JP2008072965A - トリペプチドの合成方法、ペプチド合成酵素の調製方法、およびペプチド合成酵素 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 シジミの身肉、特に中腸腺は除去して足または貝柱を切り出して抽出対象の組織とし、これに対して、分子量100000以上の画分を残存させる分離操作または濃縮操作を含む抽出工程を経て、目的トリペプチドの合成が可能な酵素溶液を得る。得られたペプチド合成酵素を用い、化学修飾されていないβ-アラニンおよびオルニチン自体を基質として、ATPとMg2+存在下、目的トリペプチドを合成できる。
【選択図】 図1
Description
〔i〕 N末端からβ-アラニン、オルニチンの順、もしくはN末端からオルニチン、オルニチンの順でペプチド結合した配列を有するペプチドまたはその塩を、蛋白質もしくは蛋白質結合担体の少なくともいずれか一方を含む試薬組成物に共存させることを特徴とする、蛋白質の安定化方法。
〔ii〕 N末端からβ-アラニン、オルニチンの順、もしくはN末端からオルニチン、オルニチンの順でペプチド結合した配列を有するペプチドまたはその塩からなる、蛋白質安定化剤。
〔iii〕 β-アラニン、オルニチンの順でペプチド結合したジペプチド、もしくはオルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したジペプチドまたはその塩からなる、蛋白質安定化剤。
〔vi〕 N末端からβ-アラニン、オルニチンの順、もしくはN末端からオルニチン、オルニチンの順でペプチド結合した配列を有するペプチドまたはその塩を、蛋白質もしくは蛋白質結合担体の少なくともいずれか一方を含む試薬組成物に共存させてなることを特徴とする、蛋白質含有溶液。
〔v〕 〔vi〕に記載の蛋白質含有溶液を用いてなる、生体成分測定用試薬。
〔vi〕 〔vi〕に記載の蛋白質含有溶液を用いてなる、生体成分測定のために用いる標準液。
(2) ペプチド合成酵素が、シジミ身肉を構成する一または複数の組織から抽出されるシジミ由来の酵素であることを特徴とする、(1)に記載のN末端からβ-アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドを合成する方法。
(3) シジミの身肉から、プロテアーゼによる自己消化を防止もしくは軽減可能なように少なくとも中腸腺を除去して抽出対象の組織とし、抽出工程を経て、N末端からβ-アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドの合成を行うシジミ由来のペプチド合成酵素の調製方法。
(4) 前記抽出対象の組織はシジミの足もしくは貝柱またはその双方であることを特徴とする、(3)に記載のシジミ由来のペプチド合成酵素の調製方法。
(5) 前記抽出工程には分子量100000以上の画分を残存させる分離操作または濃縮操作が含まれることを特徴とする、(3)または(4)に記載のシジミ由来のペプチド合成酵素の調製方法。
(6) β-アラニンとオルニチンを基質とし、ATPとMg2+存在下、N末端からβ-アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドの合成を行う、(3)ないし(5)のいずれかに記載の方法により調製されたシジミ由来のペプチド合成酵素。
(参考文献1:丸尾、田宮監修;酵素ハンドブック、p.780(1982)、朝倉書店)
特定構造(β-Ala−Orn−Orn)のトリペプチドを合成可能な本発明のペプチド合成酵素は、シジミ身肉を構成する一または複数の組織から抽出することができる。シジミ身肉は後述するように、外套膜、エラ、足、貝柱、中腸腺、生殖腺等の各組織から構成されるが、これら全部を含むシジミ身肉全体から抽出されたものではなく、その一部のみを原料としてそこから抽出された酵素が、本願に係るものである。そして本ペプチド合成酵素によれば、上述の従来技術に示したエステル化のような化学修飾を何ら施さないβ-アラニンおよびオルニチン自体を基質として、特定構造(β-Ala−Orn−Orn)のトリペプチドの合成が可能である。
<実施1 トリペプチド(N末端からβ-アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したペプチド、β-Ala−Orn−Orn)のペプチド合成酵素を用いた合成法>
β-アラニン水溶液(20μmol/ml)10μl、オルニチン水溶液(20μmol/ml)10μl、MgCl2水溶液(20μmol/ml)10μl、ATP水溶液(20μmol/ml)10μlおよび0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)50μlを混合し、後述する<実施例4>の足から調製した酵素溶液を10μl 加え、25℃で反応させた。
(参考文献2:Nagasawa et al. Molecular and Cellular Biochemistry 225: 29−34, 2001.)
