JP2008272540A - 炭化水素で汚染された土壌又は水の浄化方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】炭化水素で汚染された土壌又は水を、炭化水素分解能を有する微生物により浄化する際に、当該微生物に対してLEDの光照射を行うことによって、その浄化効率を向上させる。
【選択図】なし
Description
項1. 炭化水素で汚染された土壌又は水を、炭化水素分解能を有する微生物により浄化する方法であって、前記微生物に対してLEDの光照射を行い、前記土壌又は水を浄化することを特徴とする、浄化方法。
項2. LEDの光照射条件下で前培養した炭化水素分解能を有する微生物を、炭化水素で汚染された土壌又は水に添加して培養する工程を含む、項1に記載の浄化方法。
項3. 炭化水素分解能を有する微生物を、炭化水素で汚染された土壌又は水に添加し、LEDの光照射条件下で培養する工程を含む、項1に記載の浄化方法。
項4. 400〜940nmの波長領域にピークを持つLEDの光照射を行う、項1乃至3のいずれかに記載の浄化方法。
項5. 炭化水素がシクロアルカンである、項1乃至4のいずれかに記載の浄化方法。
実施態様1の本発明の浄化方法では、先ず、LEDを光源として用いて光照射を行いながら上記微生物の前培養を行う。
実施態様2の本発明の浄化方法では、上記微生物を汚染土壌又は水に添加してLEDの光照射条件下で培養を行う。
実施例1 プレート培養系での光照射による石油系炭化水素分解菌の生育活性化の観察
<試験方法>
これまでに微生物を用いた炭化水素汚染土壌浄化を目指し、微生物ライブラリー を構築している。このうち、Acinetobacter sp. ODDK71株、Gordonia sp. NDKY76A株、Rhodococcus sp. NDKK48株、Rhodococcus sp. NDKK6株(いずれも立命館大学理工学部化学生物工学科にて保存されている菌株)は様々な炭化水素に対して優れた分解能を示しており、現在、実汚染土壌でのバイオモニタリング、炭化水素の分解経路の解明、炭化水素の分解に関与する遺伝子解析に用いている。そこで、これらの微生物を用いて、以下の試験を行った。具体的には、1/20 LB+SW固体培地の上に1/20 LB+SW培地で前培養したそれぞれの菌の培養液を2μlずつ滴下後、ヘキサデカン50μlをプレートに落とし、プレートをパラフィルム(商品名)で巻いた。これを、外部の光を遮断した環境下でLEDの下に置き(LEDから菌までの距離は0.5cm)、700〜940nm波長の光を照射しながら25℃で16時間培養を行った(LED光の照射強度:700nmの場合720μW/cm2/nm、740nmの場合1175μW/cm2/nm、770nmの場合1878μW/cm2/nm、810nmの場合1627μW/cm2/nm、850nmの場合1005μW/cm2/nm、880nmの場合415μW/cm2/nm、910nmの場合506μW/cm2/nm、940nmの場合400μW/cm2/nm)。また、コントロールとして、LEDによる光照射を行わずに、他の条件は同様にして培養を行った。なお、本試験で使用した培地の組成及び調製法は、以下の通りである。
1/20 LB+SW 培地(g/L H2O):Peptone 0.5g, Yeast Extract 0.25g, Solution A 200ml, Solution B 50ml, SSS 1ml
Solution A(g/L H2O):NH4NO3 24.2g, MgSO44.93g, FeSO4・7H2O 0.0556g, CaCl2・2H2O 0.294g, NaCl 10g
Solution B(g/L H2O):Na2HPO4・12H2O 71.6g, KH2PO4 27.2g
SSS (g/L H2O):ZnSO4・7H2O 2.01g, (NH4)6Mo7O24・4H2O 0.15g, CuSO4・5H2O 0.2g, CoCl2・6H2O 0.4g, MnSO4・5H2O 1.49g
1/20 LB+SW固体培地:1/20 LB+SW培地1LにAgar 20gを入れて滅菌した後、プレートに20mlずつ入れて固めたもの。
図1に、培養後の各微生物のコロニーの形態を撮影した写真を示す。図1から分かるように、全ての光波長で、Acinetobacter sp. ODDK71株、Gordoniasp. NDKY76A株、Rhodococcus sp. NDKK48株、Rhodococcus sp. NDKK6株の生育が光照射なしのコントロールと比べて活性化された。再現性実験でも同じ結果を示した。また、LEDの光と菌との距離を近づけることによって菌が受ける光の強度が上がり、これによって菌の生育がより活性化されることも確認された。
<試験方法>
LED照射により光合成機構を有してない炭化水素分解菌でも生育が活性化された。そこで、本試験では、LED照射条件下でフラスコ培養を行い、石油系炭化水素分解菌の生育活性化度を定量することにより、炭化水素分解菌の生育活性化に寄与する特定波長光を検討した。具体的には、以下の方法に従って試験を行った。
