JP2008061538A - 部位特異的にリン酸化した蛋白質の合成方法、当該方法に用いるホスホセリルｔＲＮＡ及び、当該方法を実施するための試薬キット - Google Patents
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Abstract
【課題】高効率かつ簡便な、リン酸化蛋白質の合成方法を提供する。
【解決手段】本発明のリン酸化蛋白質合成方法は、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡの合成能を有する古細菌由来システインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンが、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡから選択されるいずれか一つの塩基配列からなる４塩基アンチコドンに置換された改変ｔＲＮＡを合成する工程と、ＳｅｐＲＳを用いて、上記改変ｔＲＮＡにＳｅｐをアミノアシル結合させる工程と、目的の蛋白質をコードするＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡのＳｅｐを導入する部位に上記改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応するコドンの塩基配列を導入する工程と、上記改変ＤＮＡ由来のｍＲＮＡを得る工程と、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む翻訳系を用いて蛋白質を合成する工程とを含む。
【選択図】図１
【解決手段】本発明のリン酸化蛋白質合成方法は、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡの合成能を有する古細菌由来システインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンが、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡから選択されるいずれか一つの塩基配列からなる４塩基アンチコドンに置換された改変ｔＲＮＡを合成する工程と、ＳｅｐＲＳを用いて、上記改変ｔＲＮＡにＳｅｐをアミノアシル結合させる工程と、目的の蛋白質をコードするＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡのＳｅｐを導入する部位に上記改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応するコドンの塩基配列を導入する工程と、上記改変ＤＮＡ由来のｍＲＮＡを得る工程と、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む翻訳系を用いて蛋白質を合成する工程とを含む。
【選択図】図１
Description
本発明は、リン酸化蛋白質合成方法に関するものである。さらに詳しくは、ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素に認識されるようにアンチコドンを４塩基アンチコドンに改変した改変ｔＲＮＡを用いて、標的蛋白質の目的の部位にホスホセリンを導入する方法、及び当該方法を実施するための試薬キットに関するものである
蛋白質の機能は、種々の翻訳後修飾により制御される。中でもリン酸化修飾は、シグナル伝達や転写制御において重要な役割を果たしており、多くの場合、リン酸化修飾は、蛋白質中のセリンに対して起こることが知られている。
蛋白質中に存在するセリンをリン酸化修飾したリン酸化蛋白質や、天然ではセリンが存在しない部位にホスホセリンを導入したリン酸化蛋白質を合成することができれば、生化学的解析や、臨床研究をさらに進展させることができる。そのため、標的蛋白質の目的の部位にホスホセリンを導入する技術が望まれている。
従来、リン酸化蛋白質は、大腸菌や、in vitro翻訳系により合成した未修飾の蛋白質を、リン酸化酵素による翻訳後修飾によって調製している（例えば、特許文献１、２）。
また、ｐｄＣｐＡ法により、ｔＲＮＡに、導入を目的とするアミノ酸をアミノアシル結合させて、蛋白質の任意の部位に目的のアミノ酸を導入する方法が提案されている（非特許文献１）。ｐｄＣｐＡ法では、まず、導入するアミノ酸とジヌクレオチドとを結合させてアミノアシルｐｄＣｐＡを合成する。次に、アンチコドンがＣＣＣＧ又はＡＣＣＣの４塩基、又はアンバーアンチコドンに改変され、かつ３’末端の２塩基を欠損したｔＲＮＡに、ＲＮＡリガーゼを用いて、当該アミノアシルｐｄＣｐＡを結合させることで、導入を目的とするアミノ酸とｔＲＮＡとを結合させたアミノアシルｔＲＮＡを合成する。そして、当該アミノアシルｔＲＮＡが認識可能なコドンを、蛋白質をコードするＤＮＡ中のアミノ酸を導入する位置に組み込んだ組換えＤＮＡと、当該アミノアシルｔＲＮＡとを用いて、目的の部位に目的のアミノ酸を導入した蛋白質を得る。
また、非特許文献２では、ｐｄＣｐＡ法により、アンチコドンを、ＡＧＧＵ、ＣＧＧＵ、ＣＣＣＵ、ＣＵＣＵ、ＣＵＡＵ、ＧＧＧＵ等の４塩基アンチコドンに改変したｔＲＮＡを用いて、ニトロフェニルアラニンを蛋白質に導入する方法が開示されている。
特表２００１−５０９３７０号公報（平成１３年７月２４日公開）
特表２００２−５３１０５８号公報（平成１４年９月２４日公開）
T. Hohsaka, Y. Ashizuka, H. Murakami, and M. Sisido, Incorporation of Nonnatural Amino Acids into Streptavidin through In Vitro Frame-Shift Suppression, Journal of American Chemical Society, 1996, 118, 9778-9779.
T. Hohsaka, Y. Ashizuka, H. Taira, H. Murakami, and M. Sisido, Incorporation of Nonnatural Amino Acids into Proteins by Using Various Four-Base Codons in an Escherichia coli in Vitro Translation System, Biochemistry, 2001, 40, 11060-11064.
