JP2008231125A - 改変型TGF−βスーパーファミリータンパク質 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】N末端短縮化TGF−βファミリータンパク質を含む、適切なリフォールディング条件下でリフォールドさせるための、潜在性TGF−βファミリーメンバー融合タンパク質の成分であって、該短縮化TGF−βファミリータンパク質は、フィンガー1サブドメイン、フィンガー2サブドメイン、およびヒールサブドメインを含む、TGF−βファミリータンパク質C末端7システインドメイン;および該C末端ドメインに作動可能に連結された切断可能な改変型リーダー配列であって、該リーダー配列は、該C末端ドメインと関連する生物学的活性を阻害し、該C末端ドメインは、該リーダー配列の一部または全ての切断の際に活性化する、リーダー配列を含む、融合タンパク質。
【選択図】なし
Description
本発明は、改良されたリフォールディング特性、改良された物理的特性(例えば、溶解性および安定性)、改良された生物学的活性(改変されたレセプター結合、改良された標的化能力を含む)を有する組換えタンパク質、潜在性形態のタンパク質、およびこのようなタンパク質を生成する方法に関する。より詳細には、本発明は、TGF−βスーパーファミリーの構造的に関連したタンパク質の生合成メンバーに関する。このような改変型タンパク質構築物は、N末端短縮、「潜在性」タンパク質、融合タンパク質およびヘテロ二量体を有するTGF−βファミリーメンバータンパク質を含む。
TGF−βスーパーファミリーは、TGF−βの5個の異なる形態(SpornおよびRoberts(1990)、Peptide Growth Factors and Their Receptors、SpornおよびRoberts編、Springer−Verlag:Berlin、419−472頁)、ならびに分化因子Vg−1(WeeksおよびMelton(1987)、Cell 51:861−867)、DPP−Cポリペプチド(Padgettら(1987)Nature 325:81−84)、ホルモンアクチビンおよびインヒビン(inhibin)(Masonら(1985)、Nature 318:659−663;Masonら(1987)、Growth Factors 1:77−88)、Mullerian阻害物質、MIS(Cateら(1986)、Cell 45:685−698)、骨形成タンパク質および形態形成タンパク質OP−1(PCT/US90/05903)、OP−2(PCT/US91/07654)、OP−3(PCT/WO94/10202)、BMP(米国特許第4,877,864号;同第5,141,905号;同第5,013,649号;同第5,116,738号;同第5,108,922号;同第5,106,748号;および同第5,155,058号を参照のこと)、発生的に調節されるタンパク質VGR−1(Lyonsら(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:4554−4558)、軟骨由来成長因子CDMP−1、CDMP−2およびCDMP−3(またはGDF−5、GDF−6およびGDF−7)、ならびに成長/分化因子GDF−1、GDF−3、GDF−9、およびドーサリン(dorsalin)−1(McPherronら(1993)、J.Biol.Chem.268:3444−3449;Baslerら(1993)、Cell 73:687−702)を含む。
フィンガー1サブドメイン、フィンガー2サブドメイン、およびヒールサブドメインを含む、TGF−βファミリータンパク質C末端7システインドメイン;および
該C末端ドメインに作動可能に連結された異種リーダー配列ドメイン;
を含み、融合タンパク質。
(項目2) 項目1に記載の融合タンパク質であって、ここで前記リーダー配列は、組織標的ドメイン、分子標的ドメイン、金属結合ドメイン、タンパク質結合ドメイン、セラミック結合ドメイン、ヒドロキシアパタイト結合ドメイン、およびコラーゲン結合ドメインからなる群から選択される、融合タンパク質。
(項目3) 前記組織標的ドメインが、骨基質タンパク質に結合する、項目2に記載の融合タンパク質。
(項目4) 前記組織標的ドメインが、細胞表面分子に結合する、項目2に記載の融合タンパク質。
(項目5) 前記細胞表面分子が、前骨芽細胞または軟骨細胞上にある、項目4に記載の融合タンパク質。
(項目6) 適切なリフォールディング条件下でリフォールドさせるための、潜在性TGF−βファミリーメンバー融合タンパク質であって、該短縮化TGF−βファミリータンパク質は、以下:
フィンガー1サブドメイン、フィンガー2サブドメイン、およびヒールサブドメインを含む、TGF−βファミリータンパク質C末端7システインドメイン;および
該C末端ドメインに作動可能に連結された切断可能な改変型リーダー配列であって、該リーダー配列は、該C末端ドメインと関連する生物学的活性を阻害し、そして該C末端ドメインは、該リーダー配列の一部または全ての切断の際に活性化する、リーダー配列;
を含む、融合タンパク質。
(項目7) 項目6に記載の融合タンパク質であって、組織標的ドメインが、前記切断可能なリーダー配列の内部に存在し、それにより該リーダー配列の切断によって、該組織標的ドメインが前記C末端ドメインから切断されない、融合タンパク質。
(項目8) 前記リーダー配列が、前記C末端ドメインから少なくとも7残基は分離されている、項目1または6に記載の融合タンパク質。
(項目9) 前記リーダー配列が、別のTGF−βファミリータンパク質に由来する、項目1に記載の融合タンパク質。
