等のディスプレイライブラリー；例えば各々参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込むＥＰ３６８，６８４；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５；ＰＣＴ／ＧＢ９２／００２２４０；ＰＣＴ／ＧＢ９２／００８８３；ＰＣＴ／ＧＢ９３／００６０５；ＵＳ０８／３５０，２６０（５／１２／９４）；ＰＣＴ／ＧＢ９４／０１４２２；ＰＣＴ／ＧＢ９４／０２６６２；ＰＣＴ／ＧＢ９７／０１８３５；（ＣＡＴ／ＭＲＣ）；ＷＯ９０／１４４４３；ＷＯ９０／１４４２４；ＷＯ９０／１４４３０；ＰＣＴ／ＵＳ９４／１２３４；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９６／０７７５４（Ｓｃｒｉｐｐｓ）；ＥＰ６１４９８９（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）；ＷＯ９５／１６０２７（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ）；ＷＯ８８／０６６３０；ＷＯ９０／３８０９（Ｄｙａｘ）；ＵＳ４，７０４，６９２（Ｅｎｚｏｎ）；ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２９８９（Ａｆｆｙｍａｘ）；ＷＯ８９／０６２８３；ＥＰ３７１９９８；ＥＰ５５０４００；（Ｘｏｍａ）；ＥＰ２２９０４６；ＰＣＴ／ＵＳ９１／０７１４９（Ｉｘｓｙｓ）参照；あるいは確率論的に作製されたペプチド又は蛋白質についてはＵＳ５，７２３，３２３；５，７６３，１９２；５，８１４，４７６；５，８１７，４８３；５，８２４，５１４；５，９７６，８６２；ＷＯ８６／０５８０３；ＥＰ５９０６８９（Ｉｘｓｙｓ，現在ではＡｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（ＡＭＥ）として知られる）参照）から組換え抗体を選択する方法や、当分野で公知のように及び／又は本明細書に記載するようにヒト抗体のレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物の免疫に依存する方法（例えば各々参考資料並びに関連特許及び出願としてその開示内容全体を本明細書に組込むＳＣＩＤ ｍｉｃｅ，Ｎｇｕｙｅｎら，４１ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，９０１−９０７（１９９７）；Ｓａｎｄｈｕら，１６ ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．，９５−１１８（１９９６）；Ｅｒｅｎら，９３ ＩＭＭＵＮＯＬ．，１５４−１６１（１９９８）参照）が挙げられる。このような技術としては限定されないが、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓら，９４ ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４９３７−４９４２（Ｍａｙ，１９９７）；Ｈａｎｅｓら，９５ ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１４１３０−１４１３５（Ｎｏｖ．，１９９８））；シングルセル抗体生産技術（例えば選択リンパ球抗体法（「ＳＬＡＭ」）（米国特許第５，６２７，０５２号；Ｗｅｎら，１７ Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，８８７−８９２（１９８７）；Ｂａｂｃｏｏｋら，９３ ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８４３−７８４８（１９９６））；ゲル微小液滴フローサイトメトリー（Ｐｏｗｅｌｌら，８ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．，３３３−３３７（１９９０）；Ｏｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ；Ｇｒａｙら，１８２ Ｊ．Ｉｍａｍ．ＭＥＴＨ．，１５５−１６３（１９９５）；Ｋｅｎｎｙら，１３ ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬ．，７８７−７９０（１９９５））；Ｂ細胞選択（Ｓｔｅｅｎｂａｋｋｅｒｓら，１９ ＭＯＬＥＣ．ＢＩＯＬ．ＲＥＰＯＲＴＳ，１２５−１３４（１９９４）；Ｊｏｎａｋら，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．５．Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｖ，（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ（Ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８８））が挙げられる。

抗ＮＩｇＳＡｂは場合により本明細書に記載するように及び／又は当分野で公知のようにヒト抗体のレパートリーを産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類等）の免疫により作製することもできる。ヒト抗ＮＩｇＳＡｂを産生する細胞を前記動物から単離し、本明細書に記載する方法等の適切な方法を使用して不死化することができる。

ヒト抗原及び他の外来抗原と結合するヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニックマウスは公知方法により生産することができる（例えば限定されないが、各々参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込む米国特許第５，７７０，４２８号、５，５６９，８２５号、５，５４５，８０６号、５，６２５，１２６号、５，６２５，８２５号、５，６３３，４２５号、５，６６１，０１６及び５，７８９，６５０号（以上Ｌｏｎｂｅｒｇら）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，ＷＯ９８／５０４３３；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，ＷＯ９８／２４８９３；Ｌｏｎｂｅｒｇら，ＷＯ９８／２４８８４；Ｌｏｎｂｅｒｇら，ＷＯ９７／１３８５２；Ｌｏｎｂｅｒｇら，ＷＯ９４／２５５８５；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅら，ＷＯ９６／３４０９６；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅら，ＥＰ０４６３１５１ Ｂ１；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｅら，ＥＰ０７１０７１９ Ａ１；Ｓｕｒａｎｉら，米国特許第５，５４５，８０７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，ＷＯ９０／０４０３６；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，ＥＰ０４３８４７４ Ｂ１；Ｌｏｎｂｅｒｇら，ＥＰ０８１４２５９ Ａ２；Ｌｏｎｂｅｒｇら，ＧＢ ２２７２４４０ Ａ；Ｌｏｎｂｅｒｇら，３６８ ＮＡＴＵＲＥ，８５６−８５９（１９９４）；Ｔａｙｌｏｒら，６（４）ＩＮＴ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，５７９−５９１（１９９４）；Ｇｒｅｅｎら，７ ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ，１３−２１（１９９４）；Ｍｅｎｄｅｚら，１５ ＮＡＴＵＲＥ ＧＥＮＥＴＩＣＳ，１４６−１５６（１９９７）；Ｔａｙｌｏｒら，２０（２３）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ，６２８７−６２９５（１９９２）；Ｔｕａｉｌｌｏｎら，９０（８）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，３７２０−３７２４（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇら，１３（１）ＩＮＴ．ＲＥＶ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，６５−９３（１９９５）及びＦｉｓｈｗａｌｄら，１４（７）ＮＡＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ ８４５−８５１（１９９６）参照）。一般に、これらのマウスは機能的に再配置されているか又は機能的に再配置することができる少なくとも１個のヒト免疫グロブリン遺伝子座に由来するＤＮＡを含む少なくとも１個のトランスジーンを含む。このようなマウスにおける内在免疫グロブリン遺伝子座は動物が内在遺伝子によりコードされる抗体を産生できないように破壊又は欠失することができる。

天然免疫グロブリンに対する１価抗体は天然免疫グロブリンに対して反応性の抗体を含む哺乳動物抗血清から精製するか、又はＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，２５６ ＮＡＴＵＲＥ ４９５−４９７（１９７５）の技術を使用して非変性免疫グロブリンに対して反応性のモノクローナル抗体として作製される。本明細書で使用する１価抗体とは非変性免疫グロブリンに均質な結合特性をもつ単一抗体種又は複数抗体種として定義され、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。本明細書で使用する均質結合とは上記のように、抗体種が特定抗原又はエピトープ（例えば非変性免疫グロブリンに関連するもの）と結合できることを意味する。天然免疫グロブリン特異的抗体はマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ウマ及び／又は同等物等の動物に免疫アジュバントの存在下又は不在下で適当な濃度の天然免疫グロブリンを免疫することにより生産することができ、ウサギが好ましい動物である。

ポリクローナル抗体作製
最初の免疫の前に免疫前血清を採取する。各動物に例えば許容可能な免疫アジュバントと共に天然免疫グロブリン約０．１ｍｇ〜約１０００ｍｇを投与する。このような許容可能なアジュバントとしては限定されないが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ミョウバン沈殿、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍとｔＲＮＡを含む油中水エマルションが挙げられる。初期免疫は天然免疫グロブリンを好ましくはフロイント完全アジュバントに加え、皮下（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）又は両者の複数部位に投与する。各動物から一定間隔、好ましくは１週間おきに採血し、抗体力価を測定する。初期免疫後に動物にブースター注射してもよいし、しなくてもよい。ブースター注射する動物は一般に、等量の抗原をフロイント不完全アジュバントに加えて同一経路で投与する。ブースター注射は最大力価が得られるまで約３週間隔で実施する。各ブースター免疫から約７日後又は単一免疫後約１週間おきに動物から採血し、血清を採取し、アリコートを約−２０℃で保存する。この方法を使用して本発明のポリクローナル本発明の抗ＮＩｇＳＡｂを生産することができる。

シクロホスファミド投与の使用によるサブトラクティブ免疫
サブトラクティブ免疫は標準免疫に代わる強力な方法であり、真にユニークな抗体を生産することができる。サブトラクティブ免疫は標準免疫により得られないモノクローナル抗体の生産に広く実施され、成功を収めている。サブトラクティブ免疫は所望抗原に対するモノクローナル抗体の作製を実質的に強化することができる独特な免疫寛容アプローチを利用する。このアプローチは該当抗原に構造的又は機能的に関連する可能性のある免疫優性又は他の非所望抗原（寛容原）に対して宿主動物を寛容にすることに基づく。宿主動物の寛容は当分野で公知の数種の方法の１つ（Ｈｉｇｈ Ｚｏｎｅ、Ｎｅｏｎａｔａｌ、又は薬剤誘導寛容）により実施することができる。寛容動物に次に所望抗原（免疫原）を接種し、その後の免疫応答により作製された抗体を所望抗原反応性についてスクリーニングする。

外来抗原分子に応答して増殖するように刺激されたＢ細胞を選択的に死滅させることにより、細胞毒性薬剤シクロホスファミドを使用して正常免疫応答の偏りを操作することができる。シクロホスファミド投与後にこれらの分子に暴露すると免疫応答を生じなくなる。サブトラクティブ免疫技術の１例として、マウスを寛容原に暴露した後にシクロホスファミドを注射する。薬剤を排泄させた後にマウスを免疫原に暴露する。理論的に、免疫系は寛容原に存在しない免疫原中の分子のみに免疫学的に応答する。サブトラクティブ免疫技術を使用して本発明の抗ＮＩｇＳＡｂを生産することができる。

本発明の抗ＮＩｇＳＡｂは当分野で公知の技術を使用して簡便に同定することができ、限定されないが、ペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。更に、ペプチドディスプレイライブラリーを使用して本発明のＮＩｇＳＢＲを同定することもできる。この方法は（本発明では天然免疫グロブリン又は１個以上のそのエピトープであり得る）標的分子により認識されるか又はこれと結合する個々のメンバーについて大きなペプチド集団をスクリーニングする。結合試薬を見いだすためのペプチドディスプレイライブラリーのスクリーニングは当分野で周知である。提示されるランダムペプチド配列は３〜５０００以上のアミノ酸長、多くの場合には５〜１００アミノ酸長、たいていは約８〜２５アミノ酸長とすることができる。ペプチドライブラリーを作製するための直接化学合成法に加え、数種の組換えＤＮＡ法が記載されている。１例はバクテリオファージ又は細胞の表面にランダムペプチド配列を提示する方法である。各バクテリオファージ又は細胞は特定提示ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。抗体又は他の標的分子を支持体に固定化し、ペプチドライブラリーをその表面にもつバクテリオファージ又は細胞と共にインキュベートする。例えば参考資料として本明細書に組込むＬｕら，ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１３：３６６−３７２（１９９５）に記載されているようなパニングにより数回選択後に、バクテリオファージコロニーを配列決定し、抗体により認識される共通ペプチド配列を決定する。この方法は抗体又は他の標的分子の抗原認識配列を同定することができる。このような方法はＰＣＴ特許公開ＷＯ９１／１８９８０、ＷＯ９１／１９８１８、及びＷＯ９３／０８２７８に記載されている。

