JP2008263948A - 新規クロストリジウム・スピーシーズｋｄ１３、およびこれを用いた浄化方法 - Google Patents

Abstract

【課題】従来の微生物を用いた有機塩素化合物に汚染された地下水または土壌の浄化方法では、有機塩素化合物の脱塩素に伴い、副生成物が生成し蓄積するため二次汚染が発生し、迅速に浄化を完了させることが困難であるという課題があった。
【解決手段】テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレン、テトラクロロメタン、トリクロロメタン、ジクロロメタンの浄化において、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）またはそれを含む浄化製剤を用いると、副生成物の生成がなく、速やかに浄化を遂行できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、例えば有機塩素化合物に汚染された地下水、土壌またはガスの浄化に使用される新規な微生物株およびこれを用いた有機塩素化合物に汚染された地下水、土壌、ガス、廃液、廃ガスなどの浄化方法に関する。

従来、この種の微生物およびそれを用いた有機塩素化合物に汚染された地下水または土壌の浄化方法は、汚染された地下水や土壌中に投与された微生物により有機塩素化合物を脱塩素して無害化する浄化方法が知られている（例えば、特許文献１参照）。

以下、その浄化方法について説明する。

特許文献１に示された方法は、有機塩素化合物の一つであるテトラクロロエチレンに汚染された地下水または土壌に複数の微生物を添加する浄化方法である。まずテトラクロロエチレンを嫌気的に脱塩素しトリクロロエチレンに変換する微生物群を添加する。添加された微生物群によりテトラクロロエチレンから生成されたトリクロロエチレンはトリクロロエチレンを好気的に分解することのできる別の微生物を土壌または地下水中に添加して分解する。つまり、嫌気的な状態で投与した微生物群がテトラクロロエチレンをトリクロロエチレンに変化させ、さらに好気的な状態で投与した微生物がトリクロロエチレンを分解するという浄化方法である。

本来の浄化対象物であるテトラクロロエチレンから生成したトリクロロエチレンはそれ自体も生物に対する有害性があり環境中において浄化すべき対象である。特許文献１の方法においては、テトラクロロエチレンを浄化する過程で副生成物として有害性のあるトリクロロエチレンが生成してしまうため、テトラクロロエチレンから生成したトリクロロエチレンを後から追加した好気性微生物により分解する方法を提案している。トリクロロエチレンを分解するために、土壌または地下水中で好気性微生物を利用するので、本来は嫌気状態である土壌または地下水を、好気性微生物が生育できる環境に変える目的で過酸化水素水を地下水または土壌中に添加する方法が示されている。

また、他の有機塩素化合物としてジクロロメタンは有機溶剤の一種であり、金属加工業においてはプレス加工や切削加工の段階で金属製部品の表面に付着した油脂を、後処理工程で除去するための洗浄剤に使用されることが多い。また塗装の剥離剤およびアクリル樹脂の接着剤としても活用されている。一方、ジクロロメタンは動物実験ではマウスに対する発がん性が示唆されており、環境中の濃度レベルを管理すべき化学物質の一つとされている。環境基本法により定められた地下水の水質汚濁に係る環境基準において、ジクロロメタンの地下水環境基準は１リットルあたり０．０２ｍｇとされている。

ジクロロメタンは洗浄剤や剥離剤として優れた特性を示すことから、広く利用されているが、中には不適切な取り扱い方法が原因で地下水や土壌中に漏洩した事例も報告されている。ジクロロメタンは水に溶けやすいので、漏洩したジクロロメタンは地下水や土壌中で広範囲に拡散して汚染を拡大する可能性がある。

従来、ジクロロメタン等を含有する地下水または土壌の浄化方法は、汚染された地下水や土壌中に鉄粉を投与し、ジクロロメタン等の有機塩素化合物を脱塩素化して無害化する浄化方法などが知られている（例えば、特許文献２参照）。

以下、その浄化方法について説明する。

特許文献２に示された方法は、ジクロロメタン等を含有する被浄化物質として、ジクロロメタンに汚染された地下水または土壌に鉄粉を添加する浄化方法である。図１５に従来の浄化方法において使用される鉄粉の断面図を示す。図１５に示すように鉄粉の表面には黒鉛が析出している。析出した黒鉛と鉄粉の界面でジクロロメタンの脱塩素化が進むとされている。鉄粉とジクロロメタンとの反応方法は、ジクロロメタンを含有する地下水をくみ上げ、鉄粉に接触させる方法や、ジクロロメタンで汚染された土壌を掘削し、掘削された土壌と鉄粉を混合する方法が提案されている。ジクロロメタンは鉄粉表面において脱塩素化される。本方法で用いられている鉄粉の粒子径は数１０μｍ〜数１００μｍであることから、効率よく反応を進めるためには鉄粉と土壌中に浸透しているジクロロメタンを接触させる必要がある。
特開２０００−１０２３７７号公報 特開２００２−１６６１７１号公報

このような従来の浄化方法では、浄化の途中で地下水または土壌中に本来の浄化対象物である有機化合物であるテトラクロロエチレンから生成した副生成物であるトリクロロエチレンが蓄積する。蓄積したトリクロロエチレンが地下水の拡散に伴って移動することで新たな汚染が拡大する可能性もあるという課題があり、浄化対象物から生成した副生成物が蓄積しない方法で浄化できることが要求されている。また従来の浄化方法では、本来の浄化対象物よりも浄化対象物から生成した副生成物の浄化に時間がかかる事が多く、施工費用の増加にもつながっている。さらに、浄化対象物が存在している環境の近傍に存在する人間にとって、浄化対象物とは異なる副生成物に暴露されることはさらに新たな健康リスクが増えることになる。本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、地下水または土壌中に浄化対象物から生成した副生成物が蓄積することなしに浄化することのできる浄化方法を提供することを目的としている。

また、このような従来の浄化方法では、本来の浄化対象から生成した副生成物であるトリクロロエチレンをさらに浄化しなければならず、そのために別の好気性微生物を利用する必要があり、好気性微生物を利用するためには地下水または土壌中の環境を本来の嫌気的環境から酸素含有量の高い好気的環境に変えなければならず、浄化途中で地下水または土壌中のテトラクロロエチレンの減少とトリクロロエチレンの増加を確認した後に地下水または土壌中の嫌気的環境を好気的環境に変更しなければならない。つまり浄化の進行度に応じて地下水または土壌中の環境を本来の嫌気的環境から好気的環境へと変化させなければならないという課題があり、地下水または土壌中での浄化対象物の減少度と副生成物の増加量を監視し、状況に応じて薬剤等を添加しなければならないという課題があり、浄化開始から終了まで一定の環境条件のままで浄化できることが要求されている。また、本来の嫌気的環境から好気的環境へと土壌中の環境を変化させるために投入する過酸化水素水は酸化能力が高く刺激性があるので、その使用には安全上の注意が必要であり、不適切な使用は二次災害を発生させる可能性があるという課題もある。