しかしながら、特許文献１及び２のように、未修飾の蛋白質に対して、リン酸化酵素を用いた翻訳後修飾により蛋白質をリン酸化修飾する方法では、様々な問題が生じる。
例えば、リン酸化修飾する蛋白質中のアミノ酸の種類や部位に応じて異なるリン酸化酵素が必要であるため、反応の条件設定や操作が煩雑になるという問題、目的とするアミノ酸のリン酸化修飾を触媒するリン酸化酵素が発見されていない場合、目的とするリン酸化蛋白質を得ることができないという問題、部位特異性が低い、即ち、例えば蛋白質中の一つのセリンを修飾することを目的とした場合、当該蛋白質に含まれる他のセリンもリン酸化されるという問題、さらにリン酸化効率が低いという問題が挙げられる。
また、非特許文献１で合成されるアミノアシルｐｄＣｐＡは、加水分解を起こしやすく、非常に不安定な物質である。また、アミノ酸とアミノアシル結合したｔＲＮＡであるアミノアシルｔＲＮＡは、加水分解によりアミノ酸が脱離しやすい。
これでは、実用上の利用は困難である。例えば、非特許文献１の方法を実施するキット等を製造する場合、アミノアシルｐｄＣｐＡ又はアミノアシルｔＲＮＡを試薬としてキットに含ませても、これらの物質は不安定であるため、加水分解等による損失が大きく、導入効率は極めて低くなる。そのため、少なくとも、アミノ酸を結合させたジヌクレオチドと、ｐｄＣｐＡとは結合していない状態でキットに含ませなければならず、キットの使用者はアミノアシルｐｄＣｐＡを合成する工程から始めなければならない。
従って、仮に非特許文献１の方法を応用して蛋白質にホスホセリンの導入を試みても、高い導入効率は期待できず、さらに、煩雑な作業を要する。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、高効率かつ簡便な、リン酸化蛋白質の合成方法を提供することにある。
本願発明者らは、上記課題の解決のため、鋭意検討を行なった。その結果、ホスホセリンとアミノアシル結合したｔＲＮＡであるホスホセリルｔＲＮＡの合成能を有する古細菌由来のシステインｔＲＮＡのアンチコドンをＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡのいずれか一つの４塩基アンチコドンを備えた改変ｔＲＮＡは、ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素に良好に認識され、当該改変ｔＲＮＡにホスホセリンをアミノアシル結合させたホスホセリルｔＲＮＡを得ることができることを見出し、目的の蛋白質をコードするＤＮＡのホスホセリンを導入する部位に、当該改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応する４塩基コドンを挿入又は置換した改変ＤＮＡを用いることで、簡便かつ高効率に、標的蛋白質の目的の部位にホスホセリンを導入することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明に係る蛋白質にホスホセリンを導入する方法は、上記課題を解決するために、目的の部位にホスホセリンが導入された蛋白質の合成方法であって、ホスホセリルｔＲＮＡの合成能を有する古細菌由来のシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンが、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡから選択されるいずれか一つの塩基配列からなる４塩基アンチコドンに置換された改変ｔＲＮＡを合成する工程と、ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素を用いて、上記改変ｔＲＮＡにホスホセリンをアミノアシル結合させ、ホスホセリルｔＲＮＡを得る工程と、目的の蛋白質をコードするＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡのホスホセリンを導入する部位に上記改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応するコドンの塩基配列が挿入された改変ＤＮＡ、又は、ホスホセリンと置換する部位のアミノ酸に該当するコドンの塩基配列が上記改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応するコドンの塩基配列と置換された改変ＤＮＡを得る工程と、上記改変ＤＮＡ由来のｍＲＮＡを得る工程と、上記ホスホセリルｔＲＮＡおよび上記ｍＲＮＡを含む翻訳系を用いて蛋白質を合成する工程とを含むことを特徴としている。
本発明に係るホスホセリンを導入する方法では、上記４塩基アンチコドンは、ＡＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＧＣＡＣ、ＧＣＡＡであることがより好ましい。
本発明に係るホスホセリンを導入する方法では、上記古細菌は、Methanocaldococcus jannaschii（メタノカルドコッカス ジャナシイ）又は、Methanosarcina acetivorans（メタノサルシナ アセチボランス）であることがより好ましい。
本発明に係るホスホセリンを導入する方法では、上記システインｔＲＮＡは、配列番号１又は２のいずれかに示される塩基配列からなることがより好ましい。
本発明に係るホスホセリンを導入する方法では、上記ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素は、Methanosarcina acetivorans（メタノサルシナ アセチボランス）又は、Methanocaldococcus jannaschii（メタノカルドコッカス ジャナシイ）由来のホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素であることがより好ましい。
本発明に係るホスホセリンを導入する方法では、上記ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素は、下記（ｃ）又は（ｄ）のいずれかのポリペプチドであることがより好ましい。
（ｃ）配列番号３又は４のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号３又は４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。
また、本発明に係るホスホセリルｔＲＮＡは、上記課題を解決するために、目的の部位にホスホセリンが導入された蛋白質の合成に用いるホスホセリルｔＲＮＡであって、ホスホセリルｔＲＮＡの合成能を有する古細菌由来のシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンが、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡから選択されるいずれか一つの塩基配列からなる４塩基アンチコドンに置換された改変ｔＲＮＡの３’末端に、ホスホセリンがアミノアシル結合している構造を有することを特徴としている。
また、本発明に係る試薬キットは、上記課題を解決するために、目的の部位にホスホセリンが導入された蛋白質を合成するためのキットであって、少なくともホスホセリルｔＲＮＡの合成能を有する古細菌由来のシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンが、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡから選択されるいずれか一つの塩基配列からなる４塩基アンチコドンに置換された改変ｔＲＮＡ、及びホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素を含むことを特徴としている。
本発明に係るリン酸化蛋白質合成方法を用いることにより、標的蛋白質の目的の部位にホスホセリンを導入することができるという効果を奏する。さらに、リン酸化修飾する蛋白質中のアミノ酸の種類や部位に応じて異なるリン酸化酵素を用いる必要が無く、簡便かつ高効率にリン酸化蛋白質を合成できるという効果を奏する。
