JP2008128923A

JP2008128923A - Ｆａｂｍｓ測定の前処理方法

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Publication number: JP2008128923A
Application number: JP2006316553A
Authority: JP
Inventors: Hidetoshi Yoshida; 秀俊吉田; Toshibumi Abe; 阿部　　俊文; Kenji Fukuda; 健治福田
Original assignee: Taiyo Nippon Sanso Corp
Current assignee: Taiyo Nippon Sanso Corp
Priority date: 2006-11-24
Filing date: 2006-11-24
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2026-11-24
Also published as: JP4819657B2

Abstract

【課題】ＦＡＢＭＳ測定を行う際の分子イオンピークの分裂を防ぐことで、分子イオンピークのＳ／Ｎ比の低下を防止し、分子イオンピークの強度が強い質の高いマススペクトルを得ることができるＦＡＢＭＳ測定の前処理方法を提供する。
【解決手段】試料とマトリックス溶液とを混合して質量分析を行うＦＡＢＭＳ測定における前処理方法であって、交換性の重水素を含む試料と、軽水素を含むマトリックス溶液とを混合する前に、前記試料中の交換性重水素をすべて軽水素に置き換えた後、試料とマトリックス溶液とを混合した状態で質量分析を行う。
【選択図】図１

Description

本発明は、ＦＡＢＭＳ測定の前処理方法に関し、詳しくは、分子内の交換性の水素原子が、高純度に^２Ｈにて標識されたアミノ酸等の難揮発性物質を試料としてＦＡＢＭＳ測定を行う際の前処理方法に関する。

熱分解性・難揮発性物質を質量分析する際のイオン化にＦＡＢ法を使用する方法、すなわちＦＡＢＭＳ法が知られている。ＦＡＢ法では、試料をグリセロール等の粘性のある有機化合物（マトリックス）と混合し、その混合液にキセノンやアルゴン等の原子を衝突させイオン化を行う。マトリックスとしては、グリセロール、チオグリセリン、３−ニトロベンジルアルコール等が実用的なマトリックスとして知られており、試料の性質に合わせてマトリックスを選定することが質の高いマススペクトルを得る上で、非常に重要な要因であると言える（例えば、非特許文献１参照。）。

しかし、いずれのマトリックスも非常に粘性の高い物質であり、試料が固体試料の場合には、それをマトリックスと直接混合しても、均一な試料溶液を得ることが困難であるため、通常は、試料とマトリックスとの混合は、両者が溶解する溶媒を介して行われることが多い。すなわち、試料及びマトリックスが共に溶解する溶媒とマトリックスとをあらかじめ混合してマトリックス溶液とし、このマトリックス溶液に試料を混合するようにしている。

また、ＦＡＢ法は、最も一般的なイオン化方法であるＥＩ(Electron Ionization)法に比較するとイオン化の機構がソフトであり、分子イオン（正確にはプロトン化分子：［Ｍ＋Ｈ］^＋や脱プロトン化分子：［Ｍ−Ｈ］⁻。以下同様）が出現しやすいといった特徴がある。イオン化により生成するイオンの内、フラグメントイオンは、分子内の特定の部位に関する情報のみを与える。一方、分子イオンは、分子の分子量等の分子全体にわたる情報を与えてくれる。このためＦＡＢ法は、化合物全体にわたる情報を得るためのイオン化法として汎用性があり、優れた方法であるといえる。
ＹＯＫＵＤＥＬ−ＦＡＢ−Ｍａｔｒｉｘ［ＦＡＢ測定用マトリックス］〜ＦＡＢ測定のノウハウ、日本電子データム株式会社、２００４年７月１日（第２版）

分子全体の情報を得るため、すなわち、分子イオンを得るためのイオン化手段として、ＦＡＢ法は優れた方法であるものの、試料が交換性重水素を含む場合には、試料とマトリックス溶液とを混合することで、マトリックス溶液中の交換性の軽水素（多くの場合、マトリックス溶液は交換性の軽水素を含んでいる。）と試料中の交換性重水素との同位体交換反応によって試料の質量数が変化することが生じていた。

この質量の変化（低質量数側へのシフト）は、試料中のすべての試料分子のすべての交換性重水素に対して確実に起こるものであれば、質量シフトにより分子イオンがマトリックス由来ピーク等と重ならない限り特段の問題はない。しかし、マトリックス溶液の種類や混合方法によっては、この交換反応が部分的にしか進行しないといったことも起こりえる。この場合、試料の分子イオンピークは、複数の質量数に分散して検出される（分子イオンピークの分裂）こととなるため、ピークのＳ／Ｎ比が低下してしまうなどの不都合が生じていた。

