JP2008079503A - 被験物質の評価装置 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の目的は、被験物質が生きた生物に及ぼす影響を直接的に観察することができて被験物質の評価を正しく、かつ短時間で行うことができる被験物質の評価装置を提供することにある。
【解決手段】本発明の評価装置１は、被験物質の生物に対する作用を評価するための評価装置であって、被験物質を加えた受精卵２を収容可能なインキュベータ１０と、インキュベータ１０内を受精卵に対して所定の環境条件となるように管理する環境制御手段と、受精卵２の卵殻３に設けた開口部４を通して受精卵２の卵黄血心管系を撮影する撮像装置２０、撮像装置２０と接続された画像情報処理装置３０、画像情報処理装置３０と接続されたモニタ４０とを備えた構成であるところに特徴を有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、薬等の被験物質の生物に対する作用を評価するための評価装置に関する。

生活習慣病はその多くが血管病を併発し、悪化すれば致死性の疾患に陥る。代表的な致死性疾患の脳卒中では、動脈硬化を起こす前に薬物療法を施せば発症率が減るという報告がある。生活習慣病に伴う心臓病の治療薬として数種類が既に使われているが、世界中の患者数を考えるとより副作用の少ない効果的な治療薬の開発が急がれる。

新薬の開発において未だに多くの労力と時間を必要としている部分が、薬剤候補物質の有効性と有害性を実験的に見極めるスクリーニング及び臨床の段階であるといわれている。そのスクリーニング作業のコストを大幅に削減し、より多くの薬剤候補物質の可能性についてより詳細に検討できるスクリーニングシステムを開発することは新薬開発の競争力を向上させることになる。

このような薬剤候補物質のスクリーニング方法の一例として、下記特許文献１に記載のものが知られている。特許文献１のスクリーニング方法は、生物の細胞組織の一部を取り出して、これを培養することで血管新生が行われる様子を観察し、血管が成長する様子をデジタル方式の撮像装置を用いて撮影し、得られた電子データを画像処理することにより血管の成長を定量化するものである。
特表平９−５０９８２９号公報

しかしながら、このスクリーニング方法は、生物の体内から取りだした細胞組織を観察するものであって、生体内を観察するものではない。従って、例えば薬剤候補物質が生体に及ぼす影響を評価しようとするとき、仮に薬剤候補物質の投与後に細胞組織に何らかの変化が観察された場合、その変化と全く同じ変化が生体内でも同様に生じる保証はない。逆に薬剤候補物質が細胞組織に変化を与えない場合でも、生体内では何らかの変化を生じる可能性を否定できない。

ラット等の実験動物に薬剤候補物質を投与する場合には、生体内の様子を直接観察することは容易ではなく、また、観察器具等による圧迫や損傷等によるストレスを与えてしまい、薬剤候補物質のみの純粋な影響を観察できない。更に、実験動物は取り扱いに多くの手間とコストがかかるため、大量の薬剤候補物質から有効な物質をスクリーニングする目的に使用するには適さない。

本発明は上記のような事情に基づいて完成されたものであって、被験物質が生きた生物に及ぼす影響を直接的に観察することができ、被験物質の評価を正しく、かつ短時間・低コストで大量に行うことができる被験物質の評価装置を提供することを目的とする。

上記の目的を達成するための手段として、請求項１の発明は、被験物質の生物に対する作用を評価するための評価装置であって、前記被験物質を加えた前記受精卵を収容可能な受精卵収容室と、前記受精卵収容室内を前記受精卵に対して所定の環境条件となるように管理する環境制御手段と、前記受精卵の卵殻に設けた開口部を通して前記受精卵の卵黄心血管系を撮影する撮像装置とを備えた構成としたところに特徴を有する。
本発明の「卵黄心血管系」は卵黄血管系と胚とを備えて構成され、かつ卵殻の内側領域に形成される血管系をいう。