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。しかし、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更して実施することができる。
〔本発明に係るリン酸化蛋白質合成方法〕
本発明に係るリン酸化蛋白質合成方法は、ホスホセリルｔＲＮＡ（以下、「Ｓｅｐ-ｔＲＮＡ」と表記する）の合成能を有する古細菌由来のシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンが、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡから選択されるいずれか一つの塩基配列からなる４塩基アンチコドンに置換された改変ｔＲＮＡを合成する工程と、ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＳｅｐＲＳ」と表記する）を用いて、上記改変ｔＲＮＡにホスホセリン（以下、「Ｓｅｐ」と表記する）をアミノアシル結合させ、Ｓｅｐ-ｔＲＮＡを得る工程と、目的の蛋白質をコードするＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡのＳｅｐを導入する部位に上記改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応するコドンの塩基配列が挿入された改変ＤＮＡ、又は、ホスホセリンと置換する部位のアミノ酸に該当するコドンの塩基配列が上記改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応するコドンの塩基配列と置換された改変ＤＮＡを得る工程と、上記改変ＤＮＡ由来のｍＲＮＡを得る工程と、上記ホスホセリルｔＲＮＡおよび上記ｍＲＮＡを含む翻訳系を用いて蛋白質を合成する工程とを含めばよい。
本発明に係るリン酸化蛋白質合成方法は、ホスホセリルｔＲＮＡ（以下、「Ｓｅｐ-ｔＲＮＡ」と表記する）の合成能を有する古細菌由来のシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンが、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡから選択されるいずれか一つの塩基配列からなる４塩基アンチコドンに置換された改変ｔＲＮＡを合成する工程と、ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（以下、「ＳｅｐＲＳ」と表記する）を用いて、上記改変ｔＲＮＡにホスホセリン（以下、「Ｓｅｐ」と表記する）をアミノアシル結合させ、Ｓｅｐ-ｔＲＮＡを得る工程と、目的の蛋白質をコードするＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡのＳｅｐを導入する部位に上記改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応するコドンの塩基配列が挿入された改変ＤＮＡ、又は、ホスホセリンと置換する部位のアミノ酸に該当するコドンの塩基配列が上記改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応するコドンの塩基配列と置換された改変ＤＮＡを得る工程と、上記改変ＤＮＡ由来のｍＲＮＡを得る工程と、上記ホスホセリルｔＲＮＡおよび上記ｍＲＮＡを含む翻訳系を用いて蛋白質を合成する工程とを含めばよい。
Ｓｅｐ-ｔＲＮＡの合成能を有する古細菌由来のシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンを上述の４塩基アンチコドンに改変した改変ｔＲＮＡは、ＳｅｐＲＳにより認識され、Ｓｅｐとアミノアシル結合することができる。
一方で、Ｓｅｐの導入を目的とする蛋白質をコードするＤＮＡには、当該ＤＮＡのＳｅｐを導入する部位に、当該改変ｔＲＮＡの有するアンチコドンに対応する４塩基コドンが挿入又は置換されている。
これにより、目的の部位にＳｅｐを導入したリン酸化蛋白質を得ることができる。
以下に、本発明に係るリン酸化蛋白質合成方法の一実施形態を、図１に基づいて説明する。
図１は、本発明に係るリン酸化蛋白質合成方法の原理を模式的に表した図である。
図１（ａ）は、本発明に係るリン酸化蛋白質合成方法で用いる改変ｔＲＮＡを示しており、アンチコドンとしてＡＧＣＡの４塩基アンチコドンを備えた場合を例示している。当該改変ｔＲＮＡはＳｅｐＲＳにより認識され、図１（ｂ）に示すように、当該改変ｔＲＮＡの３’末端にＳｅｐがアミノアシル結合して、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡが合成される。
図１（ｃ）は、ｍＲＮＡの翻訳が進行している状態を示している。合成を目的とする蛋白質をコードするｍＲＮＡにおいて、Ｓｅｐの導入を目的とする部位には、当該改変ｔＲＮＡによる認識を可能とするためＴＧＣＡからなる４塩基コドンが導入されている。そして、図１（ｂ）で合成されたＳｅｐ−ｔＲＮＡは、当該４塩基コドンを認識し、合成途中の蛋白質のＣ末端にＳｅｐが結合する。
図１（ｃ）に示した翻訳が進むと、図１（ｄ）に示すように目的の部位にＳｅｐを導入した蛋白質を得ることができる。
（改変ｔＲＮＡ）
本明細書において「改変ｔＲＮＡ」とは、アンチコドンを任意の塩基に改変したｔＲＮＡを言う。
本明細書において「改変ｔＲＮＡ」とは、アンチコドンを任意の塩基に改変したｔＲＮＡを言う。
本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡとしては、Ｓｅｐ-ｔＲＮＡの合成能を有する古細菌由来のシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンをＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡのうち、いずれか一つの４塩基アンチコドンに改変した改変ｔＲＮＡを合成して用いればよく、中でも、上記４塩基アンチコドンは、ＡＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＧＣＡＣ又はＧＣＡＡであることが好ましい。４塩基アンチコドンをＡＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＧＣＡＣ又はＧＣＡＡとした改変ｔＲＮＡは、さらに良好に、ＳｅｐＲＳに認識されるため、Ｓｅｐとの受容能が高く、Ｓｅｐと改変ｔＲＮＡとのアミノアシル結合効率が向上する。つまり、４塩基アンチコドンをＡＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＧＣＡＣ又はＧＣＡＡとした改変ｔＲＮＡを用いることにより、リン酸化蛋白質の合成率が著しく向上する。
Ｓｅｐ-ｔＲＮＡの合成能を有する古細菌としては、例えば、Methanocaldococcus jannaschii（メタノカルドコッカス ジャナシイ）、Methanosarcina acetivorans（メタノサルシナ アセチボランス）、Methanosarcina barkeri（メタノサルシナ バーケリ）、Methanosarcina mazei（メタノサルシナ マゼイ）、Methanococcus maripaludis（メタノコッカス マリパルディス）、Archaeoglobus fulgidus（アーキアオグロブス ファルギドゥス）、Methanopyrus kandleri（メタノピルス カンドレリ）、又は、Methanothermobacter thermautotrophicusが挙げられる。