また、従来の浄化方法では、ジクロロエタンのような有機塩素化合物を効率よく反応させるために、鉄粉と有機塩素化合物を積極的に接触させる必要がある。鉄粉の粒子径は数１０μｍ〜数１００μｍであることから、地表に鉄粉を散布しただけでは、地下水または土壌中への浸透は容易に進まない。そのためには地下水を汲み上げるか土壌を掘削するなどの作業により有機塩素化合物等を含有する地下水や土壌と鉄粉を混合させる作業が必要であり、ポンプや掘削装置などの大掛かりな設備を使用しなければならないという課題があり、作業工数や費用を削減して簡単に浄化できることが要求されている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、一定の環境条件のままで容易に地下水または土壌中の有機塩素化合物を浄化することのできる浄化方法を提供することを目的としている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものであり、大掛かりな設備を必要とせず簡単で安価な方法で塩素化合物を含有する被浄化物質を浄化することのできる浄化方法を提供することを目的としている。

本発明の新規微生物およびこれを用いた浄化方法は上記目的を達成するために、新規微生物としてクロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３を用いて水、廃水、土壌、ガスまたは廃ガスを浄化する方法としたものである。

この手段により地下水または土壌中に浄化対象物から生成した副生成物が蓄積することなしに浄化することのできる浄化方法が得られる。また、一定の環境条件のままで地下水または土壌を容易に浄化することのできる浄化方法が得られる。

また、本発明の浄化方法は上記目的を達成するために、新規微生物としてクロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３を含む浄化製剤を用いて有機塩素化合物を含有する被浄化物質を浄化する方法としたものである。

この手段により、大掛かりな設備を必要とせず簡単で安価な方法で有機塩素化合物を含有する被浄化物質を浄化することのできる浄化方法が得られる。

本発明によれば地下水または土壌中に浄化対象物から生成した副生成物が蓄積することなしに浄化することができるので、浄化に伴う二次汚染の発生の恐れが無いという効果のある浄化方法を提供できる。従来の方法では、本来の浄化対象物よりも浄化対象物から生成した副生成物の浄化に時間がかかる事が多いので、浄化に伴う二次汚染の発生の恐れが無いということは、浄化にかかる時間を短縮し、浄化にかかる費用を削減することもできる。また副生成物に暴露されることによる健康リスクを低減することができる。

また、本発明によれば一定の環境条件のままで地下水または土壌を浄化することができるので、地下水または土壌中での浄化対象物の減少度を監視しなくても良いので浄化現場の管理が容易であり、環境条件を変化させるための薬剤等が不要であるという効果のある新規微生物およびこれを用いた浄化方法を提供できる。

また、本発明の浄化製剤の主要な成分である新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）は数μｍの大きさであり、地下水や土壌への浸透性や拡散性が優れていることから溶液状の浄化製剤を注入するだけで良く、有機塩素化合物を含有する被浄化物質と浄化製剤の混合のために地下水を汲み上げる作業や土壌を掘削する作業が不要となるので、大掛かりな設備を必要とせず簡単で安価な方法で有機塩素化合物を含有する被浄化物質を浄化することができるという効果のある浄化方法を提供できる。

また、本発明の請求項１と２記載の発明は、有機塩素化合物で汚染された被浄化物質に新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）を作用させて、有機塩素化合物を分解することを特徴とする有機塩素化合物汚染被浄化物質の浄化方法であり、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）により、有機塩素化合物を副生成物が生成することなく脱塩素するという作用を有する。

また、本発明の請求項３記載の発明は、有機化合物で汚染された被浄化物質に新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）を含む浄化製剤により有機塩素化合物を分解することとしたものであり、多量の被浄化物質に対し、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）の増殖特性を高めて脱塩素するという作用を有する。

また、本発明の請求項４記載の発明は、有機塩素化合物がテトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレンのうちいずれか一つ以上を含むことを特徴としたものであり、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）は被浄化物質中のテトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレンのうちいずれか一つ以上に対して副生成物が生成することなく脱塩素するという作用を有する。

また、本発明の請求項５記載の発明は、有機化合物がテトラクロロメタン、トリクロロメタン、ジクロロメタンのうちいずれか一つを含むこととしたものであり、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）は被浄化物質中のテトラクロロエタン、トリクロロエタン、ジクロロエタンのうちいずれか一つ以上に対して副生成物が生成することなく脱塩素するという作用を有する。

また、本発明の請求項６から８記載の発明は、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）を含む浄化製剤を用いて有機塩素化合物を含有する土壌または液体、ガスを浄化するものであり、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）の大きさが数μｍ程度という特徴から、液体、ガスのみならず、土壌いった狭い間隙にも到達し、浄化を遂行することができるという作用を有する。

また、本発明の請求項９から１４記載の発明は、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）の浄化製剤にグルコース、ラクトース、スクロース、マルトース、フルクトースの栄養源が含まれるものであり、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）の増殖を促進させるという作用を有する。

また、本発明の請求項１５から２０記載の発明は、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）の浄化製剤にグルコース、ラクトース、スクロース、マルトース、フルクトースといった栄養源を吸収する吸収剤が含まれるものであり、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）の増殖を促進し、持続性を高めるという作用を有する。

また、本発明の請求項２１から２５記載の発明は、被浄化物質に含まれるテトラクロロメタンがクロロホルム、クロロメタン、ジクロロメタン、フルオロカーボン、テトラクロロエチレンの製造過程において生成したものであるとしたものであり、被浄化物質が流動的に発生する製造過程でも、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）を反応させ脱塩素するという作用を有する。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。

（実施の形態１）
新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３の単離とその生物学的特性
本発明者らは有機塩素化合物を分解する菌種を探索した結果、過去にトリクロロエチレンが土壌中に漏洩したことのある工場の敷地内の地下水中から、有機塩素化合物を分解する能力を有する新たな菌種としてクロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）を分離することに成功した。この現場では地下水中のトリクロロエチレン濃度の減少が確認されており、トリクロロエチレンなどの有機塩素化合物を分解する菌種の地下水中での存在可能性が予測されていた。そこで本発明者らは前記工場の敷地内に設けられた地下水監視用の井戸から嫌気的に地下水を採取し、その地下水の中からトリクロロエチレンを含む有機塩素化合物を分解する能力を有する菌の採取を目指すこととした。具体的には、あらかじめ地下の帯水層に達する深さまで掘られた井戸の中に、先端に水中ポンプを装着したサンプリング用の配管を挿入した。井戸の最下端には地下水が滞留しているので水中ポンプを稼動させることで、地上に地下水をくみ上げることができる。くみ上げた地下水は、できるだけ空気の混入を防止しながら、速やかにサンプリング用容器に充填して密栓する。

上記方法により採取した地下水を下記に示す組成の寒天培地に塗布した後、嫌気的に培養することでクロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）を含む複数のコロニーが形成される。それぞれのコロニーを形状や色の違いごとに、個別の培養液を充填した容器に再添加する。それぞれのコロニーを添加した培養液を含む容器にはさらに有機塩素化合物を添加し、一定時間培養後に有機塩素化合物の濃度を計測する。有機塩素化合物の濃度が初期濃度に比べて減少した培養液から本発明の新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）を絞り込むことができた。培地や培養温度などの条件は土壌中の菌を分離採取するための定法に従えば良い。なお、土壌中の嫌気環境において有機塩素化合物を分解する能力を有する菌を選択する目的であるために、地下水の採取から培養までは酸素を除去した嫌気状態でおこない、その状態で生成したコロニーから有機塩素化合物分解能を有する菌を選択することが望ましい。また、一度の培養ではコロニーが単一の菌に分離されないこともあるので、寒天平板培地への植え継ぎを繰り返すことで、単一の菌からなるコロニーを得る事ができる。また、培養液中の有機塩素化合物の濃度はヘッドスペース法に基づいてガスクロマトグラフにより計測することができる。また、同様にガスクロマトグラフ質量分析計を用いたとしても培養液中の有機塩素化合物の濃度を計測することができる。