(項目10) 適切なリフォールディング条件下でリフォールドさせる能力のある、生物学的に活性なTGF−βファミリーメンバー融合タンパク質変異体であって、該融合タンパク質は、以下:
フィンガー1サブドメイン、フィンガー2サブドメイン、およびヒールサブドメインを含む、TGF−βファミリーメンバータンパク質C末端7システインドメイン;および
該C末端ドメインに作動可能に連結されるリーダー配列ドメインであって、それによって、該リーダー配列の一部または全てが短縮化される、リーダー配列;
を含み、
ただし、該潜在性TGF−βファミリーメンバー融合タンパク質は、TGF−β1、TGF−β2、またはTGF−β3の該C末端7システインドメインを含まなくても良い、融合タンパク質変異体。
(項目11) 前記短縮が、プロテアーゼ切断によって実施される、項目10に記載のタンパク質変異体。
(項目12) 前記プロテアーゼが、トリプシンである、項目11に記載のタンパク質変異体。
(項目13) 前記短縮が、化学切断によって実施される、項目10に記載の融合タンパク質変異体。
(項目14) 前記化学切断が、酸切断である、項目13に記載の融合タンパク質。
(項目15) 前記リーダー配列の少なくとも1つの塩基性残基が、取り除かれる、項目10に記載のタンパク質変異体。
(項目16) 前記タンパク質変異体が、本質的に、配列番号69のアミノ酸配列からなる、項目10に記載の融合タンパク質。
(項目17) 生物学的に活性なTGF−βファミリーメンバータンパク質のヘテロ二量体であって、以下:
TGF−βファミリーメンバー融合タンパク質である第1のサブユニット;および
第2のサブユニットであって、該第1のサブユニットの融合タンパク質とは異なるTG
F−βファミリーメンバー融合タンパク質および野生型TGF−βファミリタンパク質からなる群より選択される、第2のサブユニット
を含む、ヘテロ二量体。
(項目18) 前記野生型TGF−βファミリータンパク質が、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、TGF−β4、TGF−β5、dpp、Vg−1、Vgr−1、60A、BMP−2A、BMP−3、BMP−4、BMP−5、BMP−6、ドーサリン、OP−1、OP−2、OP−3、GDF−1、GDF−3、GDMP−1/GDF−5、CDMP−2/GDF−6、GDF−7、GDF−9、インヒビンα、インヒビンβA、およびインヒビンβBからなる群から選択される、項目16に記載のヘテロ二量体。
(項目19) TGF−βファミリータンパク質のヘテロ二量体を精製する方法であって、該方法は、以下:
(a)第1のTGF−βファミリータンパク質サブユニットを提供する工程;
(b)該第1のサブユニットとは異なる第2のTGF−βファミリータンパク質サブユニットを提供する工程;
(c)適切なリフォールディング条件下で、該第1のサブユニットおよび該第2のサブユニットを混合して、以下
(i)2つの該第1のTGF−βファミリータンパク質サブユニットを含む、第1のホモ二量体;
(ii)2つの該第2のTGF−βファミリータンパク質サブユニットを含む、第2のホモ二量体;ならびに
(iii)1つの該第1のTGF−βファミリータンパク質サブユニット、および1つの該第2のTGF−βファミリータンパク質サブユニットを含む、ヘテロ二量体;
を含む混合物を生成する、工程であって、
ここで、該へテロ二量体は、該第1のホモ二量体および該第2のホモ二量体から分離可能である、工程;ならびに
(d)該へテロ二量体を、該第1のホモ二量体および該第2のホモ二量体から、分離する、工程、
を含む、方法。
本発明は、C末端活性ドメインのN末端側でのN末端伸長、短縮および他の改変を含む、改変TGF−βファミリータンパク質を提供する。本発明の改変タンパク質は、組換え的に発現される場合に、天然に存在するタンパク質に対して変更されたリフォールディング特性および変更された可溶性を有する。本発明の改変タンパク質はまた、変更された活性プロフィール(増強された特異位的活性を含む)を有し、そして組織特異的標識化または特異的表面結合への影響を受けやすい。
A Laboratory Manual、第2版、Sambrook、Fritsch、およびManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989);DNA Cloning、第1巻および第II巻(D.N.Glover編、1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984):Nucleic Acid Hybridization(B.D.HamesおよびS.J.Higgins編、1984);ならびにB.Perbal、A
Practical Guide To Molecular Cloning(1984)を参照のこと。上記の開示は、本明細書中で参考として援用される。米国特許第5,750,651号、および同第5,863,758号もまた参照のこと。これらの開示は本明細書中で参考として援用される。
本発明は、天然の形態と比較して、変化したリフォールディング特性、および変化した活性プロフィールを有する、改変形態のTGF−βファミリータンパク質を提供する。本発明の改変タンパク質は、天然に存在するTGF−βファミリーメンバー(特に、形態形成タンパク質)のN末端改変を含む。これらの改変は、伸長、短縮、および/または特定の部位でのプロテアーゼ切断または化学切断(例えば、酸またはCNBrによる)による活性化、異なるタンパク質ドメインの結合(融合)ならびに他のTGF−βファミリーメンバー由来のサブユニットとのヘテロダイマーの生成を含む。以下に提供する詳細な説明は、改善した活性および薬学的特性を生じる、多数の例示的な、置換、融合、および伸長を記載する。改変タンパク質を生成する方法もまた、教示する。
