JP2008249599A - Ｘ線結晶構造解析用キャピラリー及びそれを用いたタンパク質結晶試料の調製方法 - Google Patents

Abstract

【課題】タンパク質結晶に損傷を与えることなく、かつ、簡便に、室温およびクライオ条件下でのＸ線回折実験に適用するためのタンパク質結晶試料の調製方法を提供する。
【解決手段】Ｘ線回折測定に適した大きさの結晶の流出を防止する絞り領域を有するキャピラリーを用いて、その内部で結晶化、クライオプロテクタント処理およびＸ線回折測定による回折データ収集までの一連の工程を行う。
【選択図】図１

Description

本発明は、キャピラリーの内部でタンパク質の結晶を形成し、クライオプロテクタント処理を行うことによって、結晶に損傷を与えることなく、かつ、簡便に、室温およびクライオ条件下でのＸ線回折実験に適用するためのタンパク質結晶試料の調製方法を提供する。さらに、本発明は、タンパク質のＸ線結晶構造解析に用いるキャピラリーに関する。より詳しくは、本発明は、上記タンパク質結晶試料の調製方法に用いるキャピラリーを提供する。

タンパク質の機能発現はその三次元構造に依存すると考えられているため、タンパク質機能の研究には、タンパク質の構造解析が不可欠である。
自然界には、数千万種類のタンパク質が存在するといわれているが、三次元構造が確認されたタンパク質は数千種類程度である。
今後、多数のタンパク質の迅速な構造解析を行う方法の確立が必要である。

タンパク質の三次元構造を解析するための最も一般的な手法は、Ｘ線回折測定によるＸ線構造解析である。
具体的には、タンパク質の結晶を成長し、得られたタンパク質結晶をＸ線回折装置にマウントし、測定を行って、Ｘ線回折データセットを収集する。

良質のＸ線回折データセットを得るために最も重要なことは、タンパク質の良質な単結晶を得ることである。タンパク質の結晶化には、平衡化溶液の蒸気内に母液の水滴を静置させて結晶化を行う、ハンギングドロップ法、シッティングドロップ法、サンドイッチドロップ法などの蒸気拡散法が最も一般的であるが、多穴プレートを用いて、油中に母液の微小水滴を静置し、多数条件の検討を同時に行うことができるマイクロバッチ法なども開発されている。
上記の結晶化方法のいずれを用いた場合でも、クライオループなどを用いるマニュアル操作によって析出した結晶をキャピラリーに移し、このキャピラリーをＸ線回折装置のゴニオメータヘッドにマウントして、Ｘ線回折測定を行う。

タンパク質Ｘ線結晶構造解析における回折データセットの収集は、Ｘ線によるタンパク質結晶の損傷を防止するため、１００Ｋの温度条件下で行われる。したがって、タンパク質結晶は、測定前にクライオプロテクタント処理を行う必要がある、そのタンパク質結晶のクライオプロテクタント処理は、クライオループを用いたマニュアル操作を必要とし、クライオループとタンパク質結晶との接触は避けられず、結果として結晶に損傷を与えることになる。結晶に与える損傷の程度は作業者の技術に依存するため、良質な回折データを得るためには、熟練した作業者によるハンドリングが必要となる。

近年、急速にタンパク質Ｘ線構造解析の自動化が進んでいるが、結晶をＸ線回折装置にマウントする工程はマニュアルで行われているため、結晶化から回折データセットの収集までの工程はまだ完全に自動化されていない。
Ｘ線結晶構造解析の分野では、Ｘ線回折装置の高性能化、測定手法の発達など、周辺技術の発展にともない、測定精度が向上し、測定に要する時間も大幅に短縮されているが、現状の構造解析では、マニュアル作業が含まれるため、扱えるタンパク質の数に制限があり、また、得られる回折データの質にも作業者による変動がある。

そこで、Ｘ線回折装置に結晶をマウントする際に用いるキャピラリー内部でタンパク質を結晶化させる試みがなされている［非特許文献１］。
非特許文献１に開示された方法において、必要な回折分解能を有する結晶のスクリーニングを行うことを目的とし、直接キャピラリー内部にタンパク質溶液と結晶化試薬を注入し、混合することでタンパク質結晶を析出させる。
タンパク質結晶が析出した後、直接キャピラリーにＸ線を照射して、その回折分解能を評価することができる。
しかしながら、回折実験条件が室温に限定されているため、回折データセットの収集が困難である。