新鮮なシジミ貝70個(平均重量1.7g/個)を流水中室温で3時間砂抜きした。その後、70個全部を水から揚げ貝を開き、中腸腺を含む身肉全体を取り出した(収量36.7g)。集めた組織を、ハサミを用いて細片化し、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)を450ml加え、ホモジナイザを用いて破砕し、遠心分離機を用いて遠心分離(10,000Xg,30分)した。上清画分を分画分子量10,000の透析膜を用いて脱塩し、さらに分画分子量10,000の限外ろ過膜を用いて15mlまで濃縮した。砂抜き後の操作は、氷冷中もしくは4℃に設定された低温室中で行った。得られた溶液を酵素溶液として<実施例1>のトリペプチドの合成に用い、25℃で4時間反応させた溶液を高速液体クロマトグラフィに供したところ、合成されたトリペプチドの蛍光強度は207975であった。
新鮮なシジミ貝70個(平均重量1.7g/個)を流水中室温で3時間砂抜きした。その後、70個全部を水から揚げ貝を開き、身肉全体から中腸腺を除いた組織を切り出した(収量14.2g)。集めた組織を、ハサミを用いて細片化し、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)を200ml加え、ホモジナイザを用いて破砕し、遠心分離機を用いて遠心分離(10,000Xg,30分)した。上清画分を分画分子量10,000の透析膜を用いて脱塩し、さらに分画分子量10,000の限外ろ過膜を用いて15mlまで濃縮した。砂抜き後の操作は、氷冷中もしくは4℃に設定された低温室中で行った。得られた溶液を酵素溶液として<実施例1>のトリペプチドの合成に用い、25℃で4時間反応させた溶液を高速液体クロマトグラフィに供したところ、合成されたトリペプチドの蛍光強度は455513であり、<実施例2>よりも多くのトリペプチドが合成されることが分かった。
新鮮なシジミ貝70個(平均重量1.7g/個)を流水中室温で3時間砂抜きした。その後、70個全部を水から揚げ貝を開き、身肉から足あるいは貝柱の部分だけをそれぞれ切り取った(収量:足1.75g、貝柱1.72g)。集めた足あるいは貝柱それぞれを、ハサミを用いて細片化し、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.2)を25ml加え、ホモジナイザを用いて破砕し、遠心分離機を用いて遠心分離(10,000Xg,30分)した。上清画分を分画分子量10,000の透析膜を用いて脱塩し、さらに分画分子量10,000の限外ろ過膜を用いて15mlまで濃縮した。砂抜き後の操作は、氷冷中もしくは4℃に設定された低温室中で行った。得られたそれぞれの溶液を酵素溶液として<実施例1>のトリペプチドの合成に用い、25℃で4時間反応させた溶液を高速液体クロマトグラフィに供したところ、合成されたトリペプチドの蛍光強度は足が961296、貝柱が916211であり、足と貝柱のいずれを用いても<実施例3>よりもさらに多くのトリペプチドが合成されることが分かった。
実施例4により足から調製した酵素溶液を分画分子量30,000、50,000、100,000の各限外ろ過膜を用いて分画し、各画分を酵素溶液として<実施例1>に示した反応条件においてトリペプチドの合成を試み、高速液体クロマトグラフィにより分析した。その結果、分画分子量30,000、50,000および100,000の限外ろ過膜における透過液を用いた場合、すなわち分子量30,000以下、50,000以下および100,000以下の画分を酵素液として用いた場合は、トリペプチドの生成は認められなかった。分画分子量100,000の限外ろ過膜における残存液、すなわち分子量が100,000以上の画分を酵素液として用いたところ、トリペプチドの生成が認められた。このことから、抽出工程に分画分子量100,000以上の画分を残存させる分離操作または濃縮操作を加えることにより、ペプチド合成酵素を精製することができることが分かった。
