JP2008072971A - Novel gene for controlling low-amylose content and method for identifying low-amylose rice variety - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、低アミロース性を支配する遺伝子を継承する稲の品種・系統・個体に特異的な遺伝子に関する。また本発明は、低アミロース米品種の識別方法及び識別用キットに関する。 The present invention relates to a gene specific to rice cultivars / lines / individuals that inherit a gene that controls low amylose properties. The present invention also relates to a method for identifying low amylose rice varieties and a kit for identification.
水稲品種において食味は極めて重要な実用形質である。例えば、北海道品種「おぼろづき」はその特異的な低アミロース性により、飯の粘りが強く極めて食味が良い。その特性が高く評価され、現在北海道の奨励品種となるなど、生産者及び消費者から強いニーズがある。 Taste is a very important practical character in rice varieties. For example, the Hokkaido variety “Oborozuki” has a very low taste due to its unique low amylose properties. There are strong needs from producers and consumers, such as being highly evaluated for its characteristics and becoming a recommended variety in Hokkaido.
低アミロース米品種の有する遺伝子及びそのＤＮＡ塩基配列に基づいて識別する方法としては、「スノーパール」（特許文献１）及び「ミルキークイーン」（特許文献２）についてすでに報告がある。「おぼろづき」に関しては低アミロース性を付与する母本として育種に用いられているが、低アミロース性を支配する遺伝子は不明であり、ＤＮＡマーカーによる識別法も確立されていない。 There are already reports on “Snow Pearl” (Patent Document 1) and “Milky Queen” (Patent Document 2) as methods for identifying low amylose rice varieties based on genes and their DNA base sequences. “Obozuki” is used for breeding as a mother plant that imparts low amylose properties, but the gene that controls low amylose properties is not known, and a method for identifying DNA markers has not been established.
北海道では、稲品種の食味改良に低アミロース性を活用する意義が特に大きい。上記の「スノーパール」や「ミルキークイーン」の持つ遺伝子や識別法についてはすでに各地で使われているが、北海道ではこれらを用いた実用品種は開発されていない。またこれまで北海道の品種（彩、はなぶさ、あやひめなど）に導入されてきた稲変異体ＮＭ３９１由来の低アミロース性は、アミロース含量が１０％程度とかなり低くなるため、米粒の白濁や飯の粘りが強すぎ単品では食しにくい欠点があった。一方「おぼろづき」の有する低アミロース性は、１４％程度のアミロース含量を示し、適度な飯の粘りを付与するとともに米の白濁程度も少なく利用価値が高い。 In Hokkaido, the significance of utilizing low amylose properties to improve the taste of rice varieties is particularly significant. The genes and identification methods of the above-mentioned “Snow Pearl” and “Milky Queen” have already been used in various places, but no practical varieties using these have been developed in Hokkaido. In addition, low amylose derived from rice mutant NM391, which has been introduced in Hokkaido varieties (Aya, Hanabusa, Ayahime, etc.), has a very low amylose content of about 10%. However, there was a drawback that it was too strong to be eaten alone. On the other hand, the low amylose property of “Oborozuki” has an amylose content of about 14%, imparts moderate rice stickiness, and has a low level of rice turbidity, and is highly useful.
しかしこの「おぼろづき」の低アミロース性は、白濁しにくいことから選抜に際しては米粒の目視による判別が難しく、成分分析を行わなければならなかった。 However, the low amylose property of “Oborozuki” is not easily clouded, so it is difficult to visually discriminate rice grains during selection, and component analysis must be performed.
そのため、「おぼろづき」などの低アミロース品種の有する低アミロース性を支配する遺伝子の解明とＤＮＡマーカーの開発を行うことにより、効率的な育種や品種識別に広く活用できることが期待されていた。 For this reason, it has been expected that the gene which controls the low amylose property of low amylose varieties such as “Oborozuki” and the development of DNA markers can be widely used for efficient breeding and variety identification.
本発明は、低アミロース品種の簡便かつ高精度な識別方法及びその識別手段を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a simple and highly accurate identification method and identification means for a low amylose variety.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、低アミロース品種である「おぼろづき」及び「北海２８７号」において低アミロース性を支配する遺伝子として新規なＷｘ遺伝子を同定することに成功し、またこのＷｘ遺伝子が、他の米品種のものと比較して３７ｂｐの欠失領域を有することを見出し、これを利用することによって低アミロース米品種を識別することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have identified a novel Wx gene as a gene that controls low amylose properties in the low amylose varieties “Oborozuki” and “North Sea 287”. Successful finding that this Wx gene has a 37 bp deletion region compared to that of other rice varieties, and using this, the knowledge that low amylose rice varieties can be identified. The present invention has been completed.
すなわち本発明は以下の（１）〜（８）に関する。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のＷｘ遺伝子。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列に対し相補的な配列を有する核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低アミロース性を決定する機能を有する遺伝子
That is, the present invention relates to the following (1) to (8).
(1) Wx gene of the following (a) or (b).
(A) a gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) a gene that hybridizes with a nucleic acid having a sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions and has a function of determining low amylose properties
（２）識別対象の米における上記（１）のＷｘ遺伝子の存在を検出することを特徴とする低アミロース米品種の識別方法。 (2) A method for identifying low amylose rice varieties, wherein the presence of the Wx gene of (1) above is detected in rice to be identified.
上記方法において、上記（１）のＷｘ遺伝子の存在の検出は、例えばＷｘ遺伝子における配列番号３又は４に示される塩基配列の不在の検出により行うことができる。また、Ｗｘ遺伝子の検出は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ハイブリダイゼーション、配列決定法、又は制限酵素断片長多型を利用した方法により行うことができる。 In the above method, the presence of the Wx gene of (1) can be detected by, for example, detecting the absence of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 in the Wx gene. The Wx gene can be detected by, for example, polymerase chain reaction (PCR), hybridization, sequencing, or a method using restriction enzyme fragment length polymorphism.
ＰＣＲを行う場合には、例えば、配列番号１の１番から２２８２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマーと、配列番号１の２２８３番から３６１２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマーとを用いて行うことができる。また、例えば、配列番号１の１番から２２８２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマー、又は配列番号１の２２８３番から３６１２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマーと、配列番号３若しくは４の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマーとを用いて行うことができる。より具体的には、限定されるものではないが、配列番号７からなるプライマー及び配列番号８からなるプライマーを用いてＰＣＲを行うことが好ましい。また例えば、配列番号１５からなるプライマー及び配列番号１６からなるプライマーを用いてＰＣＲを行うことが好ましい。 In the case of performing PCR, for example, a primer consisting of at least 10 bases in the base sequence from 1 to 2282 of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence and a base sequence from 2283 to 3612 of SEQ ID NO: 1 or This can be performed using a primer consisting of at least 10 consecutive bases in the complementary sequence. Further, for example, a primer consisting of at least 10 bases in the base sequence from 1 to 2282 of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, or a base sequence from 2283 to 3612 of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof It can be carried out using a primer consisting of at least 10 consecutive bases and a primer consisting of at least 10 consecutive bases of the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 or its complementary sequence. More specifically, although not limited, it is preferable to perform PCR using a primer consisting of SEQ ID NO: 7 and a primer consisting of SEQ ID NO: 8. For example, PCR is preferably performed using a primer consisting of SEQ ID NO: 15 and a primer consisting of SEQ ID NO: 16.
