JP2008271949A - 小胞体局在化シグナル付スフィンゴリピッドδ４−デサチュラーゼを用いた形質転換細胞におけるセラミドの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ヒト型セラミドを酵母細胞内などの細胞内で製造する方法を提供する。
【解決手段】１）酵母細胞の形質転換によって、スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）の３’末端に酵母の小胞体局在化シグナルをコードする塩基配列を付加した小胞体局在化シグナル付スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１ｍ）を導入すること；及び ２）酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）の発現を欠失させることを含む方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヒト型セラミドを酵母細胞内などの細胞内で製造する方法に関する。

皮膚の最外層には、水分を保持する保湿機能と外部刺激から肌を保護するバリア機能を司る角質層という組織が存在する。角質層は角質細胞と天然保湿因子、そして細胞間脂質から構成されているが、その中でも特に細胞間脂質の約半分を占めるセラミドが、それらの機能に極めて重要な役割を担っている。例えば、アトピー性皮膚炎や老人性乾皮症に共通する特徴は保湿能の著しい低下であるが、その主因は脂質代謝酵素異常によるセラミド量の減少であることが知られている。またセラミドはバリア機能の増強・美白作用やメラニンの生成を抑制する作用があることも確認されている。セラミドは外部から補給することが可能な物質である。

J Invest Dermatol. 96:523-526, 1991（非特許文献１）、Arch Dermatol Res. 283:219-223,1991（非特許文献２）は、「アトピー性皮膚炎や老人性乾皮症におけるセラミド量の減少」について、J Dermatol Sci. 1:79-83, 1990（非特許文献３）、Acta Derm Venereol. 74:337-340, 1994（非特許文献４）は、「セラミド量の減少と脂質代謝酵素異常」について、Contact Dermatitis. 45:280-285, 2001（非特許文献５）、J Eur Acad Dermatol Venereol. 16:587-594, 2002（非特許文献６）は、「セラミドによるバリア機能の回復」について、そして、Cell Signal 14:779-785, 2002（非特許文献７）は、「セラミドによるメラニン生成の抑制」について開示している。

近年では、乾燥敏感肌を伴う皮膚疾患に対する治療薬あるいは化粧品・美容健康食品の素材として大変注目されている。実際、化粧品、食品・サプリメント等として、セラミドを配合した多くの製品がすでに市販されており、さらに、セラミド原料市場規模は拡大傾向が続いている。

セラミドの原料としては、これまで牛などの動物由来のものが使われていたが、感染症の問題が指摘され、現在では米、小麦、大豆や芋などの植物性セラミドが主流である。最近の基礎的研究（J. Clin. Invest. 112:1372-1382, 2003（非特許文献８））により、セラミドの構造が皮膚の保湿・バリア能に極めて重要であることが明らかとなり、ヒトのセラミドと構造が異なる植物性セラミドが機能性の高い脂質であるかどうか疑問が残る。しかも動植物に存在するセラミドは微量で抽出・精製が困難であり、生産性が悪い上コストが高いことから、それらを克服することが可能な新しい生産技術の開発が強く望まれている。

図１に示したように、スフィンゴ脂質合成・代謝経路においてジヒドロスフィンゴシン（ＤＨＳ）生合成以降の反応は、ヒトを含む高等動物細胞と酵母の間で大きく異なることが知られている。また、スフィンゴ脂質合成・代謝経路において、各工程において機能する各酵素タンパク質及び当該タンパク質をコードする遺伝子についても、ある程度知見が得られている（Biochemistry. 41:15105-15114. 2002（非特許文献９）；J Biol Chem. 277:25512-25518,2002（非特許文献１０）；Yeast 9: 267-277,1993（非特許文献１１）；J Biol Chem 272:29704-29710,1997（非特許文献１２）；J Biol Chem 275:31369-31378, 2000（非特許文献１３）；J Biol Chem 275:39793-39798, 2000（非特許文献１４））。

J Invest Dermatol. 96:523-526, 1991 Arch Dermatol Res. 283:219-223,1991 J Dermatol Sci. 1:79-83, 1990、 Acta Derm Venereol. 74:337-340, 1994 Contact Dermatitis. 45:280-285, 2001、 J Eur Acad Dermatol Venereol. 16:587-594, 2002 Cell Signal 14:779-785, 2002 J. Clin. Invest. 112:1372-1382, 2003 Biochemistry. 41:15105-15114. 2002 J Biol Chem. 277:25512-25518,2002 Yeast 9: 267-277,1993 J Biol Chem 272:29704-29710,1997 J Biol Chem 275:31369-31378, 2000 J Biol Chem 275:39793-39798, 2000 EMBO J. 9:3153-3162, 1990 J Cell Biol. 127:653-665, 1994 Science. 263:1629-1631, 1994 Cell. 79:1199-1207, 1994 Eur J Cell Biol. 64:211-216, 1994 Annu Rev Cell Dev Biol. 12:27-54, 1996 J Cell Biol. 127:21-28, 1994 J Biol Chem. 273:33273-33278, 1998 J Cell Biol. 152:935-944, 2001

植物性セラミドはヒトのセラミドと構造が異なる上に生産性が低い。それらを克服するために、ヒト型セラミドを酵母細胞などの細胞を用いて製造することが可能な、新しい生産技術の開発が強く望まれている。

本発明者らは、上記問題解決のために鋭意研究に努めた結果、本発明を想到した。
本発明は、遺伝子組み換え技術と真核生物のセラミド合成・代謝および輸送システムを巧く制御することにより、機能性の高いヒト型セラミドを効率的に生産する系を開発する。そのため遺伝子操作が比較的容易であり、しかも伝統的に食品製造に利用されている出芽酵母を宿主として用いる。

具体的には、ヒトの角質層に存在し、そのなかでも分布量が最も多く皮膚の保湿・バリア機能に極めて重要であると言われているセラミドＮＳをターゲットにする。セラミドの構造は細胞が持っている酵素の種類によって決定されており生物種で異なる。宿主として用いる出芽酵母は、高等動物の主なセラミドであるセラミドＮＳを合成する酵素を持っていない。その代わり宿主には宿主特有のセラミドを合成する酵素を有している。そのため酵母でセラミドＮＳを合成させるためには、宿主由来のセラミド合成経路を抑制し、且つ必要な酵素を酵母に導入する必要がある。

具体的には、図１に示したように、スフィンゴ脂質合成・代謝経路においてジヒドロスフィンゴシン（ＤＨＳ）生合成以降の反応は、ヒトを含む高等動物細胞と酵母の間で大きく異なる。即ち、出芽酵母（サッカロミセス属）では、スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）が存在しないことから、ＤＨＳのＣ−４位に二重結合を有するヒト型スフィンゴイド塩基（スフィンゴシン）は合成されない（図２）。その代わりスフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）がコードする酵素によってＤＨＳのＣ−４位が水酸化されフィトスフィンゴシン（ＰＨＳ）が合成される。次いでそれらのスフィンゴイド塩基はセラミドへと変換される。

本発明者らは、まずヒト型セラミドを酵母細胞内で製造させるために、酵母細胞内には存在しないスフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ酵素を酵母細胞内で発現させること、及び、スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ酵素活性を完全に又は部分的にでも破壊することが重要であること考えた。そこで先ず、酵母の形質転換により、１）上述したＳＵＲ２遺伝子破壊株を作成し、その変異株に２）ヒトＤＥＳ１遺伝子を導入する、ということを想到した。

さらに導入する酵素を最適な場所に局在化させることにより、セラミドＮＳの産生量を増大させることができる。セラミドＮＳの合成に必要なジヒドロセラミドは酵母の小胞体で合成される。しかしながらヒト型のスフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼＤＥＳ１タンパク質のＣ末端アミノ酸配列を見た限りでは、酵母の典型的な小胞体局在化シグナル、例えば、ｄｉｌｙｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ（ＫＫＸＸやＫＸＫＸＸ）の配列は認められない。したがって、ヒト型のスフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼＤＥＳ１タンパク質を酵母で発現させてもヒト型のセラミドＮＳが効率的に合成されるとは考えにくい。