また、これらの古細菌のシステインｔＲＮＡをコードするＤＮＡ配列は、Gen Bankに登録されているM. jannaschii（GenBank Accession Number NC_000909 ；gene ID 1451559、配列番号１）、M. acetivorans（GenBank Accession Number NC_003552 ； gene ID 3362166、配列番号２）、M. barkeri（GenBank Accession Number NC_007355 ； gene ID 3627317）、M. mazei（GenBank Accession Number NC_003901 ；gene ID 2820510）、M. maripaludis（GenBank Accession Number NC_005791 ； gene ID 2761128）、A. fulgidus（GenBank Accession Number NC_000917 ； gene ID 1484681）、M. kandleri（GenBank Accession Number NC_003551 ；gene ID 3161741）、又は、M. thermautotrophicus（GenBank Accession Number NC_000916 ； gene ID 1471677）から得ることができる。なお、上記GenBank Accession Numberにより、それぞれの古細菌のゲノム情報を得ることができ、上記gene IDにより、それぞれの古細菌のシステインｔＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。
中でも、それぞれ、M. jannaschii及びM. acetivoransの有するシステインｔＲＮＡである、配列番号１及び２に示す塩基配列からなるＲＮＡにより形成されるシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドン（配列番号１、２において、共に、３３位〜３５位の「gca」がアンチコドンである）を上述の４塩基アンチコドンに改変して用いることが好ましい。これらの改変ｔＲＮＡは、後述するＳｅｐＲＳに好適に認識されるからである。
また、本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡは、従来公知の生体外転写法により合成すればよい。転写合成のための鋳型ＤＮＡの合成には、例えば、プライマー伸長法、目的配列をベクターに導入してクローニングしてから用いる方法等が挙げられるが、プライマー伸長法が簡便であるため好ましい。つまり、上述したシステインｔＲＮＡの内、アンチコドンを上述した４塩基アンチコドンに置換した塩基配列を含む二重鎖ＤＮＡを、プライマー伸長法により合成し、これを転写反応に供することで合成することができる。
ここで、図２に基づいて、プライマー伸長法により本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡを合成する方法の一例について説明する。
図２は、本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡを、プライマー伸長法を用いて合成する方法の原理を模式的に表した図である。
図２（ａ）は、プライマー伸長法に用いる二つのプライマーがアニールした状態を示している。
プライマー伸長法を用いて、本発明に係る方法で用いるシステインｔＲＮＡを合成する場合の、プライマーの塩基配列の設計は、プライマー伸長反応が進行して二本鎖ＤＮＡが形成された際に、当該二本鎖ＤＮＡに、上述のシステインｔＲＮＡをコードするＤＮＡであってアンチコドンに相当する配列を上述の４塩基アンチコドンに置換したＤＮＡ、及び、当該二本鎖ＤＮＡの転写反応を制御するプロモーターをコードするＤＮＡが含まれ、さらに、プライマー同士の３’末端領域がアニール可能なように行なえばよい。
なお、図２では、プロモーターとしてＴ７プロモーターを用いた場合を例示しているが、これに限定されるものではなく、用いるＲＮＡポリメラーゼに応じて適宜選択すればよい。
図２（ｂ）は、図２（ａ）に示した状態から、プライマー伸長反応が進行した様子を示している。プライマー伸長反応が進行すると、合成を目的とする改変ｔＲＮＡをコードする塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡが合成される。
なお、例えば図２に示すように、合成した二本鎖ＤＮＡを２−プロパノール沈殿法により精製することが好ましい。
そして、当該二本鎖ＤＮＡを転写反応に供することにより、図２（ｃ）に示すように目的とする改変ｔＲＮＡを得ることができる。なお、転写反応は従来公知の方法、装置を用いて行なえばよい。
（ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素）
本明細書において「ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（ＳｅｐＲＳ）」とは、ｔＲＮＡにホスホセリンをアミノアシル結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をいう。
本明細書において「ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素（ＳｅｐＲＳ）」とは、ｔＲＮＡにホスホセリンをアミノアシル結合させるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素をいう。
本発明に係る方法で用いるＳｅｐＲＳとしては、本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡにＳｅｐをアミノアシル結合する反応を触媒し得る限り、限定されるものではない。
本発明に係るリン酸化蛋白質合成方法で用いる改変ｔＲＮＡを良好に認識し、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡの収率を向上させるＳｅｐＲＳとしては、例えばM. jannaschiiに由来するＳｅｐＲＳ（GenBank Accession Number NC_000909 ； protein ID NP_615064）、M. acetivoransに由来するＳｅｐＲＳ（GenBank Accession Number NC_003552 ； protein ID NP_248670）、M. barkeriに由来するＳｅｐＲＳ（GenBank Accession Number NC_007355 ； protein ID YP_304751）、M. mazeiに由来するＳｅｐＲＳ（GenBank Accession Number NC_003901 ； protein ID NP_633407）、M. maripaludisに由来するＳｅｐＲＳ（GenBank Accession Number NC_005791 ； protein ID NP_987808）、A. fulgidusに由来するＳｅｐＲＳ（GenBank Accession Number NC_000917 ； protein ID NP_068951）、M. kandleriに由来するＳｅｐＲＳ（GenBank Accession Number NC_003551 ； protein ID NP_613724）、M. thermautotrophicusに由来するＳｅｐＲＳ（GenBank Accession Number NC_000916 ； protein ID NP_276615）が挙げられる。なお、上記GenBank Accession Numberにより、それぞれの古細菌のゲノム情報を得ることができ、上記protein IDにより、それぞれの古細菌の有するＳｅｐＲＳのＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を得ることができる。
中でも、それぞれ、M. acetivorans、M. jannaschiiに由来するＳｅｐＲＳの一つである下記（ｃ）又は（ｄ）が好ましい。
（ｃ）配列番号３又は４のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（ｄ）配列番号３又は４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＳｅｐＲＳ活性を有するポリペプチド。