ハイブリダイゼーションを行う場合には、配列番号１の塩基配列若しくはその相補配列において少なくとも２２７９番から２２８３番の塩基を含み、かつ連続する少なくとも２０塩基からなるプローブを用いて行うことができる。また、例えば、配列番号３若しくは４の塩基配列若しくはその相補配列の連続する少なくとも２０塩基を含むプローブ、又は配列番号５に示される塩基配列若しくはその相補配列において２７３４番から２７７０番のうちの少なくとも１つの塩基を含み、かつ連続する少なくとも２０塩基からなるプローブを用いて行うことができる。 Hybridization can be performed using a probe comprising at least 2279 to 2283 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence and consisting of at least 20 consecutive bases. In addition, for example, a probe containing at least 20 bases of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 or its complementary sequence, or at least one of Nos. 2734 to 2770 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or its complementary sequence This can be carried out using a probe comprising one base and consisting of at least 20 consecutive bases.
上記方法において、低アミロース米品種としては、北海２８７号、おぼろづき、及びこれらの同系統品種が含まれる。 In the above method, examples of the low amylose rice varieties include North Sea No. 287, Orozuki, and the same varieties thereof.
（３）以下のプライマーを含むことを特徴とする低アミロース米品種の識別用キット。
（ａ）配列番号１の１番から２２８２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマー
（ｂ）配列番号１の２２８３番から３６１２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマー
(3) A kit for identifying low amylose rice varieties comprising the following primers:
(A) Primer consisting of at least 10 consecutive bases in the base sequence from 1 to 2282 of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence (b) Of the base sequence from 2283 to 3612 in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence Primer consisting of at least 10 consecutive bases
（４）以下のプライマーを含むことを特徴とする低アミロース米品種の識別用キット。
（ａ）配列番号１の１番から２２８２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマー、又は配列番号１の２２８３番から３６１２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマー
（ｂ）配列番号３若しくは４の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマー
(4) A kit for identifying low amylose rice varieties comprising the following primers:
(A) a primer comprising at least 10 consecutive bases from the 1st to 2282th base sequences of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, or a continuous of the 2283th to 3612th base sequences of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof Primer consisting of at least 10 bases (b) Primer consisting of at least 10 consecutive bases of the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 or its complementary sequence
（５）配列番号７からなるプライマー及び配列番号８からなるプライマーを含むことを特徴とする低アミロース米品種の識別用キット。
（６）配列番号１５からなるプライマー及び配列番号１６からなるプライマーを含むことを特徴とする低アミロース米品種の識別用キット。
(5) A kit for identifying low amylose rice varieties comprising a primer consisting of SEQ ID NO: 7 and a primer consisting of SEQ ID NO: 8.
(6) A kit for identifying low amylose rice varieties comprising a primer consisting of SEQ ID NO: 15 and a primer consisting of SEQ ID NO: 16.
（７）配列番号１の塩基配列若しくはその相補配列において少なくとも２２７９番と２２８３番の塩基を含み、かつ連続する少なくとも２０塩基からなるプローブを含むことを特徴とする低アミロース米品種の識別用キット。 (7) A kit for identifying low amylose rice varieties comprising a probe comprising at least 2279 and 2283 bases in the base sequence of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof and comprising at least 20 consecutive bases.
（８）配列番号３若しくは４の塩基配列若しくはその相補配列の連続する少なくとも２０塩基を含むプローブ、又は配列番号５に示される塩基配列若しくはその相補配列において２７３４番から２７７０番のうちの少なくとも１つの塩基を含み、かつ連続する少なくとも２０塩基からなるプローブを含むことを特徴とする低アミロース米品種の識別用キット。 (8) A probe comprising at least 20 bases of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 or its complementary sequence, or at least one of 2734 to 2770 in the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 5 or its complementary sequence A kit for identifying low amylose rice varieties comprising a probe comprising a base and comprising at least 20 consecutive bases.
本発明により、低アミロース米品種の識別方法及び識別用キットが提供される。かかる方法及びキットにより、低アミロース米品種を簡便かつ高精度で識別することが可能となる。従って、ＤＮＡマーカー選抜による稲新品種育成やＤＮＡ鑑定による品種識別など農業・食品分野において広範な利用が期待される。 According to the present invention, a low amylose rice variety identification method and identification kit are provided. By such a method and kit, it becomes possible to identify low-amylose rice varieties easily and with high accuracy. Therefore, it is expected to be widely used in the agricultural and food fields, such as breeding of new rice varieties by DNA marker selection and variety identification by DNA identification.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、「おぼろづき」や「北海２８７号」に存在する新規Ｗｘ遺伝子と、そのＷｘ遺伝子を検出することに基づく低アミロース米品種の識別方法に関する。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention relates to a novel Wx gene present in “Oborozuki” and “North Sea No. 287” and a method for identifying low amylose rice varieties based on detection of the Wx gene.
「おぼろづき」は、親の突然変異系統「北海２８７号」から受け継いだ低アミロース性により、一般品種に比べアミロース含量が低いものの既知の低アミロース米品種と比較するとアミロース含量がやや高い特性を有する。本発明者は、突然変異系統「北海２８７号」（おぼろづきの低アミロース性供与親）の後代を用いたＱＴＬ解析を行い、ｗｘ座に低アミロース性ＱＴＬを検出した。この結果に基づき「北海２８７号」のｗｘ座のＤＮＡ塩基配列をＤＤＢＪに登録されているｗｘ座の塩基配列及び原品種である「きらら３９７」のＷｘ遺伝子の塩基配列と比較したところ、「きらら３９７」については登録されている配列と違いが認められなかったが、「北海２８７号」については第１０エキソンと第１１エキソンの間のイントロン部分に３７ｂｐの塩基の欠失が認められた（図１）。このような欠失はこれまで報告されていないため、既報のＷｘ遺伝子とは異なる新規のＷｘ遺伝子である。
“Oborozuki” has a low amylose content inherited from the parental mutant line “North Sea No. 287”, but has a slightly higher amylose content compared to known low amylose rice varieties, although it has a lower amylose content than general varieties. The present inventor conducted QTL analysis using a progeny of the mutant line “North Sea No. 287” (a low amylose donor of the ghost) and detected low amylose QTL at the wx locus. Based on this result, the DNA base sequence of the wx locus of “North Sea No. 287” was compared with the base sequence of the wx locus registered in DDBJ and the base sequence of the Wx gene of the original variety “Kirara 397”. 397 ”showed no difference from the registered sequence, but“ Hokkaido No. 287 ”showed a 37 bp deletion in the intron between
またこの塩基欠失の両側にプライマーを設計したところ、「きらら３９７」と「北海２８７号」の間でＰＣＲ産物の長さに明らかな違いが認められた。また「おぼろづき」及び交雑後代で低アミロース性を示す系統についても「北海２８７号」と同じサイズのＰＣＲ産物が得られた。従って、新規Ｗｘ遺伝子を検出することによって、「おぼろづき」や「北海２８７号」のＷｘ遺伝子を含む低アミロース米品種を識別することができる。 In addition, when primers were designed on both sides of this base deletion, a clear difference was observed in the length of the PCR product between “Kirara 397” and “North Sea 287”. In addition, a PCR product having the same size as “North Sea No. 287” was also obtained for “Oborozuki” and the lines showing low amylose in the progeny of the cross. Therefore, by detecting a novel Wx gene, it is possible to identify low amylose rice varieties that contain the Wx gene of “Oborozuki” or “North Sea 287”.
１．Ｗｘ遺伝子
配列番号１にＷｘ遺伝子の塩基配列を示し、配列番号２にこれによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す。Ｗｘ遺伝子は、米品種の低アミロース性を決定する機能を有する。
1. Wx gene SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the Wx gene, and SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the protein encoded thereby. The Wx gene has a function of determining the low amylose property of rice varieties.
Ｗｘ遺伝子は、「おぼろづき」、「北海２８７号」及びその後代の任意の細胞若しくは組織から調製したＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを用いて、上記遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を行うことにより調製することができる。また、一旦遺伝子の塩基配列が確定すると、その後は化学合成によって、この遺伝子を得ることができる。 The Wx gene can be obtained by PCR using primers designed based on the nucleotide sequence of the above gene using DNA or cDNA library prepared from “Obozuki”, “North Sea No. 287” and any subsequent cell or tissue. It can be prepared by performing a polymerase chain reaction). Moreover, once the base sequence of a gene is determined, this gene can be obtained by chemical synthesis thereafter.