そこで、本発明は、ＦＡＢＭＳ測定を行う際の分子イオンピークの分裂を防ぐことで、分子イオンピークのＳ／Ｎ比の低下を防止し、分子イオンピークの強度が強い質の高いマススペクトルを得ることができるＦＡＢＭＳ測定の前処理方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するため、本発明のＦＡＢＭＳ測定の前処理方法は、試料とマトリックス溶液とを混合して質量分析を行うＦＡＢＭＳ測定における前処理方法であって、交換性の重水素を含む試料と、軽水素を含むマトリックス溶液とを混合する前に、前記試料中の交換性重水素をすべて軽水素に置き換えた後、試料とマトリックス溶液とを混合することを特徴としている。

また、本発明のＦＡＢＭＳ測定の前処理方法における前記試料中の交換性重水素の軽水素への置き換えは、交換性軽水素を含む溶媒に前記試料を溶解した後、乾燥させて前記溶媒を除去することにより行うことができる。

本発明のＦＡＢＭＳ測定の前処理方法によれば、分子内の交換性の水素原子が高純度に^２Ｈにて標識されたアミノ酸等の難揮発性物質を試料としてＦＡＢＭＳ測定を実施する際に、あらかじめ交換性重水素をすべて軽水素に置き換える前処理を行うことで、試料分子イオンのピークの分裂を効果的に抑制することが可能となり、分子イオンピークのＳ／Ｎ比を低下させることがなく、強度が強い質の高いマススペクトルを得ることができる。

本発明は、分子内のすべての水素原子が高純度に重水素（^２Ｈ）にて標識されたアミノ酸等の試料をマトリックス溶液に混合してＦＡＢＭＳ測定を実施する前に、分子内の交換性の重水素をすべて軽水素に（^１Ｈ）に置き換える操作を行う。この交換性重水素の軽水素への置き換えは、試料中の交換性重水素の量に比べて十分に多量の交換性軽水素を含み、かつ、試料が溶解する溶媒を用いて行うことができる。

例えば、試料中の交換性重水素の数に対して１０倍程度の交換性軽水素を含む溶媒に試料を混合、溶解させて所定時間、例えば１時間以上放置することにより、試料中の交換性重水素のすべてを軽水素に置換する。なお、放置時間は、試料の種類や交換性重水素の量、溶媒の種類や交換性軽水素の含有量、その他の条件に応じて適宜設定すればよい。

試料中の交換性重水素を軽水素に完全に置き換えた後、溶媒を蒸発させて試料を乾燥させ、試料から溶媒を除去する。溶媒の蒸発は、加熱等の任意の方法で行うことができるが、熱分解性を有する試料の場合は、分解温度を下回る温度で加熱し、ゆっくり蒸発させる必要がある。

このようにして分子内の交換性重水素を軽水素に置き換えた試料を、通常の試料と同様にしてマトリックス溶液と混合してＦＡＢＭＳ測定を実施することにより、分子イオンピークの分裂がなく、強度が強くて質の高いマススペクトルを取得することができる。

なお、軽水素への置き換えに使用する溶媒は、特に限定されるものではなく、試料中の交換性重水素の置き換えに充分な量の交換性軽水素を含み、かつ、試料が溶解するものであればよく、任意の物質を使用することが可能である。代表的な溶媒としては純水（軽純水）が挙げられるが、その他、メタノール、エタノール等のアルコール類、エタノールアミン等のアミン類、酢酸等のカルボン酸類、メチルメルカプタン等のメルカプタン類も使用可能であり、これらを単独で用いてもよく、複数種を混合して用いてもよい。

実施例１
試料として、分子内のすべての水素及び窒素を高純度に^２Ｈ及び^１５Ｎに標識化した^２Ｈ，^１５Ｎ標識システイン（ＳＨ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＣＯＯＨ）を用いた。また、マトリックス溶液には、１０％グリセロール水溶液（水素の殆どが軽水素）を用いた。まず、前記試料１ｍｇを純水（軽水）２００μＬに溶解し、常温にて１時間放置した。その後、システインが溶解した水溶液を６０℃に加熱して溶媒（水）をゆっくり蒸発させて除去した。乾燥後の試料を前記マトリックス溶液に溶解し、通常の操作にて質量分析を行ってＦＡＢＭＳスペクトルを取得した。その結果を図１に示す。