(A.TGF−β2およびOP−1の構造的特徴)
TGF−β2またはOP−1のいずれかの中のサブユニット各々は、特徴的なフォールディングパターン(図1Aに模式的に例示される)を有する。このパターンは、7個のC末端のシステイン残基のうちの6個を含む。簡潔には、各サブユニット中のシステイン残基のうちの4つが2つのジスルフィド結合を形成し、これらは互いに8残基の環を作製する。一方、2つのさらなるシステイン残基が、結び目様の構造を形成するように環を通過する、ジスルフィド結合を形成する。7個の保存されているシステイン残基のうちの最もN末端のシステイン(番号1を割り当てられる)で開始する番号付けスキームを用いると、2番目および6番目のシステイン残基が、8残基の環の1つの側面を閉じるようにジスルフィド結合し、一方、3番目および7番目のシステイン残基が、この環の他の側面を閉じるようにジスルフィド結合する。1番目および5番目の保存されているシステイン残基は、この結び目のコアを形成するように、この環の中心を通ってジスルフィド結合する。アミノ酸配列の整列のパターンは、この構造モチーフが、TGF−βスーパーファミリーのメンバーの間で保存されていることを示唆する。4番目のシステインは半保存されており、そして存在する場合には、代表的に、他のサブユニット中の対応するシステイン残基と鎖間ジスルフィド結合(ICDB)を形成する。
フィンガー領域およびヒール領域を規定するアミノ酸配列が、本明細書中で同定された、TGF−βスーパーファミリーの既知の任意のメンバーの、それぞれのフィンガー領域の配列およびヒール領域の配列に由来し得るか、または、本明細書中で以後に発見される新規のスーパーファミリーのメンバーのアミノ酸配列に由来するものが、利用され得ることが、意図される。
TGF−β1 配列番号40、残基2から29、
TGF−β2 配列番号41、残基2から29、
TGF−β3 配列番号42、残基2から29、
TGF−β4 配列番号43、残基2から29、
TGF−β5 配列番号44、残基2から29、
dpp 配列番号45、残基2から29、
Vg−1 配列番号46、残基2から29、
Vgr−1 配列番号47、残基2から29、
60A 配列番号48、残基2から29、
BMP−2A 配列番号49、残基2から29、
BMP−3 配列番号50、残基2から29、
BMP−4 配列番号51、残基2から29、
BMP−5 配列番号52、残基2から29、
BMP−6 配列番号53、残基2から29、
Dorsalin 配列番号54、残基2から29、
OP−1 配列番号55、残基2から29、
OP−2 配列番号56、残基2から29、
OP−3 配列番号57、残基2から29、
GDF−1 配列番号58、残基2から29、
GDF−3 配列番号59、残基2から29、
GDF−9 配列番号60、残基2から29、
インヒビンα 配列番号61、残基2から29、
インヒビンβA 配列番号62、残基2から29、
インヒビンβB 配列番号63、残基2から29、
CDMP−1/GDF−5 配列番号83、残基2から29、
CDMP−2/GDF−6 配列番号84、残基2から29、
GDF−6(マウス) 配列番号85、残基2から29、
CDMP−2(ウシ) 配列番号86、残基2から29、および
GDF−7(マウス) 配列番号87、残基2から29。
TGF−β1 配列番号40、残基35から62、
TGF−β2 配列番号41、残基35から62、
TGF−β3 配列番号42、残基35から62、
TGF−β4 配列番号43、残基35から62、
TGF−β5 配列番号44、残基35から62、
dpp 配列番号45、残基35から65、
Vg−1 配列番号46、残基35から65、
Vgr−1 配列番号47、残基35から65、
60A 配列番号48、残基35から65、
BMP−2A 配列番号49、残基35から64、
BMP−3 配列番号50、残基35から66、
BMP−4 配列番号51、残基35から64、
BMP−5 配列番号52、残基35から65、
BMP−6 配列番号53、残基35から65、
Dorsalin 配列番号54、残基35から65、
OP−1 配列番号55、残基35から65、
OP−2 配列番号56、残基35から65、
OP−3 配列番号57、残基35から65、
GDF−1 配列番号58、残基35から70、
GDF−3 配列番号59、残基35から64、
GDF−9 配列番号60、残基35から65、
インヒビンα 配列番号61、残基35から65、
インヒビンβA 配列番号62、残基35から69、
インヒビンβB 配列番号63、残基35から68、
CDMP−1/GDF−5 配列番号83、残基35から65、
CDMP−2/GDF−6 配列番号84、残基35から65、
GDF−6(マウス) 配列番号85、残基35から65、
CDMP−2(ウシ) 配列番号86、残基35から65、および
GDF−7(マウス) 配列番号87、残基35から65。
TGF−β1 配列番号40、残基65から94、
TGF−β2 配列番号41、残基65から94、
TGF−β3 配列番号42、残基65から94、
TGF−β4 配列番号43、残基65から94、
TGF−β5 配列番号44、残基65から94、
dpp 配列番号45、残基68から98、
Vg−1 配列番号46、残基68から98、
Vgr−1 配列番号47、残基68から98、
60A 配列番号48、残基68から98、
BMP−2A 配列番号49、残基67から97、
BMP−3 配列番号50、残基69から99、
BMP−4 配列番号51、残基67から97、
BMP−5 配列番号52、残基68から98、
BMP−6 配列番号53、残基68から98、
