JP2008309547A

JP2008309547A - 修飾ペプチドの分析方法および装置

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Publication number: JP2008309547A
Application number: JP2007156180A
Authority: JP
Inventors: Masaki Watanabe; 正樹渡邉
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2007-06-13
Filing date: 2007-06-13
Publication date: 2008-12-25
Anticipated expiration: 2027-06-13
Also published as: JP4836875B2

Abstract

【課題】多数の修飾タンパク質を含む生体試料を元に作られる複雑なペプチド混合物中に含まれる修飾ペプチド全体を、個々の修飾ペプチドの修飾状態による精製効率の差に影響を受けることなく、効率的に分析する質量分析法を用いた分析方法を提供することを目的とする。
【解決手段】修飾ペプチドを含む試料中に存在する修飾ペプチドを捕捉し、修飾ペプチドの濃度を低下させた試料を回収する第１の工程と、第１の工程により得られた、修飾ペプチドの濃度を低下させた試料の質量分析を行い、その分析データをデータベースに格納する第２の工程と、当初の修飾ペプチドを含む試料の質量分析を行い、第２の工程で得られた分析データと照合し、当初の修飾ペプチドを含む試料の選択的な質量分析を行う第３の工程とを含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、質量分析法および質量分析装置に関し、特に多種のペプチドを含む試料溶液中に含まれる特定の修飾を受けたペプチドを分析する方法および装置に関する。

修飾によるタンパク質の活性化とは、成長、発達、恒常性および細胞コミュニケーションといった生物学的機構および制御のほとんど全てを司る生体の重要なメカニズムである。例えば、タンパク質のリン酸化は、ガン、発達障害、自己免疫疾患、糖尿病等を含む多くの症状および疾病の原因において重要な役割を果たすものである。したがって、タンパク質の修飾は、生命情報の解析、疾病の診断、創薬の重要なターゲットとなり得るものであり、細胞内におけるその複雑なシステムを解明するための分析技術の開発が急務となっている。

生体内の複雑なタンパク質の全容を網羅的に解析しようとするプロテオームの分野では、質量分析法が主要な解析技術となっており、タンパク質修飾の解析においても、それは同様である。質量分析法による修飾タンパク質の解析では、検出感度の問題から、複雑なタンパク質の混合物である試料を酵素などを用いて加水分解したペプチド混合物から、修飾ペプチドのみを精製する前工程が質量分析の前に実施されるのが一般的である。例えば、リン酸化タンパク質の場合、試料の酵素消化物内に含まれる種々のリン酸化ペプチドのみを精製する。

現在、広く用いられている修飾ペプチドの精製方法の一つとして、金属イオン固定化アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）がある（非特許文献１）。この擬アフィニティー精製法は、金属イオンとリン酸のようなマイナスに荷電したペプチド部分との相互作用に基づくものである。前もって精製されたリン酸化タンパク質はペプチドへと消化され、リン酸化されたペプチドは、次いで、例えばイミノ二酢酸またはニトリロ三酢酸などの金属キレーターと共有結合させた樹脂を充填したクロマトグラフィーのカラムに消化物を通過させて精製される。Ｆｅ^３＋、Ｎｉ^２＋、Ｇａ^３＋、Ｃｕ^２＋のようないくつかの金属塩の一つで樹脂を処理して、カチオンをキレーターと非共有結合させる。タンパク質消化物がカラムにのせられると、リン酸基のような十分に高いマイナスの荷電密度を有するペプチドは、金属カチオンに結合することができる。また、最近、前述の金属カチオンと比べてよりリン酸基との親和性が高い酸化チタン（チタニア）の担体を用いた手法も開発されている（特許文献１、２）。

例えば、細胞消化物のような複雑なペプチド混合物の場合、そこに含まれる修飾ペプチドは均一の状態にはなく、修飾を受けるアミノ酸の種類や修飾基の数等、種々の要因によって望ましい精製条件が変化する。したがって、前述のような精製法を用いた場合、含まれる個々の修飾ペプチドによって回収効率に差が生じる。これは、ペプチドの修飾の状態によって、ペプチド自体と捕捉剤との親和力に差が生じるためと考えられる。