本発明の新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）の性質を以下に示す。
（Ａ）形態的性質
細胞の形及び大きさ：桿菌 幅１．０μｍ 長さ２．０〜３．０μｍ
運動性：あり
胞子の有無：あり
（Ｂ）培養的性質

下記に組成を記載した寒天培地における生育状態としてコロニーの形態を記載する。

本発明の新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）の培養に用いた培地組成を以下に示す。
培地組成
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．３％
ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．０８％
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２％
Ｌ−アスパラギン一水和物 ０．５％
Ｌ−システイン塩酸塩一水和物 ０．０５％
Ｄ−グルコース １．０％
寒天 １．５％ （寒天を添加する場合）
培養時間：４８時間
培養温度：２５℃
直径：１．０〜２．０ｍｍ
色調：白色
形：円形
隆起状態：半球状
周縁：全縁
表面の形状など：スムーズ
透明度：不透明
粘稠度：粘稠性あり
（Ｃ）生理学的性質
グラム染色性：陽性
インドールの生成：陰性
デンプンの加水分解：陽性
ウレアーゼ産生：陰性
オキシダーゼ：陰性
カタラーゼ：陰性
酸素に対する態度（好気性、嫌気性の区別など）：嫌気性
さらに、下記の糖類からの酸及びガスの生成の有無を記載する。
Ｌ−アラビノース 陽性
Ｄ−キシロース 陽性
Ｄ−グルコース 陰性
Ｄ−マンノース 陽性
マルトース 陽性
シュークロース 陽性
ラクトース 陽性
Ｄ−トレハロース 陽性
Ｄ−ソルビトール 陰性
Ｄ−マンニトール 陽性
グリセリン 陽性
サリシン 陰性
Ｄ−セロビオース 陽性
Ｄ−メレチトース 陽性
Ｄ−ラフィノース 陽性
Ｌ−ラムノース 陰性
ゼラチン加水分解 陰性
エスクリン加水分解 陽性
（Ｄ）新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）の特徴を示す性質
リパーゼ活性 陰性
レシチナーゼ活性 陰性
（Ｅ）化学分類学的性質

培養後の新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）菌体から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより１６ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ遺伝子（以後１６ＳｒＤＮＡとする）のうち、５’末端側約５００ｂｐの領域を増幅した。その後増幅された塩基配列をシーケンシングし、１６ＳｒＤＮＡ部分塩基配列を得た。得られた１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列を用いて国際塩基配列データベースに対し相同性検索を行ったところ、クロストリジウム・ベイエリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）と１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列の相同率が９８％であることが判明した。

新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）は上記の諸性質および１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列の解析結果からクロストリジウム属に属している可能性が高い。しかし、各種糖の発酵性においては、１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列から近縁と思われるクロストリジウム・ベイエリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）の特性とは異なる発酵性を示すことから、該当種を判定することはできず、クロストリジウム・スピーシーズ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ．ｓｐ）とするのが適当であると考えられる。具体的には１６ＳｒＤＮＡの部分塩基配列において新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）との相同率が高いクロストリジウム・ベイエリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）と比較すると、Ｄ−マンニトール、ラクトース、サッカロースを発酵する特性においては一致しているが、サリシンを発酵する特性においては一致しない。クロストリジウム・ベイエリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）はサリシンを発酵することができるが、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）はサリシンを発酵することができない。

また、後述する実施の形態からも明らかなように、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）は優れた有機塩素化合物分解能を有しており、有害な分解生成物の蓄積が無い状態で地下水または土壌の浄化が可能であることから、本菌を新菌株として、クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）。

以下、新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）を本菌ＫＤ１３株として記載することとする。

なお、本菌ＫＤ１３株は以下に示す液体培地中で増殖させることができる。
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．３％
ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．０８％
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０．０２％
Ｌ−アスパラギン一水和物 ０．５％
Ｌ−システイン塩酸塩一水和物 ０．０５％
Ｄ−グルコース １．０％
（ｐＨ６．８）

本菌ＫＤ１３株は嫌気状態で培養することができる。本菌ＫＤ１３株を含む上記培養液を滅菌したガラスバイアル瓶に充填した後でブチルゴムセプタムを用いて密栓し、気相部分の酸素を除去することで嫌気培養が可能である。気相部分の酸素を除去する方法は定法に従えばよく、高純度の窒素ガスを用いて気相を置換することで嫌気化してもよく、ブチルゴムセプタムを用いて密栓する前に酸素吸収剤を用いて気相部分の酸素を除去する方法により嫌気化してもよい。

なお、本菌ＫＤ１３株の培養条件はこの条件に限ったものではなく、菌体が良好に増殖し、有機塩素化合物の分解が可能な条件であれば、別の異なる組成の培養液を用いても同様の効果を得る事ができる。例えばｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の培養に適した強化クロストリジウム培地を用いてもよい。

なお、本菌ＫＤ１３株は他のｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属の菌と同様に、菌体の周囲環境が菌体の生育にとって好ましくない状態に変化すると、菌体内に耐環境性の高い芽胞を形成する事が判明している。環境を浄化する目的などで長期間に渡り本菌ＫＤ１３株株を保存する必要がある場合は、芽胞状態で保管すれば長期間の安定的な保存が可能になる。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。

（実施の形態２）
有機塩素化合物で汚染された被浄化物質において、本菌ＫＤ１３株を接触させることにより有機塩素化合物を分解する方法を以下に示す。

容量２０ｍＬのガラスバイアルに滅菌済みの上記培養液１０ｍＬを嫌気的に充填し、ブチルゴムセプタムとアルミシールで密栓した。あらかじめ別の容器を用いて同様の組成の培養液中で数日間前培養しておいた本菌ＫＤ１３株の懸濁液を、前記ガラスバイアル中の培養液に針付き注射器を用いて嫌気的に０．１ｍＬ添加し、さらに２５℃の恒温槽内に４８時間以上静置すると培養液中で本菌ＫＤ１３株が増殖する。次にガラスバイアルの嫌気状態を保ったまま、針付き注射器を用いて所定の濃度のテトラクロロエチレン／メタノール溶液を培養液中に嫌気的に添加する。ヘッドスペース法に従い、気相中に含まれるテトラクロロエチレンの濃度をガスクロマトグラフにより定量分析することで、液体培地中に含まれるテトラクロロエチレンの濃度を定量可能である。

本菌ＫＤ１３株を含んだ培養液にテトラクロロエチレンを添加後、培養液が嫌気的に充填されたバイアルの気相中のテトラクロロエチレン濃度を定期的に計測することで、培養液中のテトラクロロエチレンの減少を確認することができる。２５℃の恒温槽内に静置されたバイアル内におけるテトラクロロエチレンの残存率の推移を図１に示す。縦軸にはテトラクロロエチレンの残存率をＰＣＥ残存率として示している。横軸は培養開始からの時間を示している。液体培地中に添加したテトラクロロエチレンは、本菌ＫＤ１３株のはたらきにより約２００時間後には初期濃度の約４５％まで減少している事が分かる。従来の微生物による有機塩素化合物の分解方法ではテトラクロロエチレンの脱塩素に伴いトリクロロエチレンが生成してしまう事が課題であったが、本菌ＫＤ１３株を用いた場合はテトラクロロエチレンを添加した培養液中にトリクロロエチレンは生成されない。また、テトラクロロエチレンを添加した培養液中にジクロロエチレン、塩化ビニルも生成されない。また、テトラクロロエチレンが減少した培養液において、有機塩素化合物の分解生成物として化合物の構造中に塩素を含有する化合物は生成されない。