本発明者らは、ヒト型セラミドをより効率的に生産されるためには、酵素であるスフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼＤＥＳ１タンパク質を小胞体に局在化させるほうがより有効である、と考えた。即ち、ＤＥＳ１タンパク質を小胞体に局在化させるため、酵母の典型的な小胞体局在化シグナルをＤＥＳ１タンパク質に付加したスフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１ｍ）を酵母に導入する。導入する酵素を最適な場所に局在化させることにより、セラミドＮＳの産生量を増大させることができる。

よって、本発明は、ヒト型セラミドを酵母細胞内で製造する方法であって、
１）酵母細胞の形質転換によって、スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）の３’末端に酵母の小胞体局在化シグナルをコードする塩基配列を付加した小胞体局在化シグナル付スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１ｍ）を導入すること；及び
２）酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）の発現を欠失させること
を含む、前記製造方法を提供する。

本発明において、ヒト型セラミドは、例えば図２の「目的生産物」に示された構造式を有する、セラミドＮＳを意味する。これに対して酵母型セラミドであるフィトセラミドは、ヒト型セラミドの４位の二重結合部分が水酸基で置換されている点で相違する（図３）。

さらにまた、ヒト型セラミドＮＳを効率的に生産させるシステムを構築するために、本発明の製造方法の最適化を行った。具体的な方法としては、酵母の形質転換によって、以下の３）又は４）のいずれか、あるいはこれらの組み合わせを行い、ヒト型セラミドをより効率よく製造することに成功した：
３）セラミドＮＳが水酸化されないように酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）の発現を欠失させること；及び／又は
４）酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）の発現を欠失させること。

よって、本発明は、上記１）及び２）を必須要件とし、３）−４）を好ましい態様の追加要件として行うことにより、ヒト型セラミドを酵母細胞内で簡便かつ効率よく製造する方法を提供するものである。本発明は、好ましくは以下の態様を含む。
（態様１）
ヒト型セラミドを酵母細胞内で製造する方法であって、
１）酵母細胞の形質転換によって、スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）の３’末端に酵母の小胞体局在化シグナルをコードする塩基配列を付加した小胞体局在化シグナル付スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１ｍ）を導入すること；及び
２）酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）の発現を欠失させること
を含む、前記製造方法。
（態様２）
小胞体局在化シグナルのアミノ酸配列が、２個以上のリジン残基を含む４又は５個のアミノ酸残基からなる、態様１に記載の製造方法。
（態様３）
小胞体局在化シグナルのアミノ酸配列が、ＶＫＫＥＫ（Ｖはバリン残基を、Ｋはリジン残基を、Ｅはグルタミン酸を表す）である、態様１又は２に記載の製造方法。
（態様４）
スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）が、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、態様１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
（態様５）
小胞体局在化シグナル付スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１ｍ）が配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、態様１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
（態様６）
酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）が、配列番号６のアミノ酸配列又は配列番号６において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、態様１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
（態様７）
さらに、酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）の発現を欠失させることを含む、態様１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
（態様８）
酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）が、配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、態様７に記載の方法。
（態様９）
さらに、酵母細胞の形質転換によって、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）の発現を欠失させることを含む、態様１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
（態様１０）
酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）が、配列番号１０のアミノ酸配列又は配列番号１０において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、態様９に記載の方法。
（態様１１）
酵母が、サッカロミセス属の酵母から選択される、態様１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。

スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）
本発明の方法は構成要件１）として、酵母細胞の形質転換によって、スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）の３’末端に酵母の小胞体局在化シグナルをコードする塩基配列を付加した小胞体局在化シグナル付スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１ｍ）を導入することを含む。

限定されるわけではないが、ＤＥＳ１は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。

本発明に利用可能な遺伝子（核酸）は、ゲノムＤＮＡ（その対応するｃＤＮＡも含む）、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。

ＤＥＳ１は、好ましくは配列番号１の塩基配列を有する。これは配列番号２のアミノ酸配列を有するヒト スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼタンパク質をコードする塩基配列であり、例えば、ＧｅｎＢａｎＫ^ＴＭ： ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ４６６３７５に開示されている。

１つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする場合があり、遺伝暗号の縮重と呼ばれている。このため、配列番号１とは完全には一致していないＤＮＡ配列が、配列番号２と全く同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることがあり得る。こうした変異体ＤＮＡ配列は、サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であってもよい。

ＤＥＳ１は、好ましくは配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ活性を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。配列番号２と同等の機能を有するアミノ酸配列をコードする限り、配列番号２に限定されるものではない。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。

ＤＥＳ１にコードされるアミノ酸配列は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。

アミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。

当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。

本発明の方法において、好ましくは、スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼが、配列番号２又は配列番号２と少なくとも７０％の同一のアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ活性を有する。

同一の機能を有するタンパク質であっても、由来する品種の相違によって、そのアミノ酸配列に相違が存在しうることは当業者にとって周知の事実である。スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ活性を有する限り、ＤＥＳ１は、配列番号１の塩基配列のこのような相同体、変異体も含みうる。配列番号２のヒト スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼタンパク質以外にも、例えばマウス（Ｍ． ｍｕｓｃｕｌｕｓ）やショウジョウバエ（Ｄ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等で同様の活性を示すタンパク質をコードする遺伝子の存在が知られている（非特許文献１０）。

「スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ活性を有する」とは、例えば図２又は図３に示されているように、ジヒドロスフィンゴシンのＣ−４にニ重結合を導入し、スフィンゴシンを合成する活性を意味する。あるいは、ジヒドロセラミドのＣ−４にニ重結合を導入し、セラミドＮＳを合成する活性を意味する。ＤＥＳ１の導入により、形質転換酵母細胞内では、酵母の天然の代謝経路では合成されない、スフィンゴシン及び／又はセラミドＮＳの合成が行われる。

本発明の好ましいスフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子はまた、配列番号１の塩基配列にストリンジェントな条件下、例えば、中程度又は高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、フィンゴイド Δ４−デサチュラーゼ活性を有する核酸を含む。

「ストリンジェントな条件下」とは、中程度または高程度にストリンジェントな条件においてハイブリダイズすることを意味する。具体的には、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、一般の技術を有する当業者によって、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，第６−７章，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド中の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および例えば、約４０℃−６０℃、０．５−６×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。好ましくは中程度にストリンジェントな条件は、約５０℃、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション条件（及び洗浄条件）を含む。高ストリンジェントな条件もまた、例えばＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することが可能である。

一般に、こうした条件は、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度および／または低い塩濃度でのハイブリダイゼーション（例えば、約６５℃、６×ＳＳＣないし０．２×ＳＳＣ、好ましくは６×ＳＳＣ、より好ましくは２×ＳＳＣ、最も好ましくは０．２×ＳＳＣのハイブリダイゼーション）および／または洗浄を含み、例えば上記のようなハイブリダイゼーション条件、およびおよそ６５℃−６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳの洗浄を伴うと定義される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液では、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）にＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）を代用することが可能であり、洗浄はハイブリダイゼーションが完了した後で１５分間行う。

当業者に知られていて、以下にさらに記載したように、ハイブリダイゼーション反応と二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することによって望ましい度合いのストリンジェンシーを達成するためには、洗浄温度と洗浄塩濃度を必要に応じて調整することが可能であると理解すべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１を参照されたい）。核酸を未知配列の標的核酸へハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸のそれであると仮定される。既知配列の核酸をハイブリダイズさせる場合、ハイブリッドの長さは核酸の配列を並列し、最適な配列相補性をもつ単数または複数の領域を同定することによって決定可能である。５０塩基対未満の長さであることが予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔ_ｍ）より５−２５℃低くなければならず、Ｔ_ｍは、以下の等式により決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドに関して、Ｔ_ｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８塩基対を超える長さのハイブリッドに関しては、Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋４１（モル分率［Ｇ＋Ｃ］）−０．６３（％ホルムアミド）−５００／ｎであり、ここで、Ｎはハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ^＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ^＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、こうしたハイブリダイズする核酸は各々、少なくとも８ヌクレオチド（または、より好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）、またはそれがハイブリダイズする核酸の長さの少なくとも１％（より好ましくは少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０）である長さを有し、それがハイブリダイズする核酸と少なくとも５０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有する。ここで配列同一性は、上記により詳しく記載されるように、重複部分と同一性を最大化する一方、配列ギャップを最小化するように並列された、ハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。