また、上記「１もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異蛋白質作製法により欠失、挿入、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは１０個以下、より好ましくは７個以下、最も好ましくは５個以下）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されていることが意図される。このような変異蛋白質は、上述したように、公知の変異蛋白質作製法により人為的に導入された変異を有する蛋白質に限定されるものではなく、天然に存在する蛋白質を単離精製したものであってもよい。
本発明に係る方法で用いるＳｅｐＲＳは、本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡにＳｅｐをアミノアシル結合する反応を触媒する限り、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。また、本発明に係る方法で用いるＳｅｐＲＳは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
（ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素の調製方法）
本発明に係る方法で用いるＳｅｐＲＳは、上述したＳｅｐＲＳをコードするＤＮＡを、公知のプラスミド等のベクターに導入し、これを大腸菌等の宿主細胞に導入して発現させて、分離、精製して得ることが、簡便であるため好ましい。
本発明に係る方法で用いるＳｅｐＲＳは、上述したＳｅｐＲＳをコードするＤＮＡを、公知のプラスミド等のベクターに導入し、これを大腸菌等の宿主細胞に導入して発現させて、分離、精製して得ることが、簡便であるため好ましい。
ＳｅｐＲＳをコードするＤＮＡとしては、例えば、M. jannaschii（入手先；例えばATCC 43067）、M. acetivorans（入手先；例えば、ATCC 35395、JCM 12185）、M. barkeri（入手先；例えばATCC 29786）、M. mazei（入手先；例えばATCC BAA-159、ATCC 43573）、M. maripaludis（入手先；例えばATCC 43000）、M. kandleri（入手先；例えばDSM 4304）、M. thermautotrophicus（入手先；ATCC 29096、ATCC 29183、ATCC 35610、ATCC 43169、ATCC 43846、ATCC 700791）等のＳｅｐＲＳを有する古細菌からＤＮＡを抽出してこれを鋳型とし、ＳｅｐＲＳをコードするＤＮＡ配列よりも５’側及び３’側のＤＮＡ配列に基づいてプライマーを作製してＰＣＲにより得たものを用いてもよく、上述したＳｅｐＲＳのＤＮＡ配列に基づいて、ＳｅｐＲＳをコードするＤＮＡを化学合成して得たものを用いてもよい。また、上述したＳｅｐＲＳを有する古細菌を培養して、分離、精製して得たものを用いてもよい。
また、ＳｅｐＲＳの分離は、例えば、ＳｅｐＲＳを発現させた細胞を、超音波処理等により破砕して、遠心分離等することにより行なえばよい。さらに、アフィニティークロマトグラフィー等、従来公知の蛋白質の精製法を用いて、精製することが好ましい。
（ホスホセリルｔＲＮＡ）
本発明に係るホスホセリルｔＲＮＡ（Ｓｅｐ−ｔＲＮＡ）は、上述のように、本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡを、ＳｅｐＲＳが認識することによってＳｅｐがアミノアシル結合してなる。
本発明に係るホスホセリルｔＲＮＡ（Ｓｅｐ−ｔＲＮＡ）は、上述のように、本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡを、ＳｅｐＲＳが認識することによってＳｅｐがアミノアシル結合してなる。
つまり、本発明に係るＳｅｐ−ｔＲＮＡは、ホスホセリルｔＲＮＡの合成能を有する古細菌由来のシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンが、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡから選択されるいずれか一つの塩基配列からなる４塩基アンチコドンに置換された改変ｔＲＮＡの３’末端に、ホスホセリンがアミノアシル結合している構造を有していればよい。
また、本発明に係るＳｅｐ−ｔＲＮＡは、Ｓｅｐ、ＳｅｐＲＳ及び本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡを混合することで合成される。つまり、後述する転写反応及び翻訳反応を行なう反応液に、Ｓｅｐ、ＳｅｐＲＳ及び本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡを混合しておけば、当該反応液中で合成される。ただし、Ｓｅｐ、ＳｅｐＲＳ及び本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡを混合して、別途Ｓｅｐ−ｔＲＮＡを合成してもよく、この場合、反応温度を、３７℃にするとよい。
（改変ＤＮＡ）
本明細書において「改変ＤＮＡ」とは、蛋白質をコードするＤＮＡにおいて、一部の塩基を任意の塩基に改変したＤＮＡを言う。
本明細書において「改変ＤＮＡ」とは、蛋白質をコードするＤＮＡにおいて、一部の塩基を任意の塩基に改変したＤＮＡを言う。
本発明に係る方法で用いる改変ＤＮＡは、目的の蛋白質をコードするＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡのホスホセリンを導入する部位に、上記改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応するコドンの塩基配列を挿入して、又は、ホスホセリンと置換する部位のアミノ酸に該当するコドンの塩基配列を上記改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応するコドンの塩基配列に置換して得ればよい。
例えば、本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡの４塩基アンチコドンをＡＧＣＡとした場合、ＴＧＣＴの４塩基コドンを導入すればよい。
つまり、蛋白質中に存在する任意のセリンをリン酸化する場合は、当該セリンのコドンを上述した４塩基コドンに置換すればよく、蛋白質中の、セリンが天然に存在しない部位にＳｅｐを導入する場合は、当該蛋白質をコードするＤＮＡ中の、Ｓｅｐの導入を目的とする部位に、上述した４塩基コドンを新たに導入すればよい。
４塩基コドンを導入する方法は従来公知の方法により行なえばよく、例えば、相同組換え、市販の変異導入キット（例：QIAGEN社のQuickChange mutagenesis kit）を用いる方法等の方法が挙げられる。また、ホスホセリンの導入を目的とする蛋白質をコードし、ホスホセリンの導入を目的とする部位に４塩基コドンを含むＤＮＡを化学合成して得てもよい。
（転写反応及び翻訳反応）
本発明に係る方法では、上述した改変ＤＮＡ由来のｍＲＮＡを得て、上述したＳｅｐ-ｔＲＮＡおよび当該ｍＲＮＡを含む翻訳系を用いて蛋白質を合成すればよい。
本発明に係る方法では、上述した改変ＤＮＡ由来のｍＲＮＡを得て、上述したＳｅｐ-ｔＲＮＡおよび当該ｍＲＮＡを含む翻訳系を用いて蛋白質を合成すればよい。
上述した改変ＤＮＡ由来のｍＲＮＡは、従来公知の方法により転写反応を行なって得ればよく、蛋白質の合成は、上述したＳｅｐ-ｔＲＮＡと当該ｍＲＮＡとを含む翻訳系を用いて、従来公知の方法で翻訳反応を行なえばよい。
なお、本明細書において「翻訳系」とは、少なくとも上述したＳｅｐ-ｔＲＮＡとｍＲＮＡとを含む、翻訳反応に必要な試薬の集合をいい、具体的には、当該試薬を混合して調製した反応液等を意図する。