請求項２の発明は、請求項１に記載のものにおいて、前記撮像装置はビデオ撮影装置であるところに特徴を有する。
請求項３の発明は、請求項１または請求項２に記載のものにおいて、前記撮像装置は前記卵黄心血管系の映像を画像情報として出力するデジタル方式のものであって、さらに、その画像情報に基づいて前記卵黄心血管系における血管の枝分かれの状態や胚の心拍数等の前記卵黄心血管系の状態を経時的に測定する画像情報処理装置を備えているところに特徴を有する。
本発明では、「卵黄心血管系の状態」、即ち卵黄血管系の状態及び／又は胚の状態が測定対象となる。具体的には卵黄心血管系の状態は、血管の面積（例えば、測定領域における総面積）、血管の数（例えば、測定領域における総数）、血管の幅又は径（例えば、注目する血管のもの、又は測定領域における平均）、血管の枝分かれの状態（例えば、注目する血管のもの、又は測定領域における枝分かれの総数や総血管長）、血管の伸展速度、血液量、血液の流速、胚の大きさ、胚の心拍数などを含む。

請求項４の発明は、請求項１ないし請求項３のいずれかに記載のものにおいて、前記受精卵収容室は複数の受精卵を収容可能であって、さらに前記撮像装置を前記各受精卵の卵黄心血管系を個別的に撮影すべく移動させる撮像装置移動機構を備え、かつ、前記撮像装置には前記受精卵の卵黄心血管系部分に光を照射する照明装置が設けられてその照明装置が前記撮像装置と一体的に移動可能とされているところに特徴を有する。

＜請求項１の発明＞
請求項１の発明によると、卵殻に設けた開口部を通して受精卵の卵黄心血管系を観察することができる。また、上述のように卵殻に開口部を設けたとしても、環境制御手段により、受精卵収容室内を例えば一定温度及び一定湿度となるように管理することで、環境による不必要なストレスを与えずに受精卵を発育させることができるから、被験物質を加えた受精卵内部の発育状況を生きた状態のまま被験物質を加えた影響のみを直接観察することができる。したがって、例えば薬剤候補物質のスクリーニングにおいて、本発明の被験物質の評価装置を使用すると、被験物質のスクリーニング作業を短時間・低コストで大量に行うことができると共に、被験物質の生物に対する作用を正しく評価することができる。

＜請求項２の発明＞
請求項２の発明によると、卵黄心血管系の映像を動画として撮影することができる。したがって、例えば血管中に流れる血球の様子などを観察してより詳細な情報を取得することができる。
＜請求項３の発明＞
請求項３の発明によると、出力された卵黄心血管系のデジタル方式の画像情報を画像処理して卵黄心血管系の状態を経時的に測定することができる。したがって、卵黄心血管系の状態、例えば血管の本数の変化や血管の総面積の変化等の情報を取得し、評価することができる。

＜請求項４の発明＞
請求項４の発明によると、撮像装置が移動して複数の受精卵の様子を個々に撮影するから、少数の撮像装置で複数の受精卵の様子を観察することができてコストダウンと共に撮像条件の均一化を可能にできる。しかも、撮像装置には照明装置を一体的に設けているから、個々の受精卵に対する照射条件も一定にすることができ、その結果、受精卵毎に得られる評価情報のばらつきを減らすことができる。

＜実施形態１＞
本発明の実施形態１を図１ないし図４によって説明する。図１は、本発明における評価装置１を模式的に示す斜視図である。評価装置１は、薬剤等の被験物質の生物に対する作用を評価するためのものであって、インキュベータ（本発明における受精卵収容室に相当する。）１０と、インキュベータ１０の内部において移動可能に組み付けられた撮像装置２０と、撮像装置２０と接続された画像情報処理装置３０と、画像情報処理装置３０と接続されたモニタ４０とを備えている。

本実施形態に使用される受精卵２はニワトリの受精卵で、卵白５と卵黄６とが卵殻３によって覆われた周知の構造である。また、本実施形態における受精卵２には、受精卵２の鈍端部（気室）側における卵殻３の一部に貫通孔を設け、この貫通孔を通して卵白を少量（例えば約１５ｍｌ）抜き取った後に、受精卵２の鋭端部（鈍端部と反対側の端部）を下方に向けた状態で卵殻３内に残された卵白５の液面の若干上の位置であって受精卵２の鈍端部側の外周面を周方向に沿って切断し、その切断された鈍端部を除去することで、開口部４が設けられている。この開口部４を通して卵黄心血管系の血管領域８（本発明の卵黄心血管系の一例）に外部刺激として被験物質（例えば薬剤候補物質）を添加し、被験物質が添加された受精卵２の卵黄心血管系を生きた状態のまま直接観察することができる。