Dorsalin 配列番号54、残基68から99、
OP−1 配列番号55、残基68から98、
OP−2 配列番号56、残基68から98、
OP−3 配列番号57、残基68から98、
GDF−1 配列番号58、残基73から103、
GDF−3 配列番号59、残基67から97、
GDF−9 配列番号60、残基68から98、
インヒビンα 配列番号61、残基68から101、
インヒビンβA 配列番号62、残基72から102、
インヒビンβB 配列番号63、残基71から101、
CDMP−1/GDF−5 配列番号83、残基68から98、
CDMP−2/GDF−6 配列番号84、残基68から98、
GDF−6(マウス) 配列番号85、残基68から98、
CDMP−2(ウシ) 配列番号86、残基68から98、および
GDF−7(マウス) 配列番号87、残基68から98。
ード)ならびに代替のアミノ酸(Xaa)の両方を含む。
(2)骨形態形成タンパク質の生化学的、構造的、および機能的特性)
その成熟の、ネイティブ形態において、天然に供給される骨形成タンパク質は、グリコシル化されたダイマーであり、代表的には、SDS−PAGEによって決定されるように、約30〜36kDaの見かけの分子量を有する。還元された場合、この30kDaタンパク質は、約16kDaおよび18kDaの見かけの分子量を有するグリコシル化されたペプチドサブユニットを生じる。還元状態において、そのタンパク質は、検出可能な骨形成活性を有さない。グリコシル化されていないタンパク質(これもまた骨形成活性を有する)は、約27kDaの見かけの分子量を有する。還元された場合、この27kDaタンパク質は、約14kDa〜16kDaの分子量を有する2つのグリコシル化されていないペプチド鎖を生じる。代表的には、天然に存在する骨形成タンパク質は、代表的には約30残基未満のN末端シグナルペプチド配列、続いて成熟C末端ドメインを生じるために切断される「プロ」ドメインを有する前駆体として翻訳される。そのシグナルペプチドは、翻訳に際して、Von Heijne(1986)Nucleic Acids Research 14:4683−4691の方法を使用して、所定の配列において予測され得る切断部位で迅速に切断される。本明細書中で有用な骨形成タンパク質は、天然に存在するか、または生合成的に産生される(例えば、「ムテイン」または「変異タンパク質」を含む)かに関わらず、任意の公知の天然に存在するネイティブなタンパク質(その対立遺伝子の系統学的な対応物、および他の改変体を含む)、ならびに、一般的な形態形成ファミリーのタンパク質の骨形成的に活性な新規のメンバーを含む。
上で述べたように、本発明の構築物は、当該分野において周知であり、そして徹底的に実証された従来の組換えDNA方法論の使用によって、ならびに慣用的なペプチド化学またはヌクレオチド化学および自動化したペプチド合成機またはヌクレオチド合成機を用いた周知の生合成の方法論および化学合成の方法論の使用によって、製造され得る。このような慣用的方法論は、例えば以下の出版物に記載され、その教示は本明細書中で参考として援用される:Hilvert,1
Chem.Biol.201−3(1994);Muirら,95 Proc.Natl.Acd.Sci.USA 6705−10(1998);Wallace,6 Curr.Opin.Biotechnol.403−10(1995);Mirandaら,96 Proc.Natl.Acd.Sci.USA 1181−86(1999);Liuら,91 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 6584−88(1994)。本発明中の使用に適したものは、天然に存在するアミノ酸およびヌクレオチド;天然には存在しないアミノ酸およびヌクレオチド;修飾されたアミノ酸および異常なアミノ酸;修飾された塩基;翻訳後に修飾されたアミノ酸および/または修飾された連結、架橋およびエンドキャップ、非ペプチジルボンド、などを含むアミノ酸配列であり、そして、付録2中の表1〜6を含むWorld Intellectual Property Organization(WIPO) Handbook on
Industrial Property Information and
Documentation,Standard St.25(1998)に開示された部分がさらに挙げられるが、これらに限定されない(これらは本明細書中で参考として援用される)。これらの等価物は、当該分野の知識と共に慣用的実験法のみに依存して、当業者によって評価され得る。
目的のアミノ酸配列をコードするDNAを製造し、増幅し、そして組換えるためのプロセスは、該して当該分野において周知であり、それゆえ、本明細書中に詳細には記載されない。TGF−βスーパーファミリーメンバーをコードする遺伝子および同族のレセプターを同定しそして単離する方法はまた、十分に理解されており、そして本特許および他の文献に記載される。
一旦封入体から単離されると、タンパク質は、グアニジン塩酸または尿素のような変性剤またはカオトロピック剤によって、好ましくは約4〜9Mの範囲でそして高い温度(例えば25〜37℃)および/または塩基性pH(8〜10)で可溶化される。あるいは、タンパク質は、酸性化によって(例えば、酢酸またはトリフルオロ酢酸を用いて)、一般に1〜4の範囲のpHで可溶化され得る。好ましくは、β−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール(DTT)のような還元剤が、可溶化剤と組合せて用いられる。この可溶化された異種のタンパク質は、透析によっておよび/または公知のカラムクロマトグラフィーの方法によって(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)などによって)、可溶化したカオトロープ(caotrope)からさらに精製され得る。