クライオ条件下で、キャピラリーを用いて回折データセットを収集する方法が報告されている［非特許文献２］。
非特許文献２に開示された方法において、キャピラリー内部にクライオプロテクタント溶液を注入した後、マニュアルでタンパク質をキャピラリー内部にマウントする。そのため、クライオループで結晶を拾う際に、タンパク質結晶に損傷を与える可能性がある。

Bo Zheng et al., Angew, Chem. Int. Ed. 2004, 43, 2508-2511 Min Yao et al., Acta Cryst. (2004). D60, 39-45

本発明は、作業者が結晶に一切触れることなく、結晶化、クライオプロテクタント処理、回折データ収集までの一連の工程を全てキャピラリー内部で行う方法およびその方法に適したキャピラリーを提供する。

本発明は、注入口、測定領域および絞り領域を含み、前記絞り領域は、Ｘ線回折測定に適した直径を有する結晶がキャピラリー内部から流出することを防止できる幅の流路を形成しているキャピラリーを提供する。

本発明のキャピラリーの絞り領域の構造は、Ｘ線回折測定に適した直径を有する結晶がキャピラリー内部から流出することを防止できることを特徴とする。
この構造は、タンパク質結晶のＸ線回折測定に適した直径以下の幅の流路を有するが、この流路の形状は固定されていてもよいし、弁やスロットル機構などにより変化させることもできる。絞り領域がフレキシブルチューブにより構成されている場合、通常は、回折データ測定領域の内径と同一であるが、必要に応じて、フレキシブルチューブ外部に設けた装置により圧縮して、その断面形状を変形させて、流路幅を制御することもできる。

本発明のキャピラリーにおいて、前記測定領域の内径が０．３〜０．５ｍｍであれば、通常Ｘ線回折測定に用いるＸ線ビーム幅に適合しているため、結晶の位置調整が容易となる。

本発明のキャピラリーにおいて、前記測定領域の材質がガラスまたはポリスチレンであれば、通常Ｘ線回折測定に用いるＸ線源から質の高い回折データを得ることができる。

本発明のキャピラリーにおいて、前記絞り領域の流路の幅が０．０５ｍｍ以上かつ前記測定領域の内径未満であれば、直径０．０５ｍｍ以上の結晶を流出させることなく、キャピラリー内部の溶液を入れ替えることができる。

本発明は、上記のキャピラリーを用い、
前記注入口からキャピラリー内部に、測定対象のタンパク質を含有するタンパク質溶液および前記タンパク質を結晶化するための結晶化溶液を注入し、キャピラリー内部で、Ｘ線回折測定に適した直径を有するタンパク質の結晶を析出させる工程；
前記結晶の析出後、前記結晶を保持しつつ、前記タンパク質溶液および前記結晶化溶液を前記絞り領域を介して排出する工程；
前記絞り領域からクライオプロテクタント溶液を吸引して、前記結晶を前記クライオプロテクタント溶液に接触させる工程；および
前記クライオプロテクタント溶液を前記絞り領域を介して排出する工程
を含むことを特徴とする、Ｘ線結晶構造解析用のタンパク質結晶試料の調製方法を提供する。

本発明の調製方法によれば、結晶化から回折データ収集までの一連の工程を全てキャピラリー内部で行うことができるので、作業者の技術や経験を必要とせず、一定の品質の回折データを収集することができる。

本発明の方法を用いれば、作業者が直接結晶に接触することがないため、結晶に損傷を与えることがなく、良質の回折データを迅速に収集することが可能である。
また、結晶をマニュアルで操作する工程がないため、結晶化から回折データ収集までを完全に自動化することができる。
さらに、本発明の方法を用いれば、同一の結晶について室温条件下およびクライオ条件下で回折データを得ることができるので、信頼性の高い回折データセットを得ることができる。