また、特許文献３には、ペプチド混合物をタンデム分析することができる質量分析システムにおいて、既に計測したタンパク質および、それに由来するペプチドデータを内部データベースに自動格納し、それらと計測データを高精度に照合し、同位体ピーク判定することにより、未計測のペプチドピークを、次のタンデム分析ターゲットとして選定する処理を計測の実時間内に実施し、同じタンパク質由来のペプチドの重複計測を回避するシステムが開示されている。特許文献３の質量分析システムは、一旦測定したペプチドデータを内部データベースに自動格納することにより、同じ試料由来のペプチドの重複計測を回避することができるため、通常であれば混在する非修飾ペプチドに感度で劣る修飾ペプチドも、内部データベースとの照合、同位体ピーク判定によってデータベースにデータが格納されている非修飾ペプチドがタンデム分析の対象から排除されるため、タンデム分析が可能となる。本発明は、特許文献３に開示されているタンデム分析可能な質量分析システムを利用するものである。

ＷＯ２００３／０６５０３１特開２００５−２８３５１４号公報特開２００５−９１３４４号公報Ｐｏｓｅｗｉｔｚ他，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１５：ｐｐ．２８８３−２８９２（１９９９）

本発明は、多数の修飾タンパク質を含む生体試料を元に作られる複雑なペプチド混合物中に含まれる修飾ペプチド全体を、個々の修飾ペプチドの修飾状態による精製効率の差に影響を受けることなく、効率的に分析する質量分析法を用いた分析方法を提供することを目的とする。

本発明による分析方法は、修飾ペプチドを含む試料中に存在する修飾ペプチドを捕捉し、修飾ペプチドの濃度を低下させた試料を回収する第１の工程と、第１の工程により得られた、修飾ペプチドの濃度を低下させた試料の質量分析を行い、その分析データをデータベースに格納する第２の工程と、当初の修飾ペプチドを含む試料の質量分析を行い、第２の工程で得られた分析データと照合し、当初の修飾ペプチドを含む試料の選択的な質量分析を行う第３の工程とを含むことを特徴とする。

また、本発明による質量分析装置は、一つないし複数の溶媒を送液可能なポンプと、該ポンプからの送液に対して試料を導入する試料導入部と、その下流側に接続した修飾ペプチド捕捉手段と、タンデム分析可能な質量分析装置と、該質量分析装置で計測した２種類のペプチドの分析データを自動格納するデータベースと、前記２種類の分析データを照合して判別する判別手段とを具備し、前記試料導入部から質量分析装置までの流路に、前記修飾ペプチド捕捉手段を経由する流路と経由しない流路とに切り替え可能な流路切り替え部を設けたことを特徴とする。

本発明によれば、従来法のように修飾ペプチドの捕捉手段によって捕捉した修飾ペプチドそのものを回収・分析するのではなく、捕捉手段から素通り画分として安定的に回収される非修飾ペプチドを回収・分析して内部データベースを作成し、修飾ペプチドの修飾の状態による分析データのばらつきを抑えることができる。

図１に本発明による分析方法の概念図を示す。図１（ａ）は、試料１中の修飾ペプチド２−１を捕捉して非修飾ペプチド２−２の質量分析を行う工程を示したものであり、図１（ｂ）は、当初の試料１をそのまま質量分析する工程を示したものである。

本発明による分析方法においては、修飾ペプチドを含む試料１中の修飾ペプチド２−１を特異的に捕捉する修飾ペプチド捕捉手段２を用い、図１（ａ）に示すように、試料１を捕捉手段２によって処理したことにより生ずる非修飾ペプチドを含む非修飾ペプチド２−２を質量分析３−１で計測した非修飾ペプチド２−２の分析データ４を内部データベース３−２に自動格納する。つぎに、図１（ｂ）に示すように、当初の修飾ペプチドを含む試料１をそのまま質量分析３−３に導入し、当初の試料１の分析データを取得する。そして、当初の試料１の分析データと分析データ４とを高精度に照合し、同位体ピークを判定することにより、非修飾ペプチド２−２の分析データ４に表れないペプチドピークを、次のタンデム分析ターゲットとして選定する処理を計測の実時間内に実施し、タンデム分析可能な質量分析システム３を用いて、当初の修飾ペプチドを含む試料１の選択的な質量分析３−４を行う。これにより、修飾ペプチドの分析データ５を取得する。ここで、内部データベース３−２は、分析データ４、５を自動格納するコンピュータ読み取り可能な記録媒体である。

