JP2008268200A - 細胞増殖性障害の処置のための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、構成的なras−MAPシグナル伝達を測定することによりレオウィルス感染に対する細胞の感受性を同定する方法に関する。本発明はまた、細胞増殖性障害、詳細には、哺乳動物における細胞増殖性障害(ここで、増殖細胞は構成的なMAPKリン酸化を示す)の処置のためにレオウィルスを使用する方法に関する。特に、本方法は、乳癌(ras遺伝子の変異が重要な役割を果たすと考えられていない、腫瘍のサブセットである)を含む増殖性障害を処置するための、哺乳動物のレオウィルス処置を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は、構成的なras−MAPシグナル伝達を測定することにより、レオウィルス感染に対する細胞の感受性を同定する方法に関する。本発明はまた、細胞増殖性障害、詳細には、哺乳動物における細胞増殖性障害(ここで、増殖細胞は構成的なMAPKリン酸化を示す)の処置のためにレオウィルスを使用する方法に関する。特に、本方法は、乳癌(ras遺伝子の変異が重要な役割を果たすと考えられていない、腫瘍のサブセット)を含む増殖性障害を処置するための哺乳動物のレオウィルス処置を提供する。
(参考文献)
以下の刊行物、特許出願、および特許は、本出願において援用される。
米国特許第5,023,252号。
WO99/08692、1999年2月25日公開。
正常な細胞増殖は、増殖促進性癌原遺伝子と増殖抑制腫瘍サプレッサー遺伝子との間のバランスにより調節されている。腫瘍形成は、ゲノムへの遺伝的変化により引き起こされ得る。細胞性エレメントの変異を生じる、癌原遺伝子活性の増強作用または腫瘍抑制の不活性化のような、細胞シグナルの解釈を支配する、ゲノムに対する遺伝的変化により、腫瘍形成は生じ得る。これらのシグナルの解釈は、細胞の増殖および分化に最終的に影響し、そしてこれらのシグナルの解釈の誤りは新生物の増殖(新形成)を生じ得ると考えられている。
照射線治療に対し耐性を示しており、そしてそのような耐性は細胞の癌原遺伝子状態または抗癌原遺伝子状態に依存し得る(Lee.J.M.ら(1993)PNAS90:5742−5746;Lowe.S.W.ら(1994)Science,266:807−810;Raybaud−Diogene.H.ら(1997)J.Clin.Oncology,15(3):1030−1038)。
(項目1) 細胞における構成的ras−MAPシグナル伝達を測定することによりレオウィルス感染に対するその細胞の感受性を決定する方法であって、ここでその構成的シグナル伝達の存在は、レオウィルスによる感染に対する感受性を示す、方法。
(項目2) 上記ras−MAPシグナル伝達が、MAPキナーゼのリン酸化の状態を決定することにより測定される、項目1に記載の方法。
(項目3) 上記MAPキナーゼのリン酸化の状態が、リン酸化されたMAPキナーゼに特異的な抗体を用いて決定される、項目2に記載の方法。
(項目4) 上記細胞が、増殖性障害を有すると考えられる哺乳動物から収集された生物学的サンプルに含まれる、項目1に記載の方法。
(項目5) 上記増殖性障害が神経線維腫症である、項目4に記載の方法。
(項目6) 上記増殖性障害が固形新生物である、項目4に記載の方法。
(項目7) 上記増殖性障害が、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、腎癌、副腎癌、肝癌、膵臓癌、乳癌、および、中枢神経系の癌ならびに末梢神経系の癌からなる群から選択される、項目4に記載の方法。
(項目8) 上記増殖性障害が乳癌である、項目4に記載の方法。
(項目9) 上記哺乳動物が、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、マウス、非ヒト霊長類、およびヒトからなる群から選択される、項目4に記載の方法。
(項目10) 上記哺乳動物がヒトである、項目4に記載の方法。
(項目11) 哺乳動物における増殖性障害を処置する方法であって、その障害は、構成的MAPKリン酸化を示す増殖細胞により特徴づけられ、その増殖細胞の十分な溶解を生ずる条件下で、1以上のレオウィルスの有効量をその哺乳動物中のその増殖細胞に投与する工程を包含する方法。