部位特異的突然変異誘発法等によって遺伝子の変異型であって上記機能を有するものを合成することもできる。なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した市販の変異導入用キットなどを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャッフリングについてはStemmer, W. P. 1994, Nature, 370:389-391及びStemmer W. P., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 10747-10751を参照されたい。 It is also possible to synthesize gene variants having the above functions by site-directed mutagenesis. In order to introduce a mutation into a gene, a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method or a method based thereon can be employed. For example, mutation is introduced using a commercially available mutation introduction kit using site-directed mutagenesis. Moreover, gene mutation introduction and chimera genes can be constructed by techniques such as error introduction PCR and DNA shuffling. Error introduction PCR and DNA shuffling are techniques known in the art. For example, for error introduction PCR, Chen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5618-5622 See also Stemmer, WP 1994, Nature, 370: 389-391 and Stemmer WP, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751 for DNA shuffling.
変異した遺伝子が目的の機能（低アミロース性を決定する機能）を有するか否かは、変異遺伝子で形質転換体において発現させ、得られる形質転換体のアミロース含量を測定することにより確認することができる。 Whether or not the mutated gene has the desired function (function to determine low amylose properties) can be confirmed by expressing the mutated gene in the transformant and measuring the amylose content of the resulting transformant. it can.
さらに、上記塩基配列からなる核酸の全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、その機能を有する遺伝子も本発明のＷｘ遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、高い相同性（相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上）を有するＤＮＡがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、ナトリウム濃度が１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭであり、温度が６０〜６８℃、好ましくは６５℃での条件をいう。例えばハイブリダイゼーション条件が６５℃であり、洗浄の条件が０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中で６５℃、１０分の場合に、慣例的な手法、例えばサザンブロット、ドットブロットハイブリダイゼーションなどによってハイブリダイズすることが確認された場合には、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするといえる。 Furthermore, the Wx gene of the present invention also includes a gene that hybridizes under stringent conditions with a sequence complementary to all or a part of the nucleic acid comprising the above base sequence and has the function. Stringent conditions refer to conditions in which specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. For example, it refers to conditions under which DNA having high homology (homology is 80% or more, preferably 90% or more) hybridizes. More specifically, the sodium concentration is 150 to 900 mM, preferably 600 to 900 mM, and the temperature is 60 to 68 ° C, preferably 65 ° C. For example, when hybridization conditions are 65 ° C. and washing conditions are 0.1 × SSC containing 0.1% SDS at 65 ° C. for 10 minutes, conventional techniques such as Southern blot and dot blot hybridization are used. When hybridization is confirmed by the above, it can be said that hybridization is performed under stringent conditions.
２．低アミロース米品種の識別
本発明の低アミロース米品種の識別方法では、低アミロース米品種におけるＷｘ遺伝子の塩基配列と、通常のＷｘ遺伝子の塩基配列の相違を利用する。コシヒカリ等の通常のうるち米品種は、ｗｘ座に優性のうるち遺伝子Ｗｘ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５８２２８；塩基配列を配列番号５に示す）を保有していることが知られている（文献：奥野（１９９５）「米の科学」竹生新治郎編 朝倉書店Ｐ６１−７６）。本明細書においては、今回見出された「おぼろづき」や「北海２８７号」に存在するＷｘ遺伝子を「本発明のＷｘ遺伝子」と、コシヒカリ等の通常のうるち米品種に存在するＷｘ遺伝子を「うるち米品種のＷｘ遺伝子」という。本発明のＷｘ遺伝子（配列番号１）とうるち米品種のＷｘ遺伝子（配列番号５）は、図１に示すように、本発明のＷｘ遺伝子が第１０エキソンと第１１エキソンの間のイントロン部分に３７ｂｐの塩基の欠失（配列番号３又は４）を有するという点で相違する。従って、識別対象の米のゲノムＤＮＡにおけるこの欠失領域の有無を検出することによって、本発明のＷｘ遺伝子の有無を簡便に検出することができる。
2. Identification of low amylose rice varieties In the method for identifying low amylose rice varieties of the present invention, the difference between the base sequence of the Wx gene in the low amylose rice varieties and the base sequence of the normal Wx gene is used. Ordinary glutinous rice varieties such as Koshihikari are known to have a dominant glutinous gene Wx (GenBank accession number X58228; the base sequence is shown in SEQ ID NO: 5) at the wx locus (Reference: Okuno ( 1995) “Science of rice” edited by Shinjiro Takeo, Asakura Shoten P61-76). In the present specification, the Wx gene present in “Oborozuki” and “North Sea No. 287” found this time is referred to as “Wx gene of the present invention”, and the Wx gene present in ordinary glutinous rice varieties such as Koshihikari is referred to as “glutinous rice”. "Wx gene of the variety". As shown in FIG. 1, the Wx gene of the present invention (SEQ ID NO: 1) and the Wx gene of glutinous rice varieties (SEQ ID NO: 5) have 37 bp in the intron portion between the 10th and 11th exons. In that it has a base deletion (SEQ ID NO: 3 or 4). Therefore, the presence or absence of the Wx gene of the present invention can be easily detected by detecting the presence or absence of this deletion region in the rice genomic DNA to be identified.
本発明において識別の対象となる低アミロース米品種は、おぼろづき、北海２８７号及びそれらの同系統品種である。なお、おぼろづきは登録番号第１４０３３号（登録日は２００６年３月２０日）として品種登録されている。ここで、品種とは、重要な形質に係る特性の全部又は一部によって他の植物体の集合と区別することができ、かつ、その特性の全部を保持しつつ繁殖させることができる一の植物体の集合を意味する。また、同系統品種とは、おぼろづき又は北海２８７号を交配親に用いて育成され得る品種のことを意味する。従って、本発明に係る識別方法においては、本発明のＷｘ遺伝子を有するおぼろづき、北海２８７号及びそれらの同系統品種と、コシヒカリなどの一般うるち米品種、もち米品種、及び彩やミルキークイーンなどの他の低アミロース米品種などとを識別する。一般うるち米品種、もち米品種、及び他の低アミロース米品種としては、例えばきらら３９７、ゆきひかり、ほしのゆめ、ななつぼし、あきほ、ほしたろう、吟風、大地の星、ふっくりんこ、上育４４５号、彗星、はくちょうもち、風の子もち、あやひめ、彩、ＮＭ３９１、ミルキークイーン、及びスノーパールが挙げられる。 The low amylose rice varieties to be identified in the present invention are Orozuki, North Sea No. 287 and their same line varieties. Oborozuki is registered as a model number with registration number 14033 (registration date is March 20, 2006). Here, a variety is a plant that can be distinguished from a collection of other plant bodies by all or part of the characteristics related to important traits, and can be propagated while retaining all of the characteristics. Means a set of bodies. In addition, the same line variety means a variety that can be bred using Oborozuki or North Sea No. 287 as a mating parent. Therefore, in the identification method according to the present invention, the bottling having the Wx gene of the present invention, North Sea No. 287 and their same varieties, general glutinous rice varieties such as Koshihikari, glutinous rice varieties, and other colors such as Aya and Milky Queen Distinguish from low amylose rice varieties. General glutinous rice varieties, glutinous rice varieties, and other low amylose rice varieties include, for example, Kirara 397, Yukihikari, Hoshino Yume, Nanatsuboshi, Akiho, Hotarumo, Ginfu, Earth Star, Fukumiko, Top Iku No. 445, Comet, Hakuchomochi, Kaze no Komochi, Ayahime, Aya, NM391, Milky Queen, and Snow Pearl.