また、次の実施例に示すように、質量分析システム３の前段に、測定する試料中のペプチド成分を分離するためのペプチド分離手段８を有する場合を含める。このペプチド分離手段８は、液体クロマトグラフ、電気泳動、マイクロ流体デバイス、分離チップなどを含む。

以下、図面を参照し、本発明の実施例としてリン酸化ペプチドの分析方法について説明する。

図２はリン酸化ペプチドの分析方法の概念図である。図２（ａ）は、リン酸化ペプチドを含む試料６中のリン酸化ペプチド７−１を捕捉して非リン酸化ペプチド７−２の質量分析を行う工程を示したものであり、図２（ｂ）は、当初のリン酸化ペプチドを含む試料６をそのまま質量分析する工程を示したものである。本実施例においては、リン酸化ペプチドを含む試料６を、リン酸化ペプチド捕捉手段７に供することにより、試料６中のリン酸化ペプチド７−１をリン酸化ペプチド捕捉手段７に捕捉し、試料６からリン酸化ペプチド７−１除去した非リン酸化ペプチド７−２を非吸着画分として回収する（第１の工程）。なお、リン酸化ペプチド捕捉手段７は、酸化チタン担体、酸化ジルコニウム担体、ＩＭＡＣなどリン酸化ペプチドを特異的に捕捉可能な技術を含む。また、リン酸化ペプチド捕捉手段７は、カラムや反応チップ、マイクロピペット用チップ充填タイプなど、リン酸化ペプチドの捕捉に適した部材を含む。

つぎに、必要に応じて非リン酸化ペプチド７−２をペプチド分離手段８に供し、複数の種類の非リン酸化ペプチド７−２を適度に分離する。ペプチド分離手段８は、液体クロマトグラフ、電気泳動、マイクロ流体デバイス、分離チップなどを含む。ペプチド分離手段８で分離した非リン酸化ペプチド７−２を、連続あるいは不連続に質量分析システム３に供給する。ＭＳ^ｎ分析３−３の際に得た非リン酸化ペプチドイオンの質量数、価数、ＬＣの保持時間といった、非リン酸化ペプチドの分析データ９を内部データベース３−２に自動的に格納する（第２の工程）。ここで、ＬＣとは液体クロマトグラフの略称である。

続いて、第１の工程で用いたのと同じ、当初の試料６を、今度は直接ペプチド分離手段８に供し、試料６中のペプチドを適度に分離する。分離したペプチドを、連続もしくは非連続に質量分析システム３に供給する。ここで、ＭＳ^ｎ分析３−４を行う際、ＭＳ分析で得た測定中のペプチドイオンの質量数、価数、ＬＣの保持時間といったデータを、第２の工程の際に内部データベースに格納した非リン酸化ペプチドの分析データ９と照合する。ここで、２種類のデータが一定の誤差範囲内で一致した場合、測定中のペプチドを非リン酸化ペプチドであると見なし、たとえ同時に測定している他のペプチドよりも多量に存在していたとしてもＭＳ^ｎ分析を行わない。２種類のデータが一致しなかった場合は、測定中のペプチドをリン酸化ペプチドと見なして選択的なＭＳ^ｎ分析３−４を行い、リン酸化ペプチドの分析データ１０を得ることができる（第３の工程）。これにより、混在する非リン酸化ペプチドと比べて感度で劣るリン酸化ペプチドの分析が可能となる。

つぎに、実施例１で説明したリン酸化ペプチドの分析方法の自動化を実現する装置の一例を実施例２として説明する。図３は本実施例で説明する装置の構成図である。図２（ａ）の工程を実施する際の装置の流路は図３（ａ）のように接続する。リン酸化ペプチドを含む試料６は、一つないし複数の溶媒１１を送液可能な送液手段すなわちポンプ１２によって送液される溶液中に試料導入部１３を通じて導入する。ここで、溶媒１１は、カラム平衡化溶液、カラム洗浄溶液、リン酸化ペプチド溶出液などを含む。導入した試料６を６方バルブ１４に取り付けたリン酸化ペプチド捕捉カラム１５に供給し、試料６中のリン酸化ペプチド７−１をリン酸化ペプチド捕捉カラム１５で捕捉する。なお、リン酸化ペプチド捕捉カラム１５は、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ＩＭＡＣなどリン酸化ペプチドを特異的に捕捉可能な担体を充填したカラムを含む。ここで、６方バルブ１４およびリン酸化ペプチド捕捉カラム１５を合わせて、流路切り替え部１８と呼ぶ。試料６からリン酸化ペプチド７−１を除いた非リン酸化ペプチドを含むペプチド混合物７−２を、非吸着画分としてリン酸化ペプチド捕捉カラム１５から溶出し、ペプチド分離手段１６に送る。ペプチド分離手段１６は、液体クロマトグラフ、電気泳動、マイクロ流体デバイスなどを含む。ペプチド分離手段１６で分離した非リン酸化ペプチドをイオン化して質量分析装置１７に導入する。そして、図２（ａ）に示すように、非リン酸化ペプチドイオンの質量数、価数、ＬＣの保持時間といった分析データ９を内部データベース３−２に自動的に格納する。

