JP2008118929A - 免疫機能の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本発明の目的は、免疫機能を正確に測定できる方法を提供することである。
【解決手段】 特定のペプチドを、体液あるいは体液に含まれる細胞と接触させることによりあるいは培養することにより形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）の放出を誘導させ、該形質転換増殖因子の放出量を測定することを特徴とする、免疫機能の測定方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、免疫機能の測定方法に関する。

近年、高齢化、食生活等の生活環境の変化やストレスの増加などに伴い、悪性腫瘍や自己免疫疾患など、免疫機能の低下や亢進が関与する疾病に苦しむ患者数や重篤な症例が飛躍的に増加しており、世界的な問題となっている。今後も、さらにこの傾向に拍車がかかるものと予想されている。
これらの疾病を適切に予防あるいは治療するためには、個々の患者の持つ免疫機能を正確に測定し、それぞれに最適な予防あるいは治療方法を選択し、組み合わせることが必須である。

また、近年、抗癌剤や免疫抑制剤など、免疫機能に影響を与える薬剤が多く使われるようになってきた。これら薬剤の作用や副作用、すなわち個々の患者の持つ免疫機能の変化を、迅速かつ正確に測定することが、患者のＱＯＬ向上の観点からも強く求められている。
しかしながら、個々の患者における免疫機能を正確に把握するための実用的な方法はなく、個々の患者に最適な治療はなされていないのが現状である。

免疫機能には、さまざまな要因が複雑に関係しているが、その中で最も注目されている因子の一つが形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）である。ＴＧＦ−βは、生体内の種々の細胞、例えば免疫担当細胞であるＣＤ４Ｔ細胞やマクロファージ等から産生、放出され、免疫機能を抑制する働きを有することが明らかとなっている。

ＴＧＦ−βは、血液中にも含まれている、そこで、研究的に血液中もしくは血漿中のＴＧＦ−βの測定が行われており、その量によって免疫状態を把握しようとする試みがなされている。例えば、抗癌剤や免疫抑制剤の投与により免疫機能が低下した患者において、血漿中のＴＧＦ−β量が増加することが報告されている。しかしながら、このような測定では、すでに免疫機能が低下した状態をある程度把握することはできても、免疫機能を正確に測定し、あるいは事前に免疫機能の変化を予測することはできない。
すなわち、上述の通り、個々の患者が持つ免疫機能あるいはその変化を正確に把握するための実用的な方法はなく、個々の患者に最適な治療はなされていないのが現状である。

本発明の目的は、免疫機能を従来よりもより正確に測定できる方法を提供することである。

請求項１記載の発明は、下記式（Ｉ）で示されるペプチドを、体液あるいは体液に含まれる細胞と接触させあるいは培養することにより形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）の放出を誘導させ、該形質転換増殖因子の放出量を測定することを特徴とする、免疫機能の測定方法である。
請求項２記載の発明は、体液が血液であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫機能の測定方法である。

本発明では、インビトロ系において、上記式（Ｉ）で示されるペプチドを、体液あるいは体液に含まれる細胞と接触させあるいは培養する。この操作により、検体中の細胞からＴＧＦ−βが放出される。本発明では、このＴＧＦ−βの放出量を測定する。

本発明に用いる体液としては、特に限定されないが、例えば血液を用いることができる。これら体液の採取方法は特に限定されないが、臨床的に一般的な方法、例えば血液であればヘパリンなどの抗凝固剤を含む採血管を用いた採血などが用いられ得る。
また、本発明においては、体液をそのまま用いてもよいし、含まれる細胞成分を分離した後に使用してもよい。細胞分離の方法は特に限定されず、例えば遠心分離による方法、比重による分離法、細胞分離膜による方法などが適宜用いられ得る。

本発明において、上記ペプチドと体液あるいはこれらに含まれる細胞と接触させあるいは培養する際の検体量は、後にＴＧＦ−βを測定するのに十分な量であれば特に限定されない。また、その際の上記ペプチドの濃度は、特に限定されないが、好ましくは０．０１ｎｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬとなるように調製する。

本発明において、上記ペプチドと体液あるいは体液に含まれる細胞と接触させあるいは培養する際の容器等は特に限定されないが、個々の検体を生体に近い状態で反応させ、より正確な創傷治癒の予測を可能とするため、エンドトキシンなどの汚染・混入などがないものを用い、クリーン環境で操作することが好ましい。