40)、CHAPS(3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパン−スルフェートのような)、ジギトニン、デオキシコレート、またはN−オクチルグルコシドのような、イオン性、非イオン性、または双性イオン性であり得る。有用なカオトロピック剤としては、グアニジン、尿素、またはアルギニンが挙げられる。好ましくは、界面活性剤またはカオトロピック剤は、約0.1〜10Mの範囲、好ましくは0.5〜4Mの範囲の濃度で存在する。CHAPSが界面活性剤の場合、これは、好ましくは溶液の約0.5〜5%、さらに好ましくは溶液の約1〜3%含まれる。好ましくは溶液はまた、少し例を挙げると酸化型および還元型のグルタチオン、DTT,β−メルカプトエタノール、β−メルカプトメタノール、システインまたはシスタミンのような適切な酸化還元系を含む。好ましくは、酸化還元系は、還元剤対酸化剤の比が約1:1から約5:1の範囲で存在する。グルタチオン酸化還元系が用いられる場合、還元型グルタチオン対酸化型グルタチオンの比は、還元型対酸化型が好ましくは約0.5対5;さらに好ましくは1対1;そして最も好ましくは2対1の範囲である。好ましくは緩衝液はまた、約0.25〜2.5Mの範囲、好ましくは約0.5〜1.5Mの範囲、最も好ましくは約1Mの範囲にて存在する塩(代表的にはNaCl)を含む。当業者は、上記の条件および媒体が、通常の実験法のみを用いて変化され得ることを認識する。このような変動および改変は、本発明の範囲内である。
生じたキメラタンパク質は、インビボの事象を増強、阻害またはそうでなければ調節をするための治療の一部として個体に提供され得、その事象としては、TGF−βスーパーファミリーメンバーと1つ以上のその同族レセプターとの間の結合相互作用が挙げられるが、これに限定されない。下記のように、この構築物は薬学的組成物に処方され得、そして任意の適切な手段(好ましくは、直接または全身的に、例えば、非経口的または経口的に)よって、形態形成的に有効な量において投与され得る。好ましいキメラタンパク質をコードする、生じたDNA構築物はまた、遺伝子治療の目的のために、レシピエントに直接投与され得、このようなDNAは、キャリア成分を伴うか、もしくは伴わずに、またはマトリクス成分を伴うか、もしくは伴わずに投与され得る。あるいは、このようなDNA構築物を移入された細胞は、レシピエントに移植され得る。このような物質および方法は、当該分野において周知である。
腺ホルモン、デキサメサゾン、エストロゲン、およびIGF−IまたはIGF−IIが挙げられるが、これらに限定されない。神経組織の修復および再生のために有用な補因子は、神経増殖因子を含み得る。他の有用な補因子は、症状軽減補因子(symptom alleviating cofactor)が挙げれ、これには防腐剤、抗生物質、抗ウイルス剤および抗真菌剤ならびに鎮痛剤および麻酔薬が含まれる。
一般的に、本発明は、以下の4つの型の改変TGF−βファミリータンパク質構築物に関する:(1)N末端領域で短縮化されたTGF−βファミリータンパク質、(2)切断に際して活性化((例えば、酸切断またはプロテアーゼ処理による)N末端配列の放出を含むが、これに限定されない)され得る「潜伏性」タンパク質、(3)特定の結合能力を有する融合タンパク質、および(4)天然に存在するかまたは改変された、TGF−βファミリーのメンバーのサブユニットからなるヘテロ二量体。これらのモルフォゲン構築物の特定の種を、以下で詳細に記載する。以下に例証される種は、一般的に、改変モルフォゲンまたは骨原性タンパク質構築物に関するが、当業者は、これらの構築物が、TGF−βスーパーファミリーの他のメンバーを用いて生成され得る類似の構築物の代表であることを理解する。
(A.短縮化(truncation))
種々の形態のOP−1(例えば、23k、17k、および変動する量の15k)が存在し、それにより、代表的なOP−1調製物はこれらのすべての種を含む。精製された成熟OP−1のN末端配列決定は、異質性を明らかにした。このことは、N末端が多少短縮化され得ることを示す。RP−HPLCからの溶出およびトリプシン切断により回収された種を用いた実験を通して、ROS活性は、15kの種の中で最高である。例えば、短縮化変異体H2469は、CHO由来のOP−1標準と比較して、比較的高い活性を有する。最初の成熟は、プロOP−1においてRXXR部位で生じて17k種を生じるが、異なるプロテアーゼによる二次成熟は、最も活性な15k種を生成する。トリプシン切断は、この二次活性化を模擬し得る。
本発明のさらなる改変タンパク質は、モルフォゲンの7−システインドメインのN末端に融合された非モルフォゲン起源のペプチドを含む。例えば、図7A〜7Eを参照のこと。生じるN末端融合タンパク質は、この融合物が由来する未改変モルフォゲンにおいては存在しないさらなる生物学的または生化学的な特性を有する。この型の融合物は、そのN末端でタンパク質またはタンパク質フラグメント(例えば、コラーゲン結合ドメイン、プロテインAのFBドメイン、またはヘキサ−ヒスチジン領域)に融合されたモルフォゲンの7−システインドメインを含む。例えば、H2440は、IMAC(固定化金属親和性クロマトグラフィー)樹脂のための結合ドメインとして、そのN末端に付着したヘキサ−hisタグを有するOP−1である(図7B)。このタンパク質は、最初はその非フォールディング状態で、尿素の存在下において、銅IMAC樹脂に対して精製された。IMAC上での非フォールディングタンパク質の精製、次ぐリフォールディングの後、首尾良くリフォールディングされた画分をRP−HPLCにより精製した。このようなN末端融合タンパク質は、ROSアッセイにおいて、ほとんどまたは全く活性を示さないが、N末端非モルフォゲンペプチドの切断に際して活性化されて、活性なC末端モルフォゲンドメインを産生する。