その後、流路を図３（ｂ）に切り換え、図２（ｂ）で説明した工程を実施する。第１の工程で用いたのと同じ試料６を試料導入部１３から流路に導入し、６方バルブ１４を介してペプチド分離手段１６に送る。ここで分離されたペプチドをイオン化して質量分析装置１７に供給し、実施例１の第３の工程で説明した選択的なＭＳ^ｎ分析３−４の過程を経て、リン酸化ペプチドのＭＳ^ｎデータ１０を得ることができる。

本実施例では、修飾ペプチドがリン酸化ペプチドである場合について説明したが、他の修飾ペプチドの場合も同様に分析できることは言うまでもない。

また、上述の質量分析装置は、通常、コンピュータ、およびコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を内蔵し、本発明による分析方法における各工程を、該コンピュータにプログラムにより実行させることができるようになっている。もちろん、上述の質量分析装置の外部に設置したコンピュータ、およびコンピュータ読み取り可能な記録媒体に接続し、該プログラムにより前記各工程を実行させるようにしてもよい。

本発明の分析方法の概念図である。本発明の実施例１における分析方法の概念図である。本発明の実施例２に示す分析装置の構成図である。

符号の説明

１…修飾ペプチドを含む試料、２…修飾ペプチド捕捉手段、２−１…修飾ペプチド、２−２…非修飾ペプチド、３…質量分析システム、３−１…質量分析（ＭＳ^ｎ分析）、３−２…内部データベース、４…非修飾ペプチド２−２の分析データ、５…修飾ペプチドの分析データ、６…リン酸化ペプチドを含む試料、７…リン酸化ペプチド捕捉手段、７−１…リン酸化ペプチド、７−２…非リン酸化ペプチド、８…ペプチド分離手段、９…非リン酸化ペプチドの分析データ、１０…リン酸化ペプチドの分析データ、１１…溶媒、１２…ポンプ、１３…試料導入部、１４…６方バルブ、１５…リン酸化ペプチド捕捉カラム、１６…ペプチド分離手段、１７…質量分析装置、１８…流路切り替え部。