核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算によって決定することが可能である。あるいは、２つの核酸配列のパーセント同一性は、目視検査と数学的計算により決定可能であるか、またはより好ましくは、この比較はコンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することによってなされる。代表的な、好ましいコンピュータ・プログラムは、遺伝学コンピュータ・グループ（ＧＣＧ；ウィスコンシン州マジソン）のウィスコンシン・パッケージ、バージョン１０．０プログラム「ＧＡＰ」である（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７）。この「ＧＡＰ」プログラムの使用により、２つの核酸配列の比較の他に、２つのアミノ酸配列の比較、核酸配列とアミノ酸配列との比較を行うことができる。ここで、「ＧＡＰ」プログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドについての（同一物について１、および非同一物について０の値を含む）一元（ｕｎａｒｙ）比較マトリックスのＧＣＧ実行と、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修「ポリペプチドの配列および構造のアトラス（Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ＳｅｑｕｅｎｃｅおよびＳｔｒｕｃｔｕｒｅ）」国立バイオ医学研究財団、３５３−３５８頁、１９７９により記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５，１９８６の加重アミノ酸比較マトリックス；または他の比較可能な比較マトリックス；（２）アミノ酸の各ギャップについて３０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の１のペナルティ；またはヌクレオチド配列の各ギャップについて５０のペナルティと各ギャップ中の各記号について追加の３のペナルティ；（３）エンドギャップへのノーペナルティ：および（４）長いギャップへは最大ペナルティなし、が含まれる。当業者により使用される他の配列比較プログラムでは、例えば、国立医学ライブラリーのウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌｓ．ｈｔｍｌにより使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラム、バージョン２．２．７、またはＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが使用可能である。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕに記載されている。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを使用し、使用可能である選択パラメーターは以下の通りである：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎのＳＥＧプログラム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）により決定され；ＷｏｏｔｔｏｎおよびＦｅｄｅｒｈｅｎ，１９９６「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｂｉａｓｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ）」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：５４４−７１も参照されたい）、または、短周期性の内部リピートからなるセグメント（ＣｌａｖｅｒｉｅおよびＳｔａｔｅｓ（Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３）のＸＮＵプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、および（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、またはＥ−スコア（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない）；好ましいＥ−スコア閾値の数値は０．５であるか、または好ましさが増える順に、０．２５、０．１、０．０５、０．０１、０．００１、０．０００１、１ｅ−５、１ｅ−１０、１ｅ−１５、１ｅ−２０、１ｅ−２５、１ｅ−３０、１ｅ−４０、１ｅ−５０、１ｅ−７５、または１ｅ−１００である。

同様に、本発明のスフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号１の塩基配列とは異なるが、スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む。スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、欠失、挿入または置換される塩基の数は特に制限されないが、好ましくは１個ないし数千個、より好ましくは１個ないし千個、さらにこのましくは１個ないし５００個、さらにより好ましくは１個ないし２００個、最も好ましくは１個ないし１００個である。

既定のアミノ酸を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよい。こうした保存的置換の例には、１つの脂肪族残基を互いに、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに置換するもの；ＬｙｓおよびＡｒｇ、ＧｌｕおよびＡｓｐ、またはＧｌｎおよびＡｓｎ間といった、１つの極性残基から別のものへの置換；あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）（上述）等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。

小胞体局在化シグナル付スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１ｍ）
本発明の、小胞体局在化シグナル付スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１ｍ）は、上述したスフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）の３’末端に酵母の小胞体局在化シグナルをコードする塩基配列を付加した遺伝子である。「酵母の小胞体局在化シグナル」は、当業者において周知であり、本発明の方法において、任意の小胞体局在化シグナルを利用可能である。

例えば、限定されるわけではないが、以下の文献には、２個以上のリジン残基を含む４又は５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する、典型的な酵母の局在化シグナルが開示されている。

EMBO J. 9:3153-3162, 1990（非特許文献１５）
J Cell Biol. 127:653-665, 1994（非特許文献１６）
Science. 263:1629-1631, 1994（非特許文献１７）
Cell. 79:1199-1207, 1994（非特許文献１８）
Eur J Cell Biol. 64:211-216, 1994（非特許文献１９）
Annu Rev Cell Dev Biol. 12:27-54, 1996（非特許文献２０）

本発明の「酵母の小胞体局在化シグナル」は、好ましくは、「２個以上のリジン残基を含む４又は５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するもの」である。より好ましくは、小胞体局在化シグナルのアミノ酸配列は、ＫＫＸ_１Ｘ_２又はＫＸ_１ＫＸ_２Ｘ_３（Ｋはリジン残基を、そしてＸ_１、Ｘ_２、Ｘ_３は、任意の同一又は別個のアミノ酸残基を表す）を含む。最も好ましい小胞体局在化シグナルのアミノ酸配列の一態様として、本明細書中の実施例に記載のＶＫＫＥＫ（Ｖはバリン残基を、Ｋはリジン残基を、Ｅはグルタミン酸を表す）が含まれる。

本発明の小胞体局在化シグナル付スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１ｍ）のシグナル部分以外、即ちスフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）は特に限定されず、「スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）」の項目で上述した通りである。好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。よって、ＤＥＳ１ｍ遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列＋ＶＫＫＥＫ、即ち配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする。ＤＥＳ１ｍ遺伝子の核酸配列は、典型的には配列番号３の塩基配列からなる。配列番号３以外でも遺伝子縮重より配列番号４のアミノ酸配列をコードする塩基配列も含まれる。

「酵母の小胞体局在化シグナル」は、「２個以上のリジン残基を含む４又は５個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するもの」以外でも、多様なものが知られている。限定されるわけではないが、例えば小胞体局在のメカニズムが知られており本発明の方法に利用可能である。

J Cell Biol. 127:21-28, 1994（非特許文献２１）
アミノ酸配列ＨＤＥＬを有するタンパク質がゴルジ体より小胞体に回収されることを記載している。ＨＤＥＬと同様にＫＤＥＬも小胞体局在化シグナルとして公知である。

J Biol Chem. 273:33273-33278, 1998（非特許文献２２）
膜貫通ドメイン中の決定因子（群）が、小胞体への回収に機能していることを開示している。

J Cell Biol. 152:935-944, 2001（非特許文献２3）
ゴルジ体膜タンパク質の一種が、小胞体膜タンパク質における膜貫通ドメイン中の回収シグナルと相互作用して、小胞体への回収に関与することを記載している。

なお、酵母細胞以外の細胞を本発明の製造方法における形質転換のための宿主細胞として利用することも可能である。宿主細胞としては、哺乳動物細胞（ヒト、マウス、ラットなど）、昆虫細胞などが含まれる。これらの各種細胞において小胞体局在化のためのシグナルが知られており、使用する細胞の種類に応じた小胞体局在かシグナルを利用可能である。

酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）
本発明の方法は構成要件２）として、酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）の発現を欠失させることを含む。

限定されるわけではないが、ＳＵＲ２は、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列又は配列番号６において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。

ＳＵＲ２は、好ましくは配列番号５の塩基配列を有する。これは配列番号６のアミノ酸配列を有する酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする塩基配列であり、例えば、SGD(Saccharomyces Genome Database, http://www.yeastgenome.org/)に開示されている。

ＳＵＲ２は、好ましくは配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。配列番号６と同等の機能を有するアミノ酸配列をコードする限り、配列番号６に限定されるものではない。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。

「スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有する」とは、例えば図２又は図３に示されているように、ジヒドロスフィンゴシンのＣ−４に水酸基を導入し、フィトスフィンゴシンを合成する活性を意味する。あるいは、ジヒドロセラミドのＣ−４に水酸基を導入し、フィトセラミドを合成する活性を意味する。本発明では、酵母細胞の形質転換によって、ＳＵＲ２の発現を部分的又は完全に欠失させることによって、酵母の天然の代謝経路では合成される、フィトスフィンゴシン及び／又はフィトセラミドの合成を部分的又は完全に抑制させる。ＳＵＲ２遺伝子発現の抑制と、ＤＥＳ１遺伝子発現により、スフィンゴシン及び／又はセラミドＮＳの効率的な合成が可能になる。

ＳＵＲ２にコードされるアミノ酸配列は、配列番号６に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。

本発明の好ましい酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）はまた、配列番号５の塩基配列にストリンジェントな条件下、例えば、中程度又は高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有する核酸を含む。

同様に、本発明の酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号５の塩基配列とは異なるが、スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む。

「アミノ酸及び／又は塩基の欠失、付加、置換」、「アミノ酸及び／又は塩基の同一性パーセント」、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件下」など、共通する事項については、ＤＥＳ１について上述した通りである。

酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）
本発明の方法はさらに、酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）の発現を欠失させることを含んでもよい。ＳＣＳ７は、例えば図３又は図７のフィトセラミド、ジヒドロセラミド、セラミドＮＳのスフィンゴイド塩基にアミド結合した脂肪酸のα位の炭素に水酸基を付加し、各々Ｃｅｒ（ＡＰ）、Ｃｅｒ（ＡＳａ）、Ｃｅｒ（ＡＳ）を合成する活性を有する。ＳＣＳ７活性の存在により、所望のジヒドロセラミド、セラミドＮＳが合成されても、さらに水酸化されてしまう。よって、本発明は好ましくは、ＳＣＳ７の発現を欠失させることを含む。

限定されるわけではないが、ＳＣＳ７は、好ましくは、配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。

ＳＣＳ７は、好ましくは配列番号７の塩基配列を有する。これは配列番号８のアミノ酸配列を有する酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードする塩基配列であり、例えば、SGD(Saccharomyces Genome Database, http://www.yeastgenome.org/)に開示されている。

ＳＣＳ７は、好ましくは配列番号８に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ活性を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。配列番号８と同等の機能を有するアミノ酸配列をコードする限り、配列番号８に限定されるものではない。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。

「スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ活性を有する」とは、例えば図７に示されているように、フィトセラミド、ジヒドロセラミド、セラミドＮＳのスフィンゴイド塩基にアミド結合している脂肪酸のα位の炭素に水酸基を付加し、各々Ｃｅｒ（ＡＰ）、Ｃｅｒ（ＡＳａ）、Ｃｅｒ（ＡＳ）を合成する活性を有する、ことを意味する。本発明では、好ましくは、酵母細胞の形質転換によって、ＳＣＳ７の発現を部分的又は完全に欠失させることによって、ジヒドロセラミド、セラミドＮＳの好ましくない水酸化を抑制する。

ＳＣＳ７にコードされるアミノ酸配列は、配列番号８に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。

本発明の好ましい酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）はまた、配列番号７の塩基配列にストリンジェントな条件下、例えば、中程度又は高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ活性を有する核酸を含む。

同様に、本発明の酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号７の塩基配列とは異なるが、スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む。

「アミノ酸及び／又は塩基の欠失、付加、置換」、「アミノ酸及び／又は塩基の同一性パーセント」、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件下」など、共通する事項については、ＤＥＳ１について上述した通りである。

酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）
本発明の方法はさらに、酵母細胞の形質転換によって、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）の発現を欠失させることを含んでもよい。

ＹＤＣ１は、例えば図１−図３に示されているようにジヒドロセラミドを分解してジヒドロスフィンゴシンを合成する活性を有するタンパク質をコードする。ＹＤＣ１活性は、セラミド合成のいわば反対方向の反応を促進する活性であり、セラミドＮＳ合成の材料となるジヒドロセラミドを減少させる。よって、本発明は好ましくは、ＹＤＣ１の発現を欠失させることを含む。

限定されるわけではないが、ＹＤＣ１は、好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列又は配列番号１０において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする。

ＹＤＣ１は、好ましくは配列番号９の塩基配列を有する。これは配列番号１０のアミノ酸配列を有する酵母アルカリジヒドロセラミダーゼタンパク質をコードする塩基配列であり、例えば、SGD(Saccharomyces Genome Database, http://www.yeastgenome.org/)に開示されている。

ＹＤＣ１は、好ましくは配列番号１０に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、１またはそれ以上のアミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。配列番号１０と同等の機能を有するアミノ酸配列をコードする限り、配列番号１０に限定されるものではない。「アミノ酸変異」は１から複数個、好ましくは、１ないし２０個、より好ましくは１ないし１０個、最も好ましくは１ないし５個である。

「アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を有する」とは、例えば図１−図３に示されているようにジヒドロセラミドを分解してジヒドロスフィンゴシンを合成する活性を有する、ことを意味する。本発明では、好ましくは、酵母細胞の形質転換によって、ＹＤＣ１の発現を部分的又は完全に欠失させることによって、好ましくないジヒドロセラミドの分解を抑制する。

ＹＤＣ１にコードされるアミノ酸配列は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約７０％、好ましくは約８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有する。

本発明の好ましい酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）はまた、配列番号９の塩基配列にストリンジェントな条件下、例えば、中程度又は高程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、かつ、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を有する核酸を含む。

同様に、本発明の酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）には、１つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号９の塩基配列とは異なるが、アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸を含む。

「アミノ酸及び／又は塩基の欠失、付加、置換」、「アミノ酸及び／又は塩基の同一性パーセント」、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件下」など、共通する事項については、ＤＥＳ１について上述した通りである。

酵母の形質転換による遺伝子の導入及び発現方法
本発明において、酵母細胞内におけるＤＥＳ１ｍの発現は限定されず、公知の方法を用いて行うことが可能である。好ましくは、ＤＥＳ１ｍを含む発現ベクターで宿主酵母細胞を形質転換し、そして、核酸の発現を可能にする条件下で形質転換酵母細胞を培養する、ことを含む。

本発明の方法に利用可能な酵母は、限定されるわけではないが、好ましくは、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）由来の酵母である。より好ましくは、サッカロミセス・セレビジエ、サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・バイヤヌス、サッカロミセス・クルベリである。サッカロミセス属を含む出芽酵母は、遺伝子レベルでセラミドの合成・代謝の解析が最も進んでいる。そのため、本発明のヒト型セラミドの製造方法を迅速に最適化することが可能である。また酵母細胞は培養が容易で、また、伝統的に食品製造に利用されている。簡便、安全、安価にセラミドを大量に抽出・精製する方法を確立することが可能である。

本発明において、遺伝子の導入・発現のために公知の酵母発現ベクターを使用可能である。本発明の実施例では、公知の酵母用遺伝子発現ベクターｐＲＳ ｓｅｒｉｅｓ（ｐ４ＸＸ）（Ｍｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １５６， １１９， １９９５）及びｐＹＥ２２ｍ（Ａｓｈｉｋａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３０， ５１５， １９８９）を使用した。

酵母に導入する際に用いるベクターとしては、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ型）、染色体組み込み型（ＹＩｐ型）のいずれもが利用可能である。例えば、ＹＥｐ型ベクターとしてはＹＥｐ２４ (J. R. Broach et al., Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83, 1983)、ＹＣｐ型ベクターとしてはＹＣｐ５０ (M. D. Rose et al., gene, 60, 237, 1987)、ＹＩｐ型ベクターとしてはＹＩｐ５(K. Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035, 1979)等多数の酵母用発現ベクターが当業者に公知であり、本発明の方法に利用可能である。

発現ベクターは、各遺伝子の他に、一般的に、宿主における増殖のため、選択可能マーカーおよび複製起点を含むベクター内に含有されることが可能である。ベクターにはさらに、好ましくは酵母由来の適切な転写または翻訳制御配列が、所望により本発明の核酸に連結されて、含まれる。