(項目12) 以下:免疫抑制性薬剤の有効量を、上記哺乳動物中の上記増殖細胞へ投与する工程;その哺乳動物からB細胞またはT細胞を取り出す工程;その哺乳動物から抗レオウィルス抗体を取り出す工程;その哺乳動物から抗体を取り出す工程;その哺乳動物へ抗−抗レオウィルス抗体を投与する工程;およびその哺乳動物の免疫系を抑制する工程、
からなる群から選択される工程をさらに包含する、項目11に記載の方法。
(項目13) 上記レオウィルスが、哺乳動物のレオウィルスおよび鳥類のレオウィルスからなる群から選択される、項目11に記載の方法。
(項目14) 上記レオウィルスが哺乳動物のレオウィルスである、項目13に記載の方法。
(項目15) 上記レオウィルスがヒトレオウィルスである、項目14に記載の方法。
(項目16) 上記レオウィルスが、血清型1レオウィルス、血清型2レオウィルス、および血清型3レオウィルスからなる群から選択される、項目15に記載の方法。
(項目17) 上記レオウィルスが血清型3レオウィルスである、項目16に記載の方法。
(項目18) 上記レオウィルスが鳥類のレオウィルスである、項目13に記載の方法。
(項目19) 1を超える型のレオウィルスが投与される、項目11に記載の方法。
(項目20) 1を超える株のレオウィルスが投与される、項目11に記載の方法。
(項目21) 上記レオウィルスが野外での単離体である、項目11に記載の方法。
(項目22) 上記増殖性障害が新生物である、項目11に記載の方法。
(項目23) 上記増殖性障害が神経線維腫症である、項目11に記載の方法。
(項目24) 上記新生物が固形新生物である、項目22に記載の方法。
(項目25) 上記新生物が、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、腎癌、副腎癌、肝癌、膵臓癌、乳癌、および中枢神経系の癌ならびに末梢神経系の癌からなる群から選択される、項目22に記載の方法。
(項目26) 上記新生物が中枢神経系の癌である、項目22に記載の方法。
(項目27) 上記新生物が乳癌である、項目22に記載の方法。
(項目28) 上記新生物が造血系の新生物である、項目22に記載の方法。
(項目29) 上記レオウィルスが、注射により上記固形新生物の内部または近くに投与される、項目24に記載の方法。
(項目30) 上記レオウィルスが哺乳動物へと静脈内投与される、項目11に記載の方法。
(項目31) 上記レオウィルスが哺乳動物へと腹腔内投与される、項目11に記載の方法。
(項目32) 上記哺乳動物が免疫応答性である、項目11に記載の方法。
(項目33) 上記レオウィルスが免疫保護される、項目11に記載の方法。
(項目34) 上記レオウィルスがミセル中にカプセル化される、項目11に記載の方法。
(項目35) 上記哺乳動物がヒトである、項目11に記載の方法。
(項目36) 約1〜10 15 個のプラーク形成単位のレオウィルス/kg体重が投与される、項目11に記載の方法。
(項目37) 上記レオウィルスが単一用量で投与される、項目11に記載の方法。
(項目38) 上記レオウィルスが1を超える用量で投与される、項目11に記載の方法。
(項目39) 上記新生物が転移性である、項目22に記載の方法。
(項目40) さらに、有効量の化学療法薬剤の投与を包含する、項目11に記載の方法。
(項目41) 上記レオウィルスが投与前にプロテアーゼを用いて処理される、項目11に記載の方法。
(項目42) 上記新生物が膵臓癌である、項目22に記載の方法。
(項目43) さらに、実質的に全ての上記新生物の摘出術、および、残存する新生物細胞の実質的な腫瘍崩壊を生じるのに十分な量で、外科手術部位へのレオウィルスの投与、を包含する、項目22に記載の方法。
(項目44) ヒトにおける新生物を処置する方法であって、その新生物は、構成的MAPKリン酸化を示す増殖細胞により特徴づけられ、その新生物細胞の実質的な腫瘍崩壊を生じるのに十分な量で、レオウィルスをその新生物に投与する工程を包含する、方法。
(項目45) 上記レオウィルスが、注射により固形新生物の内部または近くに投与される、項目44に記載の方法。
(項目46) さらに、以下:免疫抑制性薬剤の有効量を、哺乳動物中の上記増殖細胞へ投与する工程;その哺乳動物からB細胞またはT細胞を取り出す工程;その哺乳動物から抗レオウィルス抗体を取り出す工程;その哺乳動物から抗体を取り出す工程;その哺乳動物へ抗−抗レオウィルス抗体を投与する工程;およびその哺乳動物の免疫系を抑制する工程、