本方法では、識別しようとする米からゲノムＤＮＡを調製する。ゲノムＤＮＡの調製は、公知の方法、例えばフェノール／クロロホルム法、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法などにより調製することができる。また、必要であれば、陽性対照及び／又は陰性対照の米品種からゲノムＤＮＡを調製してもよい。 In this method, genomic DNA is prepared from rice to be identified. The genomic DNA can be prepared by a known method such as a phenol / chloroform method, a cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method, or the like. Further, if necessary, genomic DNA may be prepared from a positive control and / or negative control rice variety.
ＤＮＡを調製する供与源もまた特に限定されるものではなく、植物体のいずれの組織からも抽出できるが、例えば、穂、葉、根、種子、精米、玄米、さらに炊飯米等からも抽出することができる。 The source for preparing the DNA is not particularly limited, and can be extracted from any tissue of the plant. For example, it is extracted from ears, leaves, roots, seeds, polished rice, brown rice, and cooked rice. be able to.
ゲノムＤＮＡにおけるＷｘ遺伝子の検出は、当技術分野で公知の任意の方法により行うことができ、限定するものではないが、増幅反応、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用した方法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）を利用した方法、ハイブリダイゼーション法、直接配列決定法、プライマー伸長反応を利用する方法などが挙げられる。これらの方法はいずれも当業者に周知である。以下にその概要を説明する。 Detection of the Wx gene in genomic DNA can be performed by any method known in the art, and includes, but is not limited to, an amplification reaction, for example, a method utilizing polymerase chain reaction (PCR), restriction enzyme fragment length Examples include a method using a polymorphism (RFLP), a hybridization method, a direct sequencing method, a method using a primer extension reaction, and the like. Both of these methods are well known to those skilled in the art. The outline will be described below.
（１）増幅反応を利用した方法（ＰＣＲ法）
本発明においては、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してＷｘ遺伝子を簡便かつ高精度に検出することができる。
(1) Method using amplification reaction (PCR method)
In the present invention, for example, the polymerase chain reaction (PCR) can be used to detect the Wx gene simply and with high accuracy.
最初に、本発明のＷｘ遺伝子とうるち米品種のＷｘ遺伝子との塩基配列の比較から、両者を区別して増幅することができるプライマーを設計する。例えば、図２Ａに示すように、本発明のＷｘ遺伝子の５’末端から欠失領域までの間で設計したプライマーと、欠失領域から３’末端までの間で設計したプライマーとからなるプライマーセット（ａ）を設計することができる。より具体的には、配列番号１の１番から２２８２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマーと、配列番号１の２２８３番から３６１２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマーとからなるプライマーセットを設計することができる。このように設計されたプライマーセットを用いた場合、本発明のＷｘ遺伝子によって得られる増幅産物と、うるち米品種のＷｘ遺伝子によって得られる増幅産物との大きさが異なることになる。従って、プライマーセットを用いた増幅反応により得られる増幅産物の大きさの相違から、試験対象のゲノムＤＮＡが本発明のＷｘ遺伝子であるか又はうるち米品種のＷｘ遺伝子であるかを区別することができる。 First, from the comparison of the nucleotide sequences of the Wx gene of the present invention and the Wx gene of glutinous rice varieties, primers that can be distinguished and amplified are designed. For example, as shown in FIG. 2A, a primer set comprising a primer designed between the 5 ′ end and the deletion region of the Wx gene of the present invention and a primer designed between the deletion region and the 3 ′ end. (A) can be designed. More specifically, a primer consisting of at least 10 bases in the base sequence from 1 to 2282 of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, and a base sequence from 2283 to 3612 of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence A primer set consisting of a primer consisting of at least 10 consecutive bases can be designed. When the primer set designed in this way is used, the size of the amplification product obtained by the Wx gene of the present invention and the size of the amplification product obtained by the Wx gene of glutinous rice varieties are different. Therefore, it is possible to distinguish whether the genomic DNA to be tested is the Wx gene of the present invention or the Wx gene of glutinous rice varieties from the difference in the size of the amplification product obtained by the amplification reaction using the primer set. .
また例えば、図２Ａに示すように、本発明のＷｘ遺伝子の５’末端から欠失領域までの間で設計したプライマーと、欠失領域に設計したプライマーとからなるプライマーセット（ｂ）を設計することができる。具体的には、配列番号１の１番から２２８２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマーと、配列番号３若しくは４の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマーとからなるプライマーセットを設計することができる。このようなプライマーセットを用いた場合、本発明のＷｘ遺伝子からは増幅産物は得られず、うるち米品種のＷｘ遺伝子からのみ増幅産物が得られる。従って、プライマーセットを用いた増幅反応により得られる増幅産物の有無から、試験対象のゲノムＤＮＡが本発明のＷｘ遺伝子であるか又はうるち米品種のＷｘ遺伝子であるかを区別することができる。 Also, for example, as shown in FIG. 2A, a primer set (b) comprising a primer designed between the 5 ′ end of the Wx gene of the present invention and the deleted region and a primer designed in the deleted region is designed. be able to. Specifically, a primer consisting of at least 10 bases of the base sequence of No. 1 to 2282 of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, and at least continuous of the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 or its complementary sequence A primer set consisting of 10 base primers can be designed. When such a primer set is used, an amplification product cannot be obtained from the Wx gene of the present invention, and an amplification product can be obtained only from the Wx gene of glutinous rice varieties. Therefore, whether the genomic DNA to be tested is the Wx gene of the present invention or the Wx gene of glutinous rice varieties can be distinguished from the presence or absence of an amplification product obtained by an amplification reaction using a primer set.
さらに、図２Ａに示すように、欠失領域に設計したプライマーと、本発明のＷｘ遺伝子の欠失領域から３’末端までの間で設計したプライマーとからなるプライマーセット（ｃ）を設計することができる。具体的には、配列番号１の２２８３番から３６１２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマーと、配列番号３若しくは４の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマーとからなるプライマーセットを設計することができる。このようなプライマーセットを用いた場合、本発明のＷｘ遺伝子からは増幅産物は得られず、うるち米品種のＷｘ遺伝子からのみ増幅産物が得られる。従って、プライマーセットを用いた増幅反応により得られる増幅産物の有無から、試験対象のゲノムＤＮＡが本発明のＷｘ遺伝子であるか又はうるち米品種のＷｘ遺伝子であるかを区別することができる。 Furthermore, as shown in FIG. 2A, a primer set (c) comprising a primer designed for the deletion region and a primer designed between the deletion region of the Wx gene of the present invention and the 3 ′ end is designed. Can do. Specifically, a primer consisting of at least 10 bases of the nucleotide sequence 2283 to 3612 of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence, and at least a sequence of at least the base sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 or its complementary sequence A primer set consisting of 10 base primers can be designed. When such a primer set is used, an amplification product cannot be obtained from the Wx gene of the present invention, and an amplification product can be obtained only from the Wx gene of glutinous rice varieties. Therefore, whether the genomic DNA to be tested is the Wx gene of the present invention or the Wx gene of glutinous rice varieties can be distinguished from the presence or absence of an amplification product obtained by an amplification reaction using a primer set.
プライマーの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプライマーは、特異的なアニーリングが可能な条件を満たす、例えば特異的なアニーリングが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。例えば、プライマーとしての機能を有する長さとしては、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは１５〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。また設計の際には、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、鋳型となるＤＮＡとプライマーとが二本鎖を形成してアニーリングするためには、アニーリングの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。Ｔｍの確認には、公知のプライマー設計用ソフトウエアを利用することができる。設計されたプライマーは、公知のオリゴヌクレオチド合成手法により化学合成することができるが、通常は、市販の化学合成装置を使用して合成される。 Primer design methods are well known in the art, and primers that can be used in the present invention satisfy conditions that allow specific annealing, such as length and base composition (melting temperature) that allow specific annealing. Designed to have For example, the length having a function as a primer is preferably 10 bases or more, more preferably 15 to 50 bases, and further preferably 20 to 30 bases. In designing, it is preferable to confirm the melting temperature (Tm) of the primer. Tm means a temperature at which 50% of an arbitrary nucleic acid strand forms a hybrid with its complementary strand. In order to anneal a template DNA and a primer to form a double strand, the annealing temperature must be Need to optimize. On the other hand, if this temperature is lowered too much, a non-specific reaction occurs, so it is desirable that the temperature be as high as possible. For confirmation of Tm, known primer design software can be used. The designed primer can be chemically synthesized by a known oligonucleotide synthesis method, but is usually synthesized using a commercially available chemical synthesizer.