なお、本菌ＫＤ１３株の培養条件は上記内容に限ったものではなく、培養液中において菌体が増殖し、有機塩素化合物を分解できる条件であれば同様の効果を得る事ができる。

（実施の形態３）
同様に、本菌ＫＤ１３株を用いたトリクロロエチレンの分解について図２を用いて説明する。実施の形態２と同様に、本菌ＫＤ１３株を２５℃の恒温槽内で嫌気的に培養している培養液中に添加したトリクロロエチレンの残存率の推移を図２に示している。縦軸にはトリクロロエチレンの残存率をＴＣＥ残存率として示している。横軸は培養開始からの時間を示している。液体培地中に添加したトリクロロエチレンは本菌ＫＤ１３株のはたらきにより約２００時間後には初期濃度の約４５％まで減少している事が分かる。実施の形態１と同様に、本菌ＫＤ１３株を用いた場合はトリクロロエチレンを添加した培養液中にジクロロエチレン、塩化ビニルは生成されない。また、テトラクロロエチレンが減少した培養液において、有機塩素化合物の分解生成物として分子中に塩素を含有する化合物は生成されない。

なお、本菌ＫＤ１３株の培養条件は上記内容に限ったものではなく、培養液中において菌体が増殖し、有機塩素化合物を分解できる条件であれば同様の効果を得る事ができる。

（実施の形態４）
同様に本菌ＫＤ１３株を用いたｃｉｓ−１，２ジクロロエチレンの分解について図３を用いて説明する。実施の形態２と同様に本菌ＫＤ１３株を２５℃の恒温槽内で嫌気的に培養している培養液中に添加したｃｉｓ−１，２ジクロロエチレンの残存率の推移を図３に示している。縦軸にはｃｉｓ−１，２ジクロロエチレンの残存率をＤＣＥ残存率として示している。液体培地中に添加したｃｉｓ−１，２ジクロロエチレンは本菌ＫＤ１３株のはたらきにより約１６０時間後には初期濃度の約４０％まで減少している事が分かる。実施の形態２と同様に、本菌ＫＤ１３株を用いた場合はｃｉｓ−１，２ジクロロエチレンを添加した培養液中に塩化ビニルの生成は確認されなかった。また、ｃｉｓ−１，２ジクロロエチレンが減少した培養液において、有機塩素化合物の分解生成物として分子中に塩素を含有する化合物は確認されなかった。

なお、本菌ＫＤ１３株の培養条件は上記内容に限ったものではなく、培養液中において菌体が増殖し、有機塩素化合物を分解できる条件であれば同様の効果を得る事ができる。

また、本菌ＫＤ１３株を用いて、テトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレンを分解する方法の一例を示したが、浄化対象は上記３種の有機塩素化合物に限ったものではなく、さまざまな有機塩素化合物に対して脱塩素能力を発現できる可能性がある。

（実施の形態５）
新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３のジクロロメタン分解能力
ジクロロメタンで汚染された被浄化物質において、本菌ＫＤ１３株を接触させることによりジクロロメタンを分解する方法を以下に示す。

容量２０ｍＬのガラスバイアルに滅菌済みの上記培養液１０ｍＬを嫌気的に充填し、ブチルゴムセプタムとアルミシールで密栓した。あらかじめ別の容器を用いて同様の組成の培養液中で数日間前培養しておいた本菌ＫＤ１３株の懸濁液を、前記ガラスバイアル中の培養液に針付き注射器を用いて嫌気的に０．１ｍＬ添加し、さらに２５℃の恒温槽内に４８時間以上静置すると培養液中で本菌ＫＤ１３株が増殖する。次にガラスバイアルの嫌気状態を保ったまま、針付き注射器を用いて所定の濃度のジクロロメタン／メタノール溶液を培養液中に嫌気的に添加する。ジクロロメタン／メタノール溶液を添加した後はガラスバイアルを２５℃の恒温槽内に静置しておく。液体培地中に含まれるジクロロメタンの濃度は、ヘッドスペース法に従い気相中に含まれるジクロロメタンの濃度をガスクロマトグラフにより定量分析することで定量可能である。

本菌ＫＤ１３株を含んだ培養液にジクロロメタンを添加後、培養液が嫌気的に充填されたバイアルの気相中のジクロロメタン濃度を定期的に計測することで、培養液中のジクロロメタンの減少を確認することができる。２５℃の恒温槽内に静置されたバイアル内におけるジクロロメタンの残存率の推移を図４に示す。縦軸にはジクロロメタンの残存率を示している。横軸は培養開始からの時間を示している。液体培地中に添加したジクロロメタンは、本菌ＫＤ１３株の働きにより約１００時間後には初期濃度の約６０％まで減少している。さらに約４００時間後には初期濃度の約４０％以下まで減少している事が分かる。さらに約７００時間後には初期濃度の約３０％まで減少している事が分かる。

なお、本菌ＫＤ１３株の培養条件は上記内容に限ったものではなく、培養液中において菌体が増殖し、ジクロロメタンを分解できる条件であれば同様の効果を得る事ができる。

また、本菌ＫＤ１３株によりジクロロメタンを分解すると、培養液中にクロロメタンは検知されない。環境中においてクロロメタンの有害性は少ないとされているが、本菌ＫＤ１３株によりジクロロメタンを分解することで新たな有害物質を生成する可能性が少ないといえるので、地下水または土壌中のジクロロメタンを分解する際には優れた特性である。

（実施の形態６）
新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３のテトラクロロメタン分解能力
本菌ＫＤ１３株とテトラクロロメタンを含む被浄化物質とを接触させた場合の本菌ＫＤ１３株によるテトラクロロメタンの分解能力を以下に記す。

容量２０ｍＬのガラスバイアルに滅菌済みの上記培養液１０ｍＬを嫌気的に充填し、ブチルゴムセプタムとアルミシールで密栓した。あらかじめ別の容器を用いて同様の組成の培養液中で数日間前培養しておいた本菌ＫＤ１３株の懸濁液を、前記ガラスバイアル中の培養液に針付き注射器を用いて嫌気的に０．１ｍＬ添加し、さらに２５℃の恒温槽内に４８時間以上静置すると培養液中で本菌ＫＤ１３株が増殖する。次にガラスバイアルの嫌気状態を保ったまま、針付き注射器を用いて所定の濃度のテトラクロロメタン／メタノール溶液を培養液中に嫌気的に添加する。テトラクロロメタン／メタノール溶液を添加した後はガラスバイアルを２５℃の恒温槽内に静置しておく。液体培地中に含まれるテトラクロロメタンの濃度は、ヘッドスペース法に従い気相中に含まれるテトラクロロメタンの濃度をガスクロマトグラフにより定量分析することで定量可能である。