からなる群から選択される工程を包含する、項目44に記載の方法。
(項目47) 哺乳動物中の新生物の転移を阻害する方法であって、その新生物は構成的MAPKリン酸化を示す増殖細胞により特徴づけられ、その新生物細胞の実質的な腫瘍崩壊を生じるのに十分な量で、レオウィルスを哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
(項目48) さらに、以下:免疫抑制性薬剤の有効量を上記哺乳動物中の上記増殖細胞へ投与する工程;その哺乳動物からB細胞またはT細胞を取り出す工程;その哺乳動物から抗レオウィルス抗体を取り出す工程;その哺乳動物から抗体を取り出す工程;その哺乳動物へ抗−抗レオウィルス抗体を投与する工程;およびその哺乳動物の免疫系を抑制する工程、
からなる群から選択される工程を包含する、項目47に記載の方法。
(項目49) 哺乳動物において疑わしい新生物を処置する方法であって、その新生物は、構成的MAPKリン酸化を示す増殖細胞により特徴づけられ、実質的に全てのその新生物の摘出術、およびその手術部位またはその近くへの、レオウィルスの有効量の投与を包含し、その結果残存する新生物細胞の腫瘍崩壊を生じる、方法。
(項目50) さらに、以下:免疫抑制性薬剤の有効量を上記哺乳動物中の増殖細胞へ投与する工程;その哺乳動物からB細胞またはT細胞を取り出す工程;その哺乳動物から抗レオウィルス抗体を取り出す工程;その哺乳動物から抗体を取り出す工程;その哺乳動物へ抗−抗レオウィルス抗体を投与する工程;およびその哺乳動物の免疫系を抑制する工程、
からなる群から選択される工程を包含する、項目49に記載の方法。
本発明は、構成的なras−MAPシグナル伝達を測定することにより、レオウィルス感染に対する細胞の感受性を同定する方法に関する。本発明はまた、細胞増殖性障害、特に哺乳動物における細胞増殖性障害(ここで、増殖細胞が構成的なMAPKリン酸化を示す)の処置のためにレオウィルスを用いる方法を提供する。特に、この方法は、乳癌(ras遺伝子の変異が重要な役割を果たしていないと考えられる腫瘍のサブセット)を含む増殖性障害を処置するための、哺乳動物のレオウィルス処置のために提供される。
既に本発明者らは、SCIDマウスモデルにおけるヒト神経膠芽細胞腫異種移植に対する有効な腫瘍崩壊剤として、ヒトレオウィルスが使用され得たことを示している(WO99/08692)。本明細書では、本発明者らは、細胞の構成的なras−MAPシグナル伝達の存在が、レオウィルスによる感染に対する感受性を示すので、そのようなシグナル伝達を測定することにより、レオウィルス感染に対する細胞性感受性が決定され得ることを見出した。本発明者らはまた、レオウィルスが、乳癌に対して腫瘍崩壊剤として有用であるという証拠を提示する。ras変異は、乳癌の病因においてまれであるが、上流シグナルエレメント(例えば、レセプターチロシンキナーゼおよび非レセプターチロシンキナーゼ(例えば、c−Src))を介する異常なRas/MAPKシグナル伝達は、共通している。
portion of reovirus protein sigma1:evidence for a conformation−dependent receptor binding domain」Virology 186(1):219−27(1992);Duncanら、「Conformational and functional analysis of the C−terminal globular head of the reovirus cell attachment protein」Virology 182(2):810−9(1991);Mahら、「The N−terminal quarter of reovirus cell attachment protein sigma 1 possesses intrinsic virion−anchoring function」Virology 179(1):95−103(1990))。
the gastrointestinal tract」Toxicological Sciences 42(2):99−108(1998))、または、もう一つの方法として、抗−抗レオウィルス抗体のような免疫阻害因子(immunoinhibitor)の投与により、抑制され得ることが企図される。レオウィルスに対する哺乳動物の体液性免疫はまた、抗レオウィルス抗体を取り出すため、哺乳動物の血液のプラスマフェレーシス(plasmaphoresis)により一時的に減少または抑制され得る。さらに、レオウィルスに対する哺乳動物の体液性免疫はまた、哺乳動物への非特異的免疫グロブリンの静脈内投与により、一時的に減少または抑制され得る。