表1にGordonia sp. NDKY76A株の生育活性化試験(3回)の平均値を示す。炭化水素分解菌であるGordonia sp. NDKY76A株をフラスコ培養系で本培養するとき、濁度をOD600で1.0調整して植菌した直後の生菌数は、5.03×106CFU/mlであった。Gordonia sp. NDKY76A株の生育は12時間培養から全ての波長でLED光照射なしのコントロールと比べて活性化が見られた。12時間までは光の波長が遠赤外線に近いほど活性化が高かったが、24時間から36時間までは光の波長が可視光線に近い方が高く活性化された。菌の生育活性化の程度を見ると、12時間培養したときには111%から380%まで活性化され、700nmから910nmでの生育活性化の平均は247%であった。24時間培養では、135%から275%まで活性化され、700nmから910nmでの生育活性化の平均は219%であった。36時間培養では、114%から182%まで活性化され、700nmから910nmまでの波長での生育活性化の平均は138%であった。
<試験方法>
上記試験結果から、炭化水素分解菌の生育活性化の実験からLED光を照射することによりGordonia sp. NDKY76A株の生育が活性化されることが確認された。そこで、Gordoniasp. NDKY76A株にLED光照射を行って前培養した後、その前培養液を用いて炭化水素の分解を行い、炭化水素の分解率について評価した。具体的には、以下の方法に従って試験を行った。
(1)培養液を250ml遠心管に入れた。
(2)培養フラスコにchloroform/methanol(3:1)溶液30ml添加した。
(3)培養フラスコを良く洗った後、その溶液を上記の遠心管に入れた。
(4)少量の蒸留水で培養フラスコを良く洗った後、上記の遠心管に入れた。(この作業を3回)
(5)抽出溶液を250回シェイキングした。
(6)遠心分離 (4000g、30分、20℃)した。
(7)GC分析用サンプルとして有機溶媒層1mlを取った。
LED光照射によるGordoniasp. NDKY76A株の生育活性化試験の結果(上記表1)に基づいて、LEDの光照射による炭化水素分解能の活性化の解析のため、前培養と共に使う光波長を選んだ。Gordonia sp. NDKY76A株の場合、400nmは菌の生育が悪くならず活性化されることから12時間、24時間、36時間の前培養時間で照射する光波長として選択した。また、12時間の前培養で使うLEDの光波長としては、生育活性化が940nmの遠赤外線に近いほど良いことから最も活性化が良かった遠赤外線である940nmと400nmから940nmで真ん中ぐらいのやや良い活性化を示す850nmを選んだ。24時間の前培養で使うLEDの光波長としては、菌の生育活性化度を見ると400nmから770nmまで高くなってから波長が940nmまでに長くなると低くなることから最も活性化が良かった770nmと弱い活性化を示す940nmを更に選んだ。36時間の前培養で使うLEDの光波長としては、菌の生育活性化度を見ると400nmから940nmまで低くなる傾向を示していたので、最も活性化が良かった700nmと弱い活性化を示す940nmを更に選んだ。
LED光照射によるGordoniasp. NDKY76A株の生育活性化試験の結果(上記表1)に基づいて、24時間の前培養時に照射する光波長を選んだ。Gordonia sp. NDKY76A株のLEDの光照射による炭化水素分解能の活性化の解析のため、選んだそれぞれの波長(400nm、770nm、940nm)のLED光照射条件下(LEDから菌までの距離は3.5cm、LED光の照射強度:400nmの場合415μW/cm2/nm、770nmの場合1153μW/cm2/nm、940nmの場合170μW/cm2/nm)で24時間の前培養を行い、前培養液1%を取って本培養に供し、30℃、120rpmで5日間培養を行った。その際、ブランク(菌を入れない系)とコントロール(LEDの非照射条件下で前培養し、それを1%取って本培養した系)も一緒の条件で培養を共に行った。その後、これらのサンプルをクロロホルム/メタノール抽出法で抽出を行い、GCで分析により炭化水素分解率を測った。GC分析結果に基づいたGordonia sp. NDKY76A株のベースオイル分解能を換算した結果を図3に示す。
LED光照射によるGordoniasp. NDKY76A株の生育活性化試験の結果(上記表1)に基づいて、36時間の前培養時に照射する光波長を選んだ。Gordonia sp. NDKY76A株のLEDの光照射による炭化水素分解能の活性化の解析のため、選んだそれぞれの波長(400nm、700nm、940nm)のLED光照射条件下(LED光の照射強度:400nmの場合415μW/cm2/nm、700nmの場合595μW/cm2/nm、940nmの場合170μW/cm2/nm)で36時間の前培養を行い、前培養液1%を取って本培養に供し、30℃、120rpmで5日間培養を行った。その際、ブランク(菌を入れない系)とコントロール(LEDの非照射条件下で前培養し、それを1%取って本培養した系)も一緒の条件で培養を共に行った。その後、これらのサンプルをクロロホルム/メタノール抽出法で抽出を行い、GCで分析により炭化水素分解率を測った。GC分析結果に基づいたGordonia sp. NDKY76A株のベースオイル分解能を換算した結果を図4に示す。