本発明の方法における、結晶化から回折データセット収集までの工程を説明する。
（結晶化および回折確認）
本発明の方法において、タンパク質の結晶化に使用するキャピラリーは、Ｘ線を照射して回折データ測定を行う測定領域および測定領域の内径よりも小さい内径を有する絞り領域を含むことを特徴とする。
本発明に用いるキャピラリーの測定領域の内径および長さは、測定対象であるタンパク質溶液の量、結晶化溶液の量によって異なるため、厳密に制限されないが、キャピラリー径は、使用するＸ線ビーム幅に合わせることが好ましい。例えば、Ｘ線ビーム幅が０．３ｍｍである場合、それよりも太い内径のキャピラリーを用いると、Ｘ線ビームに対する結晶の厳密なセンタリングが必要となるが、０．３ｍｍ径のキャピラリーを用いれば、キャピラリーの直径方向のセンタリングが不要となる。
キャピラリーの長さ方向のセンタリングは、キャピラリー内部に注入した溶液を移動させることにより行う。溶液の移動は様々な公知技術により達成することができる。

キャピラリーの測定領域でタンパク質の結晶が析出した後、タンパク質溶液と結晶化溶液を排出し、クライオプロテクタント溶液と入れ替える。この際に、回折測定に適した結晶を流出させないことを目的として、上記絞り領域が設けられる。
回折測定に適した結晶は、直径０．０５ｍｍ以上であることが好ましいが、測定装置の性能、測定の目的に応じて、直径０．０５ｍｍ以下の結晶を用いることもできる。
クライオ条件下での測定を行うため、結晶が大きくなると、冷却に時間がかかり、結晶内部で氷晶が成長し、結晶を破壊することがあり、また、結晶部位ごとに温度変化が生じると、測定精度にも影響がある。したがって、大きすぎる結晶は測定に適しない。直径０．５ｍｍ程度を超えない結晶を用いることが好ましい。
例えば、適当な結晶の直径を０．０５ｍｍ以上とする場合、絞り領域の内径を直径０．０５ｍｍとする。これにより、直径０．０５ｍｍ未満の結晶はキャピラリーから流出し、直径０．０５ｍｍ以上の結晶に付着することを防止でき、これにより分解能の高い回折データを得ることができる。

絞り領域の構造は、タンパク質結晶のＸ線回折測定に適した直径以下の幅の流路を有するが、測定対象とする結晶の直径の設定により、絞り領域の流路幅は変化する。この流路の形状は固定されていてもよいし、弁やスロットル機構などにより変化させることもできる。絞り領域がフレキシブルチューブにより構成されている場合、通常は、回折データ測定領域の内径と同一であるが、必要に応じて、フレキシブルチューブ外部に設けた装置により圧縮して、その断面形状を変形させて、流路幅を制御することもできる。
Ｘ線回折測定の自動化を達成するためには、絞り領域の内径を制御できる機構であることが好ましい。
また、本発明は、自動化されていない現行のＸ線回折測定装置に適用させるため、キャピラリーをマニュアルでゴニオメータヘッドにマウントすることもできる。この場合には、絞り領域の内径が固定されていてもよい。

本発明のキャピラリーの材質は、少なくとも測定領域がＸ線回折測定に用いるＣｕ、Ｎｉ、Ｃｒ、ＭｏなどのＸ線源からのＸ線に影響を及ぼさず、高い品質の回折データを得ることができれば、特に制限はない。
タンパク質のＸ線回折測定には通常ＣｕＫα線を用いるので、石英やボロシリケートなどのガラス製のキャピラリーが好ましい。ＭｏＫα線を用いる場合、ポリスチレンでキャピラリーを作製してもよい。

マニュアルでゴニオメータヘッドにマウントする場合に用いることができるキャピラリーの概略図を図１に示す。
市販のガラス製キャピラリー（ハンプトンリサーチ社）を加工して本発明のキャピラリーとすることができる。このキャピラリー１は、タンパク質溶液や結晶化溶液を注入するための注入口１１、Ｘ線回折測定を行うための測定領域１２およびＸ線回折測定に適した大きさの結晶の流出を防止するための絞り領域１３を含む。
この図において、タンパク質溶液や結晶化溶液の注入を容易にするため、注入口１１の内径は測定領域１２よりも大きく設計されているが、Ｘ線回折装置にマウントすることができれば、その内径や形状は特に制限されない。
キャピラリー１の測定領域１２の内径は、Ｘ線回折測定に用いるＸ線のビーム幅に依存し、通常のビーム幅が０．３〜０．５ｍｍであるため、０．３〜０．５ｍｍが好ましい。測定領域１２の長さは、Ｘ線回折装置にマウントすることができれば、特に制限されない。
この図において、キャピラリー先端が絞り領域１３に相当し、キャピラリー先端を加熱して、口径を０．０５ｍｍに加工している。キャピラリー１の絞り領域１３の内径は、回折測定に適した結晶の大きさに依存し、その大きさは測定装置の性能、測定の目的に依存する。回折測定に適した結晶の大きさは、直径０．０５ｍｍから直径０．５ｍｍ程度であるので、キャピラリー１の絞り領域１３の内径は、０．０５〜０．５ｍｍであることが好ましい。