(有用性)
本発明の診断方法は、構成的ras−MAPシグナル伝達を測定することによりレオウィルス感染に対する細胞の感受性を識別するために使用され得る。これは、どの症例において、細胞増殖性障害のレオウィルス処置が効果的である可能性があるかを決定するために有用である。
(実施例)
以下の実施例において、全ての温度は摂氏温度であり(別に指示されない場合)、全てのパーセントは重量パーセントである(これもまた別に指示されない場合)。
μM=マイクロモル濃度
mM=ミリモル濃度
M=モル濃度
ml=ミリリットル
μl=マイクロリットル
mg=ミリグラム
μg=マイクログラム
PAGE=ポリアクリルアミドゲル電気泳動
rpm=回転/分
FBS=胎児ウシ血清
DTT=ジチオスレイトール
SDS=ドデシル硫酸ナトリウム
PBS=リン酸緩衝化生理食塩水
DMEM=ダルベッコ改変イーグル培地
α−MEM=α−改変イーグル培地
β−ME=β−メルカプトエタノール
MOI=感染効率
PFU=プラーク形成単位
MAPK=MAPキナーゼ
phospho−MAPK=リン酸化MAPキナーゼ
HRP=西洋わさびペルオキシダーゼ
PKR=二本鎖RNA活性化プロテインキナーゼ
RT−PCR=逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
GAPDH=グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ
EGFR=上皮増殖因子レセプター
MEKキナーゼ=マイトジェン活性化細胞外シグナル調節キナーゼ
DMSO=ジメチルスルホキシド
SCID=重症複合免疫不全
(一般法)
(細胞およびウィルス)
親NIH−3T3細胞は、v−Srcにより形質転換されたNIH−3T3細胞とともに、Dr.Jove(University of Florida)から惜しみなく贈与された。乳癌細胞株MDA−MB−468、MCF7、MDA−MB−435、T−47D、SK−BR−3、およびコントロールHBL−100細胞は、Dr.Karl Riabowol(University of Calgary)から惜しみなく贈与された。全ての細胞株を、10%の胎児ウシ血清(FBS)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中で増殖させた。
コンフルエントな単一層細胞を24ウェルプレート中で増殖させ、これら細胞に80PFU/細胞の推定感染効率でレオウィルスを感染させた。37℃で1時間インキュベートした後、温めたDMEM−10%FBSで単一層を洗浄し、次いで同培地中でインキュベートした。感染後様々な時間に、NP−40およびデオキシコール酸ナトリウムの混合物を最終濃度1%NP−40および0.5%デオキシコール酸ナトリウムとなるように、感染した単一層細胞上の培地に直接加えた。次いで溶解物を回収し、L−929細胞でのプラーク滴定法によりウィルスの収量を決定した。
準コンフルエント(80%コンフルエント)な単一層細胞にレオウィルス(MOI約10PFU/細胞)を感染させた。感染後46時間で、培地を、無メチオニンDMEM(10%のFBSおよび0.1mCi/ml[35S]−メチオニンを含む)に取り換えた。更に37℃で2時間のインキュベーション後、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し、1%TritonX−100および0.5%デオキシコール酸ナトリウムを含む同緩衝液に溶解した。次いで溶解物を煮沸し、使用まで−70℃で保存した。
35S−標識したレオウィルス感染細胞溶解物の、抗レオウィルス血清型3血清による免疫沈降を、以前に記載(Lee,P.W.K.ら(1981)Virology,108:134−146)のように実行した。
細胞溶解物におけるMAPキナーゼの検出のために、「PhosphoPlus」p44/42MAPキナーゼ(Thr202/Tyr204)抗体キット(New England Biolabs)を、製造業者の説明書に従って使用した。簡潔には、準コンフルエントな単一層培養物を、推奨されたSDS含有サンプル緩衝液で溶解し、SDS−PAGEにかけ、続けてニトロセルロース紙上への電気ブロッティングを行った。次いで、製造業者説明書に記載されているように、メンブレンを一次抗体(抗全MAPKまたは抗phospho−MAPK)、続いて西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合型の二次抗体を用いて探索した。