本菌ＫＤ１３株を含んだ培養液にテトラクロロメタンを添加後、培養液が嫌気的に充填されたバイアルの気相中のテトラクロロメタン濃度を定期的に計測することで、培養液中のテトラクロロメタンの減少を確認することができる。２５℃の恒温槽内に静置されたバイアル内におけるテトラクロロメタンの残存率の推移を図５に示す。縦軸はテトラクロロメタンの残存率を示している。横軸は培養開始からの時間を示している。液体培地中に添加したテトラクロロメタンは、本菌ＫＤ１３株のはたらきにより約４００時間後は初期濃度の約８０％までしか減少していないが、約７００時間後には初期濃度の約５０％にまで減少している事が分かる。

なお、本菌ＫＤ１３株の培養条件は上記内容に限ったものではなく、培養液中において菌体が増殖し、テトラクロロメタンを分解できる条件であれば同様の効果を得る事ができる。

また、本菌ＫＤ１３株を上記の液体培地で７００時間培養した後、ヘッドスペースのガス組成をガスクロマトグラフによって分析した結果、図６ａに示すクロマトグラムが得られた。同様に、クロロメタンの標準液を分析した結果、図６ｂに示すクロマトグラムが得られた。同様に、テトラクロロメタンとジクロロメタンの混合標準液を分析した結果、図６ｃに示すクロマトグラムが得られた。図６ａに示す通り、７００時間後の培養液にはテトラクロロメタンのピークに加え、本菌ＫＤ１３株が培地中のグルコースを代謝したことに由来する多くのピークが検出されたが、クロロメタンのピーク（図６ｂ）は検出されない。同様に、７００時間後の培養液中にジクロロメタンのピーク（図６ｃ）も検出されなかった。このことは、本菌ＫＤ１３株によるテトラクロロメタンの分解に伴って、ジクロロメタンやクロロメタンといった新たな有害な分解生成物が生成される可能性が極めて少ないことを示しており、土壌または地下水中、廃液や廃ガス中に含まれるテトラクロロメタンを分解する際には非常に優位である。

（実施の形態７）
本菌ＫＤ１３株を用いた水の浄化方法について図７を用いて説明する。図７に示すように工場１は舗装面２の上面に建設されている。工場の内部で有機塩素化合物３が漏洩した場合、舗装面２の間隙を通過して有機塩素化合物３が地下へ浸透する。工場の地下に透水層４と不透水層５が形成されていた場合、不透水層５の上部に被浄化物質６である水７が地下水として滞留していることがある。工場１から漏洩した有機塩素化合物３は土壌中において浸透しやすい性質を有しているので、重力により透水層４内部を通過して下方に浸透していき、不透水層５の上部に存在する水７に溶解することになる。また、有機塩素化合物３により汚染された水７を観測するための観測井戸８が舗装面２の上部から水７まで透水層４を貫通して設けられている。このように水７が有機塩素化合物３に汚染されている場合、観測井戸８を利用して水７に本菌ＫＤ１３株を含む培養液を添加することで、水中で本菌ＫＤ１３株が増殖することができる。その結果、本菌ＫＤ１３株の増殖に伴い、有機塩素化合物の分解が促進され速やかに浄化を進めることができるものである。

従来例とは異なり有機塩素化合物からの分解生成物である塩素を含有する化合物が蓄積する事が無く、そのような分解生成物を浄化する目的で別の菌株を添加するために嫌気状態を好気状態に変化させる必要は無い。

なお、本菌ＫＤ１３株と同時に添加する浄化製剤９は上記に記載した組成の培養液でもよく、菌体の増殖に必要な栄養源を含む培養液であれば上記に記載した組成の培養液と異なる組成の培養液を用いても同様の効果を得ることができる。

具体的には、菌体の増殖に必要な栄養源として、グルコースの他に、ラクトース、スクロース、マルトース、フルクトースなどが挙げられ、そのうちいずれか２種類以上を添加しても効率的に菌体を増殖させることができる。浄化製剤９を投与する前から地下水または土壌中に存在する菌を土着菌とすると、投与した浄化製剤９に含まれる栄養源を本菌ＫＤ１３株ではなく土着菌が先に消費してしまう可能性がある。そこで、２種類以上の栄養源を含むことで、土着菌が消費してしまうことによる影響を減少させることができる。具体的には、土着菌は消費しにくく本菌ＫＤ１３株が利用しやすい栄養源を組み合わせることで、土着菌による消費の影響を減少させることができる。

また、ここに示した糖以外でも菌体の増殖に必要な栄養源があればその成分を添加することで同様の効果を得ることができる。

また、本実施の形態では既に観測井戸８が施工されているものとしたが、もし未施工の場合は透水層４を通過し、有機塩素化合物３に汚染された水７に到達するような配管を施工すればよい。観測井戸８からの培養液の注入は重力による自然滴下と浸透拡散を利用してもよく、ポンプを用いて圧入する方法を用いても良い。

なお、被浄化物質６である水は工場敷地内の地下水に限ったものではなく、有機塩素化合物３を含む工場廃水であっても、廃水内に本菌ＫＤ１３株を含む培養液を添加することで同様の効果を得ることができる。

また、地下水を浄化する場合には、地中からポンプなどの手段を用いて地下水をくみ上げてもよく、ポンプで揚水して貯留した地下水中に本菌ＫＤ１３株を含む培養液を添加することで浄化を進めることができるものである。

また、揚水した地下水を本菌ＫＤ１３株が担持された微生物担体を充填した容器内に通水することで浄化を進めることができるものである。菌体と被浄化物質６を含む水７を接触させることができれば同様の効果を得ることができるものである。

また、本菌ＫＤ１３株を含む培養液を添加する場合には、事前に別の培養液中で本菌ＫＤ１３株の活性を高めておくことで速やかに浄化することができるものである。具体的には本菌ＫＤ１３株の活性を高める為に、培養液中に微量の有機塩素化合物３を添加する方法などが考えられる。なお本菌ＫＤ１３株を含む培養液を環境中に添加する前に、培養液中に添加した有機塩素化合物３を削減または除去しておく必要がある。

また、本菌ＫＤ１３株を添加するための手法として、培養液中の菌体を添加するだけでなく、乾燥状態の菌体を散布する方法を用いても同様の効果を得ることができる。具体的には、本菌ＫＤ１３株は耐乾燥性のある芽胞を形成するので、芽胞状態の菌体として散布することができる。散布された芽胞状態の菌体は水中に浸漬されることで発芽するので菌体が増殖し、有機塩素化合物の分解が促進されることになる。

また、本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９は地下水または土壌中への注入の直前に栄養源を添加混合してもよく、本菌ＫＤ１３株または本菌ＫＤ１３株の芽胞を先に地下水または土壌中に注入した後で栄養源を注入しても良い。本菌ＫＤ１３株の芽胞は粒子径が小さいことから浸透性に優れているので、地下水または土壌中において速やかに広範囲に拡散させることが可能である。

また、事前に観測井戸８からの観測により水７の環境条件が本菌ＫＤ１３株の生育に適していない環境条件であった場合は、本菌ＫＤ１３株を投与する前に水７の環境を変化させることで本菌ＫＤ１３株の生育を促進させることができ、有機塩素化合物の分解を促進することができるものである。

（実施の形態８）
本菌ＫＤ１３株を用いた土壌の浄化方法について図８を用いて説明する。図８に示すように工場１は舗装面２の上面に建設されている。工場１の内部で有機塩素化合物３が漏洩した場合、舗装面２の間隙を通過して有機塩素化合物３が地下へ浸透する。工場の地下に透水層４と不透水層５が形成されていた場合、不透水層５の上部に被浄化物質６である土壌１０が汚染土壌として滞積することになる。工場１から漏洩した有機塩素化合物３は土壌中において浸透しやすい性質を有しているので、重力により下方に浸透していき、透水層４を通過して不透水層５の上部に停滞することになる。また、有機塩素化合物３により汚染された土壌１０を観測するための観測井戸８が舗装面２の上部から土壌１０まで透水層４を貫通して設けられている。