本発明において使用可能なプライマーセットとしては、限定するものではないが、配列番号７に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーが挙げられる：
プライマーWxob-L1；5’CAGGCTGGAGGAACAGAAGG 3’（配列番号７）
プライマーWxob-R3；5’TCACCTTGCCCGGATACTTC 3’（配列番号８）
Primer sets that can be used in the present invention include, but are not limited to, a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 8:
Primer Wxob-L1; 5'CAGGCTGGAGGAACAGAAGG 3 '(SEQ ID NO: 7)
Primer Wxob-R3; 5'TCACCTTGCCCGGATACTTC 3 '(SEQ ID NO: 8)
上記プライマーセットにより得られる増幅産物は、うるち米品種のＷｘ遺伝子を用いた場合には３９５ｂｐであり、本発明のＷｘ遺伝子を用いた場合には３５８ｂｐである。従って、例えば増幅産物のゲル電気泳動などによって可視的に判定することが可能である。 The amplification product obtained by the above primer set is 395 bp when the Wx gene of glutinous rice varieties is used, and 358 bp when the Wx gene of the present invention is used. Therefore, it can be determined visually by gel electrophoresis of the amplification product, for example.
また、本発明において使用可能な別のプライマーセットとしては、配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマー及び配列番号１６に示す塩基配列からなるプライマーが挙げられる：
プライマーWxob-L3；5’AAGGGGTGAGGCTTTGAACC 3’（配列番号１５）
プライマーWxob-R4；5’CTGCAGCTGGATGAGTCCAC 3’（配列番号１６）
Another primer set that can be used in the present invention includes a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 15 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 16.
Primer Wxob-L3; 5'AAGGGGTGAGGCTTTGAACC 3 '(SEQ ID NO: 15)
Primer Wxob-R4; 5 ′
上記プライマーセットにより得られる増幅産物は、うるち米品種のＷｘ遺伝子を用いた場合には２９９ｂｐであり、本発明のＷｘ遺伝子を用いた場合には２６２ｂｐである。従って、例えば増幅産物のゲル電気泳動などによって可視的に判定することが可能である。 The amplification product obtained by the above primer set is 299 bp when the Wx gene of glutinous rice varieties is used, and 262 bp when the Wx gene of the present invention is used. Therefore, it can be determined visually by gel electrophoresis of the amplification product, for example.
増幅反応は、特に限定されないが、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により行う。 The amplification reaction is not particularly limited, but is preferably performed by a polymerase chain reaction (PCR) method.
上述のようにして、識別対象の米に由来するゲノムＤＮＡを鋳型として、本発明のＷｘ遺伝子の塩基配列を含む核酸断片及び／又はうるち米品種のＷｘ遺伝子の塩基配列を含む核酸断片を特異的に増幅することができる。 As described above, a nucleic acid fragment containing the nucleotide sequence of the Wx gene of the present invention and / or a nucleic acid fragment containing the nucleotide sequence of the Wx gene of glutinous rice varieties is specifically used using genomic DNA derived from rice to be identified as a template. Can be amplified.
続いて、増幅した核酸断片の有無を検出するか、又は核酸断片の長さを測定する。例えば、アガロースゲル電気泳動法等を利用して、特定のサイズの核酸断片が増幅されているか否かを確認する。増幅産物のサイズは設計したプライマー間の塩基配列に基づいて推測することが可能である。 Subsequently, the presence or absence of the amplified nucleic acid fragment is detected, or the length of the nucleic acid fragment is measured. For example, using agarose gel electrophoresis or the like, it is confirmed whether a nucleic acid fragment of a specific size is amplified. The size of the amplification product can be estimated based on the base sequence between the designed primers.
あるいは、プライマー又は基質に標識した標識に基づいて核酸断片の増幅の有無を検出する。例えば、増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することができる。放射性同位体としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＴＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。 Alternatively, the presence or absence of amplification of the nucleic acid fragment is detected based on a label labeled on the primer or substrate. For example, a labeled body such as a radioisotope, a fluorescent substance, or a luminescent substance can be allowed to act on dNTP taken in during the amplification reaction, and this labeled body can be detected. As a radioactive isotope, 32 P, 125 I, 35 S, or the like can be used. As the fluorescent substance, for example, fluorescein (FITC), sulforhodamine (TR), tetramethylrhodamine (TRITC) and the like can be used. As the luminescent substance, luciferin or the like can be used.
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。 There are no particular restrictions on the type of the labeled body, the method for introducing the labeled body, and the like, and various conventionally known means can be used. For example, as a method for introducing a label, a random prime method using a radioisotope can be mentioned.
標識したｄＮＴＰを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。 As a method for observing the amplification product incorporating the labeled dNTP, any method known in the art for detecting the above-described labeled body may be used. For example, when a radioisotope is used as the label, the radioactivity can be measured by, for example, a liquid scintillation counter or a γ-counter. In addition, when fluorescence is used as the label, the fluorescence can be detected using a fluorescence microscope, a fluorescence plate reader, or the like.
これにより、識別対象の米が本発明のＷｘ遺伝子を有するか否か、すなわち低アミロース米品種であるか否かを識別することができる。 This makes it possible to identify whether the rice to be identified has the Wx gene of the present invention, that is, whether it is a low amylose rice variety.
（２）ハイブリダイゼーション法
本発明のＷｘ遺伝子は、ハイブリダイゼーション法を利用して検出することもできる。ハイブリダイゼーション法は、識別対象の米由来のゲノムＤＮＡが、それに対し相補的なＤＮＡ分子（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とハイブリダイズする能力に基づいて、本発明のＷｘ遺伝子の有無を決定する方法である。ハイブリダイゼーション及び検出のための種々の技術を利用してこのハイブリダイゼーション法を行うことができる。
(2) Hybridization method The Wx gene of the present invention can also be detected using a hybridization method. The hybridization method is a method for determining the presence or absence of the Wx gene of the present invention based on the ability of genomic DNA derived from rice to be identified to hybridize with a complementary DNA molecule (for example, an oligonucleotide probe). . This hybridization method can be performed using various techniques for hybridization and detection.
最初に、本発明のＷｘ遺伝子とうるち米品種のＷｘ遺伝子との塩基配列の比較から、両者を区別してハイブリダイズすることができるプローブを設計する。例えば、図２Ｂに示すように、本発明のＷｘ遺伝子に基づいて、欠失領域をまたぐようにプローブ（ａ）を設計することができる。具体的には、配列番号１の塩基配列若しくはその相補配列において少なくとも２２７９番から２２８３番の塩基を含み、かつ連続する少なくとも２０塩基からなるプローブを設計することができる。かかるプローブは、本発明のＷｘ遺伝子に対してハイブリダイズすることができるが、うるち米品種のＷｘ遺伝子にはハイブリダイズすることができない。従って、このプローブを用いたハイブリダイゼーションの有無により、試験対象のゲノムＤＮＡが本発明のＷｘ遺伝子であるか又はうるち米品種のＷｘ遺伝子であるかを区別することができる。 First, from the comparison of the nucleotide sequences of the Wx gene of the present invention and the Wx gene of glutinous rice varieties, a probe that can distinguish and hybridize both is designed. For example, as shown in FIG. 2B, based on the Wx gene of the present invention, the probe (a) can be designed to span the deletion region. Specifically, a probe comprising at least 20 bases to 2283 in the base sequence of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence and consisting of at least 20 consecutive bases can be designed. Such a probe can hybridize to the Wx gene of the present invention, but cannot hybridize to the Wx gene of glutinous rice varieties. Therefore, whether the genomic DNA to be tested is the Wx gene of the present invention or the Wx gene of glutinous rice varieties can be distinguished by the presence or absence of hybridization using this probe.