制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、またはエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が該ＤＮＡ配列に機能的に関連しているとき、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を調節するならば、ＤＮＡ配列に、機能可能であるように連結されている。宿主細胞において複製する能力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクターに取り込まれている。選択マーカーとしては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子やＨＩＳ３、ＴＲＰ１などの栄養要求性遺伝子などが例示される。

酵母ベクターは、しばしば、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、および選択可能マーカー遺伝子を含有するであろう。

べクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクター（例えば、プラスミドＤＮＡなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。プラスミドなどのベクターに遺伝子のＤＮＡ断片を組み込む方法としては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．， ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｄ．Ｗ． （２００１）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ． （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。

ベクターを宿主細胞に導入する方法としては、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（２００１）（上述）に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクトロポレーション法、エレクトロインジェクション法、ＰＥＧなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。

酵母の形質転換による各遺伝子の欠失方法
本発明の方法は、酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）の発現を欠失させること、を含む。

本発明の方法はさらに、好ましい態様において、
酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）の発現を欠失させること；及び
酵母細胞の形質転換によって、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）の発現を欠失させること
のいずれか、あるいはこれらの組み合わせを含む。

本発明において、各遺伝子の発現を欠失させるとは、各遺伝子によってコードされるタンパク質活性が発揮されないことを意味する。酵母細胞のゲノム上の各遺伝子を破壊する、遺伝子の転写を阻害する、遺伝子からタンパク質の翻訳を阻害する、タンパク質が翻訳されても活性の発揮を阻害する、など結果的に遺伝子によってコードされるタンパク質活性が発揮されなければ、本発明の方法における目的を達成するため、本発明の範囲に含まれる。欠失は、部分的な欠失であっても完全な欠失であってもよい。典型的には、母細胞のゲノム上の各遺伝子を破壊し、遺伝子を部分的又は完全に欠失させる。

ＳＵＲ２、ＳＣＳ７、ＹＤＣ１の各遺伝子の発現の欠失は公知の方法によって行うことができる。
例えば、本明細書中の実施例では各遺伝子の上流及び下流の塩基配列、及び選択マーカーを連結させたＤＮＡ断片を用い、酵母の天然のゲノム配列との相同組換えによって、各遺伝子を欠失させた。

遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Yeast 10, 1793 (1994)、Yeast 15,1541(1999)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)など参照）。

遺伝子破壊以外にも、本発明の目的のために、各遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス法（例えば、平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現 （日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993などを参照）、RNAi法（特表2002-516062号公報; 米国特許公開公報第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000などを参照）、リボザイムによる方法（FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989などを参照）、共抑制による方法（例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照）などが挙げられる。

セラミド合成の確認方法
本発明の方法によって、製造されたヒト型セラミド（セラミドＮＳ）は、公知の方法を用いることによって、抽出・精製することができる。本発明の方法は、酵母細胞を使用するため、大量の培養、セラミドの簡便かつ迅速な抽出・精製が可能である。精製されたセラミドは、公知のスフィンゴイド分析のための方法を用いて確認することが可能である。分析方法は、例えば、図４に示すＴＬＣやＨＰＬＣ、マススペクトル（例えば、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ/ＭＳ、ＦＴ−ＭＳ）等を含む。

本発明の酵素の局在制御によるセラミドNSの高効率生産システムを用いれば、ヒトの皮膚で機能性の高いヒト型セラミドをより安価に製造することが可能となる。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

実施例１：ヒト スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）発現ベクターの作製
公開されているデータベース中のヒト スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ（ｓｐｈｉｎｇｏｉｄ Δ４−ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）遺伝子（ＤＥＳ１）の塩基配列（ＧｅｎＢａｎＫ^ＴＭ： ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＦ４６６３７５）（配列番号４０、そのうちのCDSは配列番号１）を参考にプライマーｄｅｓ１Ｆ（配列番号１１）およびｄｅｓ１Ｒ（配列番号１２）を作製した。

配列番号１１：５’−ＣＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＧＣＣＧＣＧＴＣＴＣＧＣＧＧＧＡＡＧＡＣ−３’
配列番号１２：５’−ＣＣＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＡＧＣＡＴＣＡＣＴＧＧＴＣ−３’

上記プライマー対を利用して、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型にＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物（約１．１ｋｂ）のＢａｍＨＩとＳｍａＩサイトを利用して酵母用遺伝子発現ベクターｐＫＯ１１ （Ｋａｍｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３，２８３４１，１９９８；Ｄｒ．Ｋ．Ｔａｎａｋａより提供）にクローニングした。

サンガー法による塩基配列決定を行い、クローンの塩基配列がデータベースと一致することを確認した。ＢａｍＨＩとＸｈｏ１サイトを利用して酵母用遺伝子発現ベクターｐＲＳ ｓｅｒｉｅｓ（ｐ４ＸＸ）（Ｍｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １５６， １１９， １９９５）にサブクローニングした（ｐｈＤＥＳ１）。

実施例２：酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）破壊株の作製
公開されている酵母ゲノムデータベース（SGD(Saccharomyces Genome Database, http://www.yeastgenome.org/)）中の酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ（ｓｐｈｉｎｇａｎｉｎｅ Ｃ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）遺伝子（ＳＵＲ２）の塩基配列（配列番号５）とその上流および下流領域を含む配列（配列番号４１）を参考にプライマーｓｕｒ２Ｆ（配列番号１３）およびｓｕｒ２Ｒ（配列番号１４）を作製した。

配列番号１３：５’−ＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣＣＧＣＡＣＣＡＡＴＴＴＴＣＡＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＧＧ−３’
配列番号１４：５’−ＧＧＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＡＣＧＴＧＧＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧＣＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧ−３’

上記プライマー対を利用して、プラスミドｐＹＤｐ―Ｌ（Ｂｅｒｂｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ，７，４７５，１９９１）を鋳型としてＰＣＲを行い、ＳＵＲ２遺伝子上流２９５ｂｐ、選択マーカーおよびＳＵＲ２遺伝子下流７５ｂｐが連結したＰＣＲ産物を得た。このＰＣＲ産物を用いてＦＫ１１３株（ＭＡＴａ，ｕｒａ３，ｈｉｓ３，ｌｅｕ２，ｌｙｓ２，ｔｒｐ１，ｂａｒ１−１）の形質転換を常法に従って行い、栄養要求性培地で形質転換体を選抜し、ＳＵＲ２遺伝子破壊株を得た。

正常遺伝子と破壊遺伝子で増幅する断片の長さが異なるように設計した確認用のプライマー（配列番号１５および１６）を用いて、ＰＣＲ法によりＳＵＲ２遺伝子破壊の確認を行った。

配列番号１５：５’−ＣＴＣＣＧＧＣＴＴＣＴＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＡＧＴＣＴＴＴＣ−３’
配列番号１６： ５’−ＧＧＡＡＧＴＣＧＧＡＧＡＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＡＣＣＣＡＧ−３’

実施例３：酵母ＳＵＲ２、および酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）二重破壊株の作製
公開されている酵母ゲノムデータベース（SGD）中の酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ（ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）遺伝子（ＳＣＳ７）の塩基配列（配列番号７）とその上流および下流領域を含む配列（配列番号４２）を参考にプライマーｓｃｓ７ｕｐ２８０Ｆ（配列番号１７）およびｓｃｓ７ｕｐ２８０Ｒ＿Ｇ４１８（配列番号１８）、ｓｃｓ７ｄｏｗｎ２８０Ｆ＿Ｇ４１８（配列番号１９）およびｓｃｓ７ｄｏｗｎ２８０Ｒ（配列番号２０）を作製した。

配列番号１７：５’−ＣＧＡＡＴＴＣＡＧＣＣＧＡＡＡＡＣＡＧＴＣＴＴＧＣＴＴ−３’
配列番号１８：５’−ＣＴＣＣＡＴＧＴＣＧＣＴＴＡＣＣＡＣＣＧＣＴＴＴＴＡＧＴＧＣ−３’
配列番号１９：５’−ＣＧＣＴＡＴＡＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＧＴＣＣＡＡＡＡＴＴＧＴＣＡ−３’
配列番号２０：５’−ＣＧＡＡＴＴＣＴＴＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＡＡ−３’