このように土壌１０が有機塩素化合物３に汚染されている場合、観測井戸８を利用して土壌１０に本菌ＫＤ１３株を含む培養液を添加することで、土壌１０中で本菌ＫＤ１３株が増殖することができる。その結果、本菌ＫＤ１３株の増殖に伴い、有機塩素化合物の分解が促進され速やかに土壌１０の浄化を進めることができるものである。

なお、本菌ＫＤ１３株を用いた場合は従来例とは異なり有機塩素化合物からの分解生成物である塩素を含有する化合物が土壌中に蓄積する事が無く、分解生成物を浄化する目的で別の菌株を添加するために嫌気状態を変化させる必要は無い。

なお、本菌ＫＤ１３株と同時に添加する培養液は上記に記載された組成の培養液でもよく、菌体の増殖に必要な栄養源を含む培養液であれば上記記載の培養液と異なる組成の培養液を用いても同様の効果を得ることができる。

また、土壌を浄化する場合には土壌を掘削して別の場所に搬送してから本菌ＫＤ１３株を含む培養液を添加することで土壌を浄化する方法を用いてもよい。

（実施の形態９）
本菌ＫＤ１３株を用いたガスの浄化方法について図９を用いて説明する。図９に示すように、カラム１１内には本菌ＫＤ１３株を担持させた担体１２が充填されている。カラム１１は２ヶ所の開口部を有し、一方の開口部にはポンプ１３が装着され、もう一方の開口部からガス１４を吸引することができる。ガス１４は実際には容易に目視できるものではないが、説明を容易にするために明確な形状のあるものとして記載した。開口部から吸引されたガス１４は担体１２の空隙を通過し、もう一方の開口部に装着されたポンプ１３を通過し、排出口１５から排出される。ガス１４が担体１２の空隙を通過する際に担体１２の表面に存在する本菌ＫＤ１３株の働きにより、ガス１４に含まれる有機塩素化合物が分解されるものである。担体１２への本菌ＫＤ１３株の担持方法については、本菌ＫＤ１３株の培養液に多孔質の担体１２を浸漬することで担体１２表面に本菌ＫＤ１３株を担持させる方法が適当であるが、この方法に限ったものではなく、本菌ＫＤ１３株の活性を維持したまま担体１２の表面または内部に本菌ＫＤ１３株を固定化することができれば同様の効果を得ることができる。

また、担体１２の素材についても特に限定するものではなく、本菌ＫＤ１３株を固定化できる構造を有していれば、活性炭や合成高分子などでも同様の効果を得ることができる。

また、本菌ＫＤ１３株を担持した担体１２において本菌ＫＤ１３株の活性を維持するために、本菌ＫＤ１３株の栄養源となる成分を含む培養液を担体１２に含浸させて用いても良い。栄養源としては上記に記載した培地の成分等が望ましいが、本菌ＫＤ１３株の活性維持に必要な成分であれば他の成分であっても同様の効果を得ることができる。

また、本実施の形態ではポンプ１３の構成について詳細は記載しなかったが、担体１２が充填されたカラム１１の内部にガスを通過させる能力を有するポンプ１３であればどのような構成のポンプを用いても良い。本菌ＫＤ１３株を担持した担体１２とガスの接触時間が、本菌ＫＤ１３株とガス１４に含まれる有機塩素化合物の作用に十分な時間に設定できる流量を有するポンプが望ましい。同様にカラム１１の構造についても詳細は記載していないが、本菌ＫＤ１３株を担持した担体１２を内部に保持し、また外部に流出しないような構造で、さらに開口部からガス１４を吸引できるような構造であればどのような形状であっても同様の効果を得ることができる。一般的にはステンレスやガラスのカラムなど、耐食性に優れた材料で作られたカラムが用いられることが多い。本菌ＫＤ１３株を担持した担体１２の表面状態は本菌ＫＤ１３株を用いたガス１４の浄化方法において重要な監視条件であるので、ガラスカラムであれば、本菌ＫＤ１３株を担持した担体１２の表面状態を観察しやすいので好ましい。

また、本菌ＫＤ１３株をガス１４の浄化に用いる場合、ガス１４の浄化を継続していると、本菌ＫＤ１３株を担持した担体１２の表面に本菌ＫＤ１３株からの代謝物が滞積する可能性がある。担体１２表面での代謝物の滞積は本菌ＫＤ１３株の活性を維持するためには望ましくない条件であるので、適宜担体１２の表面を洗浄することで本菌ＫＤ１３株の活性を維持することができる。

なお、担体１２表面を洗浄する方法としては、カラム１１内に洗浄液を充填し、一定時間経過後に排出することで担体１２表面を洗浄する事が可能である。洗浄液には界面活性剤等を添加してもよいが、担体１２表面から本菌ＫＤ１３株を脱落させることがない特性の洗浄液を用いることが望ましい。

ガス１４の浄化方法はこの方法に限ったものではなく、本菌ＫＤ１３株とガス１４に含まれる有機塩素化合物を作用させる方法であれば同様の効果を得ることができる。具体的には本菌ＫＤ１３株を含む培養液中にバブリング装置などでガス１４を通過させることでも同様の効果を得る事ができるものである。

また、本菌ＫＤ１３株は嫌気性菌であることからガス１４中に多くの酸素が含まれる場合は酸素を事前に除去することでカラム１１内の担体１２に保持された菌の活性を長期間維持することができるものである。

また、浄化対象であるガス１４は有機塩素化合物に汚染された土壌中から真空ポンプにより吸引したガスや、有機塩素化合物使用施設から排出されるガスなどの有機塩素化合物を含有しているものであれば同様の効果を得ることができる。

（実施の形態１０）
本菌ＫＤ１３株を用いた廃液の浄化方法について図１０を用いて説明する。図１０に示すようにジクロロメタンを含む廃液１６が容器１７に蓄えられている。ジクロロメタンは金属加工業において金属部品の洗浄剤として用いられることが多い。また、塗装の剥離剤やアクリル樹脂の接着剤としても利用されている。本実施の形態では洗浄剤や剥離剤としての用途を終え廃液として保管する場合、またアクリル樹脂の接着作業において余剰になった接着剤を廃液として保管する場合の処理方法について示す。連続的に廃液が発生しない場合や、廃液の発生量が一定ではない場合など、ジクロロメタンの廃液は一旦容器に回収して、一定量が蓄積された段階で専門の産業廃棄物処理業者に委託することが多い。しかしジクロロメタンの廃液を産業廃棄物処理業者へ委託する前に、ジクロロメタンが容器から揮散して周囲の環境を汚染することがある。したがって、廃液を保管している容器内部でジクロロメタンを安全に処理することが望まれている。

図１０に示すようにジクロロメタンを含む廃液１６に本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９を添加する。ジクロロメタンが高濃度の場合は本菌ＫＤ１３株の増殖が阻害される場合があるので廃液１６を水で適当な濃度に希釈しても良い。