インキュベータ１０は略方形の閉じた箱形をなし、その前面が例えばアクリル板等の透明な部材によって形成され、インキュベータ１０の内部が外部から観察できるようになっている。インキュベータ１０の内部は、ヒータ及び加湿器を備えた環境制御手段（図示せず）によって一定温度及び一定湿度となるように管理されている。インキュベータ１０の内部における底部には、受精卵２を配置する受精卵載置台１１が設けられている。受精卵載置台１１には、受精卵２の鋭端部を収容する複数の凹部１２が縦横に並んで形成され、この凹部に受精卵２を収容することで受精卵２の開口部４が上方を向いた姿勢に保持できるようにしている。

インキュベータ１０の内部の上面側には、受精卵２の卵黄心血管系の血管領域８をその開口部４を通して撮影する撮像装置２０が設けられている。撮像装置２０は、下向きに開口したレンズ２０Ｂからの光を本体部２０Ａにより受けて、その本体部２０Ａ内に設けた光電変換素子から画像信号を出力するデジタル方式のものである。この画像信号は、接続ケーブル１３を通して画像情報処理装置３０へと送られる。

インキュベータ１０は、その上部に撮像装置２０を前後左右に移動させるための撮像装置移動機構２１を備えている。この撮像装置移動機構２１は、インキュベータ１０の天井部の左右両側に前後方向に延びる一対の縦ガイドレール２４を備えており、その両ガイドレール２４間に横ガイドレール２３が掛け渡されて前後方向に移動可能に支持されている。横ガイドレール２３には駆動ブロック２２が左右方向に移動可能に支持されており、ここに前記撮像装置２０がレンズ２０Ｂを下向きにして固定されている。各縦ガイドレール２４にはそれぞれ縦駆動モータ２６が設けられ、その縦駆動モータ２６によって例えばベルト機構（図示せず）を駆動することにより横ガイドレール２３を前後に移動させることができる。一方、前記駆動ブロック２２には横駆動モータ２５が搭載され、その横駆動モータ２５によって例えばラックピニオン機構（図示せず）を駆動することにより駆動ブロック２２を左右に移動させることができる。この結果、駆動ブロック２２ひいては撮像装置２０を前後左右方向の所望の位置に移動させることができる。

撮像装置２０の下部には、レンズ２０Ｂの下方領域に光を照射するための照明装置２９が設けられ、これが撮像装置２０と一体的に移動可能となっている。本実施形態においては、上記照明装置２９は例えば４個のランプ２９Ａから構成され、各ランプ２９Ａの照射光軸はレンズ２０Ｂの光軸上で交差するように取り付けられている。

画像情報処理装置３０は、撮像装置２０に対して撮影を指示する撮影制御手段と、前記撮像装置移動機構２１を制御する移動制御手段とを備える。これらは、前記撮像装置２０が各受精卵２の上方で停止して撮影を行いつつ、かつ各受精卵２の上方を順に巡って循環するように制御する。撮像装置２０が全受精卵２の上方を一回りするために要する時間は例えば１０分とされ、その結果、各受精卵２については１０分毎の撮影が行われることになる。

撮像装置２０から送られた画像情報（デジタル信号）は１画面毎に画像情報処理装置３０の記憶手段に記憶される。記憶手段に記憶された画像信号は、適宜読み出されて二値化手段に入力され、ここで画像（画素）の明度を所定の閾値と比較することで二値化される。面積算出手段は、受精卵２の卵黄心血管系の血管領域８に対応する画素を例えば黒とし、その黒画素数を計測し、黒画素数と全画素数との比率から黒比率を算出し、その黒比率に基づき卵黄心血管系の血管領域８が占める総面積を算出する。
なお、画像情報処理装置３０による画像処理においては、画像情報処理装置３０に接続されたモニタ４０を確認しながら二値化手段における閾値を使用者が手動で調整することができる。

ところで、受精卵２の卵黄心血管系は正常に成長すると、図２〜図４に模式的に示したような変化を辿る。図２の受精卵２は孵卵約０日目の状態であって、卵殻３の内側部分が卵白６を示し、卵白６の内側部分が卵黄５を示し、卵黄５の中心付近に胚（胚盤葉）７が形成されている。図３の受精卵２は孵卵約３日目の状態であって、卵黄５の表面付近に胚７から放射状に拡がる卵黄心血管系の血管領域８が形成されている。図４の受精卵２は孵卵約５日目の状態であって、図３の状態よりも胚７の色が濃くなると共に、卵黄心血管系の血管領域８の枝分かれがさらに進んで卵黄心血管系の血管領域８の総面積が大きくなっている。