Claims

修飾ペプチドを含む試料中に存在する修飾ペプチドを捕捉し、修飾ペプチドの濃度を低下させた試料を回収する第１の工程と、第１の工程により得られた、修飾ペプチドの濃度を低下させた試料の質量分析を行い、その分析データをデータベースに格納する第２の工程と、当初の修飾ペプチドを含む試料の質量分析を行い、第２の工程で得られた分析データと照合し、当初の修飾ペプチドを含む試料の選択的な質量分析を行う第３の工程とを含むことを特徴とする分析方法。
請求項１に記載の分析方法において、質量分析の前にペプチド分離工程を設けたことを特徴とする分析方法。
請求項２に記載の分析方法において、前記ペプチド分離工程を液体クロマトグラフィーで行うことを特徴とする分析方法。
請求項２に記載の分析方法において、前記ペプチド分離工程を電気泳動法で行うことを特徴とする分析方法。
請求項２に記載の分析方法において、前記ペプチド分離工程を、マイクロ流体デバイスを用いて行うことを特徴とする分析方法。
請求項２に記載の分析方法において、前記ペプチド分離工程を、分離チップを用いて行うことを特徴とする分析方法。
請求項１から６のいずれかに記載の分析方法において、試料中の修飾ペプチドがリン酸化ペプチドであることを特徴とする分析方法。
請求項７に記載の分析方法において、修飾ペプチドの捕捉を酸化チタン担体で行うことを特徴とする分析方法。
請求項７に記載の分析方法において、修飾ペプチドの捕捉を酸化ジルコニウム担体で行うことを特徴とする分析方法。
請求項７に記載の分析方法において、修飾ペプチドの捕捉を金属イオン固定化アフィニティークロマトグラフィーで行うことを特徴とする分析方法。
修飾ペプチドを含む試料中に存在する修飾ペプチドを捕捉する第１の工程と、第１の工程により得られた、修飾ペプチドの濃度を低下させた試料の質量分析を行い、その分析データをデータベースに格納する第２の工程と、当初の修飾ペプチドを含む試料の質量分析を行い、第２の工程で得られた分析データと照合し、当初の修飾ペプチドを含む試料の選択的な質量分析を行う第３の工程とをコンピュータに実行させるためのプログラム。
修飾ペプチドを含む試料中に存在する修飾ペプチドを捕捉する第１の工程と、第１の工程により得られた、修飾ペプチドの濃度を低下させた試料の質量分析を行い、その分析データをデータベースに格納する第２の工程と、当初の修飾ペプチドを含む試料の質量分析を行い、第２の工程で得られた分析データと照合し、当初の修飾ペプチドを含む試料の選択的な質量分析を行う第３の工程とをコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
一つないし複数の溶媒を送液可能なポンプと、該ポンプからの送液に対して試料を導入する試料導入部と、その下流側に接続した修飾ペプチド捕捉手段と、タンデム分析可能な質量分析装置と、該質量分析装置で計測した２種類のペプチドの分析データを自動格納するデータベースと、前記２種類の分析データを照合して判別する判別手段とを具備し、前記試料導入部から質量分析装置までの流路に、前記修飾ペプチド捕捉手段を経由する流路と経由しない流路とに切り替え可能な流路切り替え部を設けたことを特徴とする質量分析装置。
請求項１３に記載の質量分析装置において、該質量分析装置の前段にペプチド分離手段を設けたことを特徴とする質量分析装置。
請求項１４に記載の質量分析装置において、該ペプチド分離手段が液体クロマトグラフであることを特徴とする質量分析装置。
請求項１４に記載の質量分析装置において、該ペプチド分離手段が電気泳動装置であることを特徴とする質量分析装置。
請求項１４に記載の質量分析装置において、該ペプチド分離手段がマイクロ流体デバイスであることを特徴とする質量分析装置。
請求項１４に記載の質量分析装置において、該ペプチド分離手段が分離チップであることを特徴とする質量分析装置。
請求項１３から１８のいずれかに記載の質量分析装置において、前記修飾ペプチド捕捉手段が酸化チタン担体であることを特徴とする質量分析装置。
請求項１３から１８のいずれかに記載の質量分析装置において、前記修飾ペプチド捕捉手段が酸化ジルコニウム担体であることを特徴とする質量分析装置。
請求項１３から１８のいずれかに記載の質量分析装置において、前記修飾ペプチド捕捉手段が金属イオン固定化アフィニティークロマトグラフであることを特徴とする質量分析装置。
一つないし複数の溶媒を送液可能な送液手段、該送液手段からの送液に対して試料を導入する試料導入手段、その下流側に接続した修飾ペプチド捕捉手段、タンデム分析可能な質量分析手段、該質量分析手段で計測した２種類のペプチドの分析データを自動格納するデータ格納手段、前記２種類の分析データを照合して判別する判別手段、および前記試料導入手段から質量分析手段までの流路に設けた、前記修飾ペプチド捕捉手段を経由する流路と経由しない流路とに切り替え可能な流路切り替え手段としてコンピュータを機能させるためのプログラム。
一つないし複数の溶媒を送液可能な送液手段、該送液手段からの送液に対して試料を導入する試料導入手段、その下流側に接続した修飾ペプチド捕捉手段、タンデム分析可能な質量分析手段、該質量分析手段で計測した２種類のペプチドの分析データを自動格納するデータ格納手段、前記２種類の分析データを照合して判別する判別手段、および前記試料導入手段から質量分析手段までの流路に設けた、前記修飾ペプチド捕捉手段を経由する流路と経由しない流路とに切り替え可能な流路切り替え手段としてコンピュータを機能させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。