上記プライマー対を利用して、常法により調製した酵母ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＳＣＳ７遺伝子上流域約２８０ｂｐ、下流域約２８０ｂｐにそれぞれ相当するＰＣＲ産物を得た。

次に２段階目のＰＣＲとして、これら２種類のＰＣＲ断片を混合し、既存プライマーをＧ−５０ゲル濾過カラム（Ｑｕｉｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎｓ ｆｏｒ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｒｏｃｈｅ社）で除去した後、ジェネティシン（Ｇ４１８）抵抗性遺伝子をマーカーにもつｐＦＡ６ａ−ｋａｎＭＸ４（ＥＭＢＬ ＡＪ００２６８０）ベクターを鋳型に、上記プライマーｓｃｓ７ｕｐ２８０Ｆとｓｃｓ７ｄｏｗｎ２８０Ｒの組み合わせで約２．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。この最終ＰＣＲ産物を用いて、実施例２記載の酵母ＳＵＲ２破壊株の形質転換を常法に従って行った。Ｇ４１８ ３００ ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ平板培地（１％酵母エキス、２％ポリペプトン、２％グルコース、２％寒天）で形質転換体を選抜し、ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株を取得した。

目的の場所にＧ４１８遺伝子が挿入されＳＣＳ７遺伝子が破壊されているかどうか調べるために、ＳＣＳ遺伝子内でプライマーＳＣＳ７ ＧＤ ＣｈｅｃｋＦ２（配列番号２１）を、Ｇ４１８遺伝子内でプライマーＧ４１８ＣｈｅｃｋＲ（配列番号２２）を作製した。ＰＣＲで１．２ｋｂの断片が増幅したものについて、遺伝子破壊株と確認した。

配列番号２１：５’−ＧＣＧＣＴＧＣＡＴＡＣＡＴＡＧＡＣＡＴＡＴＡＣＡＣ−３’
配列番号２２：５’−ＡＴＡＣＧＣＧＡＴＣＧＣＴＧＴＴＡＡＡＡＧＧＡＣＡ−３’

実施例４：酵母ＳＵＲ２、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）、およびＳＣＳ７三重破壊株の作製
公開されている酵母ゲノムデータベース（SGD）中の酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｅｒａｍｉｄａｓｅ）遺伝子（ＹＤＣ１）の塩基配列（配列番号９）とその上流および下流領域を含む配列（配列番号４３）を参考に、プライマーｙｄｃ１ｕｐ２８０Ｆ（配列番号２３）および ｙｄｃ１ｕｐ２８０Ｒ（配列番号２４）、ｙｄｃ１ｄｏｗｎ２５０Ｆ（配列番号２５）およびｙｄｃ１ｄｏｗｎ２５０Ｒ（配列番号２６）を作製した。

配列番号２３：５’−ＣＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＧＡＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＴＴＡ−３’
配列番号２４：５’−ＴＧＧＡＴＧＧＣＡＣＧＧＡＴＣＣＧＡＡＡＧＧＣＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＴＴＡＴＧＧ−３’
配列番号２５：５’−ＴＧＴＧＣＣＴＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＴＧＣＣＡＴＣＣＡＴＴＴＧＡＡＴＣ−３’
配列番号２６：５’−ＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＴＡＡＣＴＧＣＴ−３’

上記プライマー対を利用して、常法により調製した酵母ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＹＤＣ１遺伝子上流域約２８０ｂｐ、下流域約２５０ｂｐにそれぞれ相当するＰＣＲ産物を得た。プライマーｙｄｃ１ｕｐ２８０Ｒとｙｄｃ１ｄｏｗｎ２５０Ｆはそれぞれ共通に相補的な配列を共有しておりＹＤＣ１遺伝子の上流域と下流域の境界にＢａｍＨＩサイトを含む。

ＹＤＣ１遺伝子上流域約２８０ｂｐ、下流域約２５０ｂｐにそれぞれ相当するＰＣＲ産物を混合し、プライマーｙｄｃ１ｕｐ２８０Ｆとｙｄｃ１ｄｏｗｎ２５０Ｒを用いてＰＣＲを行い、ＢａｍＨＩサイトをはさんでＹＤＣ１遺伝子の上下流域を含む５３０ｂｐのＰＣＲ産物を得た。これをあらかじめｐＵＣ１９をＢａｍＨＩで切断後、Ｔ４ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる平滑末端化を行った後にセルフライゲーションして得たベクターに、プライマーｙｄｃ１ｕｐ２８０Ｆとｙｄｃ１ｄｏｗｎ２５０Ｒに含まれるＥｃｏＲＩサイトを利用してクローニングした（ｐＹＤＣ１−１）。

１）次に導入する予定のハイグロマイシン抵抗性遺伝子内にＥｃｏＲＩサイトが存在するので、ｐＹＤＣ１−１中のＥｃｏＲＩサイトを除くため、プライマーＹＤＣ１ｕｐ２８０Ｆ＿Ｓｓｅ（配列番号２７）とＹＤＣ１ｄｏｗｎ２５０Ｒ＿Ｓｓｅ（配列番号２８）を作製し、ｐＹＤＣ１−１を鋳型にＰＣＲを行った。得られた５３０ｂｐの断片を制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉで消化した後、アガロースゲル電気泳動で精製・回収（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｔｕｒｂｏ， Ｑ−ＢＩＯ Ｇｅｎｅ社）した断片をｐＵＣ１９のＰｓｔＩ部位に挿入した（ｐＹＤＣ１−２）。ハイグロマイシン抵抗性遺伝子を制限酵素ＢｇｌＩＩで切り出せるようにするため、プライマーＧＡ３２−２（配列番号２９）とＧＡ３２Ｒ（配列番号３０）を作製、ｐＧＡ３２ （Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ｙｅａｓｔ． １５ １５４１ （１９９９））を鋳型にＰＣＲを行い１．５ｋｂの断片を得た。

配列番号２７： ５’−ＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＣＡＡＡＧＡＴＧＴＴＡＡＧＴＴＡＧＡＴＴＴＴＣ−３’
配列番号２８： ５’−ＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＴＴＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴ−３’
配列番号２９： ５’−ＴＡＡＧＡＴＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＡＴＡＣ−３’
配列番号３０： ５’−ＴＡＡＧＡＴＣＴＣＧＣＡＣＴＴＡＡＣＴＴＣＧＣＡＴＣＴＧ−３’

この断片を上記ｐＹＤＣ１−２のＢａｍＨＩサイトに導入し、結果としてＹＤＣ１遺伝子の上下流域がハイグロマイシン抵抗性遺伝子によって分断されたコンストラクトが完成した（ｐＹＤＣ１−３）。ｐＹＤＣ１−３を制限酵素Ｓｓｅ８３８７Ｉ消化によってｐＵＣ１９ベクター部分を除いた領域を、上記のようにアガロースゲル電気泳動で精製・回収したものを用いて、実施例３記載の酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７破壊株の形質転換を常法に従って行った。ハイグロマイシン ２００ ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ平板培地で形質転換体を選抜し、ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株を取得した。

２）あるいは、プラスミドｐＹＤｐ−Ｈ（Ｂｅｒｂｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ， ７， ４７５， １９９１）をＢａｍＨＩで切断し、ＨＩＳ３遺伝子を含む約１．２ｋｂの断片を、上記のＹＤＣ１遺伝子の上下流域を含むプラスミドのＢａｍＨＩサイトに挿入した。得られたＹＤＣ１遺伝子の上下流域にＨＩＳ３遺伝子をはさんだ領域を含むプラスミドをＥｃｏＲＩで切断して得られた断片を用い、実施例２記載の酵母ＳＵＲ２破壊株の形質転換を常法に従って行った。ヒスチジンを含まない最少完全平板培地（ＳＣ−Ｈｉｓ）でスクリーニングを行うことにより、ＳＵＲ２／ＹＤＣ１二重破壊株を得た。次に、実施例３記載のジェネティシン（Ｇ４１８）抵抗性遺伝子をもつ約２．３ｋｂのＰＣＲ産物を用いて、上記の酵母ＳＵＲ２／ＹＤＣ１二重破壊株の形質転換を常法に従って行った。Ｇ４１８ ３００ｍｇ／Ｌを含むＹＰＤ平板培地で形質転換体を選抜し、ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株を取得した。