本発明はまた、OP−1のN末端の短縮は、タンパク質に負の影響を有さないので、N末端が融合タンパク質の溶解度および活性に影響し得る程度の驚くべき発見を利用する。さらに、OP−1の結晶構造は、N末端に関するどのような位相幾何学的情報も示さなかった。
リフォールディング、溶解性、活性および発現を変更するためのさらなる構築物が、1つのTGF−βスーパーファミリータンパク質のネイティブリーダー配列を、別のTGF−βファミリーメンバーのネイティブなリーダー配列で置換することにより設計され得る。例えば、構築物H2549は、OP−1上に置き換えられたBMP−2のN末端を有する。
上記のいくつかのN末端融合タンパク質モノマーは、リーダー配列の切断なしに活性なホモダイマーを形成しないが、活性なヘテロダイマーが、これらのタンパク質とTGF−βファミリータンパク質の未改変モノマーとの間で形成される。従って、このようなヘテロダイマーは、融合タンパク質に付着したN末端非TGF−βファミリータンパク質ドメイン(例えば、コラーゲン結合部位)によってタンパク質を標的部位に提供するために用いられ得る。あるいは、ヘテロダイマーの精製を増強するために設計特徴が用いられ得る。例えば、ヘキサヒスチジンを付加することにより、2種のサブユニットの間の精製の差異を強調することによって精製を容易にし得る。混合されたリフォールディングにより、2つのホモダイマーおよびヘテロダイマーの混合物を提供する。これは3つの分離可能な種を提供する。例えば、ヘキサ−ヒスチジンドメインを含むN末端融合タンパク質(例えば、図7Bに示されるH2440)
(これは、IMACカラムに結合する)は、N末端ドメインの切断により引き続いて活性化され得る融合タンパク質の精製を補助するために有用である。
本明細書中に教示されるように、本発明は、注文に応じた(customized)キメラタンパク質およびこのキメラタンパク質をコードするDNAを巧妙に作るノウハウを当業者に提供する。キメラタンパク質を特定のインビボでの適用に適切にする、特定の所望される特性を有するキメラタンパク質を設計する手段が、本明細書中にさらに教示および例示される(少なくともI.B.節、II節、およびIII節、前述のキメラタンパク質の例示的な実施態様についての実施例1〜4、8および11を参照のこと)。例えば、変化した溶解度という特性を有するキメラタンパク質は、レシピエントに提供される形態形成的有効量を操作するために、インビボで使用され得る。すなわち、溶解度の増大は、アベイラビリティーの増大を生じ得;溶解度の減少は、アベイラビリティーの減少を生じ得る。従って、このような全身投与されるキメラタンパク質は、即座に利用可能であり得、そして/または即効性の形態形成効果を有し得、一方、局所投与されたキメラタンパク質は、よりゆっくりと利用可能であり得/長期化した形態形成効果を有し得る。当業者は、手近な事実および状況を考慮して、減少した溶解度という特性に対して増大した溶解度という特性が好ましい場合を理解する。このようなパラメーターの最適化は、慣用的な実験法および通常の技能を必要とする。
図8は、OP−1のC末端の7つのシステインドメインのためのヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を示す。これらの配列を知ることにより、例えば、カセット変異誘発またはKunkelの周知の方法(ml3から派生した一本鎖の鋳型を使用するプライマー伸長による変異誘発)によって、または周知のPCR方法(重複伸長を含む)によって変異操作のための有用な制限部位の確認が可能になる。OP−1の例示的な変異体は、以下に記載のように構築される、フィンガー−2サブドメインにおいて4つのアミノ酸変化および最後のC末端アミノ酸において1つのアミノ酸変化を有する、H2460である。記載されている変異誘発プロトコルが例示のみであること、および本発明の構築物を作製するための他の手段は周知であり、当該技術分野において十分に記載されていることは当業者によって理解されている。
TCTAGAATAATTTTGTTTAACCTTTAAGAAGGAGATATACG ATG(配列番号75)。
CA)))にクローニングした。クローニングしたPCRフラグメントを、XbaIおよびBamHIを用いる制限消化によって回収し、Pet3d(Novagen Inc.(Madison WI))のような市販のT7発現ベクターのXbaIおよびBamHI部位に挿入した。
形質転換した細胞を、標準的培養条件下で、標準的SPYE 2YT培地、1:1比(例えば、Sambrookら、を参照のこと)中で、37℃で増殖した。異種タンパク質の過剰発現は、代表的には、8〜48の時間以内に封入体を生じた。封入体を、単離して、次のように可溶化した。1リットルの培養液を、細胞を集めるために遠心分離した。次いで、得られたペレット中の細胞を60mlの25mM Tris、10mM EDTA、pH 8.0(TE緩衝液)+100μg/mlのリゾチーム中に再懸濁し、そして、37℃で2時間インキュベートした。次いで、細胞懸濁液を、氷冷して、超音波処理して細胞を溶解させた。細胞溶解を、検鏡によって確認した。溶解物の体積を、TE緩衝液でほぼ300mlに調整した。次いで、封入体ペレットを得るために遠心分離した。このペレットを、TE緩衝液中の2〜4回の連続再懸濁および遠心分離によって洗浄した。洗浄した封入体ペレットを、40mlの100mM Tris、10mMのEDTA、6MのGuHCl(グアニジウム塩酸塩)、250mMのDTT、pH 8.8中での変性および還元により可溶化した。次いで、タンパク質を、標準的な、市販のC2またはC8カートリッジ(SPICEカートリッジ、400mg、Ananltech、Inc.)を用いて予め精製した。タンパク質溶液を2% TFA(トリフルオロ酢酸)で酸性化し、カートリッジに適用し、0.1% TFA/10%アセトニトリルで洗浄し、そして0.1%TFA/70%アセトニトリルで溶出した。次いで、溶出した物質を、乾燥するかまたは希釈して、C4 RP−HPLCによって分画した。