LED光照射条件で前培養したGordoniasp. NDKY76A株の炭化水素分解能をより詳細に明らかにするために、更に400nm〜940nmのLED光照射(LEDから菌までの距離は3.5cm、LED光の照射強度:400nmの場合415μW/cm2/nm、700nmの場合595μW/cm2/nm、740nmの場合796μW/cm2/nm、770nmの場合1153μW/cm2/nm、810nmの場合970μW/cm2/nm、850nmの場合728μW/cm2/nm、880nmの場合232μW/cm2/nm、910nmの場合242μW/cm2/nm、940nmの場合170μW/cm2/nm)を採用し、上記<試験結果−24時間前培養で光照射>の方法に従って試験を実施した。結果を図5に示す。
<試験方法>
上記試験結果から、LED光を照射することによりRhodococcus sp. NDKK6株の生育が活性化されることが確認された。そこで、Rhodococcus sp. NDKK6株にLED光照射を行って前培養した後、その前培養液を用いて炭化水素の分解を行い、炭化水素の分解率について評価した。具体的には、以下の方法に従って試験を行った。
得られた結果を表4に示す。この結果から、光照射なしのコントロールと比較して810nmのLEDの光を照射すると、ベースオイル分解率は最も高くなることが確認された。
<試験方法>
酵母に対し、特定の波長のLED光を照射することによる生育特性への影響を検討するために以下の試験を行った。
EF培地(g/L H2O):グルコース 50g, Yeast Extract 1.5g, K2HPO4 5.5g, NH4Cl 2.5g, MgSO4・7H2O 0.3g, NaCl 1.0g。
結果を図6に示す。LED光照射を行った酵母は、LED光照射を行っていない場合に比して、0.4〜0.56高い濁度を示した。紫外領域に近い400 nmの波長においても生育は阻害されず、生育能が活性化されることも明らかとなった。以上の結果より、LED光照射は酵母の生育の活性化に有効であることが確認された。
<試験方法>
バシラスに対し、特定の波長のLED光を照射することによる生育特性への影響を検討するために以下の試験を行った。
結果を図7に示す。培養開始時の濁度は0.047とした。培養開始8時間後、光照射有りの場合と光照射無しの場合とで差が現れた。この時、最も濁度が高かった400 nmの波長光を照射した場合の濁度は2.08であり、LED光照射無しの場合と0.45の差があった。他の波長でも0.3以上の差があった。以上のことから、Bacillus circulans HA12は、対数増殖期にLED光照射をすることにより、一層効果的な生育促進が可能になることが確認できた。
<試験方法>
ゴルドニアに対し、炭化水素を含まない培地中でLEDによる特定の波長を照射して、その生育特性への影響を検討した。具体的には、以下の方法に従って試験を行った。
結果を図8に示す培養開始12時間後、光照射有りの場合と光照射無しの場合とで差が現れた。この時、最も濁度が高かった810 nmの波長光を照射した場合の濁度は0.251であり、光照射無しの場合と0.155の差があった。他の波長でも0.077以上の差があった。以上のことから、Gordonia sp. NDKY76A株は、炭化水素を含まない培地でも生育が活性化することが確認できた。
<試験方法>
ストレプトマイセスに対し、特定の波長のLED光を照射することによる生育特性への影響を検討するために以下の試験を行った。
結果を図9に示す。培養開始50時間後、光照射有りの場合と光照射無しの場合とで差が現れた。この時、最も乾燥菌体重量が高かった770 nmの波長光を照射した場合は0.1482gであり、LED光照射無しの場合と0.0793gの差があった。他の波長でも0.0113以上の差があった。以上のことから、Streptomyces sp. MF20株は、対数増殖期にLED光照射をすることにより、一層効果的な生育促進が可能になることが確認できた。
<試験方法>
大腸菌に対し、特定の波長のLED光を照射することによる生育特性への影響を検討するために以下の試験を行った。
結果を図10に示す。培養開始6時間後、光照射有りの場合と光照射無しの場合とで差が現れた。この時、最も濁度が高かった810 nmの波長光を照射した場合は0.385であり、LED光照射無しの場合と0.016(24%の増加)の差があった。殆どの波長でも濁度の差があった。以上のことから、Escherichia coli JM109株は、LED光照射をすることにより、一層効果的な生育促進が可能になることが確認できた。
Claims (5)
- 炭化水素で汚染された土壌又は水を、炭化水素分解能を有する微生物により浄化する方法であって、前記微生物に対してLEDの光照射を行い、前記土壌又は水を浄化することを特徴とする、浄化方法。
- LEDの光照射条件下で前培養した炭化水素分解能を有する微生物を、炭化水素で汚染された土壌又は水に添加して培養する工程を含む、請求項1に記載の浄化方法。
- 炭化水素分解能を有する微生物を、炭化水素で汚染された土壌又は水に添加し、LEDの光照射条件下で培養する工程を含む、請求項1に記載の浄化方法。
- 400〜940nmの波長領域にピークを持つLEDの光照射を行う、請求項1乃至3のいずれかに記載の浄化方法。
- 炭化水素がシクロアルカンである、請求項1乃至4のいずれかに記載の浄化方法。
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