正常遺伝子と破壊遺伝子ではＰＣＲで増幅する断片の長さが異なるように、プライマーＹＤＣ１ＵＰｃｈｅｃｋＦ２（配列番号３１）とｙｄｃ１＿ＧＤ＿ＣｈｅｃｋＲ２（配列番号３２）を作製し、ＰＣＲで遺伝子破壊を確認した。

配列番号３１：５’−ＣＴＣＧＴＣＣＴＣＴＧＡＡＣＣＡＡＡＧＣ−３’
配列番号３２：５’−ＧＧＴＡＡＡＴＡＧＡＡＣＴＴＴＴＡＴＧＴＧＣＣＧＣ−３’

実施例５ 小胞体局在化シグナル付ヒトＤＥＳ１（ｈＤＥＳ１ｍ）発現ベクターの作製
酵母の小胞体局在酵素であるＳＵＲ２タンパクのＣ末端アミノ酸配列ＶＫＫＥＫ（小胞体局在化シグナル）をｈＤＥＳ１のＣ末端側に結合する形になるように、以下方法にてベクターを構築した。

実施例１記載ｈＤＥＳ１発現ベクターを鋳型に１段階目のＰＣＲとして、プライマー４２６ＳｓｅＦ（配列番号３３）とＶＫＫＥＫ＿Ｒ２（配列番号３６）の組み合わせで約１．５ｋｂのＰＣＲ断片を、プライマーＶＫＫＥＫ＿Ｆ２（配列番号３５）と４２６ＳｓｅＲ（配列番号３４）の組み合わせで約０．６ｋｂの断片をそれぞれ増幅した。

配列番号３３：５’− ＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡ−３’
配列番号３４：５’− ＴＴＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ−３’
配列番号３５：５’− ＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＣＡＴＴＡＧＴＧＣＣＡＡＡＧ−３’
配列番号３６：５’− ＴＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＴＴＡＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’

次に２段階目のＰＣＲとして、これら２種類のＰＣＲ断片を混合し、既存プライマーをアガロースゲル電気泳動で精製除去（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ Ｔｕｒｂｏ， Ｑ−ＢＩＯ Ｇｅｎｅ社）したものを鋳型とし、プライマー４２６ＳｓｅＦと４２６ＳｓｅＲの組み合わせで約２ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。この２ｋｂの断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ ＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にサブクローニングした。

サンガー法による塩基配列決定を行い、クローンの塩基配列を確認した（配列番号３７）。このうち、ＤＥＳ１ｍのＯＲＦ部分の塩基配列を配列番号３、配列番号３がコードするアミノ酸配列を配列番号４とする。制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩ消化により約１．３ｋｂの断片を得、Ｕｒａ３をマーカーにもつｐＲＳ４２６（２μ）ＧＰＤベクター（Ｍｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ，１５６，１１９−１２２，１９９５）の同制限酵素部位に挿入した（ｐｈＤＥＳ１ｍ）。

実施例６ ヒトＤＥＳ１ あるいは小胞体局在化シグナル付ヒトＤＥＳ１（ＤＥＳ１ｍ）発現プラスミドをもつセラミド合成系・代謝系形質転換株の作製
上記実施例３、４で得られた各遺伝子の破壊株を用いてＤＥＳ１遺伝子（実施例１）あるいはＤＥＳ１ｍ遺伝子（実施例５）発現株を作製した。

Ｉ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊（実施例３）＋ＤＥＳ１遺伝子発現
ＩＩ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊（実施例３）＋ＤＥＳ１ｍ遺伝子発現
ＩＩＩ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊（実施例３）＋空ベクター
ＩＶ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊（実施例４）＋ＤＥＳ１遺伝子発現
Ｖ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊（実施例４）＋ＤＥＳ１ｍ遺伝子発現
ＶＩ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊（実施例４）＋空ベクター

実施例１のヒトＤＥＳ１発現プラスミド、あるいは実施例５で作製した小胞体局在化シグナル付ヒト型ＤＥＳ１（ＤＥＳ１ｍ）を用いて、実施例３、４で得られた破壊株の形質転換を常法に従って行った。形質転換体の選抜はウラシルを含まない最少完全平板培地（ＳＣ−Ｕｒａ）を用いて行った。

得られた形質転換株におけるヒトＤＥＳ１遺伝子の発現は、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製した総ＲＮＡをプライマーＨｄｅｓ１＿Ｒ（配列番号３８）を用いたＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）による逆転写反応と反応物のＨｄｅｓ１＿Ｆ（配列番号３９）とＨｄｅｓ１＿Ｒ（配列番号３８）を用いたＥｘ−ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ社）によるＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行って確認した。

配列番号３８：５’−ＴＣＣＡＧＣＡＣＣＡＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴ−３’
配列番号３９：５’−ＡＧＴＧＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＧＡＣＣＡＧ−３’

実施例７ トリチウム標識（ ^３ Ｈ）したＤ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ を用いたセラミドの解析
上記実施例６のセラミド合成系・代謝系形質転換株をヒスチジン、ロイシン、リジン、アデニン、およびトリプトファンを添加したウラシルを含まない最少液体培地で２５℃、１５０ｒｐｍで２４時間振盪培養した後、酵母を回収し、最少液体培地に懸濁させた懸濁液０．５ｍｌ（１６ＯＤ_６００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を調製した。トリチウム標識（^３Ｈ）したＤ−エリスロ−ジヒドロスフィンゴシンを１０μｌ（１０μＣｉ）加え、一晩２５℃で培養を行った（Zanolari et al., The EMBO Journal, 19, 2824,2000)。２５０ｍＭのＮａＦと２５０ｍＭのＮａＮ_３を２００μｌ加え、反応を停止させた後、氷冷した滅菌水で３度洗浄し、菌体を６６μｌの滅菌水に懸濁させた。

本懸濁液にグラスビーズを加え、激しく攪拌することにより菌体を破砕した。これにクロロホルム、メタノール、懸濁液の比が１０：１０：３になるようにクロロホルム、メタノールを加え、脂質を抽出した。抽出液の遠心分離を行い、得られた上清を回収した後、窒素ガスを吹き付けて濃縮乾燥させた。試料を１００μｌのクロロホルム−メタノール−水（１０：１０：３）に溶解し、０．６Ｎ ＮａＯＨメタノール溶液を２０μｌ加え、３０℃、９０ｍｉｎ反応させた後、０．６Ｎ 酢酸溶液で中和させた。ブタノール抽出により塩を除去し、得られたブタノール層（上層）を窒素ガスを吹き付けて濃縮乾燥させた。

脂質を２０μｌのクロロホルム−メタノール（１：１）に溶解させ、あらかじめｂｏｒａｔｅ（７０ｍＭ Ｎａ_２Ｂ_４Ｏ_７．１０Ｈ_２０ メタノール溶液）で３０ｍｉｎ間処理し乾燥させた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートにスポットし、クロロホルム−メタノール（９：１）で展開した（Ｔｒｉｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ６６， １６７１， ２００４）。展開後、放射能標識セラミドをバイオイメージアナライザー（ＢＡＳ）で分析した。結果を図５及び図６に示す。

ヒトＤＥＳ１発現プラスミドをもつＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株およびＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株のセラミドＮＳ（ＣｅｒＮＳ）を１００％とした場合、小胞体局在化シグナル付ヒトＤＥＳ１（ＤＥＳ１ｍ）発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株のセラミドＮＳ（ＣｅｒＮＳ）は１７７％、小胞体局在化シグナル付ヒトＤＥＳ１（ＤＥＳ１ｍ）発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊株のセラミドＮＳ（ＣｅｒＮＳ）は２３２％と増加した。