まず、タンパク質溶液および結晶化溶液をキャピラリー１の注入口１１からその内部に入れ、その中で混合する（図２ａ）。シリンジを用いて、注入口１１からグリスなどの粘稠な物質３を注入し、タンパク質を含む混合溶液２を結晶化位置、すなわち、測定領域１２に移動させる（図２ｂ）。結晶４の析出が確認できれば（図２ｃ）、そのままＸ線回折装置６のゴニオメータヘッド６１にキャピラリー１をマウントし、Ｘ線６２を照射し、回折Ｘ線６３を検出器６４で検出することによって、室温での回折測定を行う（図４）。

（クライオプロテクタント処理および回折データセット収集）
室温での回折測定で構造解析に十分な回折分解能が確認できれば、結晶のクライオプロテクタント処理を行う（図３）。
キャピラリー１の内部にさらにグリス３を注入して、タンパク質溶液および結晶化溶液の混合溶液２をキャピラリー先端（絞り領域１３）から排出する（図３ａ）。キャピラリー先端の口径が０．０５ｍｍであるので、このとき、直径０．０５ｍｍ未満の結晶が流出するが、それ以上の大きさの結晶はキャピラリー内部に残留する。
次に、シリンジでキャピラリー内部のグリス３を吸引して、キャピラリー先端からクライオプロテクタント溶液５を結晶４のある位置まで吸い込む（図３ｂ,ｃ）。
その後、シリンジでグリス３を注入し、クライオプロテクタント溶液５をキャピラリーから排出する（図３ｄ）。このとき、目的のタンパク質結晶がキャピラリー先端付近に流された場合、少量のフルオリナート、オイルまたはクライオプロテクタント溶液５を結晶４の位置まで吸い上げた後、結晶４と共に液体を移動させることによって、その結晶位置を調節する（図３ｅ）。
クライオプロテクタント処理後、低温窒素ガスを低温ガス吹き付け装置６５から吹き付けることによってキャピラリー１をフラッシュクーリングし、回折装置のゴニオメータヘッド６１にマウントし、回折データセット収集を行う（図４）。

本発明の方法の有用性を確認するため、高度好熱菌Thermus thermophilus HB8由来ＴＴＨＢ０４９タンパク質を用いて、Ｘ線回折測定を行った。ＴＴＨＢ０４９タンパク質は、２．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス塩酸バッファー、ｐＨ８．３の条件下で結晶が析出する。
本実施例において、回折測定は、株式会社リガク製のＣｕＫα回折装置を用いて行った。そのＸ線ビーム幅は０．３ｍｍであるため、測定領域の内径が０．３ｍｍの市販のボロシリケート製キャピラリー（製品番号ＨＲ６−１０８，ハンプトン社製）を用いた。

最初に、キャピラリーの先端を加熱して、口径を約０．０５ｍｍに加工した。次に、キャピラリー内部に、１μＬのタンパク質溶液（タンパク質濃度２１．８８ｍｇ／ｍＬ）および１．０μＬの結晶化溶液（２．７５Ｍ塩化ナトリウム、０．１Ｍトリス塩酸バッファー、ｐＨ８．３）を充填した。
キャピラリー内部にグリスを注入して、タンパク質溶液を回折測定領域である結晶化位置まで移動させた。１８℃にて静置して一週間後、キャピラリー内部に結晶が析出していることを確認した。このときの結晶の直径は、約０．２ｍｍであった。その他、０．０５ｍｍ以下の微小な結晶も多数析出していた。
ここで、通常は、室温での測定を行い、タンパク質結晶の回折分解能を評価するが、今回用いたタンパク質結晶の回折分解能はすでに評価されているため、今回は実施しなかった。