なお、本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９は上記に記載した組成のようにグルコースを含む培養液でもよく、菌体の増殖に必要な栄養源を含む浄化製剤９であれば上記に記載した組成の培養液と異なる組成の浄化製剤９を用いても同様の効果を得ることができる。具体的には、菌体の増殖に必要な栄養源として、グルコースの他に、ラクトース、スクロース、マルトース、フルクトースなどが挙げられ、そのうちいずれか２種類以上を添加しても効率的に菌体を増殖させることができる。

また、ここに示した糖以外でも菌体の増殖に必要な栄養源があればその成分を添加することで同様の効果を得ることができる。

本実施の形態では浄化製剤９として本菌ＫＤ１３株を含む溶液を示したが、浄化製剤９の形状は溶液に限ったものではなく、本菌ＫＤ１３株を芽胞状態で乾燥した粉末状の浄化製剤９を利用しても良い。その場合は本菌ＫＤ１３株の栄養源も同様に粉末状で供給し、さらに水分のみを別に供給してもよく、本菌ＫＤ１３株の増殖に必要な栄養源や水分が得られる方法であればどのような浄化製剤９の形状であってもよい。

（実施の形態１１）
本菌ＫＤ１３株を用いた有機塩素化合物を含有する液体の浄化方法について図１１を用いて説明する。有機塩素化合物を含有する液体として、洗浄剤や剥離剤としての用途を終えた廃液１６、またアクリル樹脂の接着作業において余剰になった接着剤である廃液１６を想定している。図１１に示すように吸収剤１８と本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９が処理容器１９に収納されている。本実施の形態では浄化製剤９を粉末状の浄化製剤９とした。吸収剤１８は多孔質の物質でありセルロースやポリアクリル酸ナトリウムなどの高分子材料やシリカゲルやゼオライトなどの無機材料や活性炭など様々な素材を採用することができる。特に本菌ＫＤ１３株の増殖場所として適当な大きさの空隙を有する素材や、ジクロロメタンとの親和性の高い素材が適している。

処理容器１９に容器１７にあるジクロロメタンを含む廃液１６を注入すると浄化製剤９が含まれている本菌ＫＤ１３株の働きによりジクロロメタンが分解される。廃液１６中のジクロロメタンが高濃度の場合は本菌ＫＤ１３株の増殖が阻害される場合があるので廃液１６を水で適当な濃度に希釈しても良い。

本実施の形態では吸収剤１８を備えたことにより本菌ＫＤ１３株が付着して増殖する場所を提供することができ、またジクロロメタンを吸収し吸収剤１８内に濃縮することができるので、本菌ＫＤ１３株によるジクロロメタンの分解を促進することができるものである。ジクロロメタンを吸収することで濃縮する効果は本実施の形態のように浄化製剤９に廃液１６を添加する方法だけでなく、廃液中に浄化製剤９を添加する場合でも同様な効果を得ることができる。

なお、本実施の形態では浄化製剤９における吸収剤１８の含有量については特定しなかったが、ジクロロメタンを含む廃液の量に合わせて吸収剤１８の含有量を設定すればよい。

また、本実施の形態では浄化製剤９に廃液を添加する方法を示したが、それ以外にも同様に地下水または土壌中に吸収剤１８を含む浄化製剤９を添加しても同様の効果を得ることができる。地下水または土壌中に井戸などを利用して吸収剤１８を含む浄化製剤９を添加することができる。地下水または土壌中に添加された吸収剤１８を含む浄化製剤９は地下水または土壌中のジクロロメタンを含有する被浄化物質６を吸収濃縮し浄化製剤９に含まれる本菌ＫＤ１３株により分解を促進することができる。地下水または土壌中に吸収剤１８を含む浄化製剤９を添加する場合は、吸収剤１８の特性としてジクロロメタンとの親和性だけでなく、吸水力に優れた吸収剤１８を利用しても良い。ジクロロメタンは水溶性が高いので、地下水または土壌中での水の吸収に伴いジクロロメタンを吸収することができるものである。

（実施の形態１２）
新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３を用いたテトラクロロメタン含有廃液の浄化方法
本菌ＫＤ１３株を用いたテトラクロロメタンを含有する廃液の浄化方法について図１１、図１２を用いて説明する。まず、図１１に示すようにクロロホルム、ジクロロメタン、クロロメタンやフルオロカーボン、テトラクロロエチレンといった物質を製造するときに生成されたテトラクロロメタンを含む廃液１６が容器１７に蓄えられている。テトラクロロメタンを含む廃液１６に本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９を添加する。テトラクロロメタンが高濃度の場合は本菌ＫＤ１３株の増殖が阻害される場合があるので廃液１６を水で適当な濃度に希釈しても良い。ここで、浄化製剤９は液状のものが廃液１６内での分散性が高く好ましいが、これに限定されず、顆粒、ペレット、打錠、粉状であっても良い。そのような場合は、廃液１６中に入れた後、攪拌する、または加熱する等の方法により浄化製剤９の成分を分散させる操作を行っても良い。

また、図１２に示すように、処理容器１９に本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９を吸着させた担体１２を充填し、テトラクロロメタンを含む廃液１６を流入パイプ２０を介して処理容器１９内に流入せしめ、担体１２と接触させる。これにより、浄化製剤９に含まれる本菌ＫＤ１３株とテトラクロロメタンが接触し、分解が行われる。テトラクロロメタンが分解されて環境基準値以下の濃度になった後、廃液１６は処理容器１９の上部に設けられたポンプ１３により汲み上げられ、排出パイプ２１を通過して河川や海洋といった環境中に放出される。

ここで、浄化の対象となる、テトラクロロメタンが含まれる廃液１６はクロロホルム、ジクロロメタン、クロロメタンやフルオロカーボン、テトラクロロエチレンといった物質を製造するときに生成された場合に限らず、テトラクロロメタンが遺漏した地下水といった環境中の水を採取してきたものであっても良い。

また、担体１２の例としては、活性炭のように多孔質なものが好ましいが、これに限定されず、本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９が吸着可能なものであれば良い。

また、廃液１６に含まれるテトラクロロメタンの濃度により、処理容器１９内での滞留時間、即ち本菌ＫＤ１３株とテトラクロロメタンとの接触時間を調節するのが好ましい。テトラクロロメタン含有廃液の量が多い場合は、浄化製剤９を追加で処理容器１９に投入することにより対応できる。

なお、本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９は上記に記載した組成のようにグルコースを含むものが望ましいが、菌体の増殖に必要な栄養源を含有しておれば、これに限定されない。また、テトラクロロメタンの浄化を繰り返し、長時間行うことにより、本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９に含まれる栄養源が枯渇した場合は、流入パイプ２０からテトラクロロメタンを含む廃液１６とともに栄養源を処理容器１９へ送液することで、本菌ＫＤ１３株のテトラクロロメタン分解活性を高めることができる。

（実施の形態１３）
新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３を用いたテトラクロロメタン含有廃ガスの浄化方法
本菌ＫＤ１３株を用いたテトラクロロメタンを含有する廃ガスの浄化方法について図１３、図１４を用いて説明する。