特定標的分子（例えば天然免疫グロブリン又は１個以上のそのエピトープ）に特異的な結合試薬（本発明のＮＩｇＳＢＲ及び抗ＮＩｇＳＡｂ等）を同定するための当分野で周知の別法はその表面にペプチド又は蛋白質分子を発現するウイルス、バクテリオファージ又は宿主細胞の利用である。この方法では、蛋白質、ペプチド、抗体、抗体部分、抗体変異体、抗体フラグメント、複合抗体、融合蛋白質又はハイブリッド蛋白質をコードするＤＮＡがウイルス、バクテリオファージ、宿主細胞又は他の複製コンピテントシステム内に含まれる。これらの分子はウイルス、バクテリオファージ、リボソーム、宿主細胞又は他の複製コンピテントシステムで発現され、１個以上の固定化標的分子と結合することにより選択される。数回選択後、標的結合分子をコードするＤＮＡが単離される。ＰＣＴ特許公開ＷＯ９１／１７２７１参照。ランダム及び特定ペプチドのライブラリーを作製するための他のシステムはｉｎ ｖｉｔｒｏ化学合成法と組換え法の両方の側面をもつ。リボソームディスプレイライブラリーも当分野で公知であり、市販されている（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ，Ａｆｆｉｔｅｃｈ，Ｂｉｏｓｉｔｅ）。ＰＣＴ特許公開ＷＯ９２／０５２５８、ＷＯ９２／１４８４３、及びＷＯ９６／１９２５６参照。米国特許第５，６５８，７５４号及び５，６４３，７６８号も参照。

これらの方法を実施するためのペプチドディスプレイライブラリー、抗体フラグメントディスプレイライブラリー、ハイブリッド蛋白質ディスプレイライブラリー、融合蛋白質ディスプレイライブラリー、ベクター、及びスクリーニングキットは当分野で公知であり、及び／又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、Ｐｈｙｌｏｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）、Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びＭａｘｙｇｅｎ（Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）等の業者から市販されている。例えば米国特許第４，７０４，６９２号、４，８７４，７０２号、４，９３９，６６６号、４，９４６，７７８号、５，２６０，２０３号、５，４５５，０３０号、５，５１８，８８９号、５，５３４，６２１号、５，６５６，７３０号、５，７６３，７３３号、５，７６７，２６０号、５，８５６，４５６号（譲受人Ｅｎｚｏｎ）；５，２２３，４０９号、５，４０３，４８４号、５，５７１，６９８号及び５，８３７，５００号（譲受人Ｄｙａｘ）；５，４２７，９０８号及び５，５８０，７１７号（譲受人Ａｆｆｙｍａｘ）；５，８８５，７９３号（譲受人Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；５，７５０，３７３号（譲受人Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；５，６１８，９２０号、５，５９５，８９８号、５，５７６，１９５号、５，６９８，４３５号、５，６９３，４９３号及び５，６９８，４１７号（譲受人Ｘｏｍａ）；Ｃｏｌｌｉｇａｎ，前出；Ａｕｓｕｂｅｌ，前出；又はＳａｍｂｒｏｏｋ，前出を参照することができ、上記特許及び刊行物は参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込む。

本発明のＮＩｇＳＢＲは各種化合物ライブラリーから同定することもできる。このような化合物は広範な種類のものとすることができ、限定されないが、ペプチド、蛋白質、抗体、核酸、ＤＮＡアプタマー、炭水化物、多糖、融合蛋白質、ハイブリッド分子（例えばペプチド−核酸ハイブリッド）又は他の任意有機もしくは無機分子もしくは分子組み合わせが挙げられる。標的分子と結合する任意メンバーについてこれらの化合物のライブラリーをスクリーニングする。広範な適用可能なスクリーニング方法が当業者に周知である。各種ライブラリーから本発明のＮＩｇＳＢＲを同定するための標的分子としては限定されないが、天然免疫グロブリンとその任意エピトープが挙げられる。本発明のＮＩｇＳＢＲの同定に使用するのに適した各種ライブラリーとしては限定されないが、非免疫グロブリンペプチドをフレームワーク又はスカフォールドとして使用し、標的分子の結合領域として機能する可変アミノ酸配列のセグメントを構築する蛋白質スカフォールドライブラリーが挙げられる。当業者に容易に理解される通り、広範な蛋白質スカフォールドライブラリーがＮＩｇＳＢＲを同定するための本発明の方法で使用するのに適している。これらの各種ライブラリーと、標的分子と結合するメンバーを同定するためのそれらのスクリーニング方法は当分野で周知である（例えばフィブロネクチンをベースとする「Ｔｒｉｎｅｃｔｉｎ」として知られる蛋白質スカフォールド、及びＰｈｙｌｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡの「Ｐｒｏｆｕｓｉｏｎ」として知られるディスプレイ技術；アフィボディＡＢのＳ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡをベースとするアフィボディ；並びにＰｉｅｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｏｌａｂ ＡＧのリポカリンをベースとするＡｎｔｉｃａｌｅｎｓ）。高い特異性と親和性で蛋白質と結合するＤＮＡアプタマー等の非蛋白質捕獲分子もライブラリーとアレイで使用される（ＳｏｍａＬｏｇｉｃ）。当分野で「ＳＥＬＥＸ」として知られる方法はこれらの核酸アプタマーの同定方法の１つである。これらの分子は本発明のＮＩｇＳＢＲを単離するためにこれらの利用可能な技術を使用して当業者により同定される。

特異的蛋白質進化ライブラリーとスクリーニング法も本発明のＮＩｇＳＢＲを同定するために使用することができる。これらの技術は一般に遺伝子レベルでランダムに突然変異を誘導した後に蛋白質レベルで所望特性を選択する。特異的蛋白質進化ライブラリーとその作製及びスクリーニング方法は当分野で周知である。

蛋白質アレイも本発明のＮＩｇＳＢＲを同定するために利用することができる。蛋白質アレイはガラス、プラスチック、膜、ビーズ又は他の任意表面等の表面に固定化した蛋白質を使用する固相結合アッセイシステムである。これらのアレイは選択結合特性をもつディスプレイライブラリーから個々のメンバーを単離するために使用される。ＮＩｇＳＢＲ及び抗ＮＩｇＳＡｂをファージディスプレイ又はリボソームディスプレイライブラリーから選択するために本発明の方法で蛋白質アレイを使用することができる。蛋白質アレイとその作製及び使用方法は当業者に周知である。

多数の米国特許及び公開米国特許出願が各種ライブラリーと、その作製方法及び標的と結合する分子を見いだすためのそのスクリーニング方法を開示している。これらのライブラリー及び方法の例は各々参考資料として本明細書に組込む以下の米国特許及び公開米国特許出願に開示されている。例えば米国特許第６，６０５，４４９号、６，５３７，７７６号及び米国出願第２００２／０１４６７６２号、及び２００２／０１４２３９４号（譲受人Ｄｉｖｅｒｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；米国特許第５，８１１，２３８号（譲受人Ａｆｆｙｍａｘ）；米国特許第６，４８９，１０３号（譲受人Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）；米国出願第２００３／０１８６２２３号（譲受人Ｄｙａｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；米国特許第６，３７６，１９０号、６，３３１，３９８号、６，１１４，１２０号、６，１１０，９００号、５，８４３，６５３号、５，７０７，７９６号、６，１５９，６９０号、５，６９６，２４９号、５，６７０，６３７号、５，４７５，０９６号、５，２７０，１６３号、米国出願第２００３／０１５７４８７号、２００３／００４４８１８号、及び２００２／０１０２５９９号（譲受人ＳＥＬＥＸ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）；米国特許第６，６１３，５１４号、６，６０２，９８６号、６，５８６，１８２号、６，５７９，６７８号、６，５７６，４６７号、６，５７３，０９８号、６，５１８，０６５号、６，５０６，６０３号、６，５０６，６０２号、６，４５５，２５３号、６，４４４，４６８号、６，４３６，６７５号、６，４２０，１７５号、６，４１３，７７４号、６，３９５，５４７号、６，３７２，４９７号、６，３５５，４８４号、６，３４４，３５６号、６，３３５，１６０，５号、３２３，０３０号、６，３１９，７１３号、６，３０３，３４４号、６，２８７，８６１号、６，２９７，０５３号、６，２９１，２４２号、６，２７７，６３８号、６，１８０，４０６号、６，１６５，７９３号、６，１１７，６７９号、米国出願第２００３／０１８６３５６号、及び２００３／００７７６１３号（譲受人Ｍａｘｙｇｅｎ）；米国特許第６，６０２，６８５号、６，５３７，７４９号、６，４３６，６６５号、６，４２９，３００号、６，４１６，９５０号、６，３１２，９２７号及び米国出願第２００２／０１８２６８７号（譲受人Ｐｈｙｌｏｓ）；米国特許第６，５７９，６７６号、５，４１１，８６１号、及び５，９５５，２６４号（譲受人Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；米国出願第２００２／００５１９９８号及び２００１／００５１８５５号（譲受人Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；米国出願第２００２／０１６４６３５号（譲受人Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；米国出願第２００３／０１６２２１８号、２００３／０１５２９４３号、２００３／０１４８３５３号、２００３／０１３４３５１号、２００３／０１１３７３８号、２００３／００７７６１３号、２００２／０１０２７３４号、２００２／００４５１７５号、２００３／０１８０７１８号及び２００３／０１６７１２８号参照。これらの各特許及び出願は参考資料として本明細書に組込む。

少なくとも１種の抗ＮＩｇＳＡｂをコードする核酸を使用して本発明の抗ＮＩｇＳＡｂを作製し、その乳汁中に前記抗体を産生するヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ等のトランスジェニック動物又は哺乳動物を提供することもできる。このような動物は公知方法を使用して提供することができる。例えば限定されないが、各々参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込む米国特許第５，８２７，６９０号、５，８４９，９９２号、４，８７３，３１６号、５，８４９，９９２号、５，９９４，６１６号、５，５６５，３６２号、５，３０４，４８９号等参照。