また、例えば図２Ｂに示すように、欠失領域を含むようにプローブ（ｂ）を設計することができる。具体的には、配列番号３若しくは４の塩基配列若しくはその相補配列の連続する少なくとも２０塩基を含むプローブ、又は配列番号５に示される塩基配列若しくはその相補配列において２７３４番から２７７０番のうちの少なくとも１つ（好ましくは２つ、より好ましくは３つ）の塩基を含み、かつ連続する少なくとも２０塩基からなるプローブを設計することができる。かかるプローブは、うるち米品種のＷｘ遺伝子に対してハイブリダイズすることができるが、本発明のＷｘ遺伝子にはハイブリダイズすることができない。従って、このプローブを用いたハイブリダイゼーションの有無により、試験対象のゲノムＤＮＡが本発明のＷｘ遺伝子であるか又はうるち米品種のＷｘ遺伝子であるかを区別することができる。 Further, for example, as shown in FIG. 2B, the probe (b) can be designed to include a deletion region. Specifically, a probe comprising at least 20 bases of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 or its complementary sequence, or at least one of 2734 to 2770 in the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or its complementary sequence A probe comprising one base (preferably two, more preferably three) and consisting of at least 20 consecutive bases can be designed. Such a probe can hybridize to the Wx gene of glutinous rice varieties, but cannot hybridize to the Wx gene of the present invention. Therefore, whether the genomic DNA to be tested is the Wx gene of the present invention or the Wx gene of glutinous rice varieties can be distinguished by the presence or absence of hybridization using this probe.
プローブの設計手法は当技術分野で周知であり、本発明において使用可能なプローブは、特異的なハイブリダイゼーションが可能な条件を満たす、例えば特異的なハイブリダイゼーションが可能な長さ及び塩基組成（融解温度）を有するように設計される。プローブの長さは、１０塩基以上が好ましく、さらに好ましくは２０〜５０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３０塩基である。 Probe design methods are well known in the art, and probes that can be used in the present invention satisfy conditions that allow specific hybridization, such as length and base composition (melting that allows specific hybridization). Temperature). The length of the probe is preferably 10 bases or more, more preferably 20 to 50 bases, and further preferably 20 to 30 bases.
本方法においては、プローブを用いて識別対象の米由来のゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーション反応を行い、その特異的結合（ハイブリッド）を検出することにより、本発明のＷｘ遺伝子又はうるち米品種のＷｘ遺伝子の存在を検出する。 In this method, the presence of the Wx gene of the present invention or the Wx gene of glutinous rice varieties is detected by performing a hybridization reaction on the genomic DNA derived from rice to be identified using a probe and detecting its specific binding (hybrid). Is detected.
ハイブリダイゼーション反応は、ストリンジェントな条件下で行う必要がある。そのようなストリンジェントな条件は当技術分野で周知であり、特に限定されない。 The hybridization reaction needs to be performed under stringent conditions. Such stringent conditions are well known in the art and are not particularly limited.
本方法においてハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブに蛍光標識（フルオレセイン、ローダミンなど）、放射性標識（32Ｐなど）、酵素標識（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ等）、ビオチン標識等の適当な標識を付加することができる。 When hybridization is performed in this method, the probe is appropriately labeled with a fluorescent label (such as fluorescein or rhodamine), a radioactive label (such as 32 P), an enzyme label (such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase), or a biotin label. Can be added.
標識化プローブを用いた検出は、識別対象の米由来のゲノムＤＮＡとプローブとをハイブリダイズ可能なように接触させることを含む。具体的には、例えば識別対象の米由来のゲノムＤＮＡを、必要であれば適宜制限酵素で消化して、スライドグラス、メンブラン、マイクロタイタープレート等の適当な担体に固定し、標識したプローブを添加することにより、プローブとゲノムＤＮＡとを接触させてハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかったプローブを除去した後、ゲノムＤＮＡとハイブリダイズしているプローブの標識を検出する。標識が検出された場合には、識別対象の米が本発明のＷｘ遺伝子又はうるち米品種のＷｘ遺伝子を有していることになる。 The detection using the labeled probe includes bringing the genomic DNA derived from rice to be identified into contact with the probe so that they can be hybridized. Specifically, for example, genomic DNA derived from rice to be identified is appropriately digested with restriction enzymes if necessary, fixed on an appropriate carrier such as a slide glass, membrane, or microtiter plate, and a labeled probe is added. Thus, a hybridization reaction is performed by bringing the probe into contact with the genomic DNA, and the probe that has not hybridized is removed, and then the label of the probe hybridized with the genomic DNA is detected. When the label is detected, the rice to be identified has the Wx gene of the present invention or the Wx gene of the glutinous rice variety.
あるいは、ハイブリダイゼーションはＤＮＡチップを利用して検出することもできる。この方法においては、プローブを固相支持体に貼り付ける。識別対象の米由来のゲノムＤＮＡサンプルをＤＮＡチップと接触させ、ハイブリダイゼーションを検出する Alternatively, hybridization can be detected using a DNA chip. In this method, the probe is attached to a solid support. A genomic DNA sample from rice to be identified is brought into contact with a DNA chip to detect hybridization.
（３）直接配列決定法
本発明のＷｘ遺伝子は、ゲノムＤＮＡを用いて直接配列決定法により検出することができる。直接配列決定法においては、最初に、識別対象の米からゲノムＤＮＡを調製し、検出対象となるＷｘ遺伝子を含む領域（特に第１０エキソンと第１１エキソンの間の領域）をベクターにクローニングし、宿主細胞（例えば細菌）において増幅させる。あるいは、検出対象のＷｘ遺伝子を含む領域内のＤＮＡをＰＣＲにより増幅することも可能である。増幅後、検出対象領域内のＤＮＡを配列決定する。配列決定法としては、限定されるものではないが、手動式配列決定法又は自動配列決定法が挙げられる。手動配列決定法としては、例えば放射性マーカーヌクレオチドを使用する方法などが挙げられ、自動配列決定法としては、ダイターミネーターを使用する方法などが挙げられる。配列決定の結果に基づいて、識別対象の米が目的のＷｘ遺伝子を有するか否かを判定する。
(3) Direct Sequencing Method The Wx gene of the present invention can be detected by direct sequencing method using genomic DNA. In the direct sequencing method, first, genomic DNA is prepared from rice to be identified, and the region containing the Wx gene to be detected (particularly the region between
（４）ＲＦＬＰ法
本発明のＷｘ遺伝子は、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。まず、検出対象の本発明のＷｘ遺伝子を含む領域をＰＣＲで増幅する。続いてこのＰＣＲ産物を、本発明のＷｘ遺伝子に独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で切断する。制限酵素により消化されたＰＣＲ産物は、一般的にはゲル電気泳動により分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化する。断片の長さを、分子量マーカー、うるち米品種由来のＷｘ遺伝子（対照）により生じた断片の長さと比較することによって、識別対象の米における本発明のＷｘ遺伝子の存在を検出することができる。
(4) RFLP method The Wx gene of the present invention can also be detected using restriction fragment length polymorphism (RFLP). First, a region containing the Wx gene of the present invention to be detected is amplified by PCR. The PCR product is then cleaved with a restriction enzyme known to produce a fragment of a length unique to the Wx gene of the present invention. PCR products digested with restriction enzymes are generally separated by gel electrophoresis and visualized by ethidium bromide staining. The presence of the Wx gene of the present invention in the rice to be identified can be detected by comparing the length of the fragment with the length of the fragment produced by the molecular weight marker, Wx gene derived from glutinous rice varieties (control).