卵黄心血管系の血管領域８は感受性が高く、外部刺激を与えたときの応答性に優れる。また、卵黄心血管系の血管領域８では血管形成速度が速い。これらの特徴によって迅速な評価が可能となる。また、微量の試料で測定・評価が可能となる。このことは例えば、大量に調整することが困難な物質の作用を評価する場合に特に有効な評価系になることを意味する。

卵黄心血管系の血管領域８は発生段階ではじめに形成される血管系であり、しかも受精卵２の表層近くに形成されることからその観察及び測定が容易である。また、単純な構造であることも、卵黄心血管系の血管領域８の観察及び測定に対して有利に働く。さらに、動物個体に比較して鳥類の受精卵２は固体差が小さいことから、得られるデータの信頼性が高く、再現性もよい。
このような発育過程を辿る受精卵２の卵黄心血管系の血管領域８に対して薬剤候補物質が作用すると、例えば血管新生を阻害することがあり、それを観察することで薬剤候補物質の生物に対する作用に関して、薬剤候補物質をスクリーニングできる。

本実施形態のスクリーニングの実験例は次の通りである。
１．転卵培養（孵卵後数日間）
産卵直後の受精卵２を温度３７．５〜３８．５℃、相対湿度６０〜８０％の条件下、２．８日間転卵培養する。転卵角度は９０°とし、１時間に２回の頻度で転卵させる。
２．卵殻切断と静置培養（孵卵後数日間経過後）
転卵培養後、受精卵２の鈍端部側の卵殻３の外周面を切断し、開口部４を設ける。受精卵２の表面にリング状のプラスチック小板（内径約５ｍｍ）を載せた後、受精卵２の表面が乾燥しないように蓋をし、インキュベータ１０内で静置培養する。インキュベータ１０の内部は、環境制御手段により温度３７．５〜３８．５℃及び相対湿度６０〜８０％となるように管理し、受精卵２の発育に悪影響を与えないようにする。

３．静置培養開始から２４時間後に、プラスチック小板の中央開口部（測定領域）から受精卵２の卵黄５の表面に所定の濃度に調整された薬剤（例えば血管新生阻害剤カプトプリル（アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤））のＰＢＳ溶液を１００μｌ添加する。そして、薬剤添加後も引き続き静置培養を継続する。なお、比較サンプルとしてＰＢＳのみを１００μｌ添加したもの及び無添加のものを用意する。
４．撮影
添加０分後から添加１２０分後まで１０分間隔で測定領域をデジタルカメラで写真撮影し、卵黄心血管系の血管領域８の連続的変化を観察する。

５．画像解析
得られた画像信号をグレースケール変換し、卵黄心血管系の血管領域８に対応する画素が黒となるように二値化し、得られた黒画素数を計測し、黒画素数と全画素数との比率から黒比率を算出し、黒比率に基づいて測定領域に存在する卵黄心血管系の血管領域８の総面積を算出する。
６．評価結果
卵黄心血管系の血管領域８の総面積をグラフ化し、評価結果の検討を行う。評価結果の一例として、添加６０分後から、薬剤を添加したものと添加しなかったものとの間に有意差が認められた。このようにわずか６０分という短時間で薬剤の作用を明確に判定することができた。

以上のように本実施形態では次に示す効果を奏することができる。
１．薬剤等の被験物質のスクリーニング作業を非常に短時間で大量に行うことができると共に、被験物質の生物に対する作用を正しく評価することができる。
２．血管新生の状態、例えば卵黄血管の本数の変化や卵黄心血管系の血管領域８の総面積の変化等を数値化して把握することができる。
３．スクリーニングにかかるコストを大幅に低減することができる。
４．受精卵２毎にばらつきの少ない評価情報を得ることができる。
＜他の実施形態＞
本発明は上記記述及び図面によって説明した実施形態に限定されるものではなく、例えば次のような実施形態も本発明の技術的範囲に含まれる。