更に少なくとも１種の抗ＮＩｇＳＡｂをコードする核酸を使用して本発明の抗ＮＩｇＳＡｂを作製し、植物部分又はその培養細胞中にこのような抗体、特定部分又は変異体を産生するトランスジェニック植物及び培養植物細胞（例えば限定されないが、タバコ、ジャガイモ及びトウモロコシ）を提供することもできる。非限定的な例として、組換え蛋白質を発現するトランスジェニックタバコ葉を使用して例えば誘導プロモーターを使用して多量の組換え蛋白質を提供するのに成功している。例えばＣｒａｍｅｒら，２４０ ＣＵＲＲ．ＴＯＰ．ＭＩＣＲＯＢＯＬ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，９５−１１８（１９９９）及びその引用文献参照。また、トランスジェニックトウモロコシを使用して哺乳動物蛋白質を商業生産レベルで発現させ、他の組換えシステムで生産されたレベル又は天然源から精製されたレベルと等価の生物活性が得られている。例えばＨｏｏｄら，４６４ ＡＤＶ．ＥＸＰ．ＭＥＤ．ＢＩＯＬ．，１２７−１４７（１９９９）及びその引用文献参照。１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）等の抗体フラグメントを含むトランスジェニック植物種子（例えばタバコ種子及びジャガイモ塊茎）からも多量の抗体が産生されている。例えばＣｏｎｒａｄら，３８ ＰＬＡＮＴ ＭＯＬ．Ｂｉｏｌ．，１０１−１０９（１９９８）及びその引用文献参照。従って、本発明の抗体は公知方法に従ってトランスジェニック植物を使用して生産することもできる。例えばＦｉｓｃｈｅｒら，３０ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＡＰＰＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，９９−１０８（Ｏｃｔ．，１９９９）；Ｍａら，１３ ＴＲＥＮＤＳ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．，５２２−５２７（１９９５）；Ｍａら，１０９ ＰＬＡＮＴ ＰＨＹＳＩＯＬ．，３４１−３４６（１９９５）；Ｗｈｉｔｅｌａｍら，２２ ＢＩＯＣＨＥＭ．ＳＯＣ．ＴＲＡＮＳ．，９４０− ９４４（１９９４）；Ｐａｙｎｅら，ＰＬＡＮＴ ＣＥＬＬ ＡＮＤ ＴＩＳＳＵＥ ＣＵＬＴＵＲＥ ＩＮ ＬＩＱＵＩＤ ＳＹＳＴＥＭＳ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；Ｇａｍｂｏｒｇ ａｎｄ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）ＰＬＡＮＴ ＣＥＬＬ，ＴＩＳＳＵＥ ＡＮＤ ＯＲＧＡＮ ＣＵＬＴＵＲＥ；ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９９５）；ＰＬＡＮＴ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ Ｃｒｏｙ（ｅｄ．）ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．（１９９３）；Ｃｌａｒｋ，Ｅｄ．ＰＬＡＮＴ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（１９９７）及びその引用文献も参照。上記各文献は参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込む。

本発明の抗体は広い範囲の親和性（Ｋ_Ｄ）で天然免疫グロブリン蛋白質と結合することができる。１好適態様では、少なくとも１種の本発明の抗ＮＩｇＳＡｂは場合により少なくともウェスタンブロットで使用するのに十分高い親和性で天然免疫グロブリン蛋白質と結合することができる。

抗原に対する抗体の親和性又はアビディティは適切な任意方法を使用して実験により測定することができる。（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ（Ｅｄ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９）；Ｊａｎｉｓ Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）；及び本明細書に記載する方法参照）。特定抗体−抗原相互作用の親和性測定値は測定条件（例えば塩濃度、ｐＨ）により変化する可能性がある。従って、親和性及び他の抗原結合パラメーター（例えばＫ_Ｄ，Ｋ_ａ，Ｋ_ｄ）の測定は抗体と抗原の標準化溶液と、本明細書に記載する緩衝液等の標準化緩衝液を使用して実施することが好ましい。

核酸分子
本明細書に記載する情報を使用し、本明細書に記載する方法を使用するか又は当分野で公知のように少なくとも１種の抗ＮＩｇＳＡｂをコードする本発明の核酸分子を得ることができる。

本発明の抗ＮＩｇＳＡｂをコードする核酸分子を得るためには、抗体のアミノ酸配列が必要であると思われる。このためには、抗体蛋白質を精製し、自動配列決定装置により部分アミノ酸配列を決定すればよい。完全アミノ酸配列を決定する必要はなく、部分抗ＮＩｇＳＡｂ ＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅用プライマーを作製するために蛋白質に由来する６〜８アミノ酸の２領域の線状配列を決定する。

適切なアミノ酸配列が同定されたら、その配列をコードすることが可能なＤＮＡ配列を合成する。遺伝コードは縮重しているので、特定アミノ酸をコードするために２個以上のコドンを使用することができ、従って、縮重ＤＮＡオリゴヌクレオチドセットの任意のものによりアミノ酸配列をコードすることができる。所与抗ＮＩｇＳＡｂ配列に一致するのはセットのただ１つのメンバーであるが、プローブ核酸オリゴヌクレオチドが遺伝コードの縮重によりミスマッチをもつとしても、複数のメンバーが一般に抗ＮＩｇＳＡｂをコードする核酸とハイブリダイズすることができる。ミスマッチ縮重ＤＮＡオリゴヌクレオチドは一般に抗ＮＩｇＳＡｂをコードする核酸とまだ十分にハイブリダイズすることができるので、抗体をコードする核酸を同定及び単離することができる。これらの方法により単離されたＤＮＡは無脊椎動物及び脊椎動物に由来する種々の細胞型からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、相同遺伝子を単離するために使用することができる。

限定されないが、溶液相、固相、混合相、又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ等のハイブリダイゼーションフォーマットが該当クローンの検出に有用である。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）に記載されている。核酸を標識するための標識ストラテジー及び対応する検出ストラテジーは例えばＨａｕｇｌａｎｄ（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）；又はＨａｕｇｌａｎｄ（２００１）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｅｉｇｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）（ＣＤ ＲＯＭ版）に記載されている。

本発明の核酸分子はｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ又は他の任意形態等のＲＮＡ形態でもよいし、限定されないが、例えばクローニングにより得られるか、合成されるか、又はその任意組み合わせにより得られるｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ等のＤＮＡの形態でもよい。ＤＮＡは２本鎖でも１本鎖でもよいし、その任意組み合わせでもよい。ＤＮＡ又はＲＮＡの少なくとも１本の鎖の任意部分はコーディング鎖（センス鎖とも言う）でもよいし、非コーディング鎖（アンチセンス鎖とも言う）でもよい。

本発明の単離核酸分子は場合により１個以上のイントロンと共にオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸分子を含むことができ、例えば限定されないが、少なくとも１個のＣＤＲの少なくとも１個の特定部分（例えば少なくとも１個の重鎖又は軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）；抗ＮＩｇＳＡｂ又は可変領域のコーディング配列を含む核酸分子；及び上記のものとは実質的に異なるヌクレオチド配列を含むが、遺伝コードの縮重により本明細書に記載するように及び／又は当分野で公知のように少なくとも１種の抗ＮＩｇＳＡｂを依然としてコードする核酸分子が挙げられる。当然のことながら、遺伝コードは当分野で周知である。従って、本発明の特定抗ＮＩｇＳＡｂをコードするこのような縮重核酸変異体を作製することは当業者に日常的である。例えばＡｕｓｕｂｅｌら，前出を参照でき、このような核酸変異体も本発明に含まれる。

本明細書に記載するように、抗ＮＩｇＳＡｂをコードする核酸を含む本発明の核酸分子としては限定されないが、抗体フラグメント、部分又は変異体自体のアミノ酸配列をコードするもの；完全抗体又はその一部のコーディング配列；抗体、フラグメント、部分又は変異体のコーディング配列と付加配列（例えば上記付加コーディング配列（例えば少なくとも１個のイントロン）を伴う又は伴わず、付加非コーディング配列（限定されないが、転写や、スプライシング及びポリアデニル化シグナル（例えばｍＲＮＡのリボソーム結合及び安定性）等のｍＲＮＡプロセシングに関与する転写非翻訳配列等の非コーディング５’及び３’配列）を伴う少なくとも１個のシグナルリーダー又は融合ペプチドのコーディング配列）；付加機能を提供するもの等の付加アミノ酸をコードする付加コーディング配列が挙げられる。従って、抗体をコードする配列は抗体フラグメント、部分又は変異体を含む融合抗体の精製を容易にするペプチドをコードする配列等のマーカー配列と融合することができる。

核酸の構築
本発明の単離核酸は当分野で周知の通り、（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、又はその組み合わせにより作製することができる。

核酸は本発明の抗ＮＩｇＳＡｂポリヌクレオチド配列に加えていくつかの配列を含むと適切である。例えば、ポリヌクレオチドを単離し易くするために、１個以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸に挿入することができる。また、本発明の翻訳ポリヌクレオチドを単離し易くするために翻訳可能な配列を挿入することもできる。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は本発明の蛋白質を精製するために好適な手段を提供する。コーディング配列以外の本発明の核酸は場合により本発明のポリヌクレオチドのクローニング及び／又は発現用のベクター、アダプター、又はリンカーである。

このようなクローニング及び／又は発現配列に付加配列を加えると、クローニング及び／又は発現におけるその機能を最適化するか、ポリヌクレオチドを単離し易くするか、又はポリヌクレオチドの細胞導入を改善することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、及びリンカーの使用は当分野で周知である（例えばＡｕｓｕｂｅｌ，前出；又はＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。

核酸を構築するための組換え法
本発明の単離核酸組成物（例えばＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はその任意組み合わせ）は当業者に公知の多数のクローニング法を使用して生物起源から得ることができる。所定態様では、ストリンジェント条件下で本発明のポリヌクレオチドと選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用してｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーで所望配列を同定する。ＲＮＡの単離とｃＤＮＡ及びゲノムライブラリーの構築は当業者に周知である（例えばＡｕｓｕｂｅｌ，前出；又はＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。

核酸を構築するための合成法
本発明の単離核酸は公知方法により直接化学合成により作製することもできる（例えばＡｕｓｕｂｅｌら，前出参照）。化学合成は一般に、相補的配列とのハイブリダイゼーション又は１本鎖を鋳型として使用するＤＮＡポリメラーゼによる重合により２本鎖ＤＮＡに変換することが可能な１本鎖オリゴヌクレオチドを生産する。当業者に自明の通り、ＤＮＡの化学合成は一般に約１００塩基以下の配列には最も有効であるが、化学又はリガーゼ法により単に短い配列のライゲーションにより長い配列を得ることができる。

組換え発現カセット
本発明は更に本発明の核酸を含む組換え発現カセットを提供する。本発明の核酸配列（例えば本発明の抗体をコードするｃＤＮＡ又はゲノム配列）を使用して、少なくとも１種の所望宿主細胞に導入可能な組換え発現カセットを構築することができる。組換え発現カセットは一般に所期宿主細胞におけるポリヌクレオチドの転写を誘導する転写開始調節配列と機能的に連結した本発明のポリヌクレオチドを含む。本発明の核酸の発現を誘導するには異種プロモーターと非異種（即ち内在）プロモーターの両者を利用することができる。

所定態様では、本発明のポリヌクレオチドの発現をアップレギュレート又はダウンレギュレートするように本発明のポリヌクレオチドの非異種形の適当な位置（上流、下流又はイントロン内）にプロモーター、エンハンサー、又は他のエレメントとして機能する単離核酸を導入することができる。例えば、突然変異、欠失及び／又は置換により内在プロモーターをｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ改変することができる。

ベクター及び宿主細胞
本発明は本発明の単離核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子組換えされた宿主細胞、及び当分野で周知のような組換え技術による少なくとも１種の抗ＮＩｇＳＡｂの生産にも関する。例えば各々参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込むＳａｍｂｒｏｏｋら，前出；Ａｕｓｕｂｅｌら，前出参照。