例えば、従来公知の方法で得た大腸菌Ｓ３０抽出物を用いて、無細胞系で転写反応、翻訳反応を行なえばよく、その他にも従来公知のウサギ網状赤血球系、昆虫系、コムギ系、大腸菌PURE system等により行なってもよい。
また、本発明に係る方法には、上述したＳｅｐ−ｔＲＮＡを予め合成して、これを分離、精製して得た後、上述した４塩基コドンを導入した改変ＤＮＡの転写反応及び翻訳反応に、当該Ｓｅｐ−ｔＲＮＡを供することも包含されるが、チューブ等の一つの反応器において、本発明に係る方法で用いる改変ｔＲＮＡ、Ｓｅｐ、ＳｅｐＲＳ及び当該改変ＤＮＡを含む反応液を調製して、これを、転写反応及び翻訳反応に供することが好ましい。
上述したＳｅｐ−ｔＲＮＡは、転写反応及び翻訳反応を行なう反応液中で良好に合成され、そのまま当該翻訳反応に供されるため、別途Ｓｅｐ−ｔＲＮＡを合成する必要が無い。つまり、一つの反応器でＳｅｐ−ｔＲＮＡの合成、転写反応及び翻訳反応を行なうことができ、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡの加水分解による損失も最小限に抑えることができるため、簡便かつ高効率に、標的蛋白質の目的の部位にＳｅｐを導入することができる。
〔本発明に係る試薬キット〕
本発明に係る試薬キットは、ＳｅｐＲＳを保持する古細菌由来のシステインｔＲＮＡのアンチコドンを、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡのうち、いずれか一つの４塩基アンチコドンに改変した改変ｔＲＮＡ、及び、ＳｅｐＲＳを含めばよい。
本発明に係る試薬キットは、ＳｅｐＲＳを保持する古細菌由来のシステインｔＲＮＡのアンチコドンを、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡのうち、いずれか一つの４塩基アンチコドンに改変した改変ｔＲＮＡ、及び、ＳｅｐＲＳを含めばよい。
また、試薬キットの構成としては上記挙げたものに限定されるものではなく、Ｓｅｐ等、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、転写、翻訳反応関連試薬・器具（ＲＮＡポリメラーゼ、バッファー等）を含んでもよいし、改変ｔＲＮＡやＳｅｐＲＳを安定的に保持するための試薬や緩衝液を含んでもよい。
上記の何れの構成であっても、目的の部位にホスホセリンが導入されたリン酸化蛋白質の合成に好ましい薬剤等が含まれている。また、本発明に係る試薬キットを用いれば、Ｓｅｐ-ｔＲＮＡを合成し、当該Ｓｅｐ-ｔＲＮＡをそのまま翻訳反応に供することができる。
従って、本発明に係る試薬キットを用いれば、簡便かつ高効率に、目的の部位にホスホセリンが導入された蛋白質を合成することができる。さらに、上述のように保管が困難なアミノアシルｐｄＣｐＡ又はアミノアシルｔＲＮＡを用いる必要が無いため、実用上も優れている。
また、本発明に係る試薬キットの提供形態は、含まれる試薬全てを、適切な容量及び／又は形態で含有した一つの容器として提供してもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。また、本発明に係る試薬キットには、蛋白質にＳｅｐを導入するための手順等を記載した説明書を含んでもよい。
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
〔実施例１：アンチコドンを改変したｔＲＮＡの合成〕
配列番号１に示す塩基配列からなるシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンを、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ又はＧＣＡＡに改変した改変ｔＲＮＡ、及び、ＵＣＡに改変した改変ｔＲＮＡを合成した実施例について説明する。
配列番号１に示す塩基配列からなるシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンを、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ又はＧＣＡＡに改変した改変ｔＲＮＡ、及び、ＵＣＡに改変した改変ｔＲＮＡを合成した実施例について説明する。
（鋳型ＤＮＡの合成）
まず、ｔＲＮＡを合成するための鋳型となる２本鎖ＤＮＡを（以下、「鋳型ＤＮＡ」と表記する。）、プライマー伸長法により合成した。プライマーとして、全ての改変ｔＲＮＡの合成において、一方のプライマーに配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーを用い、他方のプライマーとして、アンチコドンを、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ又はＧＣＡＡに改変した改変ｔＲＮＡを合成するために、それぞれ配列番号６〜１３に示す塩基配列からなるプライマー、ＵＣＡに改変した改変ｔＲＮＡを合成するために、配列番号１４に示す塩基配列からなるプライマーを用いた。
まず、ｔＲＮＡを合成するための鋳型となる２本鎖ＤＮＡを（以下、「鋳型ＤＮＡ」と表記する。）、プライマー伸長法により合成した。プライマーとして、全ての改変ｔＲＮＡの合成において、一方のプライマーに配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーを用い、他方のプライマーとして、アンチコドンを、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ又はＧＣＡＡに改変した改変ｔＲＮＡを合成するために、それぞれ配列番号６〜１３に示す塩基配列からなるプライマー、ＵＣＡに改変した改変ｔＲＮＡを合成するために、配列番号１４に示す塩基配列からなるプライマーを用いた。
プライマー伸長法は、以下の条件で行なった。
プライマー伸長反応用の反応液は、全量を100μlとして、２種類のプライマーをそれぞれ1μM、dNTPsを0.2mM、KOD Dash DNAポリメラーゼ（東洋紡社製）を25U、上記東洋紡社製KOD Dash ＤＮＡポリメラーゼに添付の10×Bufferを10μl混合し、残部を純水とした。
次に、予め94℃に加温したＰＣＲ用のサーマルサイクラーに、上記プライマー伸長反応用の反応液を含む反応器を配置して、94℃で90秒間、55℃で2秒間、72℃で30秒間静置してプライマー伸長反応を行なった。
プライマー伸長反応後の反応液に対して２倍量の２−プロパノールを混合した。その後、上清を廃棄して、析出した沈殿物を回収した。ここで得た沈殿物を、80％エタノールで洗浄して、乾燥させた後、滅菌水５０μlに溶解させて鋳型ＤＮＡ溶液を得た。
得られた鋳型ＤＮＡ溶液の内１μlを、6％polyacrylamide、1×TBEからなるゲルを用いて電気泳動（２００Ｖ、２０℃、３０分間）に供して、鋳型ＤＮＡの合成を確認した。
その結果を図３に示す。図３は、得られた鋳型ＤＮＡを電気泳動に供した結果を示す図であり、各バンドパターンの上に、それぞれの鋳型ＤＮＡを用いて得られる改変ｔＲＮＡが有するアンチコドンの塩基配列を示す。また、最も左のバンドパターンは、分子量マーカーである。図３により、いずれの鋳型ＤＮＡも合成されたことが確認できる。
（改変ｔＲＮＡの合成）
次に、合成した鋳型ＤＮＡを用いて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写反応を行なった。転写反応に用いた転写用反応液は、全量を400μlとして、それぞれの鋳型ＤＮＡ溶液20μlを、10×Tバッファー（40μl）、25mM NTPs（32μl）、100mM グアニル酸（40μl）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（3μl、Takara社製）、残部を純水とした。そして、それぞれの転写用反応液を37℃、4時間静置することで転写反応を行ない、改変ｔＲＮＡ溶液を得た。