ここで、水素、窒素の殆どすべてが^２Ｈ及び^１５Ｎであって、それ以外の元素が天然存在比だと考えられるシステインにおいて、最も存在比の大きな分子は、
^３２Ｓ^２Ｈ−^１２Ｃ^２Ｈ_２−^１２Ｃ^２Ｈ（^１５Ｎ^２Ｈ_２）−^１２Ｃ^１６Ｏ^１６Ｏ^２Ｈ
であるから、その分子量は１２９となる。したがって、この分子にプロトン（軽プロトン）が付加したイオンは、Ｍ／Ｚ＝１３０に検出される。

一方、この試料分子には、Ｓ^２Ｈ基、Ｎ^２Ｈ_２基、ＣＯＯ^２Ｈ基等の交換性重水素基が存在するので、この試料と前記マトリックス溶液とを単に混合すると、マトリックス溶液中の交換性軽水素と試料中の交換性重水素との同位体交換反応により、試料中の交換性重水素が部分的にマトリックス中の交換性軽水素に置き換わった分子、
^３２Ｓ^２Ｈ−^１２Ｃ^２Ｈ_２−^１２Ｃ^２Ｈ（^１５Ｎ^２Ｈ_２）−^１２Ｃ^１６Ｏ^１６Ｏ^１Ｈ（分子量：１２８）、
^３２Ｓ^１Ｈ−^１２Ｃ^２Ｈ_２−^１２Ｃ^２Ｈ（^１５Ｎ^２Ｈ_２）−^１２Ｃ^１６Ｏ^１６Ｏ^１Ｈ（分子量：１２７）、
^３２Ｓ^１Ｈ−^１２Ｃ^２Ｈ_２−^１２Ｃ^２Ｈ（^１５Ｎ^１Ｈ^２Ｈ）−^１２Ｃ^１６Ｏ^１６Ｏ^１Ｈ（分子量：１２６）
等が生じるため、質量数（Ｍ／Ｚ）：１２９、１２８及び１２７（分子量＋１の質量数）にピークが検出されることになる。

なお、システインは、分子内に硫黄原子を１つ含むアミノ酸であり、硫黄には安定同位体として^３２Ｓ以外に天然存在比で０．７５atom％の^３３Ｓ、４．２１５atom％の^３４Ｓ及び０．１０７atom％の^３６Ｓ（残りの９５．０１８atom％が^３２Ｓ）が存在する。したがって、本実施例における^２Ｈ，^１５Ｎ標識システインの内で最も存在比の大きな分子の硫黄原子を順に^３３Ｓ、^３４Ｓ及び^３６Ｓに置き換えた分子であって、かつ、その分子内の交換性重水素を完全に軽水素へ置き換えた分子の分子量は、順に１２６、１２７及び１２９となり、これらの分子にプロトン（軽プロトン）が付加したイオンは、Ｍ／Ｚ＝１２７、１２８及び１３０に検出される。つまり、１２７、１２８及び１３０の３つの質量数のピーク強度には、これらのイオンに由来する強度も含まれていることとなる。このため、硫黄が^３２Ｓである最も存在比の大きい分子であって、軽水素への置き換えが不完全なものに由来する強度は、実際に観測されたこれらのピーク強度より低いものである。

これに対し、前記手順によってすべての交換性重水素を軽水素に置き換えた場合は、
^３２Ｓ^１Ｈ−^１２Ｃ^２Ｈ_２−^１２Ｃ^２Ｈ（１５Ｎ^１Ｈ_２）−^１２Ｃ^１６Ｏ^１６Ｏ^１Ｈ（分子量：１２５）
となっているから、Ｍ／Ｚ＝１２６にピークが検出されることになる。

図１を見ると、Ｍ／Ｚ＝１２０〜１３０付近では、Ｍ／Ｚ＝１２６のところに強いピークが出現し、その他の質量数（Ｍ／Ｚ）では、僅かな強度のピークしか出現していないことが分かる。すなわち、交換性重水素を軽水素に置き換える前処理を実施することにより、部分的な同位体交換を起こした分子の分子イオンピークの出現が非常に低く抑えられ、交換性の重水素が完全に軽水素に置き換わった分子イオンピークであるＭ／Ｚ＝１２６のピークのみを強く出現されることが可能となったことが分かる。つまり、分子イオンピークが複数の質量数に分散することなく、その殆どがＭ／Ｚ＝１２６のピークとして検出されているため、分子イオンピークのＳ／Ｎ比が低下することなく、質の高いマススペクトルが得られていることが分かる。

実施例２
試料として、分子内のすべての水素、炭素及び窒素を高純度に^２Ｈ、^１３Ｃ及び^１５Ｎで標識化したセリン（ＨＯ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＮＨ_２）ＣＯＯＨ）を用いた。マトリックス溶液及び溶媒には実施例１と同じものを使用し、同じ手順で前処理を行った後、ＦＡＢＭＳ測定を実施した。得られたマススペクトルを図２に示す。

