JP2008154479A - 塹壕熱病原体(Bartonellaquintana)遺伝子の検出方法及び検出用キット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】被検体を、塹壕熱病原体遺伝子のITS1の領域を鋳型として増幅し得る2つのPCRプライマーからなるプライマーセットと、前記プライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し得る塩基配列を有し、5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブと、5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとを用いて、DNA増幅のためのサーマルサイクルに供し、前記プローブの破壊に起因する発色によって、前記被検体中の前記遺伝子の存在を検出する方法。PCRプライマーセット、5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブ、及び5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含む塹壕熱病原体遺伝子の検出用キット。
【選択図】なし
Description
Journal of Clinical Microbiology, Mar. 1999, p596-599
[1]被検体を、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子のintergenic spacer region (ITS)1の領域を鋳型として増幅し得る2つのPCRプライマーからなるプライマーセットと、前記プライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し得る塩基配列を有し、5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブと、5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとを用いて、DNA増幅のためのサーマルサイクルに供し、前記プローブの破壊に起因する発色によって、前記被検体中の前記遺伝子の存在を検出することを特徴とする塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の検出方法。
[2]前記プライマーセットが、配列表の配列番号1及び2で示される塩基配列を有するDNAである2つのPCRプライマーからなるか、配列表の配列番号3及び4で示される塩基配列を有するDNAである2つのPCRプライマーからなる[1]に記載の検出方法。
[3]前記プローブがTaqManMGBプローブである[1]または[2]に記載の検出方法。
[4]前記プローブが、配列表の配列番号5または6で示される塩基配列を有するDNAである[1]〜[3]のいずれかに記載の検出方法。
[5]前記5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、Taqポリメラーゼである[1]〜[4]のいずれかに記載の検出方法。
[6]前記サーマルサイクルが、蛍光発光検出用サーマルサイクラーを用いて行われる[1]〜[5]のいずれかに記載の検出方法。
[7]配列表の配列番号1及び2で示される塩基配列を有するDNAである2つのPCRプライマーからなるか、配列表の配列番号3及び4で示される塩基配列を有するDNAである2つのPCRプライマーからなる少なくとも1種のPCRプライマーセット、
5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブ、及び
5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ
を含む塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の検出用キット。
[8]前記プローブは前記プライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し得る塩基配列を有する[7]に記載の検出用キット。
[9]前記プローブがTaqManMGBプローブである[7]または[8]に記載の検出用キット。
[10]前記プローブが、配列表の配列番号5または6で示される塩基配列を有するDNAである[7]または[8]に記載の検出用キット。
[11]前記5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、Taqポリメラーゼである[7]〜[9]のいずれか1項に記載の検出用キット。
本発明の塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の検出方法は、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子のintergenic spacer region (ITS)1の領域を鋳型として、2つのPCRプライマーからなるプライマーセットと、前記プライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し、5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブと、5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとを用いてDNAを増幅し、前記プローブの破壊に起因する発色によって、前記遺伝子の存在を検出することを特徴とする。
プライマーセット0.1〜1μM
プローブ0.1〜1μM
ポリメラーゼ10〜100U/ml
本発明は、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の検出用キットを包含する。本発明の検出用キットは、
(1)配列表の配列番号1及び2で示される塩基配列を有するDNAである2つのPCRプライマーからなるか、配列表の配列番号3及び4で示される塩基配列を有するDNAである2つのPCRプライマーからなる少なくとも1種のPCRプライマーセット、
(2)5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブ、及び
(3)5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ
を含む。
プライマーセット0.1〜1μM
プローブ0.1〜1μM
ポリメラーゼ10〜100U/ml
とすることができる。
次に本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
コロモジラミ (Pediculus humanus humanus) をMixer Mill MM300 (Qiagen社製) により破砕し、IsoQuick (ORCA Research社製) を用いてゲノムDNAを抽出した。Bartonella henselaeの抽出は、ChargeSwitch gDNA Mini Bacteria Kit (Invitrogen社製)で行った。なお、Bartonella henselae (ATCC49882) は佐々木次雄博士(国立感染症研究所細菌二部)より供与を受けた。