図１３に示すように、処理容器１９に液状またはゲル状に調整した本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９を充填する。クロロホルム、ジクロロメタン、クロロメタンやフルオロカーボン、テトラクロロエチレンといった物質を製造するときに生成されたテトラクロロメタンを含む廃ガス２２を処理容器１９の下部に設けられた流入パイプ２０から流入させる。テトラクロロメタンを含む廃ガス２２は泡状となり、処理容器１９の上部まで昇っていく間に本菌ＫＤ１３株と接触し、分解が行われる。分解が十分に行われ、テトラクロロメタンの含有量が環境基準値以下に下がったガスは、ポンプ１３、排出パイプ２１により大気中に放出される。ここで、泡状のテトラクロロメタンを含む廃ガス２２と浄化製剤９に含まれる本菌ＫＤ１３株との接触時間を上げて分解の効率化を図るためには、処理容器１９に浄化製剤９を追加で投入する方法に加え、テトラクロロメタンを含む廃ガス２２の泡の粒径は小さく、かつ処理容器１９の高さは長くするのが好ましく、廃ガス２２に含まれるテトラクロロメタン濃度に応じて調節する必要がある。

図１４に示すように、処理容器１９に本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９を吸着させた担体１２を充填し、流入パイプ２０を介して処理容器１９内に流入したテトラクロロメタンを含む廃ガス２２を担体１２と接触せしめる。これにより、本菌ＫＤ１３株とテトラクロロメタンが接触し、分解が行われる。テトラクロロメタンが分解されて環境基準値以下の濃度になった後、廃ガス２２は処理容器１９の上部に設けられたポンプ１３により汲み上げられ、排出パイプ２１を通過して大気中に放出される。

ここで、担体１２の例としては活性炭のように多孔質なものが好ましいが、これに限定されず、本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９が吸着可能なものであれば良い。

なお、本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９は上記に記載した組成のようにグルコースを含むものが望ましいが、菌体の増殖に必要な栄養源を含有しておれば、これに限定されない。

また、浄化を繰り返し、長時間行うことで本菌ＫＤ１３株を含む浄化製剤９に含まれる栄養源が枯渇した場合は、流入パイプ２０からテトラクロロメタンを含む廃ガス２２とともに栄養源を処理容器１９へ流入させることで、担体１２へ吸着した本菌ＫＤ１３株のテトラクロロメタン分解活性を高めることができる。

これらの方法の浄化対象となる、テトラクロロメタンが含まれる廃ガス２２はクロロホルム、ジクロロメタン、クロロメタンやフルオロカーボン、テトラクロロエチレンといった物質を製造するときに生成される場合に限らず、テトラクロロメタンが遺漏した土壌や地下水を加熱、曝気してテトラクロロメタンを揮発させたガスといった環境試料由来のものであっても良い。

本発明の新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３）を用いることで有機塩素化合物に汚染された地下水または土壌またはガスを浄化する用途に適用できる。

本発明の実施の形態２におけるテトラクロロエチレンの減少を示す図 本発明の実施の形態３におけるトリクロロエチレンの減少を示す図 本発明の実施の形態４におけるジクロロエチレンの減少を示す図 本発明の実施の形態５におけるジクロロメタンの減少を示す図 本発明の実施の形態６におけるテトラクロロメタンの減少を示す図 本発明の実施の形態６におけるクロロメタン、ジクロロメタンの生成の有無を示す図 本発明の実施の形態７における水の浄化方法を示す図 本発明の実施の形態８における土の浄化方法を示す図 本発明の実施の形態９におけるガス浄化方法を示す図 本発明の実施の形態１０における廃液の浄化方法を示す図 本発明の実施の形態１１および１２における廃液の浄化方法を示す図 本発明の実施の形態１２における廃液の浄化方法を示す図 本発明の実施の形態１３における廃ガスの浄化方法を示す図 本発明の実施の形態１３における廃ガスの浄化方法を示す図 従来例の浄化化方法において使用される鉄粉の断面を示す図

符号の説明

１ 工場
２ 舗装面
３ 有機塩素化合物
４ 透水層
５ 不透水層
６ 被浄化物質
７ 水
８ 観測井戸
９ 浄化製剤
１０ 土壌
１１ カラム
１２ 担体
１３ ポンプ
１４ ガス
１５ 排出口
１６ 廃液
１７ 容器
１８ 吸収剤
１９ 処理容器
２０ 流入パイプ
２１ 排出パイプ
２２ 廃ガス
１０１ 鉄粉
１０２ 黒鉛

Claims (25)

1. 新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）。
2. 有機化合物で汚染された被浄化物質に新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）を作用させて、有機塩素化合物を分解することを特徴とする浄化方法。
3. 有機化合物で汚染された被浄化物質に新規クロストリジウム・スピーシーズＫＤ１３（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．ＫＤ１３ 特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−２１１１５）を含む浄化製剤を作用させて有機塩素化合物を分解することを特徴とする浄化方法。
4. 有機化合物がテトラクロロエチレン、トリクロロエチレン、ジクロロエチレンのうちいずれか一つ以上を含むことを特徴とする請求項２または３記載の浄化方法。
5. 有機化合物がテトラクロロメタン、トリクロロメタン、ジクロロメタンのうちいずれか一つを含むことを特徴とする請求項２または３記載の浄化方法。
6. 被浄化物質が液体であることを特徴とする請求項２から５いずれか１項に記載の浄化方法。
7. 被浄化物質が土壌であることを特徴とする請求項２から５いずれか１項に記載の浄化方法。
8. 被浄化物質がガスであることを特徴とする請求項２から５いずれか１項に記載の浄化方法。
9. 浄化製剤がグルコースを含むことを特徴とする請求項３記載の浄化方法。
10. 浄化製剤がラクトースを含むことを特徴とする請求項３記載の浄化方法。
11. 浄化製剤がスクロースを含むことを特徴とする請求項３記載の浄化方法。
12. 浄化製剤がマルトースを含むことを特徴とする請求項３記載の浄化方法。
13. 浄化製剤がフルクトースを含むことを特徴とする請求項３記載の浄化方法。
14. 浄化製剤がグルコース、ラクトース、スクロース、マルトース、フルクトースのうちいずれか２種類以上を含むことを特徴とする請求項３記載の浄化方法。
15. 浄化製剤が吸収剤を含むことを特徴とする請求項３または１０から１４いずれか１項に記載の浄化方法。
16. 吸収剤がセルロースであることを特徴とする請求項１５記載の浄化方法。
17. 吸収剤がポリアクリル酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１５記載の浄化方法。
18. 吸収剤がシリカゲルであることを特徴とする請求項１５記載の浄化方法。
19. 吸収剤がゼオライトであることを特徴とする請求項１５記載の浄化方法。
20. 吸収剤が活性炭であることを特徴とする請求項１５記載の浄化方法。
21. 被浄化物質に含まれるテトラクロロメタンがクロロホルムの製造過程において生成したものであることを特徴とする請求項５から８いずれか１項に記載の浄化方法。
22. 被浄化物質に含まれるテトラクロロメタンがクロロメタンの製造過程において生成したものであることを特徴とする請求項５から８いずれか１項に記載の浄化方法。
23. 被浄化物質に含まれるテトラクロロメタンがジクロロメタンの製造過程において生成したものであることを特徴とする請求項５から８いずれか１項に記載の浄化方法。
24. 被浄化物質に含まれるテトラクロロメタンがフルオロカーボンの製造過程において生成したものであることを特徴とする請求項５から８いずれか１項に記載の浄化方法。
25. 被浄化物質に含まれるテトラクロロメタンがテトラクロロエチレンの製造過程において生成したものであることを特徴とする請求項５から８いずれか１項に記載の浄化方法。

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