以上の方法により、識別対象の米が、本発明のＷｘ遺伝子を有するか否か、又はうるち米品種のＷｘ遺伝子を検出し、その結果から、識別対象の米が目的の低アミロース米品種であるか否かを識別することが可能となる。本発明の方法は、遺伝的手法を利用するため、従来の白濁を利用した方法と比べて簡便かつ高精度に目的の米品種を識別することができる。 By the above method, whether or not the rice to be identified has the Wx gene of the present invention, or the Wx gene of the glutinous rice varieties is detected. It is possible to identify whether or not. Since the method of the present invention uses a genetic technique, the target rice varieties can be identified easily and with higher accuracy than the conventional method using cloudiness.
３．キット
上述した低アミロース米品種の識別方法は、キットを用いることによりさらに簡便に実施することができる。本キットは、上述したような本発明のＷｘ遺伝子を検出することができる手段、具体的にはプライマー又はプローブを少なくとも含むものである。またキットは、プライマーを含む場合には、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨなど）、校正用の標準試料などを含んでもよい。また、プローブを含む場合には、さらに、ハイブリダイゼーションバッファー、洗浄バッファー、マイクロプレート、ナイロンメンブレンなどを含んでもよい。
3. Kit The above-described method for identifying low amylose rice varieties can be more easily carried out by using a kit. This kit includes at least a means capable of detecting the Wx gene of the present invention as described above, specifically, a primer or a probe. When the kit includes a primer, the kit may further include a buffer constituting the reaction solution, a dNTP mixture, enzymes (such as reverse transcriptase and RNase H), and a standard sample for calibration. Further, when a probe is included, it may further include a hybridization buffer, a washing buffer, a microplate, a nylon membrane, and the like.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to these Examples.
北海２８７号及び原品種のきらら３９７の葉から、それぞれＣＴＡＢ法によりＤＮＡを抽出した。ｗｘ座の塩基配列を解析するため、まずInukai et.al.2000 Genome 43に示されたプライマーＮ、プライマーＹ、プライマーＢ、及びプライマーＥを合成した。
各プライマーの塩基配列は以下の通りである。
DNA was extracted from the leaves of North Sea No. 287 and the original variety Kirara 397 by the CTAB method. In order to analyze the nucleotide sequence of the wx locus, first, primer N, primer Y, primer B, and primer E shown in Inukai et.al. 2000 Genome 43 were synthesized.
The base sequence of each primer is as follows.
プライマーＮ；5’TCAAGAGCATGGAGGAGAAGTA 3’（配列番号９）
プライマーＹ；5’AGCACATTCTCCCAGTTCTTCGCA 3’（配列番号１０）
プライマーＢ；5’CAACCACCATGTCGGCTCTCACCA 3’（配列番号１１）
プライマーＥ；5’ACCCTGAAACACACACGGATCA 3’（配列番号１２）
Primer N; 5′
Primer Y; 5'AGCACATTCTCCCAGTTCTTCGCA 3 '(SEQ ID NO: 10)
Primer B; 5'CAACCACCATGTCGGCTCTCACCA 3 '(SEQ ID NO: 11)
Primer E; 5'ACCCTGAAACACACACGGATCA 3 '(SEQ ID NO: 12)
このうち、プライマーＮとＹのペア及びプライマーＢとＥのペアで、タカラ社製のPrime STARTMHS DNA polymeraseを用いてＰＣＲ反応を行い、各々の品種について約２．４ｋｂ及び１．２ｋｂのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物をベクターｐＵＣ１１８／ＨｉｎｃＩＩ／ＢＡＰに組み込み、シークエンスプライマーを用いた塩基配列の決定操作を行い、塩基配列を得た。 Of these, a PCR reaction was performed using Primer STAR ™ HS DNA polymerase manufactured by Takara Co., Ltd. with a pair of primer N and Y and a pair of primer B and E, and about 2.4 kb and 1.2 kb PCR for each variety. The product was obtained. The obtained PCR product was incorporated into the vector pUC118 / HincII / BAP, and the base sequence was determined using a sequence primer to obtain the base sequence.
得られた２種の塩基配列の間に、既知のＷｘ遺伝子の配列と比較して、解析できなかったギャップ領域が存在していたため、その領域の塩基配列を解析するため、ギャップ領域を含む塩基配列を増幅できるようにＰｒｉｍｅｒ３によりプライマーを設計・合成した。設計し塩基配列解析に用いたプライマーは以下の通りである。
プライマーWxob-L1；5’CAGGCTGGAGGAACAGAAGG 3’（配列番号７）
プライマーWxob-R3；5’TCACCTTGCCCGGATACTTC 3’（配列番号８）
Between the obtained two types of base sequences, there was a gap region that could not be analyzed compared to the sequence of the known Wx gene. Therefore, in order to analyze the base sequence of that region, the base including the gap region Primers were designed and synthesized with
Primer Wxob-L1; 5'CAGGCTGGAGGAACAGAAGG 3 '(SEQ ID NO: 7)
Primer Wxob-R3; 5'TCACCTTGCCCGGATACTTC 3 '(SEQ ID NO: 8)
タカラ社製Ｅｘ−Ｔａｑを用いてＰＣＲ反応を行い、北海２８７号では３５８ｂｐ、きらら３９７では３９５ｂｐのＰＣＲ産物を得た。得られたＰＣＲ産物をベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒに組込み、シークエンスプライマーを用いた塩基配列の決定操作を行い、塩基配列を得た。 A PCR reaction was performed using Ex-Taq manufactured by Takara, and a PCR product of 358 bp was obtained from No. 287 in North Sea and 395 bp was obtained from Kirara 397. The obtained PCR product was incorporated into a vector pT7Blue T-vector, and a base sequence was determined using a sequence primer to obtain a base sequence.
さらに配列の得られていなかった第１４エクソンの塩基配列を解析するため、目的領域を増幅するプライマーを設計・合成した。プライマーは以下の通りである。
5916_3722U；5’GAAACGGAGGGAGTATAAAC 3’（配列番号１３）
5616_4362L；5’ACCCAGATACATAACTAAAA 3’（配列番号１４）
Furthermore, in order to analyze the base sequence of the 14th exon for which the sequence was not obtained, a primer for amplifying the target region was designed and synthesized. The primers are as follows.
5916_3722U; 5'GAAACGGAGGGAGTATAAAC 3 '(SEQ ID NO: 13)
5616_4362L; 5'ACCCAGATACATAACTAAAA 3 '(SEQ ID NO: 14)
タカラ社製Ｅｘ−Ｔａｑを用いてＰＣＲ反応を行い、北海２８７号ときらら３９７のＰＣＲ産物について各々５９１６＿３７２２Ｕプライマーを使用してダイレクトシークエンスにより塩基配列を得た。 A PCR reaction was performed using Ex-Taq manufactured by Takara, and the base sequence was obtained by direct sequencing using 5916_3722U primer for each of the PCR products of No. 287 and the 397 PCR of North Sea.
以上、４通りの塩基配列解析で得られた塩基配列のコンティグを作成し、北海２８７号ときらら３９７についてＷｘ遺伝子の翻訳開始点から終止点までの塩基配列を得た。北海２８７号に由来するＷｘ遺伝子の配列を配列番号１に、きらら３９７に由来するＷｘ遺伝子の配列を配列番号５に示す。 As described above, contigs of the base sequences obtained by the four types of base sequence analysis were prepared, and base sequences from the translation start point to the end point of the Wx gene were obtained for No. 287 Torahara 397. The sequence of the Wx gene derived from North Sea No. 287 is shown in SEQ ID NO: 1, and the sequence of the Wx gene derived from Kirara 397 is shown in SEQ ID NO: 5.