結晶析出後、さらにグリスを注入することによって、タンパク質溶液をキャピラリーから排出し、その後、グリスをシリンジで吸入することによって、キャピラリー先端からクライオプロテクタント溶液（結晶化溶液に３０％グリセロールを添加したもの）をキャピラリー内部の結晶位置まで吸い込んだ。結晶のクライオプロテクタント処理が完了した後、グリスをキャピラリー内部に注入することによって、クライオプロテクタント溶液を排除した。
キャピラリーに低温窒素ガス（１００Ｋ）によるフラッシュクーリングを行い、回折測定装置のゴニオメータヘッドにマウントした。
クライオ条件下で行った回折測定の結果を表１に示した。

本発明の方法を用いたことにより、タンパク質結晶に直接触れることがなく、構造解析に十分な回折分解能である２．０Åのデータを収集することができた。

従来のように、プレート上で直径が約０．２ｍｍの結晶を析出させ、クライオループを用いて、キャピラリーに移し、このキャピラリーをＸ線回折装置にマウントして、Ｘ線回折測定を行った場合、回折データ処理ができないことが多く、細心の注意を払って、結晶を操作しなければ、良質の回折データを収集することができなかった。

本発明のキャピラリーの一つの具体例の概略図。 本発明によるタンパク質結晶の調製方法を説明する概略図。 本発明によるクライオプロテクタント処理を説明する概略図。 Ｘ線回折装置にキャピラリーをマウントした状態を示す概略図。

符号の説明

１・・・Ｘ線回折測定用キャピラリー
１１・・・注入口
１２・・・測定領域
１３・・・絞り領域
２・・・タンパク質溶液および結晶化溶液
３・・・グリス
４・・・結晶
５・・・クライオプロテクタント溶液
６・・・Ｘ線回折装置のマウント部分
６１・・・ゴニオメータヘッド
６２・・・入射Ｘ線
６３・・・回折Ｘ線
６４・・・検出器
６５・・・低温ガス吹き付け装置

Claims (8)

1. 注入口、測定領域および絞り領域を含み、前記絞り領域は、Ｘ線回折測定に適した直径を有する結晶がキャピラリー内部から流出することを防止できる幅の流路を形成しているキャピラリー。
2. 前記測定領域の内径が０．３〜０．５ｍｍである請求項１に記載のキャピラリー。
3. 前記測定領域の材質が、ガラスまたはポリスチレンである請求項１または２に記載のキャピラリー。
4. 前記絞り領域の流路の幅が０．０５ｍｍ以上かつ前記測定領域の内径未満である請求項１〜３いずれかに記載のキャピラリー。
5. 注入口、測定領域および絞り領域を含み、前記絞り領域は、Ｘ線回折測定に適した直径を有する結晶がキャピラリー内部から流出することを防止できる幅の流路を形成しているキャピラリーを用い、
   前記注入口からキャピラリー内部に、測定対象のタンパク質を含有するタンパク質溶液および前記タンパク質を結晶化するための結晶化溶液を注入し、キャピラリー内部で、Ｘ線回折測定に適した直径を有するタンパク質の結晶を析出させる工程；
   前記結晶の析出後、前記結晶を保持しつつ、前記タンパク質溶液および前記結晶化溶液を前記絞り領域を介して排出する工程；
   前記絞り領域からクライオプロテクタント溶液を吸引して、前記結晶を前記クライオプロテクタント溶液に接触させる工程；および
   前記クライオプロテクタント溶液を前記絞り領域を介して排出する工程
   を含むことを特徴とする、Ｘ線結晶構造解析用のタンパク質結晶試料の調製方法。
6. 前記測定領域の内径が０．３〜０．５ｍｍである請求項５に記載の調製方法。
7. 前記測定領域の材質が、ガラスまたはポリスチレンである請求項６または７に記載の調整方法。
8. 前記絞り領域の流路の幅が０．０５ｍｍ以上かつ前記測定領域の内径未満である請求項５〜７いずれかに記載の調製方法。

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