ポリヌクレオチドは場合により宿主での増殖用選択マーカーを含むベクターと結合することができる。一般に、リン酸カルシウム沈殿等の沈殿や、荷電脂質との複合体にプラスミドベクターを導入する。ベクターがウイルスである場合には、適当なパッケージング細胞株を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏパッケージングした後に宿主細胞に形質導入することができる。

ＤＮＡインサートは適当なプロモーターと機能的に連結すべきである。発現構築物は更に転写開始部位、終結部位、及び転写領域における翻訳用リボソーム結合部位を含む。構築物により発現される成熟転写産物のコーディング部分は始点の翻訳開始コドンと、翻訳すべきｍＲＮＡの末端に適切に配置された終結コドン（例えばＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含むことが好ましく、哺乳動物又は真核細胞発現にはＵＡＡとＵＡＧが好ましい。

発現ベクターは場合により少なくとも１種の選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては限定されないが、例えばメトトレキセート（ＭＴＸ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ，米国特許第４，３９９，２１６号；４，６３４，６６５号；４，６５６，１３４号；４，９５６，２８８号；５，１４９，６３６号及び５，１７９，０１７号；真核細胞培養用としてアンピシリン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ミコフェノール酸、又はグルタミンシンテターゼ（ＧＳ，米国特許第５，１２２，４６４号；５，７７０，３５９号及び５，８２７，７３９号）耐性遺伝子、及び大腸菌や他の細菌又は原核細胞培養用としてテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる（上記特許は参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込む）。上記宿主細胞に適した培地と培養条件は当分野で公知である。適切なベクターは当業者に容易に理解されよう。宿主細胞へのベクター構築物の導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、カチオン脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染又は他の公知方法により実施することができる。このような方法は例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，前出，第１−４及び１６−１８章；Ａｕｓｕｂｅｌ，前出，第１，９，１３，１５，１６章等の当分野の文献に記載されている。

少なくとも１種の本発明の抗体は融合蛋白質等の修飾形態で発現させることができ、分泌シグナルに加え、付加異種機能領域も含むことができる。例えば、精製中又はその後の操作及び保存中に宿主細胞における安定性と持続性を改善するために、付加アミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域を抗体のＮ末端に付加することができる。また、精製を容易にするためにペプチド部分を本発明の抗体に付加することができる。このような領域は抗体又は少なくとも１個のそのフラグメントの最終作製の前に除去することができる。このような方法はＳａｍｂｒｏｏｋ，前出，第１７．２９−１７．４２及び１８．１−１８．７４章；Ａｕｓｕｂｅｌ，前出，第１６，１７及び１８章等の多数の標準実験マニュアルに記載されている。

当業者は本発明の蛋白質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現システムを熟知している。あるいは、本発明の核酸は本発明の抗体をコードする内在ＤＮＡを含む宿主細胞で（操作により）発現させることにより宿主細胞で発現させることができる。このような方法は、例えば参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込む米国特許第５，５８０，７３４号、５，６４１，６７０号、５，７３３，７４６号及び５，７３３，７６１号に記載されているように、当分野で周知である。

抗体、その特定部分又は変異体の生産に有用な細胞培養の例は哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞システムは細胞単層形態のことが多いが、哺乳動物細胞懸濁液又はバイオリアクターも使用することができる。無傷のグリコシル化蛋白質を発現することが可能な多数の適切な宿主細胞株が当分野で開発されており、ＣＯＳ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ− １０）、ＣＨＯ（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１０）及びＢＳＣ−１（例えばＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６）細胞株、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐＧ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞等が挙げられ、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手可能である。１態様では、宿主細胞は骨髄腫及びリンパ腫細胞等のリンパ起源細胞を含む。

これらの細胞の発現ベクターは限定されないが、以下の発現調節配列即ち複製起点；プロモーター（例えば後期又は初期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号及び５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１αプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１種のヒト免疫グロブリンプロモーター；エンハンサー、及び／又はプロセシング情報部位（例えばリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えばＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ ＡｇポリＡ付加部位）、及び転写終結配列の１種以上を含む。例えばＡｕｓｕｂｅｌら，前出；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出参照。本発明の核酸又は蛋白質の生産に有用な他の細胞も公知であるか、及び／又は例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）又は他の公知もしくは商業ソースから入手可能である。

真核宿主細胞を利用する場合には、ポリアデニル化又は転写終結配列をベクターに組込むのが一般的である。終結配列の１例はウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化配列である。転写産物の正確なスプライシングのための配列を付加することもできる。スプライシング配列の１例はＳＶ４０由来ＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅら，４５ Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，７７３−７８１（１９８３））。更に、当分野で公知のように、宿主細胞における複製を制御するための遺伝子配列をベクターに組込むことができる。

抗体の精製
抗ＮＩｇＳＡｂは限定されないが、プロテインＡ又はプロテインＧ精製、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、イオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィー等の周知方法により血清、又はハイブリドーマ又は組換え細胞培養から回収及び精製することができる。高性能液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に利用することができる。例えば各々参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込むＣｏｌｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７−２００１），例えば第１，４，６，８，９，１０章参照。本明細書に記載する他の文献の多くに加え、種々の精製並びに関連蛋白質フォールディング及びリフォールディング法が当分野で周知であり、抗体又は他のＮＩｇＳＢＲ分子精製に適用することができ、例えばＲ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）；Ｂｏｌｌａｇら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ（１９９６）；Ｗａｌｋｅｒ Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９６）；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ（１９９３）；Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ（１９９８）；及びＷａｌｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９８）；並びにその引用文献に記載されているものが挙げられる。

本発明のＮＩｇＳＢＲ及び抗ＮＩｇＳＡｂとしては天然精製物、化学合成法の生成物、及び原核又は真核宿主（例えば細菌、真菌、酵母、植物、昆虫、非哺乳動物、及び哺乳動物細胞）から組換え技術により生産された生成物の任意のものが挙げられる。組換え生産法で使用する宿主に応じて、本発明の抗体はグリコシル化してもよいし、グリコシル化しなくてもよいが、所定態様ではグリコシル化していることが好ましい。このような方法はいずれも参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込むＳａｍｂｒｏｏｋ，前出，セクション１７．３７−１７．４２；Ａｕｓｕｂｅｌ，前出，第１０，１２，１３，１６，１８及び２０章，Ｃｏｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，前出，第１２−１４章等の多数の標準実験マニュアルに記載されている。

本発明のポリクローナル抗ＮＩｇＳＡｂは変性免疫グロブリンと結合する抗体を除去するように処理することができる。この処理はポリクローナル抗ＮＩｇＳＡｂを変性免疫グロブリンと接触させた後に、変性免疫グロブリンと結合している抗体を除去することにより実施することができる。この除去は例えば不溶性支持体に固定した変性免疫グロブリンを使用して実施することができる。未結合抗体を採取するか又は変性免疫グロブリンと結合した抗体と共に変性免疫グロブリンを固定した不溶性支持体を除去することにより、支持体に固定した変性免疫グロブリンと結合する任意抗体を残りの抗体源から分離することができる。当業者に容易に理解される通り、不溶性支持体はビーズ、プレート、ウェル、チューブ、シート、又は広範な形状、寸法もしくは材料の任意のものとすることができる。

ＮＩｇＳＢＲの作製
一般に本明細書に記載するように抗体以外の任意ＮＩｇＳＢＲを同定し、単離し、特性決定することができる。当業者に容易に理解される通り、一般に特定クラスのＮＩｇＳＢＲ化合物又は分子に適合又は適応するように任意特定非抗体ＮＩｇＳＢＲを当分野で公知の標準方法及び操作で使用することができる。該当特定ＮＩｇＳＢＲの単離、精製、製剤化、操作等に適合又は適切な方法は過度の実験を介さずに当業者に容易に理解され、選択されよう。上記のように、蛋白質又は関連ＮＩｇＳＢＲについては、以下の文献がこのような方法についてかなり詳細に記載している：Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９７）；Ｂｏｌｌａｇら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ（１９９６）；Ｗａｌｋｅｒ Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９６）；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ（１９９３）；Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ（１９９８）；及びＷａｌｋｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９８）。核酸操作については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌが核酸（及び蛋白質と所定の小分子）の詳細な単離、精製、製剤化及び操作方法を記載している。有機合成技術と得られる分子の単離、精製、製剤化及び操作法については、例えばＯｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ ａｎｄ Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ，（１９８２，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌａｒｄ Ｇｒａｎｔ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ．）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｍａｒｃｈ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；及びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｂｙ Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔｓ Ａ ａｎｄ Ｂ，１９９０，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ）参照。多数の化合物の単離、精製、製剤化及び操作に関する更に詳細は２００４年Ｓｉｇｍａカタログ（ＵＳＡ）又は２００４年Ａｌｄｒｉｃｈカタログ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）に記載されている。

診断法
本発明は研究、治療又は診断法で使用するための本明細書に記載する検出可能に標識した抗ＮＩｇＳＡｂを提供する。

本発明の抗ＮＩｇＳＡｂは試料中又は支持体上の他の抗原又は抗体を検出又は定量するイムノアッセイ等の各種方法で有用である。抗体を検出するためのイムノアッセイは一般に本発明の検出可能に標識された抗ＮＩｇＳＡｂの存在下で試料をインキュベートする段階と、試料中で結合した標識抗体を検出する段階を含む。種々の臨床アッセイ法が例えばＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ８０’ｓ，（Ｅｄｓ．Ａ．Ｖｏｌｌｅｒら，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ，１９８１）及びＰａｕｌ（ｅｄ．）ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＦＯＵＲＴＨ ＥＤＩＴＩＯＮ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，ＮＹ，ＮＹ（１９９９）に記載されているように、当分野で周知である。

従って、アッセイで使用される抗ＮＩｇＳＡｂ、ＮＩｇＳＢＲ又は他の任意抗体分子はニトロセルロース、又は細胞、細胞内容物もしくは蛋白質を固定化することが可能な別の固体支持体に付加することができる。その後、支持体を適切な緩衝液と他の所望試薬で洗浄した後、検出可能に標識された抗ＮＩｇＳＡｂ又は検出可能に標識されたＮＩｇＳＢＲで処理することができる。次に、固相支持体に緩衝液で２回目の洗浄を行い、検出可能に標識された未結合抗ＮＩｇＳＡｂ又は検出可能に標識された未結合ＮＩｇＳＢＲを除去することができる。その後、固体支持体に結合した標識量を公知方法段階により検出又は定量することができる。

「固相支持体」又は「キャリヤー」としてはペプチド、蛋白質、抗原又は抗体と結合することが可能な任意支持体が挙げられる。周知支持体又はキャリヤーとしてはガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セルロース、ニトロセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイトが挙げられる。キャリヤーの性質は本発明の目的ではある程度まで可溶性であるか又は不溶性とすることができる。支持体材料はカップリングした分子が抗原又は抗体と結合できる限り、ほぼ任意の可能な構造形状とすることができる。従って、支持体形状はビーズ等の円形、又は試験管内面やロッド外面等の円筒形とすることができる。あるいは、表面はシート、培養皿、試験ストリップ等のように平坦でもよい。好適支持体としてはポリスチレンビーズとプレートのウェルが挙げられる。抗体、ペプチド又は抗原と結合するのに適した他の多数のキャリヤーが存在することは当業者に容易に理解されるか、あるいは日常的実験により確認することができる。