きらら３９７のＷｘ遺伝子は既知のＷｘ遺伝子と同じ塩基配列であったが、北海２８７号については、実施例１の結果、配列番号３又は４に示す３７ｂｐの配列が欠失していた。この欠失領域を含む１５０〜５００ｂｐ程度の配列を増幅するように、Ｐｒｉｍｅｒ３によりプライマーを設計・合成した。設計し品種系統識別に用いたプライマーは以下の通りである。
プライマーWxob-L1；5’CAGGCTGGAGGAACAGAAGG 3’（配列番号７）
プライマーWxob-R3；5’TCACCTTGCCCGGATACTTC 3’（配列番号８）
The Wx gene of Kirara 397 had the same base sequence as that of the known Wx gene. However, with respect to North Sea No. 287, the 37 bp sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4 was deleted as a result of Example 1. A primer was designed and synthesized by
Primer Wxob-L1; 5'CAGGCTGGAGGAACAGAAGG 3 '(SEQ ID NO: 7)
Primer Wxob-R3; 5'TCACCTTGCCCGGATACTTC 3 '(SEQ ID NO: 8)
上記のプライマーセットを用いて、きらら３９７及び北海２８７号のＤＮＡについてＥｘ−ｔａｑを用い１．５％アガロースゲルで１００Ｖ ５０分電気泳動を行った。その結果を図３に示す。図３に示すように、きらら３９７と北海２８７号のＤＮＡを用いた増幅反応によって、サイズの異なる増幅産物が得られることがわかった。 Using the above primer set, Kirara 397 and North Sea No. 287 DNA were subjected to electrophoresis at 100 V for 50 minutes on 1.5% agarose gel using Ex-taq. The result is shown in FIG. As shown in FIG. 3, it was found that amplification products having different sizes can be obtained by the amplification reaction using Kirara 397 and North Sea No. 287 DNA.
また、上記のプライマーセットを用いて、表１及び表２に示す品種・系統のＤＮＡについて、BIOLINE社製BIOTAQTMDNA Polymeraseを用い３％アガロースで１００ｖ １２０分電気泳動を行った。表１は、北海２８７号又はおぼろづきの交雑後代系統であり、これらのうち、米の特性がおぼろづき型の低アミロース性を示すものは、２〜６、８及び１０である。また、表２は、北海道の代表的品種及び低アミロース米の代表的品種であり、これらのうち、米の特性がおぼろづき型の低アミロース性を示す品種は、おぼろづき及び北海２８７号（２、３、２２及び２３）のみである。 Moreover, using the above primer sets, DNAs of the varieties and strains shown in Tables 1 and 2 were subjected to electrophoresis at 3% agarose for 100 v 120 minutes using BIOTAQ ™ DNA Polymerase manufactured by BIOLINE. Table 1 shows the North Sea No. 287 or the progeny of the progeny line, and among these, the ones having a low amylose property with rice characteristics are 2-6, 8 and 10. Table 2 shows representative varieties of Hokkaido and representative varieties of low amylose rice. Among these, varieties exhibiting low amylose properties with a characteristic of rice that are sloppy and low amylose are Orozuki and Hokukai No. 287 (2, 3). , 22 and 23) only.
表１及び表２の品種・系統を用いて得られた結果をそれぞれ図４及び５に示す。これらの結果から、ＰＣＲのバンドパターンから本発明のＷｘ遺伝子を有する低アミロース米品種と、他のうるち米品種などとを識別できることが明らかとなった。 The results obtained using the varieties / lines of Table 1 and Table 2 are shown in FIGS. 4 and 5, respectively. From these results, it became clear that low amylose rice varieties having the Wx gene of the present invention can be distinguished from other glutinous rice varieties from the band pattern of PCR.
実施例２と同様に、下記のプライマーセットを設計した：
プライマーWxob-L3；5’AAGGGGTGAGGCTTTGAACC 3’（配列番号１５）
プライマーWxob-R4；5’CTGCAGCTGGATGAGTCCAC 3’（配列番号１６）
Similar to Example 2, the following primer set was designed:
Primer Wxob-L3; 5'AAGGGGTGAGGCTTTGAACC 3 '(SEQ ID NO: 15)
Primer Wxob-R4; 5 ′
続いて、実施例２と同様の手順で、表２に示す品種・系統のＤＮＡについて、増幅反応を行った後、電気泳動を行った。上記プライマーセットにより得られる増幅産物は、うるち米品種のＷｘ遺伝子を用いた場合には２９９ｂｐであり、本発明のＷｘ遺伝子を用いた場合には２６２ｂｐである。従って、例えば増幅産物のゲル電気泳動などによって可視的に判定することが可能である。 Subsequently, the DNAs of the cultivars and strains shown in Table 2 were subjected to an amplification reaction in the same procedure as in Example 2, and then subjected to electrophoresis. The amplification product obtained by the above primer set is 299 bp when the Wx gene of glutinous rice varieties is used, and 262 bp when the Wx gene of the present invention is used. Therefore, it can be determined visually by gel electrophoresis of the amplification product, for example.
結果を図６に示す。この結果から、ＰＣＲのバンドパターンから本発明のＷｘ遺伝子を有する低アミロース米品種と、他のうるち米品種などとを識別できることが明らかとなった。 The results are shown in FIG. From these results, it became clear that low amylose rice varieties having the Wx gene of the present invention can be distinguished from other glutinous rice varieties from the band pattern of PCR.
本発明により、低アミロース米品種の識別方法及び識別用キットが提供される。かかる方法及びキットにより、低アミロース米品種を簡便かつ高精度で識別することが可能となる。従って、ＤＮＡマーカー選抜による稲新品種育成やＤＮＡ鑑定による品種識別など農業・食品分野において広範な利用が期待される。 According to the present invention, a low amylose rice variety identification method and identification kit are provided. By such a method and kit, it becomes possible to identify low-amylose rice varieties easily and with high accuracy. Therefore, it is expected to be widely used in the agricultural and food fields, such as breeding of new rice varieties by DNA marker selection and variety identification by DNA identification.
配列番号３及び４：Ｗｘ遺伝子の部分配列
配列番号７〜１６：合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NOs: 3 and 4: Partial sequence of Wx gene SEQ ID NOs: 7 to 16: Synthetic oligonucleotides
Claims (17)
（ａ）配列番号１に示される塩基配列を有する遺伝子、
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列に対し相補的な配列を有する核酸と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ低アミロース性を決定する機能を有する遺伝子 Wx gene of the following (a) or (b).
(A) a gene having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) a gene that hybridizes with a nucleic acid having a sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under highly stringent conditions and has a function of determining low amylose properties
（ａ）配列番号１の１番から２２８２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマー
（ｂ）配列番号１の２２８３番から３６１２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマー A kit for identifying low amylose rice varieties characterized by comprising the following primers:
(A) Primer consisting of at least 10 consecutive bases in the base sequence from 1 to 2282 of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence (b) Of the base sequence from 2283 to 3612 in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence Primer consisting of at least 10 consecutive bases
（ａ）配列番号１の１番から２２８２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマー、又は配列番号１の２２８３番から３６１２番の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマー
（ｂ）配列番号３若しくは４の塩基配列若しくはその相補配列のうち連続する少なくとも１０塩基からなるプライマー A kit for identifying low amylose rice varieties characterized by comprising the following primers:
(A) a primer comprising at least 10 consecutive bases from the 1st to 2282th base sequences of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof, or a continuous of the 2283th to 3612th base sequences of SEQ ID NO: 1 or a complementary sequence thereof Primer consisting of at least 10 bases (b) Primer consisting of at least 10 consecutive bases of SEQ ID NO: 3 or 4 or its complementary sequence
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