また、接触や培養は、通常はプレートや試験管等の容器中で行われるが、その際、プレートや試験管などを振とう機や回転培養器を用いて混和することが好ましい。
また、接触あるいは培養の際の温度は、好ましくは１５〜４２℃であり、通常は３７℃付近の温度条件下で行われる。
また、この培養する際の接触時間は、特に限定されない。

本発明において、放出されたＴＧＦ−βを測定する方法は、特に限定されないが、例えば各種の酵素免疫測定法、酵素測定法、比色定量法、化学発光法等で行うことができる。

次に本発明の一実施様態として、内部を減圧にすることが可能である測定容器に、上記式（Ｉ）で示されるペプチド及び血液抗凝固剤を収納して製造した測定容器を用いて、免疫機能を測定する方法を述べる。
まず、血管または採血容器と上記測定容器とを、例えばマルチプル注射針（両端が搾針でき、かつ連通されている採血針）を用いて連通させ、上記測定容器中に患者の血液を吸入させる。これにより、血液細胞が上記式（Ｉ）で示されるペプチドと接触し、ＴＧＦ−βが放出される。このＴＧＦ−βの量を上記の方法により測定することによって、免疫機能を測定することができる。

本発明では、上記式（Ｉ）で示されるペプチドを、体液あるいはこれらに含まれる細胞と接触させあるいは培養することによりＴＧＦ−βの放出を誘導させ、該ＴＧＦ−βの放出量を測定することにより、免疫機能の測定を精度良く行うことができる。

以下、本発明の実施例及び比較例を挙げることにより、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

（実施例１〜３）
（ペプチドの調製）
理化学研究所から入手した放線菌Ｓ．ノビリス（ＪＣＭ４２７４）を、酵母エキス０．２％（ｗ／ｖ）添加澱粉・アンモニウム培地５０ｍＬを含む５００ｍＬ容坂口スラスコ５本で、２６℃、１５０ｒｐｍ、１２０時間振盪培養（前々培養）した。続いて同培地１２Ｌを含む２０Ｌ容ジャーファメンターに前々培養菌液２４０ｍＬを接種し、２６℃、４１０ｒｐｍ、通気量４Ｌ／分で２４時間培養（前培養）した。更に、澱粉・アンモニウム培地（蒸留水１００ｍＬ中に可溶性澱粉を１ｇ、リン酸水素二カリウムを０．０５ｇ、塩化アンモニウムを０．０５ｇ含む）１４０Ｌを含む２００Ｌ容ジャーファメンターに、前培養菌液１２Ｌを接種し、２６℃、２４時間種培養した。

次いで、澱粉・アンモニウム培地１４００Ｌを含む２０００Ｌ容タンクに、種培養菌液１４０Ｌを接種し、２６℃、１４０ｒｐｍ、通気量７００Ｌ／分、ｐＨ７．５で７日間培養した。

培養終了後、濾過により菌体を濾別した。このようにして得られた菌体６．３４ｋｇ（湿重量）のうち、菌体１ｋｇ（湿重量）にジクロロメタン３Ｌを加え、室温で１５時間攪拌後、菌体を濾別し、菌体抽出液を得た。菌体については、同操作を３回繰り返した。得られた菌体抽出液を濃縮後、シリカゲル担体１２０ｇに吸着させた。本吸着シリカゲル担体をシリカゲルカラムにより精製した。

シリカゲル担体８００ｇを充填した径８．０ｃｍのカラムに上記抽出物吸着担体約１２０ｇをチャージし、シリカゲルカラムを作成した。このシリカゲルカラムを下記の条件を用いて精製を行った。溶出溶剤として、ａ）ヘキサン：酢酸エチル＝４：６を４Ｌ、ｂ）酢酸エチルを３．５Ｌ、ｃ）メタノール２Ｌを、この順に流速５００ｍＬ／時間で流した。分画は、溶剤組成を変更する毎に行い、特に酢酸エチルの溶出画分は５００ｍＬずつ分画した（従って、酢酸エチルについては、溶出画分数は合計７画分となる）。

上記の各溶出画分について、それぞれ、ＯＤＳ−８０ＴＭ、内径４．６ｍｍ×長さ２５．０ｃｍのカラム（東ソー社製）を用いたＨＰＬＣ（日立社製、ポンプＬ−６０００、Ｌ−６２００、検出器Ｌ−３０００、カラムオーブン６５５Ａ−５２）によって、検出波長２１０ｎｍ、カラム温度４０℃、流速１ｍｌ／分の条件で、溶離液として水：アセトニトリル＝３：７を用いて、純度を確認した。