周知方法段階により所与ロットの抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲの結合活性を決定することができる。当業者は本明細書に開示する方法に加えて周知方法を使用して日常的実験により有効な最適アッセイ条件を決定することができる。

抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲを検出可能に標識するには、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、又は酵素イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）用酵素と結合することにより実施することができる。結合した酵素は暴露される基質と反応し、例えば分光光度測定、蛍光光度測定又は目視手段により検出することができる化学部分を発生する。本発明の抗ＮＩｇＳＡｂを検出可能に標識するために使用することができる酵素としては限定されないが、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Δ５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスフアターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グリコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。

抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲを放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により非変性免疫グロブリンを検出することができる（例えば、Ｗｏｒｋら，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｙ．（１９７８）参照）。放射性同位体はガンマカウンターもくはシンチレーションカウンターの使用等の手段又はオートラジオグラフィーにより検出することができる。本発明の目的に特に有用な同位体は^３Ｈ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃ及び^１２５Ｉである。

抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲを蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識物質を適正な波長の光に暴露すると、その存在を蛍光により検出することができる。最も一般に使用されている蛍光標識化合物としてはイソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレサミンが挙げられる。Ｈａｕｇｌａｎｄ，ＨＡＮＤ ＢＯＯＫ ＯＦ ＦＬＯＵＲＥＳＣＥＮＴ ＰＲＯＢＥＳ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＰＲＯＤＵＣＴＳ，ＮＩＮＴＨ ＥＤＩＴＩＯＮ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ Ｏｒｅｇｏｎ（２００３）も参照。

抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲは^１５２Ｅｕ又は他のランタニド系等の蛍光発光金属を使用して検出可能に標識することもできる。これらの金属はジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の金属キレート基を使用して抗ＮＩｇＳＡｂに結合することができる。

抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲは化学発光化合物と結合することにより検出可能に標識することもできる。その後、化学反応中に発生する発光の存在を検出することにより化学発光標識した抗体の存在を判定する。特に有用な化学発光標識化合物の例はルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及び蓚酸エステルである。

同様に、生物発光化合物を使用して本発明の抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲを標識することもできる。生物発光は生体系に存在する型の化学発光であり、触媒蛋白質が化学発光反応の効率を増加する。生物発光蛋白質の存在は発光の存在を検出することにより判定される。標識目的に重要な生物発光化合物はルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。

抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲの検出は例えば、検出可能な標識が放射性ガンマ線放出体である場合には例えばシンチレーションカウンターを使用し、例えば標識が蛍光物質である場合には蛍光計を使用して実施することができる。酵素標識の場合には、酵素の基質を利用する比色法により検出することができる。基質の酵素反応の程度を同様に作製した標準と目視比較することにより検出することもできる。

例えば患者から組織標本を採取し、検出可能に標識された本発明の抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲと前記標本の組み合わせを提供することにより、ｉｎ ｓｉｔｕ検出を行うこともできる。検出可能に標識された抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲは検出可能に標識された抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲを生体試料に添加又は重層することにより提供することが好ましい。このような方法を使用することにより、試験組織中の天然免疫グロブリンの存在のみならず、天然免疫グロブリンの分布も測定することができる。本発明を使用すると、当業者に自明の通り、このようなｉｎ ｓｉｔｕ検出を達成するように各種組織学的方法（例えば染色法）の任意のものを応用することができる。

本発明の抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲは免疫測定アッセイ（「２部位」又は「サンドイッチ」アッセイとも言う）で使用するように適応させることができる。典型的免疫測定アッセイでは、所定量の未標識抗体（又は抗体フラグメント）を被験液に不溶性の固体支持体に固定し、固相抗体、抗原、及び検出可能に標識された物質の間に形成された三元複合体を検出及び／又は定量できるように所定量の検出可能に標識された抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲを加える。

典型的な免疫測定アッセイとしては、固相に固定した抗体をまず被験試料と接触させて二元固相抗体−抗体複合体の形成により試料から抗原を抽出する「フォワード」アッセイが挙げられる。適切なインキュベーション時間後、固体支持体を洗浄して未反応抗原を含む液体試料の残渣を除去した後、（「レポーター分子」として機能する）既知量の標識抗体を含む溶液と接触させる。未標識抗体を介して固体支持体に固定した抗原と標識抗体に複合体を形成させる第２のインキュベーション時間後に、固体支持体に２回目の洗浄を実施し、未反応標識固体を除去する。この型のフォワードサンドイッチアッセイは抗原の有無を判定する単純な「イエス／ノー」アッセイでもよいし、既知量の非変性免疫グロブリンを含む標準試料で得られた測定値と標識抗体測定値を比較することにより定量的にすることもできる。このような「２部位」又は「サンドイッチ」アッセイはＷｉｄｅ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄ，（Ｅｄ．Ｋｉｒｋｈａｍ，Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ（１９７０）１９９−２０６）により記載されている。

天然免疫グロブリンで同様に有用であり得る他の型の「サンドイッチ」アッセイは所謂「同時」アッセイと「リバース」アッセイである。同時アッセイはインキュベーション段階が１回だけであり、固体支持体に固定した抗体、抗原、及び標識抗体と他の所望抗原を同時に被験試料に加える。インキュベーションの完了後、固体支持体を洗浄し、液体試料の残渣と未結合標識抗体を除去する。その後、従来の「フォワード」サンドイッチアッセイと同様に、固体支持体に結合している標識抗体の存在を判定する。

「リバース」アッセイでは、まず液体試料に標識抗体溶液を加えた後に、適切なインキュベーション時間後に固体支持体に固定した未標識抗体を加える段階的添加を利用する。２回目のインキュベーション後に固相を従来通りに洗浄して被験試料の残渣と未反応標識抗体を除去する。次に、固体支持体に結合した標識抗体の存在を「同時」及び「フォワード」アッセイと同様に判定する。１態様では、同一又は別のエピトープに特異的な本発明の抗ＮＩｇＳＡｂ及び／又はＮＩｇＳＢＲの組み合わせを使用して高感度多部位免疫放射定量測定アッセイを実施することができる。

本発明の抗ＮＩｇＳＡｂ又はＮＩｇＳＢＲを含むキット又は製品を作製することができる。このようなキット又は製品は研究、治療、又は診断法の実施で使用される。

一般に本明細書に記載する方法では、抗ＮＩｇＳＡｂ及びＮＩｇＳＢＲは交換可能であり、例えば検出可能に標識する場合には、相互に置き換えることもできるし、相互に組み合わせることもできる。

以下、実施例により本発明を例証するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。本発明に従って置換可能な本質的に等価の各種パラメーター及び材料が当業者に認識されよう。

抗体の生産
免疫及び融合方法
Ｌｏｕ／Ｍラットにマウス血清免疫グロブリンを免疫した。Ｂａｌｂ／ｃマウスにウサギ血清免疫グロブリンを免疫した。３回免疫後に血清力価を試験した。血清力価の高い動物に由来する脾臓をマウス骨髄腫融合パートナーＳＰ２／Ｏと融合した。

融合プロトコール
Ａ．培地調製
１）ＩＭＤＭ基礎培地：
２）２０％ＦＢＳ完全培地：
ＩＭＤＭ基礎培地５００ｍｌ＋ＦＢＳ１００ｍｌ＋Ｐ／Ｓ６．５ｍｌ（ストック溶液濃度：ペニシリン１０，０００単位／ｍｌ；ストレプトマイシン１００，０００単位／ｍｌ）＋グルタミン６．５ｍｌ（ストック溶液濃度：２００μＭ）。
３）サプリメント：
１００ｘ ＨＡＴ
５０ｘ ＨＥＳ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ：ハイブリドーマ増強サプリメント）。
４）融合培地：
完全培地５００ｍｌ
１００ｘ ＨＡＴ ５ｍｌ
５０ｘ ＨＥＳ １０ｍｌ。
５）５０％ ＰＥＧ（Ｓｉｇｍａ，ＭＷ １５００）。

Ｂ．骨髄腫細胞の調製
１）融合前に骨髄腫細胞株を少なくとも１０−２０％ ＦＢＳ ＩＭＤＭ培地で３〜４日間培養した。細胞融合前は骨髄腫を対数増殖期に維持した。
２）光学顕微鏡を使用して骨髄腫細胞の増殖と生存をチェックした。
３）骨髄腫細胞をフラスコの表面から静かに剥がし、５０ｍｌコニカルチューブに移した。
４）骨髄腫細胞を１１００ｒｐｍで５分間遠心した。
５）上清を捨て、細胞ペレットを基礎ＩＭＤＭ培地に再懸濁した。
６）骨髄腫細胞を１１００ｒｐｍで５分間遠心した。
７）上清を捨て、細胞ペレットを基礎ＩＭＤＭ培地に再懸濁した。
８）洗浄を１回繰返し、細胞カウントを実施した。

Ｃ．脾細胞の調製を以下のように実施した：
１）動物を麻酔し、心臓穿刺によりできるだけ多量を採血した後に頸部脱臼させた。
２）動物を７５％エタノール浴に２〜３分間浸漬した。
３）左腹側領域を露出させるように動物の右側を下にし、７５％エタノールで消毒した発泡スチレンラックにピンで固定した。
４）左脚の皮膚を鋏でＶ字形に切開した。切り口から皮膚を引っ張って切開を拡大することにより、腹膜を露出させた。左腹部の腹膜の真下に脾臓が暗赤色塊として見えた。
５）腹膜を小鋏で切開し、脾臓を露出させた。
６）脾臓を摘出し、付着物を取り除いて脾臓を取出した。予め湿潤させたナイロンスクリーンセルストレナーを５０ｍｌコニカルチューブの頂部に載せ、その上に脾臓を置いた。脾臓を小型カーブ鋏で小切片に裁断した。
７）脾臓切片を１ｃｃシリンジプランジャーでセルストレナーに押し付け、圧延作用によりホモジナイズした。基礎ＩＭＤＭ培地（場合によりペニシリン／ストレプトマイシン）を加えた５０ｍｌコニカルチューブで脾細胞をリンスした。全脾細胞が分離するまで脾細胞を連続的にホモジナイズ及びリンスした。
８）脾細胞を１１００ｒｐｍで５分間遠心した。上清を捨て、ペレットを再懸濁した。ＩＭＤＭ ４０ｍｌを細胞に加え、上記のように遠心を繰返した。これを第１洗浄物とした。
９）洗浄した脾細胞ペレットをＩＭＤＭ培地に再懸濁し、細胞カウントを実施した。