次に、合成した鋳型ＤＮＡを用いて、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写反応を行なった。転写反応に用いた転写用反応液は、全量を400μlとして、それぞれの鋳型ＤＮＡ溶液20μlを、10×Tバッファー（40μl）、25mM NTPs（32μl）、100mM グアニル酸（40μl）、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（3μl、Takara社製）、残部を純水とした。そして、それぞれの転写用反応液を37℃、4時間静置することで転写反応を行ない、改変ｔＲＮＡ溶液を得た。
次に、改変ｔＲＮＡの合成の確認のため、それぞれの改変ｔＲＮＡ溶液の内３μlを、10% polyacrylamide、7M 尿素、１×TBEからなるゲルを用いて電気泳動（２００Ｖ、２０℃、３０分間）に供して、転写反応の確認を行なった。
その結果を図４に示す。図４は、得られた改変ｔＲＮＡを電気泳動に供した結果を示す図であり、各バンドパターンの上に、それぞれの改変ｔＲＮＡが有するアンチコドンの塩基配列を示す。また、最も右のバンドパターン、最も左のバンドパターン及びその右のバンドパターンは、改変していないM. jannaschii由来のシステインｔＲＮＡを示しており、各バンドパターンの上に付した数値は、当該システインｔＲＮＡの濃度を示している。図４より、いずれの改変ｔＲＮＡも得られたことが確認できた。
〔実施例２：ＳｅｐＲＳの調製〕
（ＳｅｐＲＳ発現細胞の調製）
配列番号１５に示す塩基配列からなるＤＮＡを、pET-21a（＋）プラスミド（Novagen社）のNdeI-XhoIサイトに導入した。なお、配列番号１５に示す塩基配列は、M. acetivoransが有するＳｅｐＲＳをコードする塩基配列である。
（ＳｅｐＲＳ発現細胞の調製）
配列番号１５に示す塩基配列からなるＤＮＡを、pET-21a（＋）プラスミド（Novagen社）のNdeI-XhoIサイトに導入した。なお、配列番号１５に示す塩基配列は、M. acetivoransが有するＳｅｐＲＳをコードする塩基配列である。
次に、大腸菌BL21（DE3）（Novagen社製）の懸濁液に、当該プラスミドを5ng/50μlとなるように添加し、氷上で30分間、42℃で45秒間、さらに氷上で5分間静置した。
その後、大腸菌BL21(DE3)をLB培地（Triptone peptone 10g/l、Yeast extract 5g/l、NaCl 10g/l、Bacto agar 15g/l、オートクレーブによる滅菌後、アンピシリン 100mg/l添加）に植菌して、37℃で一晩培養した。これによりＳｅｐＲＳ発現細胞を得た。
（ＳｅｐＲＳ発現細胞の培養）
フィルター滅菌したリン酸緩衝液（0.72M K2HPO4、0.17M KH2PO4）及び100mg/lアンピシリン溶液100μlを添加したTB培地（Bacto peptone 12g/L、Yeast extract 24g/l、glycerol 4ml/l）100mlに、得られたＳｅｐＲＳ発現細胞を植菌して、37℃で振騰培養した。600nmの吸光度(A600)で0.6になるまで培養した後、培養温度を30℃とした上で、1M IPTG（イソプロピルチオガラクトシド）100μl、及び、100mg/lアンピシリン溶液40μlを添加して一晩培養した。
フィルター滅菌したリン酸緩衝液（0.72M K2HPO4、0.17M KH2PO4）及び100mg/lアンピシリン溶液100μlを添加したTB培地（Bacto peptone 12g/L、Yeast extract 24g/l、glycerol 4ml/l）100mlに、得られたＳｅｐＲＳ発現細胞を植菌して、37℃で振騰培養した。600nmの吸光度(A600)で0.6になるまで培養した後、培養温度を30℃とした上で、1M IPTG（イソプロピルチオガラクトシド）100μl、及び、100mg/lアンピシリン溶液40μlを添加して一晩培養した。
（ＳｅｐＲＳの精製）
培養したＳｅｐＲＳ発現細胞を、培養後のTB培地を遠心分離（5000rpm、4℃、20分間）して、上清を廃棄することで回収した。
培養したＳｅｐＲＳ発現細胞を、培養後のTB培地を遠心分離（5000rpm、4℃、20分間）して、上清を廃棄することで回収した。
次に、氷冷したbuffer An 5ml（50mM HEPES-KOH(pH7.5)、150mM (NH4)2SO4、7mM MgCl2、20% glycerol、使用直前に7mM β-Mercaptoethanol、及び、100μM PMSF（フッ化フェニルメチルスルホニル）を添加）に、回収したＳｅｐＲＳ発現細胞を懸濁させた。
次に、回収したＳｅｐＲＳ発現細胞の懸濁液を、超音波破砕装置（Branson社製；型番S-250D、条件；out put 3、duty cycle 20% 、10分間）を用いた超音波破砕に供して、ＳｅｐＲＳ発現細胞の細胞壁を破壊した。その後、2mlチューブに分取したものを、15,000rpm、4℃、30分間、遠心分離して、沈殿物が混入しないように、上清を回収した。なお、当該上清の内、2μlは、SDS-PAGEに供して、ＳｅｐＲＳの合成を確認した。
ＳｅｐＲＳの精製は、カラム（Qiagen社製Ni-NTA Agarose；型番30210）を用いて行なった。当該カラムは、十分に懸濁したNi-NTA樹脂を1ml充填し、滅菌水3mlで洗浄した後、上記buffer An 10mlで洗浄したものである。
まず、上記カラムに、回収した上清を流し、次に、当該カラムを、上記buffer An 30mlで洗浄し、その後、buffer B 30ml（50mM HEPES-KOH(pH7.5)、1M NH4Cl、10mM Imidazole、20% glycerol、使用直前に5mM β-Mercaptoethanolを添加）で洗浄した。
さらに、当該カラムにbuffer Cn 100μl（50mM HEPES-KOH(pH7.5)、100mM (NH4)2SO4、150mM Imidazole、20% glycerol、使用直前に5mM β-Mercaptoethanolを添加）を流した。ここで得られた溶出液を1.5mlチューブで分取した（これを画分１とする）。
さらに、当該カラムに上記buffer Cnを1ml流し、得られた溶出液を1.5mlチューブで分取した（これを画分２とする）。
画分２を得た操作と同様の操作を繰り返し、画分３、４、５を分取した。
次に、画分１〜５を96ウェルプレート上に2μlずつ分取して、BioRad社製 Protein Assay Kitに付属の蛋白質検出溶液を５倍希釈したものを、200μlずつ加えた。これにより、ＳｅｐＲＳ濃度が高い画分ほど濃い青に呈色した。よって、最も濃い青を示した画分を、ＳｅｐＲＳ溶液として、後述する改変ｔＲＮＡとＳｅｐとのアミノアシル結合に用いた。なお、当該ＳｅｐＲＳ溶液は、−８０℃で保存した。
〔実施例３：改変ｔＲＮＡと、ホスホセリンとのアミノアシル結合〕
次に、得られた改変ｔＲＮＡとＳｅｐとのアミノアシル結合を行なった。
次に、得られた改変ｔＲＮＡとＳｅｐとのアミノアシル結合を行なった。
まず、実施例１で得られた改変ｔＲＮＡ溶液に対して、フェノール処理、イソプロピルアルコール沈殿を行なった後、ゲル（10% polyacrylamide、7M 尿素、１×TBE）を用いて電気泳動を行なって改変ｔＲＮＡを精製した。切り出した改変ｔＲＮＡを含むゲル断片を、2mM EDTA溶液に溶解してエタノール沈殿させた後、Ｓｅｐとのアミノアシル結合反応に用いた。
なお、フェノール処理は以下のようにして行なった。フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールの混合液（重量比25:24:1）を、改変ｔＲＮＡ溶液に等量加えて、1分間攪拌した後、10000rpmで1分間遠心し、上清を回収した。次に、回収した上清に対して、クロロホルムを等量加え、1分間攪拌した後、10000rpmで1分間遠心分離し、上層を取り出した。