（１）本実施形態では撮像装置２０としてデジタルカメラを例示したものの、本発明によれば、撮像装置２０として卵黄心血管系の血管中を流れる血球の様子を動画として撮影するデジタルビデオであってもよい。
（２）本実施形態では受精卵収容室としてインキュベータ１０を例示したものの、本発明によれば、所定の環境条件となるように管理することができるものであれば他の機械であってもよく、例えば恒温恒湿槽でもよい。また、本発明の環境制御手段によると、一定温度及び一定湿度に保持するものに限られず、温度及び湿度が変化するような環境条件となるように設定することも可能である。
（３）本実施形態では卵黄心血管系の血管領域８の映像を画像信号として出力するデジタル方式のものを例示したものの、本発明によれば、銀塩カメラを用いて卵黄心血管系の血管領域８の映像を撮影し、現像したフィルムを目で見て薬剤添加の有無による有意差を評価してもよいし、或いは現像したフィルムをスキャナで取り込んで、画像処理して数値化して評価してもよい。

（４）本実施形態では一定時間毎（例えば１０分毎）に卵黄心血管系の血管領域８を撮影するものを例示したものの、本発明によれば、最初の１時間は１０分毎に撮影し、次の１時間は５分毎に撮影する等、経時的に撮影が行われるものであればよく、撮影する間隔は一定でなくてもよい。
（５）本実施形態では複数の受精卵２を収容可能なインキュベータ１０を例示したものの、本発明によると、受精卵２の数は限定されない。
（６）本実施形態では画像情報処理装置３０に記憶手段を設けたものを例示したものの、本発明によると、撮像装置２０に記憶手段を設けて、この記憶手段に記憶された画像情報を適宜読み出して画像処理を行うようにしてもよい。

（７）本実施形態では照明装置２９が撮像装置２０と一体的に移動可能とされているものを例示したものの、本発明によると、照明装置２０を各受精卵２が一定の照射条件となるように複数個設置しておき、撮像装置２０のみを移動させるようにしてもよい。
（８）本実施形態では撮像装置２０が移動するものを例示したものの、本発明によれば、受精卵２を配置している受精卵載置台１１が移動するものであってもよい。
（９）本実施形態では卵黄心血管系の血管領域８を観察するものを例示したものの、本発明によれば、卵黄心血管系であれば卵黄心血管系の血管領域８以外の部分を観察するものであってもよく、例えば胚７を観察してもよい。

実施形態１における検査装置を用いて卵黄心血管系を撮影する様子を模式的に示した斜視図 その凹部内にセットされた孵卵約０日目の受精卵を上方から見た状態を模式的に示した平面図 その凹部内にセットされた孵卵約３日目の受精卵を上方から見た状態を模式的に示した平面図 その凹部内にセットされた孵卵約５日目の受精卵を上方から見た状態を模式的に示した平面図

符号の説明

１…評価装置
２…受精卵
３…卵殻
４…開口部
７…胚
８…卵黄心血管系の血管領域
１０…インキュベータ（受精卵収容室）
２０…撮像装置
２１…撮像装置移動機構
２９…照明装置
３０…画像情報処理装置

Claims (4)

1. 被験物質の生物に対する作用を評価するための評価装置であって、
   前記被験物質を加えた前記受精卵を収容可能な受精卵収容室と、
   前記受精卵収容室内を前記受精卵に対して所定の環境条件となるように管理する環境制御手段と、
   前記受精卵の卵殻に設けた開口部を通して前記受精卵の卵黄心血管系を撮影する撮像装置とを備えた被験物質の評価装置。
2. 前記撮像装置はビデオ撮影装置である請求項１記載の被験物質の評価装置。
3. 前記撮像装置は前記卵黄心血管系の映像を画像情報として出力するデジタル方式のものであって、さらに、その画像情報に基づいて前記卵黄心血管系における血管の枝分かれの状態や胚の心拍数等の前記卵黄心血管系の状態を経時的に測定する画像情報処理装置を備えている請求項１または請求項２記載の被験物質の評価装置。
4. 前記受精卵収容室は複数の受精卵を収容可能であって、さらに前記撮像装置を前記各受精卵の卵黄心血管系を個別的に撮影すべく移動させる撮像装置移動機構を備え、かつ、前記撮像装置には前記受精卵の卵黄心血管系部分に光を照射する照明装置が設けられてその照明装置が前記撮像装置と一体的に移動可能とされている請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の被験物質の評価装置。

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