Ｄ．脾細胞と骨髄腫の融合を以下のように実施した：
１）脾細胞と骨髄腫細胞を２−５：１の脾細胞対骨髄腫細胞比で混合した（２：１又は３：１が好ましい）。
２）細胞混合物を１５００ｒｐｍで７分間遠心した。
３）ガラスパスツールピペットを使用して上清を吸引し、５０ｍｌコニカルチューブの側面に水分が残らないようにした。
４）チューブの側面を発泡スチレンラックにぶつけることによりペレットを静かに剥がした。
５）（３７℃まで予め加温しておいた）５０％ＰＥＧを時折撹拌しながら１分間かけて滴下した。
マウス又はハムスター融合体 ０．８−１．０ｍｌ ＰＥＧ
ラット融合体 ０．９−１．２ｍｌ ＰＥＧ。
６）細胞／５０％ＰＥＧ懸濁液を反応させた。
マウス又はハムスター融合体：１分１５秒
ラット融合体：１分３０秒。
７）予め加温しておいた基礎ＩＭＤＭ培地１５ｍｌを５分間かけて徐々に加えた：
ａ）最初の１分間は時折混合しながら１ｍｌを加えた。
ｂ）次の１分間は時折混合しながら培地２ｍｌを加えた。
ｃ）次の２〜３分間で残りの培地を時折混合しながら加えた。
８）細胞懸濁液を３７℃水浴で２〜５分間インキュベートした。
９）細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心した。
１０）上清を捨て、ペレットを静かに再懸濁した。次に細胞を適正容量の融合培地（ＨＡＴ培地）に注意深く移した。
１１）３０分〜１時間後にハイブリドーマ培養液２００μｌ／ウェルを幅広オリフィスチップで９６ウェル平底組織培養プレートにプレーティングした。
１２）混合物を３７℃、湿度１００％の７％ＣＯ_２インキュベーターで３〜４日間培養した。上清の２／３を全ウェルから吸引した後、細胞コロニーがばらばらにならないようにＨＴ培地１４０−１８０μｌ／ウェルを幅広オリフィスチップで注意深く再添加した。
１３）９〜１０日後にハイブリドーマ上清をスクリーニングした。

天然免疫グロプリンに対する抗体の優先的反応性の特性決定
スクリーニング：９６ウェルプレート中の全クローンをＥＬＩＳＡにより以下のようにスクリーニングした：
１）ＥＬＩＳＡプレートにＰＢＳ中濃度２μｇ／ｍｌのマウス血清ＩｇＧ １００μｌ／ウェルをコーティングした。プレートをシールし、４℃で一晩インキュベートした。
２）ウェルを吸引し、３００μｌ／ウェルを上回る洗浄用緩衝液で３回洗浄した。プレートを反転させ、吸収紙に吸収させて残留緩衝液を除去した。
３）ウェルをアッセイ希釈剤２００μｌ／ウェルでブロックし、室温で１時間インキュベートした。
４）ステップ２を繰返した。
５）ＴＣＳ試料１００μｌ／ウェルをウェルに加えた。プレートをシールし、室温で２時間インキュベートした。
６）ステップ２を繰返し、合計５回洗浄した。
７）ＨＲＰ標識マウス抗ラット抗体１００μｌ／ウェルをアッセイ希釈剤に加え、２０００倍濃度に希釈した。プレートをシールし、室温で１時間インキュベートした。
８）ステップ２を繰返し、合計５回洗浄した。
９）ＡＢＴＳ基質を使用の２０分間以内に融解し、基質１１ｍｌ当たり３０％ Ｈ_２Ｏ_２ １１μｌを加えた。ＡＢＴＳ基質溶液１００μｌ／ウェルを各ウェルに加えた。プレートを室温で１０〜２０分間インキュベートした。
１０）プレートを４０５ｎｍで読み取った。

全陽性クローンを選択し、以下の試験を実施した：
１）特異性試験：ＥＬＩＳＡプレートにＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの各種マウスアイソタイプ１００μｌ／ウェルをコーティングした。マウスＩｇＧ１．２ａ、２ｂ、Ｇ３、ＩｇＡ及びＩｇＭをＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ行に加えた。試料を１、２、３、４列等に加えた。他のアッセイステップは上記スクリーニングプロトコールに記載したように実施した。
２）アイソタイプ試験：ＥＬＩＳＡプレートにＰＢＳ中２μｇ／ｍｌの各種抗マウスアイソタイプｍＡｂ１００μｌ／ウェルをコーティングした。マウスＩｇＧ１．２ａ、２ｂ、Ｇ３、ＩｇＡ及びＩｇＭをＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧ行に加えた。試料を１、２、３、４列等に加えた。他のアッセイステップは上記スクリーニングプロトコールに記載したように実施した。
３）免疫グロブリンのウェスタンブロット／イムノブロットを以下のように実施した：
１）血清ＩｇＧ（天然及び変性）試料を作製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを泳動した。
２）最良の蛋白質転写結果が得られるように転写システム製造業者の説明書に従って試料をゲルからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に転写した。
３）ブロットをＴＣＳ試料と共に抗体結合緩衝液で一晩４℃にてインキュベートした。
４）膜と試料の一晩インキュベーション後、ブロットを５分間ＴＢＳＴで５回洗浄した。
５）ＨＲＰ標識抗Ｉｇの２０００倍希釈液と共にブロットを１時間室温でインキュベートした。
６）抗ＮＩｇＳＡｂのインキュベーション後、ブロットを５分間ＴＢＳＴで５回洗浄した。
７）製造業者のＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＨＲＰ基質説明書に従ってブロットを展開した。
８）ブロットを適当な時間写真フィルムに露光した。最良結果を得るためには、１分〜１５分間露光し、特異的抗体−抗原反応に対応する化学発光シグナルを可視化すべきである。天然免疫グロブリンと反応するが、変性免疫グロブリンと反応しなかったクローンを増殖させ、精製し、ＨＲＰ抗ＮＩｇＳＡｂと結合した後、免疫沈降／ウェスタンブロット（ＩＰ／ＷＢ）試験を実施した：
４）ＩＰ／ＷＢは以下のように実施した：
ステップＩ：細胞溶解液調製を以下のように実施した：
１．Ｊｕｒｋａｔ細胞約１０^７個を採取した。
２．細胞をコニカルチューブ内にてＰＢＳ約１０ｍｌで洗浄し、４００ｘｇで１０分間遠心した。
３．上清を捨て、ステップ２を繰返した。
４．２回目の洗浄後、上清を完全に捨て、１Ｘ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌを加えた冷溶解用緩衝液１ｍｌに細胞ペレットを再懸濁した（最終濃度１０^７細胞／ｍｌ）。チューブを静かにボルテックスした。
５．チューブを時折混合しながら氷上に３０分間置いた。
６．細胞溶解液を１０，０００ｘｇで１５分間４℃にて遠心した。
７．ペレットを撹乱しないように上清を注意深く集め、清浄なチューブに移した。この時点で細胞溶解液を長期保存に備えて−８０℃で凍結することができる。ペレットを捨てた。

ステップＩＩ：細胞溶解液プレクリアを以下のように実施した：
１．抗免疫グロブリンビーズスラリー５０μｌを試験管に移し、冷溶解用緩衝液４５０μｌを加えた。混合物を１００００ｘｇで６０秒間遠心し、溶解用緩衝液を除去した。冷溶解用緩衝液５００μｌで洗浄を繰返し、ビーズを冷溶解用緩衝液５０μｌに再懸濁した。
２．抗免疫グロブリンビーズスラリー５０μｌと溶解用緩衝液５００μｌを試験管に加え、氷上で６０分間インキュベートした。
３．混合物を１００００ｘｇで１０分間４℃にて遠心し、上清を別の試験管に移した。ビーズが混入した場合には、上清を再遠心し、更に別の試験管に移さなければならない。

ステップＩＩＩ：免疫沈降を以下のように実施した：
１．プレクリア済み冷溶解液を入れた試験管に抗ヒトカスパーゼ−７抗体５μｇを加えた。
２．混合物を４℃で１時間インキュベートした。
３．プレチルド溶解用緩衝液中の抗免疫グロブリンスラリー５０μｌを（上記プレクリアステップ１に指示したように調製した）混合物に加えた。
４．混合物をロッキングプラットフォーム又はローテーターで４℃にて１時間インキュベートした。
５．試験管を１００００ｘｇで６０秒間４にて遠心した。
６．上清を注意深く完全に除去し、ビーズを溶解用緩衝液５００μｌで３回洗浄した。バックグラウンドを最小限にするために、これらの洗浄で上清を完全に除去するように注意した。
７．最終洗浄後、上清を吸引し、試料緩衝液５０μｌをビーズペレットに加え、１００℃まで１０分間加熱混合した。
８．混合物を１０，０００ｘｇで５分間遠心した後、上清を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードした。ゲルを後で泳動する場合にはこの時点で上清試料を集めて凍結保存することができる。
９．ＳＤＳ−ＰＡＧＥの製造業者の説明書に従う。
１０．転写システム製造業者の説明書に従って試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ膜に転写した。
１１．ブロットを抗体結合緩衝液中２μｇ／ｍｌの抗ヒトカスパーゼ−７ｍＡｂ（一次抗体）と共に一晩４℃でインキュベートした。
１２．膜と一次抗体の一晩インキュベーション後、ブロットを５分間ＴＢＳＴで５回洗浄した。
１３．ＨＲＰ標識した第２段階ｍＡｂ（抗ＮＩｇＳＡｂ）の２５０倍希釈液と共にブロットを１時間室温でインキュベートした。
１４．二次抗体のインキュベーション後、ブロットを５分間ＴＢＳＴで５回洗浄した。
１５．Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ＨＲＰ基質説明書に従ってブロットを展開した。
１６．ブロットを適当な時間写真フィルムに露光した。最良結果を得るためには、１分〜１５分間露光し、特異的抗体−抗原反応に対応する化学発光シグナルを可視化する。

本発明の方法は免疫沈降段階から持ち込まれる変性軽鎖及び重鎖分子との結合に起因するバックグラウンドノイズを減らしながら、最適シグナルのために高い優先度で天然免疫グロブリンと結合する抗体を選択的に集積した。

本発明の抗ＮＩｇＳＡｂ及びＮＩｇＳＢＲの実例として、ＩＰ／ウェスタンブロットで天然免疫グロブリンと特異的に結合するようにクローンｅＢ１４４により産生されたモノクローナル抗体を図１、２及び３に示し、同図から明らかなように、本発明の抗ＮＩｇＳＡｂ及びＮＩｇＳＢＲは変性免疫グロブリン分子の重鎖と軽鎖の両方と反応する従来のポリクローナル抗体に比較して天然免疫グロブリンのみと選択的に反応するという実質的利点がある。図面から明らかなように、天然免疫グロブリンとの結合を１００％とすると、抗ＮＩｇＳＡｂで検出された変性免疫グロブリン分子との結合は約０％であった。

検出可能に標識された本発明の抗ＮＩｇＳＡｂを使用したイムノブロットの結果を図１に示す。組換えヒトＩＬ−２ １００ｎｇをウサギ抗ヒトＩＬ−２ポリクローナル抗体で免疫沈降させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに２０ｎｇ／ウェルをロードし、ウェスタンブロット膜に転写した。レーン１は従来の標識ポリクローナル抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍロバ抗ウサギＩｇ，１：５０００）と共にインキュベートし、このレーンの付加バンドは変性免疫グロブリン軽鎖及び重鎖汚染物質を示す。レーン２は本発明の方法に従って調製した検出可能に標識されたモノクローナルラット抗ウサギＩｇ上清と共にインキュベートした。