5〜8週齢雄SCIDマウスをCharles River Canadaから購入し、University of Calgary Animal Care Committeeにより認可されたプロトコールに従って処置した。
活発に増殖しているMDA−MB−468ヒト乳癌細胞を回収し、洗浄し、滅菌PBS中に2×107細胞/mlの濃度に再懸濁した。2.0×106細胞(100il中)を後部側腹部上の部位に皮下注射した。移植した腫瘍を、0.5×0.5cmの触診可能な腫瘍を得るまで、2〜3週間増殖させた。
一旦樹立した腫瘍が処置可能な大きさを得ると、生きた、またはUV不活性化されたかのいずれかのレオウィルス(血清型3、Dearing株)1.0×107PFUを20ilの滅菌PBSに入れて単一の腫瘍内注射した。腫瘍サイズを毎週2回、2〜4週間測定した。動物が、過度の全身腫瘍組織量または観察可能なレベルの苦痛により重篤な病的状態を示した場合、その動物を屠殺した。
カバーガラス上に乗せた、ホルマリン固定しパラフィン包埋した腫瘍切片を用いて、免疫蛍光検査解析を行った。キシレンによりパラフィンを除去した後、切片を脱水し、室温で2時間、一次抗体(PBS中で1/100に希釈した、ウサギ多クローン性抗レオウィルス型3血清)にさらした。PBSでの3回洗浄後、この切片を、二次抗体[10%ヤギ血清および0.005%のエヴァンズブルー対比染色を含むPBS中で1/100に希釈した、ヤギの抗ウサギIgG(全分子)−フルオレセインイソチオシアネート結合体(FITC)または、実験に応じて、同濃度のCy3]に、室温で1時間さらした。また、さらなる対比染色として、核染色DAPIも使用した。最後に、固定し処理した切片をPBSでさらに3回洗浄し、次いで二重蒸留水で1回洗浄した。次いでスライドを乾燥し、0.1%フェニレンジアミンを含む90%グリセロール中でスライドに載せた。そして、カールツァイスカメラ(Carl Zeiss camera)が備え付けられたZeiss Axiophot顕微鏡(Zeiss Axiophot
microscope)で注視した(全写真の倍率は200×だった)。
生検乳癌サンプルを95%エタノール中への浸漬により滅菌し、続いて、滅菌したPBSで数回洗浄した。次いでサンプルを小切片にスライスし、10%FCSを有するDMEMを含む24ウェルプレート中に置いた。レオウィルス(1×108PFUs)を加えた。感染後種々の時間に、滅菌したPBS中でサンプルを洗浄し、次いでホルマリン中に固定した。次いで、サンプルを、全レオウィルスタンパク質に対して指向された抗体を用いて免疫組織化学解析に使用するために、パラフィン中に包埋し、切断した。
本発明者らは以前、非感染性のNR6細胞およびNIH−3T3細胞のレセプターチロシンキナーゼによるトランスフェクションが、レオウィルス複製を可能にするために十分である(Strong,1993)ことを示したが、非レセプターチロシンキナーゼのトランスフェクションがレオウィルスへの感受性を生じ得るかどうかは知られていなかった。Srcファミリーキナーゼの活性化(多数の乳癌の制御されていない増殖に頻繁に貢献する)が、レオウィルス複製を可能にするために十分なRas活性を生じるか否かを決定するために、非感染性のNIH−3T3細胞をv−srcで形質転換し、レオウィルスに対する感受性を評価した。v−srcにより形質転換されたNIH−3T3、またはそれらの親細胞のコンフルエントな単一層を、レオウィルス約50のプラーク形成単位(PFU)の感染効率(MOI)で、レオウィルスにさらした。細胞および培地を、感染後様々な時間に回収し、得られたサンプルをプラーク滴定解析に使用し、レオウィルス複製を測定した。本発明者らの結果は、感染後48時間までのv−src形質転換細胞における劇的な細胞変性効果(データ示さず)およびウィルスの排出量の増強(プラーク滴定アッセイにより測定された)を示した。これらの結果(図1)は、非レセプターチロシンキナーゼですら強力にレオウィルス感染を仲介し得、そして乳癌の別のサブセットを標的とし得ることを示す。