実施例８ ＥＧＦＰ付ヒトＤＥＳ１（ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１）あるいはＥＧＦＰおよび小胞体局在化シグナル付ヒトＤＥＳ１（ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１ｍ）発現ベクターの作製
ｈＤＥＳ１と小胞体局在化シグナルを付けたｈＤＥＳ１ｍが酵母の細胞中でどこに局在しているのか調べるため、本実施例では、それぞれのｈＤＥＳ１のＮ末端側にＥＧＦＰを結合させたコンストラクトを作製した。

ベクターの構築方法を以下に示す。実施例１に記載のｐｈＤＥＳ１より制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩでＤＥＳ１遺伝子を切り出し、ｐＲＳ３１４−ＧＡＬ−ＥＧＦＰ−ＥＢＰ２ベクター（ＧＡｌ１プロモーターとＴＤＨターミネーターを持ったｐＲＳ３１４発現ベクターのＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩサイトにＥＧＦＰ遺伝子がＢａｍＨＩとＸｈｏＩサイトにＥＢＰ２遺伝子が挿入されているベクター；広島大学、Ｄｒ． Ｋｅｉｋｏ Ｍｉｚｕｔａより提供）の同制限酵素部位に挿入した（ｐＲＳ３１４−ＧＡＬ−ＥＧＦＰ−ＤＥＳ１）。制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩでＥＧＦＰ−ＤＥＳ１遺伝子を切り出し、酵母用遺伝子発現ベクターｐＲＳ４２６−ＧＰＤ（Ｍｕｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １５６， １１９， １９９５）にサブクローニングした（ｐＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１）。

ｐＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１よりＥＧＦＰ遺伝子部分約７５０ｂｐを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切り出した断片（ＥＧＦＰ−ＢａｍＨＩ）を、実施例５記載のｈＤＥＳ１ｍ発現ベクター（ｐｈＤＥＳ１ｍ）のＢａｍＨＩサイトに挿入した（ｐＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１ｍ）。

実施例９ ＥＧＦＰ付ヒトＤＥＳ１（ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１）あるいはＥＧＦＰおよび小胞体局在化シグナル付ヒトＤＥＳ１（ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１ｍ）発現ベクターをもつＤＥＳ１タンパク質局在解析用形質転換株の作製
実施例２と３で得られたＳＵＲ２破壊株とＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株および実施例２に記載のＦＫ１１３株にＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１遺伝子（実施例８）あるいはＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１ｍ遺伝子（実施例８）発現ベクターを常法に従って形質転換した。形質転換体の選抜はヒスチジン、ロイシン、リジン、アデニン、およびトリプトファンを添加したウラシルを含まない最少平板培地を用いて行った。

Ｉ． ＦＫ１１３株（実施例２）＋ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１遺伝子発現
ＩＩ． ＳＵＲ２破壊株（実施例２）＋ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１遺伝子発現
ＩＩＩ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株（実施例３）＋ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１遺伝子発現
ＩＶ． ＦＫ１１３株（実施例２）＋ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１ｍ遺伝子発現
Ｖ． ＳＵＲ２破壊株（実施例２）＋ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１ｍ遺伝子発現
ＶＩ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株（実施例３）＋ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１ｍ遺伝子発現

実施例１０ ＥＧＦＰ付ヒトＤＥＳ１（ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１）あるいはＥＧＦＰおよび小胞体局在化シグナル付ヒトＤＥＳ１（ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１ｍ）発現ベクターをもつＤＥＳ１タンパク質の局在解析
実施例９で得られたＩ．ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＦＫ１１３株、ＩＩ．ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２破壊株、ＩＩＩ．ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株、ＩＶ．ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１ｍ遺伝子発現酵母ＦＫ１１３株、Ｖ．ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１ｍ遺伝子発現酵母ＳＵＲ２破壊株、ＶＩ．ＥＧＦＰ−ｈＤＥＳ１ｍ遺伝子発現酵母ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊株をそれぞれヒスチジン、ロイシン、リジン、アデニン、およびトリプトファンを添加したウラシルを含まない最少液体培地で一晩２５℃で振盪培養後した。蛍光顕微鏡（ＯＬＭＰＵＳ ＢＸ５１）によりＥＧＦＰ融合タンパク質の局在をＧＦＰ用フィルターを用いて観察した。

結果を図７に示す。ｈＤＥＳ１ｍは、いずれの株でも小胞体に局在することが確認された。

図１は、酵母及び高等動物細胞におけるスフィンゴ脂質合成代謝経路を示す。 図２は、本発明のヒト型セラミドを酵母細胞内で製造する方法の好ましい態様の概要を示す。 図３は、酵母及び高等動物のスフィンゴイド及びセラミドの分子種とその構造式を示す。 図４は、酵母菌体の培養からＴＬＣ及びＨＰＬＣによる分析までの工程を模式的に示したものである。 図５は、トリチウム標識（^３Ｈ）したＤ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ を用いた酵母のセラミドのＴＬＣによる分析結果とバイオイメージアナライザー（ＢＡＳ）を用いた放射能標識セラミドの定量結果を示す。標識時間は１６時間、温度は２５℃であった。左からサンプル１−３は以下の通りである。 １． 実施例６ＩＩＩ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊（実施例３）＋空ベクター ２． 実施例６Ｉ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊（実施例３）＋ＤＥＳ１遺伝子発現 ３． 実施例６ＩＩ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７二重破壊（実施例３）＋ＤＥＳ１ｍ遺伝子発現 図６は、トリチウム標識（^３Ｈ）したＤ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ を用いた酵母のセラミドのＴＬＣによる分析結果とバイオイメージアナライザー（ＢＡＳ）を用いた放射能標識セラミドの定量結果を示す。標識時間は１６時間、温度は２５℃であった。左からサンプル１−３は以下の通りである。 １． 実施例６ＶＩ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊（実施例４）＋空ベクター ２． 実施例６ＩＶ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊（実施例４）＋ＤＥＳ１遺伝子発現 ３． 実施例６Ｖ． ＳＵＲ２／ＳＣＳ７／ＹＤＣ１三重破壊（実施例４）＋ＤＥＳ１ｍ遺伝子発現 図７は、実施例９で作成した融合タンパク質の局在を、蛍光顕微鏡（ＯＬＭＰＵＳ ＢＸ５１）によりＧＦＰ用フィルターを用いて観察した結果を示す。

Claims (11)

1. ヒト型セラミドを酵母細胞内で製造する方法であって、
   １）酵母細胞の形質転換によって、スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）の３’末端に酵母の小胞体局在化シグナルをコードする塩基配列を付加した小胞体局在化シグナル付スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１ｍ）を導入すること；及び
   ２）酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）の発現を欠失させること
   を含む、前記製造方法。
2. 小胞体局在化シグナルのアミノ酸配列が、２個以上のリジン残基を含む４又は５個のアミノ酸残基からなる、請求項１に記載の製造方法。
3. 小胞体局在化シグナルのアミノ酸配列が、ＶＫＫＥＫ（Ｖはバリン残基を、Ｋはリジン残基を、Ｅはグルタミン酸を表す）である、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１）が、配列番号２のアミノ酸配列又は配列番号２において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
5. 小胞体局在化シグナル付スフィンゴリピッド Δ４−デサチュラーゼ遺伝子（ＤＥＳ１ｍ）が配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
6. 酵母スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＵＲ２）が、配列番号６のアミノ酸配列又は配列番号６において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンガニン Ｃ４−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
7. さらに、酵母細胞の形質転換によって、酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）の発現を欠失させることを含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
8. 酵母スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ遺伝子（ＳＣＳ７）が、配列番号８のアミノ酸配列又は配列番号８において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、スフィンゴ脂質 α−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、請求項７に記載の方法。
9. さらに、酵母細胞の形質転換によって、酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）の発現を欠失させることを含む、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
10. 酵母アルカリジヒドロセラミダーゼ遺伝子（ＹＤＣ１）が、配列番号１０のアミノ酸配列又は配列番号１０において１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有しており、かつ、アルカリジヒドロセラミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする、請求項９に記載の方法。
11. 酵母が、サッカロミセス属の酵母から選択される、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。