更に本発明の方法により生産された抗体と変性ウサギ免疫グロブリンの反応の欠如の選択方法を示す。各レーンは異なる抗体を使用してプローブした。各パネルの対応するレーンは同一抗体でプローブした。天然抗体と優先的に結合する抗体の生産を示す。レーン５、６、１０、１２、１５はウェスタンブロットにより抗ＮＩｇＳＡｂが変性ウサギ免疫グロブリンに対する抗体反応性を殆ど又は全く示さないことを各々示す。レーン４、７、８、１１、１３、１４、１６、及び１７は各々天然免疫グロブリンと変性免疫グロブリンの両者と反応した。

図３は非変性免疫グロブリンに対する本発明の抗ＮＩｇＳＡｂの親和性を示す。ＪＵＲＫＡＴ細胞溶解液（１Ｘ１０ｅ７細胞／ｍｌ ０．５ｍｌ）をマウス抗ヒトカスパーゼ７（５μｇ）で免疫沈降させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに１０μｌ／ウェル（１Ｘ１０^６細胞）をロードし、ウェスタンブロット膜に転写した。レーン１は従来の標識ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎポリクローナル抗マウスＩｇ，１：５０００）と共にインキュベートし、このレーンの付加バンドは軽鎖及び重鎖汚染物質を示す。レーン２は本発明の検出可能に標識された抗ＮＩｇＳＡｂ（抗マウスＩｇ）（１：３００）と共にインキュベートした。レーン３はレーン１に使用した従来の標識ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎポリクローナル抗マウスＩｇ，１：５０００）を使用したレーン２の再ブロットである。レーン３の付加バンドの出現は軽鎖及び重鎖汚染物質を示し、本発明の検出可能に標識された抗ＮＩｇＳＡｂ（抗マウスＩｇ）（１：３００）が汚染性変性Ｉｇよりも天然Ｉｇと選択的且つ優先的に結合することが確認された。

ポリクローナル抗ＮＩｇＳＡｂを作製するためのサブトラクティブ免疫
手順：

１日目：完全アジュバントを使用して最終抗体生産に所望されない寛容原（変性免疫グロブリン）（２５−５０ｍｇ）をマウス６匹に注射（ｉ．ｐ．）する。１０分後に滅菌リン酸緩衝食塩水中のシクロホスファミド（ＳＩＧＭＡ）１００ｍｇ／ｋｇ体重を注射する。この目的には、２ｍｇ／ｍｌシクロホスファミド溶液を調製する。

２日目：シクロホスファミドを再び注射する（１００ｍｇ／ｋｇ体重）。

３日目：シクロホスファミド注射を繰返す。

７日目：マウスから採血し、ＥＬＩＳＡにより抗体力価を測定する。

１４日目：不完全アジュバントを使用して最終抗体生産に所望されない寛容原（２５−５０ｍｇ）をマウス６匹に注射（ｉ．ｐ．）する。１０分後に滅菌リン酸緩衝食塩水中のシクロホスファミド１００ｍｇ／ｋｇ体重を注射する。

１５日目：シクロホスファミドを再び注射する（１００ｍｇ／ｋｇ体重）。

１６日目：シクロホスファミド注射を繰返す。

２１日目：マウスから採血し、抗体力価を測定する。抗体力価が得られない場合には、次段階に進む。まだ抗体力価が存在している場合には寛容原とシクロホスファミドの注射を繰返す。

２８日目：完全アジュバントを使用して所望免疫原（天然免疫グロブリン）を免疫する。

３８日目：マウスから採血し、抗体力価アッセイを実施する。

４２日目：不完全アジュバントを使用して免疫原の免疫を繰返す。

４６日目：マウスから採血し、抗体力価を測定する。この抗体が抗ＮＩｇＳＡｂに相当する。所望抗体力価（約１／１０^３以上）が得られるならば、モノクローナル抗体を動物用に生産する場合には翌日細胞融合を実施する。所望力価が得られないならば、所望力価が得られるまでアジュバントによる免疫原注射を２週置きに繰返す。

哺乳動物細胞における抗ＮＩｇＳＡｂのクローニングと発現
典型的な哺乳動物発現ベクターはｍＲＮＡの転写開始を媒介する少なくとも１種のプロモーターエレメントと、抗体コーディング配列と、転写終結と転写産物のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。付加エレメントとしてエンハンサー、Ｋｏｚａｋ配列及びＲＮＡスプライシングの供与部位と受容部位により挟まれる介在配列が挙げられる。ＳＶ４０に由来する初期及び後期プロモーター、レトロウイルスに由来する長い末端反復配列（ＬＴＲＳ）（例えばＲＳＶ，ＨＴＬＶＩ，ＨＩＶＩ）及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターにより高度に効率的な転写を達成できる。他方、細胞エレメント（例えばヒトアクチンプロモーター）も使用できる。本発明の実施に使用するのに適切な発現ベクターとしては、例えばｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ＰＬＸＳＮ、又はｐＬＮＣＸ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐｃＤＮＡ／Ｚｅｏ（＋／−）又はｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋／−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰＳＶＬ及びＰＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）及びｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）等のベクターが挙げられる。使用することができる哺乳動物宿主細胞としてはヒトＨｅｌａ２９３、Ｈ９及びＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３及びＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７及びＣＶ１、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞並びにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。

あるいは、染色体に組込まれた遺伝子を含む安定な細胞株で遺伝子を発現させることができる。ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン又はハイグロマイシン等の選択マーカーとのコトランスフェクションによりトランスフェクトした細胞を同定及び単離することができる。

トランスフェクトした遺伝子を増幅し、コードされる抗体を多量に発現させることもできる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは該当遺伝子の数百又は数千のコピーをもつ細胞株を開発するために有用である。別の有用な選択マーカーは酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙら，２２７ ＢＩＯＣＨＥＭ．Ｊ．，２７７−２７９（１９９１）；及びＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎら，１０ Ｂｉｏ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，１６９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを使用し、哺乳動物細胞を選択培地で増殖させ、最高の耐性をもつ細胞を選択する。これらの細胞株は染色体に組込まれた増幅遺伝子を含む。多くの場合にはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＮＳＯ細胞を抗体産生に使用する。

発現ベクターｐＣ１及びｐＣ４はラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら，５ ＭＯＬＥＣ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．，４３８−４４７（１９８５））とＣＭＶエンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔら，４１ ＣＥＬＬ，５２１−５３０（１９８５））を含む。例えば制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＡｓｐ７１８によるマルチクローニング部位は該当遺伝子のクローニングを助長する。ベクターは更にラットプレプロインスリン遺伝子のポリアデニル化及び終結シグナルである３’イントロンを含む。

非変性免疫グロブリンに対して反応性のモノクローナル抗体の作製
本発明の方法で使用することができるモノクローナル抗体を作製するためにはマウスを使用することができる。

免疫
抗ＮＩｇＳＡｂハイブリドーマを作製するためには１種以上の免疫スケジュールを使用することができる。以下の典型的な免疫プロトコール後に最初の数種の融合を実施することができるが、他の同様の公知プロトコールも使用することができる。２０週齢雌及び／又は外科的に去勢した雄マウス数匹に最終容量１００〜４００μＬ（例えば２００）となるように等容量のＴＩＴＥＲＭＡＸ又は完全フロイントアジュバントで乳化した所望免疫グロブリン蛋白質１〜１０００μｇをＩＰ及び／又はＩＤ免疫する。各マウスに場合により２個のＳＱ部位の各々に生理的食塩水１００μＬ中１〜１０μｇを投与してもよい。次に１〜７、５〜１２、１０〜１８、１７〜２５及び／又は２１〜３４日後に等容量のＴＩＴＥＲＭＡＸ又は不完全フロイントアジュバントで乳化した免疫グロブリン蛋白質をマウスにＩＰ（１〜４００μｇ）及びＳＱ（１〜４００μｇ ｘ２）免疫することができる。１２〜２５日後と２５〜４０日後に抗凝血剤を使用せずに眼後穿刺によりマウスから採血することができる。次に血液を室温で１時間凝固させ、血清を採取し、公知方法に従って抗免疫グロブリンＥＩＡアッセイを使用して力価を測定する。繰返して注射しても力価が増加しない場合には融合を実施する。その時点で、生理的食塩水１００μＬで希釈した免疫グロブリン蛋白質１〜４００μｇをマウスに最終ＩＶブースター注射することができる。３日後に頸部脱臼によりマウスを安楽死させ、脾臓を無菌摘出し、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び０．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ（ＰＳＡ）を加えた冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＬに浸漬することができる。脾臓をＰＳＡ−ＰＢＳで滅菌潅流することにより脾細胞を回収する。細胞を冷ＰＳＡ−ＰＢＳで１回洗浄し、トリパンブルー色素排除法を使用してカウントし、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓを加えたＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁する。

細胞融合
融合は公知方法に従って（例えば当分野で公知のように）１：１〜１：１０のマウス骨髄腫細胞対生存脾細胞比で実施することができる。非限定的な例として、脾細胞と骨髄腫細胞を一緒にペレット化することができる。次に、ペレットを３７℃の５０％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ／ＰＢＳ溶液（ＰＥＧ分子量１，４５０，Ｓｉｇｍａ）１ｍＬに３０秒間かけてゆっくりと再懸濁することができる。次に２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓを加えたＲＰＭＩ １６４０培地（３７℃）１０．５ｍＬを１０分間かけてゆっくりと加えることにより融合を停止することができる。融合細胞を５分間５００〜１５００ｒｐｍで遠心する。次に細胞をＨＡＴ培地（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１０％ Ｆｅｔａｌ Ｃｌｏｎｅ Ｉ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、２．５％ Ｏｒｉｇｅｎ培養サプリメント（Ｆｉｓｈｅｒ）、１０％ ６５３馴化ＲＰＭＩ １６４０／Ｈｅｐｅｓ培地、５０μＭ ２−メルカプトエタノール、１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、及び１６μＭチミジンを加えたＲＰＭＩ １６４０培地）に再懸濁した後、２００μＬ／ウェルで９６ウェル平底組織培養プレート１５枚にプレーティングする。次に５％ ＣＯ_２と９５％空気を含有する加湿３７℃インキュベーターにプレートを７〜１０日間入れる。

マウス血清中の抗ＮＩｇＳＡｂの検出
天然免疫グロブリンに特異的なヒトＩｇＧ抗体についてマウス血清をスクリーニングするためには固相ＥＩＡを使用することができる。要約すると、プレートにＰＢＳ中２μｇ／ｍＬ免疫グロブリンを一晩コーティングすることができる。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ ２０を加えた０．１５Ｍ食塩水で洗浄後、ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ２００μＬ／ウェルで１時間室温にてウェルをブロックすることができる。プレートをすぐに使用するか又は将来の使用に備えて−２０℃で凍結する。免疫グロブリンをコーティングしたプレートでマウス血清希釈液５０μＬ／ウェルを室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで３０，０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）５０μＬ／ウェルでプローブする。プレートを再び洗浄することができ、クエン酸−リン酸基質溶液（０．１Ｍクエン酸と０．２Ｍリン酸ナトリウム，０．０１％ Ｈ_２Ｏ_２及び１ｍｇ／ｍＬ ＯＰＤ）１００μＬ／ウェルを１５分間室温で加える。次に停止溶液（４Ｎ硫酸）２５μＬ／ウェルを加え、自動プレートスペクトロフォトメーターによりＯＤを４９０ｎｍで読み取る。