この標識セリンで最も存在比が高い分子は、
^２Ｈ^１６Ｏ‐^１３Ｃ^２Ｈ_２‐^１３Ｃ^２Ｈ（^１５Ｎ^２Ｈ_２）^１３Ｃ^１６Ｏ^１６Ｏ^２Ｈ
であり、この分子に由来する分子イオンピークが出現する質量数はＭ／Ｚ＝１１７（分子量＋１）である。

一方、上記標識セリンには、４個の交換性重水素（^２Ｈ^１６Ｏ−、−^１５Ｎ^２Ｈ_２及び−^１２Ｃ^１６Ｏ^１６Ｏ^２Ｈ）が存在するので、部分的にこれらが軽水素に交換すると、交換後の分子に由来するピークがＭ／Ｚ＝１１６〜１１４に出現し、完全に軽水素に置き換わった場合には、Ｍ／Ｚ＝１１３にピークが出現することになる。

図２を見ると、Ｍ／Ｚ＝１１３〜１１７の範囲においては、Ｍ／Ｚ＝１１３のピーク、すなわち、交換性重水素が完全に軽水素に置き換わった分子に由来するピークのみが強く出現し、他は、極僅かの強度でしか出現していないことが分かる。

実施例３
試料として、分子内のすべての水素、炭素及び窒素を高純度に^２Ｈ、^１３Ｃ及び^１５Ｎで標識化したシステイン（ＳＨ−ＣＨ_２−ＣＨ（ＮＨ_２）−ＣＯＯＨ）を用いた。マトリックス溶液及び溶媒には実施例１と同じものを使用し、同じ手順で前処理を行った後、ＦＡＢＭＳ測定を実施した。得られたマススペクトルを図３に示す。

この標識システインで最も存在比が高い分子は、
^３２Ｓ^２Ｈ−^１３Ｃ^２Ｈ_２−^１３Ｃ^２Ｈ（^１５Ｎ^２Ｈ_２）−^１３Ｃ^１６Ｏ^１６Ｏ^２Ｈ
であり、この分子に由来する分子イオンピークが出現する質量数はＭ／Ｚ＝１３３（分子量＋１）である。

一方、上記標識システインには、４個の交換性重水素（^３２Ｓ^２Ｈ−、−^１５Ｎ^２Ｈ_２及び−Ｃ^１６Ｏ^１６Ｏ^２Ｈ）が存在するので、部分的にこれらが軽水素に交換すると、交換後の分子に由来するピークがＭ／Ｚ＝１３２〜１３０の範囲に出現し、完全に軽水素に置き換わった場合には、Ｍ／Ｚ＝１２９にピークが出現することになる。

図３を見ると、Ｍ／Ｚ＝１２９〜１３３の範囲においては、Ｍ／Ｚ＝１２９のピーク、すなわち、交換性重水素が完全に軽水素に置き換わった分子に由来するピークのみが強く出現し、他は、極僅かの強度でしか出現していないことが分かる。

実施例４
実施例３の操作を５回繰り返して、５回分のマススペクトルを取得した。得られたマススペクトルからＭ／Ｚ＝１２９〜１３３のピークを抽出し、Ｍ／Ｚ＝１２９のピーク強度を１００とした場合の各ピークの相対強度を算出した。その結果を表１に示す。

実施例５
試料として分子内のすべての水素及び窒素を高純度に^２Ｈ及び^１５Ｎに標識した^２Ｈ，^１５Ｎ標識システインを使用し、軽水素への置き換えの有無によるマススペクトルの差を確認する実験を行った。

（１）軽水素への置き換えを行わずに試料１ｍｇをそのまま１０％グリセロール水溶液（実施例１と同じ）と混合して溶解させたものに対して通常の操作で質量分析を行い、ＦＡＢＭＳスペクトルを取得した。その結果を図４に示す。

（２）試料１ｍｇを純水（軽水）２００μＬに溶解して１時間放置した後、６０℃に加熱して溶媒（水）をゆっくり蒸発させて除去することにより軽水素への置き換えを行った。この試料を（１）と同じ１０％グリセロール水溶液と混合して溶解させ、（１）と同様にして質量分析を行い、ＦＡＢＭＳスペクトルを取得した。その結果を図５に示す。