乳房由来腫瘍に対して、レオウィルスを使用する可能性を評価するため、以下:MDA−MB−468、MCF7、MDA−MB−435、T47D、およびSK−BR−3を含む乳癌細胞のパネルを選択し、インビトロでのレオウィルス感染に対する感受性を決定した。コントロールとして、正常乳房組織に由来するHBL−100細胞を使用した。これら6つの細胞株を80%コンフルエンシーまで増殖させ、次いでレオウィルスでMOI10でチャレンジした。感染48時間後に、2時間の間、細胞を[35S]メチオニンで標識した。次いで細胞をリン酸緩衝化生理食塩水により洗浄し、溶解した。次いで、全レオウィルスタンパク質に対して指向された抗体を用いて、調製した溶解物を免疫沈降に使用した。免疫沈降したタンパク質をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)により解析した。結果(図2A)は、乳癌に由来した細胞株内で有効なレオウィルス複製を明確に示すが、しかし、レオウィルス複製はHBL−100細胞株に限定された。このことは、これらの乳癌細胞が、Rasの活性化(直接の変異生成によるか、または上流のシグナル伝達エレメントを介してのいずれかで)の結果として感染可能であることを示唆する。このことは、この特異的活性化はこの癌タイプには稀であるが、Rasを標的とする治療により、高い割合の乳癌がおそらく処置可能であることを示唆する点で、重要である。
FCS)させた。次いで細胞をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で洗浄し、タンパク質サンプル緩衝液中に回収した。細胞溶解物をSDS−PAGEにかけ、続いてニトロセルロース紙上にブロットし、製造業者により推奨されるように抗phospho−MAPK抗体を用いて探索した。その結果(図2B)は、非感染性の細胞株(HBL−100)のみが血清の存在下および非存在下においてphospho−MAPKを保持していることを明確に示し、このことは、この経路におけるRasシグナル伝達が異常でないことを示している。残存する感染した細胞株は、それらがこの経路の構成的活性化を有する場合に、期待されるように、分裂促進的シグナルの存在に無関係にphospho−MAPKを有する。タンパク質濃度は、全MAPKに対して指向される抗体を使用して標準化した(図2C)。
ヒト乳癌細胞株(MDA−MB−468)を、腫瘍異種移植片としてSCIDマウスの後側腹部上の部位に皮下導入した。触診可能な腫瘍樹立の後、MDA−MB−468腫瘍に、PBS中に入れたレオウィルス血清型3(Dearing株)1.0×107個のプラーク形成単位(PFU)の単一腫瘍内注射を投与した。コントロール動物には、UV不活性化レオウィルスの腫瘍内注射を投与した。腫瘍増殖を4週間追跡した。示される(図3)ように、レオウィルス処置は腫瘍サイズの劇的な後退を生ずる。従来どおり、残存する塊のヘマトキシリン/エオシン(HE)染色は、コントロール腫瘍と比較して、単一レオウィルス注射が腫瘍細胞の完全な破壊を生ずることを示した(データ示さず)。腫瘍細胞の観察された溶解がウィルス複製によるのかどうかを決定するため、および、腫瘍塊を超えてレオウィルスタンパク質が拡散したかどうかを決定するために、免疫蛍光顕微鏡検査を実施した。全レオウィルスタンパク質に対して指向された抗体および残存する腫瘍塊のパラフィン包埋した薄い切片を用いて、レオウィルス複製がMDA−MB−468腫瘍細胞に限定され、周囲の骨格筋に達していないことを確定した。
レオウィルスの腫瘍崩壊効果が継代された細胞株の先天性の性質に起因しないことを確実にするため、ヒト乳癌の初期サンプルを得、レオウィルス感染能について評価した。生検乳癌サンプルを95%エタノールでの液浸により滅菌し、続いて滅菌したPBSで数回洗浄した。次いでそのサンプルを小切片にスライスし、10%FCSを有するDMEMを含む24ウェルプレート中に置いた。レオウィルス(1×108PFU)を加えた。感染後種々の時間に、サンプルを滅菌のPBSで洗浄し、それからホルマリン中に固定した。次いで、サンプルを、全レオウィルスタンパク質に対して指向された抗体を用いて免疫組織化学解析に使用するために、パラフィンで包埋し、切断した。その結果は(示さず)、チャレンジされたそれらの腫瘍におけるレオウィルス染色を明確に示し、これは、これらの初期サンプルにおけるウィルスの複製を証明する。
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