ハイブリドーマ上清中の免疫グロブリンの検出
免疫グロブリンを分泌する増殖陽性ハイブリドーマは適切なＥＩＡにより検出することができる。要約すると、９６ウェルポップアウトプレート（ＶＷＲ，６１０７４４）に炭酸ナトリウム緩衝液中１０μｇ／ｍＬヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃを一晩４℃でコーティングすることができる。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１時間３７℃にてブロックし、すぐに使用するか又は−２０℃で凍結する。未希釈ハイブリドーマ上清をプレート上で１時間３７℃にてインキュベートする。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで１０，０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウス抗体で１時間３７℃にてプローブする。次にプレートを上記のように基質溶液と共にインキュベートする。

抗ＮＩｇＳＡｂ反応性の測定
上記のようなハイブリドーマは適切なＲＩＡウェスタンブロット又は他のアッセイを使用して天然免疫グロブリンに対する反応性を同時にアッセイすることができる。ハイブリドーマを分泌する抗ＮＩｇＳＡｂを細胞培養で増殖させ、限界希釈法により順次サブクローニングすることができる。得られたクローン集団を増殖させ、凍結培地（９５％ＦＢＳ，５％ＤＭＳＯ）で低温処理し、液体窒素中で保存することができる。本発明のモノクローナル抗体は変性免疫グロブリンに比較して天然免疫グロブリンに特異性を示す。

クラスタイピング及びアイソタイピング
抗体のアイソタイプ決定はマウス免疫血清を特定力価についてスクリーニングするために使用したフォーマットと同様のフォーマットでＥＩＡを使用して実施することができる。抗原を上記のように９６ウェルプレートにコーティングし、精製抗体２μｇ／ｍＬをプレート上で１時間室温にてインキュベートすることができる。プレートを洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで４０００倍に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ_１、又はＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ_３又は他の任意クラス特異的もしくはアイソタイプ特異的抗体で１時間室温にてプローブする。プレートを再び洗浄し、上記のように基質溶液と共にインキュベートする。

結果と考察
抗ＮＩｇＳＡｂモノクローナル抗体の作製
数種の融合を実施し、天然免疫グロブリンに特異的な抗体数ダースを産生するプレート１５枚に各融合体（１４４０ウェル／融合体）を播種する。免疫グロブリン蛋白質を免疫したマウスに由来する脾細胞を使用して数種の融合を実施する。天然免疫グロブリン反応性モノクローナル抗体数個１組を作製する。抗ＮＩｇＳＡｂを更に特性決定し、変性免疫グロブリンに比較して天然免疫グロブリンとの特異的結合を実証する。

引用文献
以下の文献は参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込む。Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７−１９９１））；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））、及びＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（２０００）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））；Ｃｏｌｌｉｇａｎら（Ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２００１））；Ｃｏｌｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹ，（１９９７−２００１））。

以下の文献は本発明に関連して有用な手順に関する有用な詳細を記載しており、同様に参考資料としてその開示内容全体を本明細書に組込む。

（１．）Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｆｕｓｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，ＮＡＴＵＲＥ，（１９７５），２５６（５５１７）：４９５−７。

（２．）Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８８。

（３．）“Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ８１（Ｆ．Ｍｅｌｃｈｅｒｓ，Ｍ．Ｐｏｔｔｅｒ，ａｎｄ Ｎ．Ｗａｒｎｅｒ，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，，１９７８）。

（４．）Ｂｒｏｏｋｓら，“Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｙｉｅｌｄｓ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ”，Ｊ．ＯＦ ＣＥＬＬ ＢＩＯＬ．，（１９９３）１２２（６）：１３５１−１３５９。

（５．）Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｖ．，Ｃ．Ｌ．Ｓｔｅｃｈｍａｎｎ ａｎｄ Ｓ．Ｃ．ＭｃＬｏｏｎ，“Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｒａｒｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ”，ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，（１９９２）１２（６）：８４２−８４７。

（６．）Ｓｌｅｉｓｔｅｒ，Ｈ．Ｍ．ａｎｄ Ａ．Ｇ．Ｒａｏ，“Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｓｉｍｉｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ”，Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．ＭＥＴＨＯＤＳ．，（２００２）２６１（１−２）：２１３−２２０。

本明細書に引用する全刊行物、特許又は他の文献はその開示内容全体を参考資料として組込み、各刊行物、特許又は他の文献がその開示内容全体を参考資料として組込むと個々に記載されているものとして扱う。これらの文献は本発明当時の技術水準を示し、及び／又は本発明の記載と実施可能性を示す。刊行物は任意化学もしくは特許文献、又は全記録、電子又は印刷フォーマットを含む任意媒体フォーマットで入手可能な他の任意情報を含む。

本発明の抗体がウェスタンブロットフォーマットで天然免疫グロブリンと優先的に結合することを示す。 図２Ａはウェスタンブロットフォーマットで天然免疫グロブリンと優先的に結合する抗体を生産及び選択する本発明の方法の結果を示す。 図２Ｂはウェスタンブロットフォーマットで天然免疫グロブリンと優先的に結合する抗体を生産及び選択する本発明の方法の結果を示す。 本発明の抗ＮＩｇＳＡｂ（レーン２）と比較して天然免疫グロブリン（レーン１）と優先的に結合しない従来の抗体を使用したウェスタンブロットの結果を示す。レーン３はレーン１で使用した従来の抗体で再ブロットしたレーン２を示す。

Claims (37)

1. 単離又は組換え抗ＮｉｇＳＡｂ。
2. 前記抗ＮＩｇＳＡｂが天然免疫グロブリン蛋白質と特異的に結合する請求項１に記載の抗ＮＩｇＳＡｂ。
3. 前記抗体がモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体部分、抗体フラグメント、抗体変異体、抗ＮＩｇＳＡｂ、抗ＮＩｇＳＡｂ部分、抗ＮＩｇＳＡｂフラグメント、及び抗ＮＩｇＳＡｂ変異体から構成される群から選択される請求項２に記載の抗ＮＩｇＳＡｂ。
4. 前記抗体が哺乳動物で産生される請求項３に記載の抗体。
5. 前記哺乳動物がヒト、マウス、ラット、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウマ及びハムスターから構成される群から選択される請求項４に記載の抗体。
6. 前記ポリクローナル抗体が変性免疫グロブリンのサブトラクティブ免疫後に天然免疫グロブリンを免疫することにより哺乳動物で産生される請求項２に記載のポリクローナル抗体。
7. 前記ポリクローナル抗体が不溶性支持体に固定した変性免疫グロブリンと前記ポリクローナル抗体を接触させることにより抗変性免疫グロブリン抗体を除去するように処理されている請求項２に記載のポリクローナル抗体。
8. 前記不溶性支持体がビーズ、プレート、ウェル、チューブ、膜又はシートから構成される群から選択される請求項７に記載のポリクローナル抗体。
9. 前記抗ＮＩｇＳＡｂが組換え動物又は組換え宿主細胞により産生される請求項１に記載の抗ＮＩｇＳＡｂ。
10. 前記組換え宿主細胞が哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、及び細菌細胞から構成される群から選択される請求項９に記載の抗ＮＩｇＳＡｂ。
11. 前記抗ＮＩｇＳＡｂがバクテリオファージにより産生される請求項１４に記載の抗ＮＩｇＳＡｂ。
12. 抗ＮｉｇＳＡｂを発現する組換え細胞株。
13. 少なくとも１種の抗ＮＩｇＳＡｂと希釈剤又はキャリヤーを含有する組成物。
14. 免疫グロブリン抗原に対する抗体をスクリーニングし、天然免疫グロブリンと特異的に結合する抗体を同定する段階を含む少なくとも１種の抗ＮＩｇＳＡｂの生産方法。
15. 前記抗ＮＩｇＳＡｂがポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体部分、抗体フラグメント、抗体変異体、抗ＮＩｇＳＡｂフラグメント、抗ＮＩｇＳＡｂ部分及び抗ＮＩｇＳＡｂ変異体から構成される群から選択される請求項１４に記載の方法。
16. パッケージング材料と少なくとも１種の単離抗ＮＩｇＳＡｂを含む容器を含む研究又は診断用製品。
17. 前記抗ＮＩｇＳＡｂが検出可能に標識されている請求項１６に記載の製品。
18. 前記標識が化学発光剤、放射性同位体、酵素、蛍光剤及び発色剤から構成される群から選択される請求項１７に記載の製品。
19. 前記標識がＨＲＰを含む請求項１８に記載の製品。
20. 前記抗体がマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ハムスター及びウマから構成される群から選択される哺乳動物で産生される請求項１７に記載の製品。
21. 試料を１種以上の抗ＮＩｇＳＡｂと接触させる段階と、前記抗ＮＩｇＳＡｂと前記試料の結合を測定する段階を含む天然免疫グロブリンの検出方法。
22. 前記抗ＮＩｇＳＡｂが検出可能に標識されている請求項２１に記載の方法。
23. 前記抗ＮＩｇＳＡｂが検出可能な反応生成物の形成を触媒する酵素である請求項２２に記載の方法。
24. 前記試料が支持体に固定化されている請求項２１に記載の方法。
25. 前記支持体がビーズ、プレート、シート、ストリップ、ウェル、膜及びチューブから構成される群から選択される請求項２４に記載の方法。
26. 単離又は組換えＮＩｇＳＢＲ。
27. ＮＩｇＳＢＲが検出可能に標識されている請求項２６に記載のＮＩｇＳＢＲ。
28. 前記標識が化学発光剤、放射性同位体、酵素、蛍光剤及び発色剤から構成される群から選択される請求項２７に記載のＮＩｇＳＢＲ。
29. 少なくとも１種のＮＩｇＳＢＲと適切な希釈剤又はキャリヤーを含有する組成物。
30. パッケージング材料と少なくとも１種のＮＩｇＳＢＲを含む容器を含む研究又は診断用製品。
31. １種以上の化合物をスクリーニングし、天然免疫グロブリンと特異的に結合する化合物を同定する段階を含む少なくとも１種のＮＩｇＳＢＲの生産方法。
32. 前記ＮＩｇＳＢＲが蛋白質スカフォールドライブラリー、ペプチドディスプレイライブラリー、特異的進化ライブラリー、及び蛋白質アレイライブラリーから構成される群から選択されるライブラリーから同定される請求項３１に記載の方法。
33. 前記ＮＩｇＳＢＲがポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体部分、抗体フラグメント、抗体変異体、組換え蛋白質、ポリマースカフォールド、組換え化合物、ポリペプチド、哺乳動物システムで作製されたポリマー、非哺乳動物システムで作製されたポリマー、及びファージディスプレイにより大腸菌で作製されたポリマーから構成される群から選択される請求項３１に記載の方法。
34. 試料を１種以上のＮＩｇＳＢＲと接触させる段階と、前記ＮＩｇＳＢＲと前記試料の結合を測定する段階を含む天然免疫グロブリンの検出方法。
35. 前記ＮＩｇＳＢＲが検出可能に標識されている請求項３４に記載の方法。
36. 前記試料が支持体に固定化されている請求項３４に記載の方法。
37. 前記支持体がビーズ、プレート、シート、ストリップ、ウェル、膜及びチューブから構成される群から選択される請求項３６に記載の方法。