（３）試料１ｍｇをエタノール（交換性水素の殆どすべてが軽水素）２００μＬに溶解して１時間放置した後、４０℃に加熱して溶媒（エタノール）をゆっくり除去することにより軽水素への置き換えを行った。この試料を、（１）と同じ１０％グリセロール水溶液と混合して溶解させ、（１）と同様にして質量分析を行い、ＦＡＢＭＳスペクトルを取得した。その結果を図６に示す。

軽水素への置き換えを行わなかった図４のマススペクトルを見ると、Ｍ／Ｚ＝１２０〜１３０付近に分子イオンピークの分裂に由来する複数のピークが観測され、かつ、Ｓ／Ｎ比が低下していることが分かる。

一方、溶媒として純水やエタノールを用いて軽水素への置き換えを行った図５及び図６のマススペクトルを見ると、Ｍ／Ｚ＝１２０〜１３０付近では、Ｍ／Ｚ＝１２６のところに強いピークが出現し、その他の質量数（Ｍ／Ｚ）では、僅かな強度のピークしか出現していないことが分かる。

このことから、軽水素への置き換えを行うことにより、分子イオンピークが複数の質量数に分散することがなく、その殆どがＭ／Ｚ＝１２６のピークとして検出されているため、分子イオンピークのＳ／Ｎ比が低下することなく、したがってマススペクトルの質が高く保たれたままであることが分かる。また、軽水素への置き換えを行う際に使用する溶媒の種類によらず、同様の効果が得られることも分かる。

実施例６
試料として分子内のすべての水素及び窒素を高純度に^２Ｈ及び^１５Ｎに標識した^２Ｈ，^１５Ｎ標識グリシン（ＣＨ_２（ＮＨ_２）−ＣＯＯＨ）を使用した以外は、実施例５と同じ手順でマススペクトル（ＦＡＢＭＳスペクトル）をそれぞれ取得した。その結果を図７〜図９に示す。

^２Ｈ，^１５Ｎ標識グリシンの場合、最も存在比が高い分子は^１２Ｃ^２Ｈ_２（^１５Ｎ^２Ｈ_２）^１２Ｃ^１６Ｏ^１６Ｏ^２Ｈであり、この分子に由来する分子イオンピークが出現する質量数はＭ／Ｚ＝８２である。一方、上記標識グリシンには３個の交換性重水素（−^１５Ｎ^２Ｈ_２及び−^１２Ｃ^１６Ｏ^１６Ｏ^２Ｈ）が存在するので、部分的にこれらが軽水素と交換するとＭ／Ｚ＝８１〜８０に交換後の分子に由来するピークが出現し、完全に置き換わったものは、Ｍ／Ｚ＝７９にピークが出現することになる。

軽水素への置き換えを行わなかった図７のマススペクトルを見ると、Ｍ／Ｚ＝７９〜８２において複数のピークが検出され、かつ、Ｓ／Ｎ比が低下していることが分かる。一方、純水を溶媒として軽水素への置き換えを行った図８、エタノールを溶媒として軽水素への置き換えを行った図９のマススペクトルを見ると、Ｍ／Ｚ＝７９のピーク、すなわち、交換性重水素が完全に軽水素に置き換わった分子に由来するピークのみが強く出現し、他は、極僅かの強度でしか出現していないことが分かる。

このことから、本実施例においても、溶媒の種類によらず、軽水素への置き換えを行うことによってＳ／Ｎ比に優れ、強度が強い質の高いマススペクトルを取得できることが分かる。

実施例１で取得したマススペクトルである。実施例２で取得したマススペクトルである。実施例３で取得したマススペクトルである。実施例５において、軽水素への置き換えを行わなかったときのマススペクトルである。実施例５において、純水で軽水素に置き換えたときのマススペクトルである。実施例５において、エタノールで軽水素に置き換えたときのマススペクトルである。実施例６において、軽水素への置き換えを行わなかったときのマススペクトルである。実施例６において、純水で軽水素に置き換えたときのマススペクトルである。実施例６において、エタノールで軽水素に置き換えたときのマススペクトルである。

Claims

試料とマトリックス溶液とを混合して質量分析を行うＦＡＢＭＳ測定における前処理方法であって、交換性の重水素を含む前記試料と、軽水素を含む前記マトリックス溶液とを混合する前に、前記試料中の交換性重水素をすべて軽水素に置き換えた後、試料とマトリックス溶液とを混合することを特徴とするＦＡＢＭＳ測定の前処理方法。
前記試料中の交換性重水素の軽水素への置き換えは、交換性軽水素を含む溶媒に前記試料を溶解した後、乾燥させて前記溶媒を除去することにより行うことを特徴とする請求項１記載のＦＡＢＭＳ測定の前処理方法。