上記のＨＰＬＣによる純度確認において、リテンションタイムが１２〜１５分で溶出されるピーク面積が、全溶出ピーク面積の８０％以上を占めることが確認されたシリカゲルカラム溶出画分を合わせ、同一画分とした。本画分を濃縮乾固後、メタノール−ジクロロメタン系を用いて繰り返し再結晶を行い、柱状結晶３．５ｇを得た。

この物質の構造は、種々の機器分析データよりＷＯ９６／１２７３２号公報に記載された物質と同一であり、上記式（１）で表されるペプチドであることがわかった。
得られたペプチドの機器分析データを以下に示す。

１．ＭＳ
・ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝９１３．６（Ｍ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ）^＋、９３１．６（Ｍ＋Ｈ）^＋、９５３．６（Ｍ＋Ｎａ）^＋
・ＨＲＦＡＢ−ＭＳ
Ｆｏｕｎｄ：ｍ／ｚ＝９１３．５０７９（Ｍ＋Ｈ−Ｈ_２Ｏ）^＋、ｍ／ｚ＝９１３、９５３、９３１（９１３がメイン，９３１は非常に小さい）
Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ：Ｃ_４５Ｈ_６９Ｎ_８Ｏ_１２
ｍ／ｚ＝９１３．５０５３

２．ＩＲ
ＩＲ：３，４００ｃｍ^−１：−ＯＨ，−ＮＨ
２，９００ｃｍ^−１：アルキル基
１，７５０ｃｍ^−１：−Ｃ（＝Ｏ），−Ｏ−
１，６５０ｃｍ^−１：−Ｃ（＝Ｏ），−ＮＨ−

３．アミノ酸分析
加水分解物としてＤ−セリン、Ｌ−アラニンおよびＤ−Ｎ−メチル−フェニルアラニンが認められた。

（ＴＧＦ−βの放出、測定）
タクロリムス一水和物（和光純薬社製）を０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（ナカライテスク社製）水溶液に懸濁して１ｍｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬとし、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（８週齢、雄性、日本ＳＬＣ社）に２ｍＬ／ｋｇ（タクロリムスとして２ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇ）として経口投与した。また、コントロールとして、タクロリムス一水和物を含まない０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム水溶液のみをと同様に投与した。
投与２４時間後に、これらのマウスからヘパリン採血した。
これらの血液を、エンドトキシンフリー（抽出液中のエンドトキシン含量が０．５ＥＵ／ｍｌ未満）のポリエチレンテレフタレート製採血管（内容量５ｍＬ、１２．６φ×７５ｍｍ、積水化学社製）に０．５ｍＬ添加し、さらに上記ペプチドのメタノール溶液（５μｇ／ｍＬ）を１０μＬ（上記ペプチドとして５０ｎｇ、最終濃度１００ｎｇ／ｍＬ）添加した。次いで、管径に合うブチルゴム製の栓体で開口部を密栓した。
これを、３７℃で３時間インキュベートし、反応終了後、４℃、１６００Ｇで１０分間遠心分離して、上清を採取した。ここで得られた上清を検体として、ＴＧＦ−β_１ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ社製）を用いてＴＧＦ−β_１量の測定を行った（Ａ）。
また、上記ペプチドのメタノール溶液のかわりに、上記ペプチドを含まないメタノールを使用した以外は、同様の操作を行った場合のＴＧＦ−β_１量を測定した（Ｂ）。
上記により得られたＴＧＦ−β_１測定値の差（Ａ−Ｂ）をＴＧＦ−β_１放出量として算出した（実施例１〜３）。
本試験は、それぞれ５匹のマウスを用いて行い、ＴＧＦ−β_１放出量の平均値を求めた。
結果を表１に示した。

表１から明らかなように、免疫抑制剤であるタクロリムス一水和物を前投与したマウスでは、用量依存的に血液から放出されたＴＧＦ−β_１量が増加していた。
以上から明らかなように、本発明によるＴＧＦ−β放出量を測定することにより、免疫機能を測定することができる。

従来から、免疫機能を測定することは非常に困難であったところ、本発明の方法を用いることにより、従来よりもより正確に免疫機能を測定することが可能となり、結果として個々の患者に最適な治療を行うことができるようになる。即ち、本発明の方法は、疾病の治療等に極めて有用に用いられ得るものである。

Claims (2)

1. 下記式（Ｉ）で示されるペプチドを、体液あるいは体液に含まれる細胞と接触させることによりあるいは培養することにより形質転換増殖因子（ＴＧＦ−β）の放出を誘導させ、該形質転換増殖因子の放出量を測定することを特徴とする、免疫機能の測定方法。
   

   
2. 体液が血液であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫機能の測定方法。