上記の通りに調製したタンパク質を、リフォールディング前に乾燥するかまたはリフォールディング緩衝液に直接希釈した。用いた好適なリフォールディング緩衝液は、以下であった:100mM Tris、10mM EDTA、1M NaCl、2% CHAPS、5mM GSH(還元グルタチオン)、2.5mM GSSG(酸化グルタチオン)、pH 8.5。リフォールディング(12.5〜200μgタンパク質/ml)を、24〜90時間、代表的には36〜48時間、4℃にて実行し(ただし、いくつかの変異体では、これより長い(数週間まで)と、良好なリフォールディングが提供されると予期される)、続いて、0.1% TFAに対して透析し、次いで0.01% TFA,50%エタノールに対して透析した。次いで、透析した材料のアリコートを種々のアッセイに備えて乾燥した。
(4A.SDS−PAGE、HPLC)サンプルを乾燥して、Laemmliゲルサンプル緩衝液において再懸濁して、次いで、15%のSDS−ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動した。全てのアッセイは、比較のための、分子量標準および/または哺乳動物細胞が産生した精製OP−1を含んだ。OP−1ダイマーの解析を、添加した還元剤の非存在下で実行した。一方で、OP−1モノマーをゲルサンプルへの100mMのDTTの添加によって生成した。フォールディングしたダイマーは約30〜36kDaの範囲のみかけの分子量を有する。一方で、モノマー種は、約14〜16kDaの見かけの分子量を有する。
本実施例は、本発明に従って骨原性能力または骨形成能力を獲得したモルフォゲン構築物の生物活性を実証する。高い特異的な骨形成活性についての生得の能力または獲得された能力のいずれかを有する骨原性タンパク質は、ラット骨肉腫細胞およびラット頭蓋冠(calveria)細胞を含むラット骨芽細胞においてアルカリホスファターゼ活性を誘導し得る。このアッセイにおいて、ラット骨肉腫または頭蓋冠細胞を、マルチウェルプレート(例えば、48ウェルプレート)の上へ、10%のFBS(ウシ胎仔血清)、L−グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含有するαMEM(改変イーグル培地、Gibco Inc.、Long Island)中で、1ウェルあたり50,000の骨芽細胞の濃度でプレートした。細胞を、37℃で24時間インキュベートした。この時点で、増殖培地を1%FBS含有αMEMで置換し、そしてこの細胞を、さらに24時間インキュベートし、その結果、この細胞は、実験のこの時点で血清枯渇増殖培地中にあった。
本実施例は、本発明に従って増強された組織形態形成能力を獲得した構築物のの生物活性を実証する。ネイティブなCDMPは、実施例5において用いたようなラット骨肉腫細胞において、アルカリホスファターゼ活性を誘導し得ないが、それらは、マウス奇形癌細胞株ATDC−5(軟骨前駆細胞(chondroprogenitor)細胞株(Atsumiら、1990、Cell Differentiation and Development 30:109))においてアルカリホスファターゼ活性を誘導する。ラット骨癌細胞アッセイにおいて陰性であるが、ATDC−5アッセイにおいて陽性であるフォールディングされた変異体は、CDMP様活性を獲得したことが記載されている。ATDC−5アッセイにおいて、細胞を無血清基本培地(BM:Ham’s F−12/DMEM[1:1]以下を含む:ITSTM+培養補充物[Collaborative Biomedical Products、Bedford、MA]、α−ケトグルタレート(1×10-4M)、セルロプラスミン(0.25 U/ml)、コレステロール(5μg/ml)、ホスファチジルエタノールアミン(2μg/ml)、α−トコフェロール酸スクシナート(9×10-7M)、還元グルタチオン(10μg/ml)、タウリン(1.25μg/ml)、トリヨードサイロニン(1.6×10-9M)、副甲状腺ホルモン(5×10-10M)、β−グリセロリン酸(10mM)およびL−アスコルビン酸2−スルフ
ェート(50μg/ml))中、4×104の密度でプレートした。CDMPまたは他の
生合成骨原性タンパク質(0〜300ng/ml)をその翌日、添加し、そして、CDMPまたは生合成骨原性タンパク質を含む培養培地を1日おきに交換した。アルカリホスファターゼ活性を処理の4、6および/または12日後、超音波処理した細胞ホモジネート中で決定した。PBSを用いた大規模な洗浄の後、細胞層を0.05%Triton−X100を含有する500μlのPBS中で超音波処理した。50〜100μlのアリコートを、アッセイ緩衝液(0.1M バルビタールナトリウム緩衝液(pH 9.3))中で、そして基質としてp−ニトロフェニルホスフェートを用いて、酵素活性についてアッセイした。吸光度を、400nmで測定し、そして活性をBradfordタンパク質アッセイ(ウシ血清アルブミン標準)で測定されるタンパク含有量に対して標準化した。