Bartonella quintanaのITS1の領域を増やすために、Bartonella 属特異的ITS1のプライマーであるQHVE1のプライマー(TTCAGATGATGATCCCAAGC)(配列番号7)とQHVE3のプライマー (AACATGTCTGAATATATCTTC) (配列番号8)を作製し、抽出したゲノムDNAを鋳型にしてAccu Power PCR PreMix (Bioneer社製)やα-TaqDNA polymerase (Bionex社製)を用いてPC701 (ASTEC社製)やMyCycler (Bio-Rad社製)でPCR反応を行った。さらに、PCR産物を鋳型にしてQHVE12プライマー (CCGGAGGGCTTGTAGCTCAG)(配列番号9)やQHVE14プライマー(CACAATTTCAATAGAAC)(配列番号10)を用いたnested PCR反応を行った。その後、TAクローニングをpGEM-T Easy Vector with DH5 (Promega社製)を用いて行った。BigDye Terminator ver 1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystem社製)によって遺伝子配列を決定した。遺伝子配列から米国National Center for Biotechnology Information (NCBI) のblastnで相同性検索を行い、Bartonella quintanaのITS1であることを確認した。
ITS1のプラスミドを標準物とするため、プラスミドをEcoRIで切断しリニアにした。プローブとプライマーの配列は表1に示した。Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (Takara社製)を試薬として用い、95℃10秒を1サイクル、95℃5秒及び60℃31秒を45サイクルの反応をiCycler (Bio-Rad社製)にて行った。各試薬の使用量は、プライマーセット0.2μM、プローブ0.2μM、Premix Ex Taq 1x concentration (ポリメラーゼ 25 U/ml)とした。
図4に、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)の遺伝子のコピー数を変えて、リアルタイムPCR によって検出した結果を示す。AはプローブとしてITS1-pを用い、プライマーセットとしてITS1-ss1及びITS1-aa1を用いた結果である。BはプローブとしてITS1-p2を用い、プライマーセットとしてITS1-ss2及びITS1-aa2を用いた結果である。この結果から、いずれのプローブ及びプライマーセットを用いた場合にも、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)の遺伝子を、コピー数10以上であれば、良好に検出できることが分かる。
図5には、本発明のTaqManプローブ法に用いた塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子検出方法の特異性を検証するために、ネガティブサンプルとして2003年4月21日に路上生活者から採取され、PCRの検出で陰性のコロモジラミサンプル、ポジティブサンプルとして1999年10月27日に路上生活者から採取され、PCRの検出で陽性のコロモジラミサンプル、比較対象サンプルとして猫引っかき病(Bartonella henselae)を用いて、図4の場合と同様のプローブ及びプライマーセットを用いてTaqManプローブ法を実施した。図5において、AはプローブとしてITS1-pを用い、プライマーセットとしてITS1-ss1及びITS1-aa1を用いた結果である。BはプローブとしてITS1-p2を用い、プライマーセットとしてITS1-ss2及びITS1-aa2を用いた結果である。この結果から、本発明の方法は、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子検出に高い特異性を有することが分かる。
Claims (11)
- 被検体を、塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子のintergenic spacer region (ITS)1の領域を鋳型として増幅し得る2つのPCRプライマーからなるプライマーセットと、前記プライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し得る塩基配列を有し、5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブと、5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼとを用いて、DNA増幅のためのサーマルサイクルに供し、前記プローブの破壊に起因する発色によって、前記被検体中の前記遺伝子の存在を検出することを特徴とする塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の検出方法。
- 前記プライマーセットが、配列表の配列番号1及び2で示される塩基配列を有するDNAである2つのPCRプライマーからなるか、配列表の配列番号3及び4で示される塩基配列を有するDNAである2つのPCRプライマーからなる請求項1に記載の検出方法。
- 前記プローブがTaqManMGBプローブである請求項1または2に記載の検出方法。
- 前記プローブが、配列表の配列番号5または6で示される塩基配列を有するDNAである請求項1〜3のいずれか1項に記載の検出方法。
- 前記5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、Taqポリメラーゼである請求項1〜4のいずれか1項に記載の検出方法。
- 前記サーマルサイクルが、蛍光発光検出用サーマルサイクラーを用いて行われる請求項1〜5のいずれか1項に記載の検出方法。
- 配列表の配列番号1及び2で示される塩基配列を有するDNAである2つのPCRプライマーからなるか、配列表の配列番号3及び4で示される塩基配列を有するDNAである2つのPCRプライマーからなる少なくとも1種のPCRプライマーセット、
5'末端に蛍光タグを有し、3'末端にクエンチャーを有するプローブ、及び
5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ
を含む塹壕熱病原体(Bartonella quintana)遺伝子の検出用キット。 - 前記プローブは前記プライマーセットの順方向プライマーの下流側に位置し得る塩基配列を有する請求項7に記載の検出用キット。
- 前記プローブがTaqManMGBプローブである請求項7または8に記載の検出用キット。
- 前記プローブが、配列表の配列番号5または6で示される塩基配列を有するDNAである請求項7または8に記載の検出用キット。
- 前記5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが、Taqポリメラーゼである請求項7〜9のいずれか1項に記載の検出用キット。
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JP2004024043A (ja) * | 2002-06-21 | 2004-01-29 | Kokuritsu Seishin Shinkei Center | アルツハイマー病の遺伝子診断およびこれに用いるための核酸分子 |
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