a.分子量
<実施例4>により足から調製した酵素溶液をSephacryl S−300ゲルろ過カラム(アマシャム バイオサイエンス、2.3X118cm)に供した。溶出液は0.1M NaCl、流速0.5ml/min、4℃の条件で行った。5mlずつ分取し、各画分を酵素溶液として、<実施例1>の方法と同様にトリペプチドの合成を試み、合成されたトリペプチドを高速液体クロマトグラフィにより定量した。
<実施例4>により足から調製した酵素溶液を、DEAE−Sephacel イオン交換カラム(アマシャム バイオサイエンス、2X25cm)に供した。溶出は、20mMリン酸緩衝液(pH7.2)を用いて0−0.5MのNaClによる直線濃度勾配により行い、流速0.5ml/min、4℃の条件で行った。5mlずつ分取し、各画分を酵素溶液として、<実施例1>の方法と同様にトリペプチドの合成を試み、合成されたトリペプチドを高速液体クロマトグラフィにより定量した。
<実施例1>に示した反応条件におけるトリペプチド合成酵素の至適温度を調べるために、反応温度を20℃−35℃に変えてトリペプチドの合成を試みた。その結果、上記条件でのトリペプチド合成酵素の至適温度は約30℃であることが分かった。
図4は、本発明トリペプチド合成酵素の至適温度測定結果を示すグラフである。
<実施例1>に示した反応条件におけるトリペプチド合成酵素の基質特異性を調べるために、β-アラニンに替えてL-アラニンとγ-アミノ酪酸を、またL-オルニチンに替えてD-オルニチン、L-ヒスチジン、L-リジン、L-アルギニンを基質としてペプチドの合成を試み(代替アミノ酸以外の反応条件は変えない)、高速液体クロマトグラフィにより検出を行った。その結果、代替アミノ酸のいずれにおいてもペプチドの合成は観察されなかった。このことから、本酵素は、本反応条件においてβ-アラニンとL-オルニチン以外のL-アラニン、γ-アミノ酪酸、D-オルニチン、L-ヒスチジン、L-リジン、L-アルギニンは基質とならないか、あるいはなったとしてもβ-アラニンやL-オルニチンと比べて反応速度は極めて遅いものと考えられた。
Claims (6)
- ともに化学修飾されていないβ-アラニンおよびオルニチン自体を基質として、ATPとMg2+存在下、ペプチド合成酵素を用いて、N末端からβ-アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドを合成する方法。
- ペプチド合成酵素が、シジミ身肉を構成する一または複数の組織から抽出されるシジミ由来の酵素であることを特徴とする、請求項1に記載のN末端からβ-アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドを合成する方法。
- シジミの身肉から、プロテアーゼによる自己消化を防止もしくは軽減可能なように少なくとも中腸腺を除去して抽出対象の組織とし、抽出工程を経て、N末端からβ-アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドの合成を行うシジミ由来のペプチド合成酵素の調製方法。
- 前記抽出対象の組織はシジミの足もしくは貝柱またはその双方であることを特徴とする、請求項3に記載のシジミ由来のペプチド合成酵素の調製方法。
- 前記抽出工程には分子量100000以上の画分を残存させる分離操作または濃縮操作が含まれることを特徴とする、請求項3または4に記載のシジミ由来のペプチド合成酵素の調製方法。
- β-アラニンとオルニチンを基質とし、ATPとMg2+存在下、N末端からβ-アラニン、オルニチン、オルニチンの順でペプチド結合したトリペプチドの合成を行う、請求項3ないし5のいずれかに記載の方法により調製されたシジミ由来のペプチド合成酵素。
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