本実施例は、本発明に従って生物学的能力を改変された生合成変異体TGF−βタンパク質の生物活性を実証する。TGF−βタンパク質は、上皮細胞増殖を阻害し得る。多数の細胞阻害アッセイが、当該分野において十分に記載されている。例えば、Brownら(1987)J.Immunol.139:2977(ヒト黒色腫A375線維芽細胞を用いる比色アッセイを記載しており、そして、本願明細書において以下に記載される)を参照のこと。別のアッセイは上皮細胞(例えば、ミンク肺上皮細胞)を使用し、そして増殖の効果は3H−チミジン取込みによって決定される。
にTGF−βに曝露された後、停止される。簡潔には、細胞を、10%のFBS、200単位/mlのペニシリンおよび200μg/mlのストレプトマイシンを補充したEMEMを用いて、コンフルエンスになるまで生長させる。これらの細胞を、1ウェルあたり約200,000細胞の細胞密度になるまで培養する。コンフルエンスの時点で、培地を、1%のFBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを含有する0.5mlのEMEMで置換し、そしてこの培養物を、37℃で24時間インキュベートする。次いで、候補タンパク質を各ウェルに添加し、細胞を37℃で18時間インキュベートする。インキュベーションの後、10μl中に1.0μCiの3H−チミジンを、各々のウェルに添加し、そ
して細胞を、37℃で4時間インキュベートした。次いで、培地を、各ウェルから取り除き、細胞を、氷冷リン酸緩衝化生理食塩水を用いて1回洗浄し、そして、各ウェルに0.5mlの10% TCAを添加することによってDNAを、沈殿して、15分間室温でインキュベートした。この細胞を、氷冷蒸留水で3回洗浄し、0.5mlの0.4M NaOHで溶解し、次いで、各ウェルからの溶解物をシンチレーションバイアルに移し、そしてシンチレーションカウンター(Smith−Kline Beckman)を用いて放射能を記録する。生物学的に活性な分子は、細胞増殖を阻害し、その結果、不活性タンパク質および/または陰性コントロールウェル(増殖因子を添加してない)と比べて、より少ないチミジン取込みおよびより少ない計数を生じる。
SampathおよびReddi(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80:6591−6595)、および米国特許第4,968,590号、同第5,266,683号(これらの開示は本明細書において参考として援用される)によって記載される、骨誘導についての当該分野で認識されるバイオアッセイは、所定のタンパク質、デバイスまたは処方物の効力を評価するために用いられ得る。簡潔には、このアッセイは、エーテル麻酔下で試験試料をレシピエントラットの皮下の部位に配置することからなる。垂直の切開(1cm)を、胸の領域の上の皮膚に無菌条件下で作製し、そして、ポケットを、閉鎖(blunt)切開によって準備する。特定の場合において、凍結乾燥のような標準的手順を用いて調製した、所望の量の骨原性タンパク質(10ng〜10μg)を、約25mgのマトリックス材料と混合し、そして、試験試料を、ポケットの内側深くに移植し、そして切開を、金属の皮膚クリップで閉鎖する。異所性部位は、同所性部位の使用から生じる可能なあいまい性なしに骨誘導の研究を可能にする。このインプラントはまた、筋肉内に提供され得る。これはこのデバイスを接近可能な前駆細胞とより近接して設置する。代表的には、筋肉内インプラントを、両方の脚の骨格筋に作製する。
pH9.0中で均質化し、そして沈渣の酸可溶性画分のカルシウム含量を測定する後に決定され得る。
例えばある型のTGF−βファミリーのメンバーのタンパク質のN末端領域を獲得し、そしてこれを別の型のTGF−βファミリーのメンバーのタンパク質の7つのシステインのドメインに接続する場合、ドメインスワッピングが、生じる。ある変異体構築物は、当業者に一般に公知の慣用的な技術を用いて、OP−1の7つのシステインの活性ドメイン上のBMP−2末端の配列のスプライシングによって作製した。生じた変異体H2549は、MQAKHKQRKRLKSS−CからなるN末端領域を有する。最後のアミノ酸であるシステインは、OP−1の7つのシステインの活性ドメインの最初のシステインである。実施例5に上述したようなROSアッセイを、H2549の活性を試験するために用いた。
改変されたモルフォゲンタンパク質のN末端領域の、例えば、トリプシン切断による短縮化は、ROS活性を上昇させる。H2223構築物は、CHO細胞において発現される改変されたOP−1変異体である。H2223の2つのHPLC画分である画分13および14が、回収された。各々の画分の量は、実施例4中のダイマーに際して用いたものと類似の様式において、トリプシン分解によって分解された。次いで結果生じた4つのサンプル、すなわちトリプシン未処理の画分13および14およびトリプシン処理した画分13および14は、OP−1活性を標準として用いた上述の実施例5のようにROSアッセイに供した。
ヘテロダイマーの活性レベルは、ヘテロダイマーのそれぞれのサブユニット各々より形成されるホモダイマーの活性レベルよりも高い。6−His N末端を伴うOP−1であるH2440構築物、およびBMP−2であるH2142構築物を、上述した実施例3に記載の方法を用いてヘテロダイマーおよびホモダイマーを形成させた。次いでH2440/2142のヘテロダイマーならびにH2440/2440のホモダイマーおよびH2142/2142のホモダイマーを、上述の実施例4および5に記載のようにROSアッセイに供した。
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