また、イソプロピルアルコール沈殿は以下のようにして行なった。フェノール処理後の改変ｔＲＮＡ溶液に対してイソプロピルアルコールを0.8倍容量加えて、攪拌して、氷上で5分放置した後、15000rpm、4℃で15分遠心分離した。その後、上清を除いて沈殿物を回収した後、氷冷した70%エタノールを100μl加えて15000rpm、4℃で1分遠心して、上清を除き沈殿物を回収した。なお、イソプロピルアルコール沈殿により得た沈殿物は減圧乾燥して保管した。
アミノアシル結合反応に用いる反応液は、全量を15μlとして、上述の精製により得た改変ｔＲＮＡを0.05 OD/μlとなるように調製したものを0.4μl、10×Tris‐HCl/NaCl/DTT（1.5μl）、MgCl2を5mM含む5×ATP（3μl）、上述の方法で得たＳｅｐＲＳ溶液（3μl）、300μM Ｓｅｐ（2μl）を混合し、残部は純水とした。なお、後述のように放射活性を測定することで、Ｓｅｐと改変ｔＲＮＡとのアミノアシル結合効率を確認するため、ここで用いたＳｅｐは、放射標識が施されている。
次に、当該反応液を37℃で30分間インキュベートすることでアミノアシル結合反応を行なった。
それぞれの改変ｔＲＮＡに対する、Ｓｅｐのアミノアシル結合効率は、以下の方法で確認した。
まず、アミノアシル結合反応後の反応液をフィルター（Whatman社製、グレード3MM）にスポットし、10%トリクロロ酢酸溶液中で10分の洗浄を3回行なった後、エタノールで軽く濯ぎ、再びエタノールを加えて10分洗浄した。その後、白熱ランプでフィルターを乾燥した。これを5mlの液体シンチレーター(DOTITE DPO 4g、DOTITE POPOP 0.1g／トルエン1lの割合で調合)中にいれて、放射活性を測定した。
ここでフィルターに結合しているのは、改変ｔＲＮＡ、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡ、及びＳｅｐＲＳである。なお、改変ｔＲＮＡにアミノアシル結合しなかったＳｅｐは、上述のフィルター上における洗浄工程で洗い流されているので検出されない。よって、フィルターに残った放射活性は、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡの量を示す。なお、予め放射標識したＳｅｐを用いて、測定される放射活性からセリンの量を算出するための検量線を作成することで、各反応液において得られた放射活性から、得られたＳｅｐ-ｔＲＮＡの量（pmol）を算出し、さらに、アミノアシル結合効率（アミノアシル結合反応に供した改変ｔＲＮＡの内、Ｓｅｐと結合した改変ｔＲＮＡの割合）を算出した。また、バックグラウンドの放射活性等は適宜調整する計算を行ない、Ｓｅｐ−ｔＲＮＡ由来の放射活性を算出した。その結果を表１に示す。
なお、表１には、実施例１では作製していない、配列番号１に示す塩基配列からなるシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンをＣＣＣＧ又はＡＣＣＣに改変した改変ｔＲＮＡと、Ｓｅｐとのアミノアシル結合効率を、実施例３に記載の方法で求めた結果も示している。当該改変ｔＲＮＡは、実施例１と同様の方法で得たものである。
表１に示すように、アンチコドンをＵＣＡ、ＣＣＣＧ又はＡＣＣＣに改変した改変ｔＲＮＡには、全くＳｅｐが結合せず、アンチコドンをＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ又はＧＣＡＡに改変した改変ｔＲＮＡにはＳｅｐが結合したことが確認された。また、４塩基コドンを、ＡＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＧＣＡＣ、ＧＣＡＡに改変した場合、さらに良好にＳｅｐと結合することが確認された。
本発明に係るリン酸化蛋白質合成方法は、天然に存在するホスホセリン修飾蛋白質のみではなく、天然には存在しないホスホセリン修飾蛋白質をも得ることができる。本発明に係るリン酸化蛋白質合成方法により得られた様々なホスホセリン修飾蛋白質は、生化学研究や臨床研究で利用可能であり、さらに、創薬などの医薬品産業で利用可能である。
Claims (8)
- 目的の部位にホスホセリンが導入された蛋白質の合成方法であって、
ホスホセリルｔＲＮＡの合成能を有する古細菌由来のシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンが、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡから選択されるいずれか一つの塩基配列からなる４塩基アンチコドンに置換された改変ｔＲＮＡを合成する工程と、
ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素を用いて、上記改変ｔＲＮＡにホスホセリンをアミノアシル結合させ、ホスホセリルｔＲＮＡを得る工程と、
目的の蛋白質をコードするＤＮＡにおいて、当該ＤＮＡのホスホセリンを導入する部位に上記改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応するコドンの塩基配列が挿入された改変ＤＮＡ、又は、ホスホセリンと置換する部位のアミノ酸に該当するコドンの塩基配列が上記改変ｔＲＮＡの有する４塩基アンチコドンに対応するコドンの塩基配列と置換された改変ＤＮＡを得る工程と、
上記改変ＤＮＡ由来のｍＲＮＡを得る工程と、
上記ホスホセリルｔＲＮＡおよび上記ｍＲＮＡを含む翻訳系を用いて蛋白質を合成する工程とを含むことを特徴とするリン酸化蛋白質合成方法。 - 上記４塩基アンチコドンは、ＡＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＧＣＡＣ、ＧＣＡＡであることを特徴とする請求項１に記載のリン酸化蛋白質合成方法。
- 上記古細菌は、Methanocaldococcus jannaschii（メタノカルドコッカス ジャナシイ）又は、Methanosarcina acetivorans（メタノサルシナ アセチボランス）であることを特徴とする請求項１に記載のリン酸化蛋白質合成方法。
- 上記システインｔＲＮＡは、配列番号１又は２のいずれかに示される塩基配列からなることを特徴とする請求項１に記載のリン酸化蛋白質合成方法。
- 上記ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素は、Methanosarcina acetivorans（メタノサルシナ アセチボランス）又は、Methanocaldococcus jannaschii（メタノカルドコッカス ジャナシイ）由来のホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素であることを特徴とする請求項１に記載のリン酸化蛋白質合成方法。
- 上記ホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素は、下記（ｃ）又は（ｄ）のいずれかのポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載のリン酸化蛋白質合成方法。
（ｃ）配列番号３又は４のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｄ）配列番号３又は４のいずれかに示されるアミノ酸配列において、１個又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。 - 目的の部位にホスホセリンが導入された蛋白質の合成に用いる、ホスホセリルｔＲＮＡであって、
ホスホセリルｔＲＮＡの合成能を有する古細菌由来のシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンが、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡから選択されるいずれか一つの塩基配列からなる４塩基アンチコドンに置換された改変ｔＲＮＡの３’末端に、ホスホセリンがアミノアシル結合している構造を有することを特徴とするホスホセリルｔＲＮＡ。 - 目的の部位にホスホセリンが導入された蛋白質を合成するためのキットであって、
少なくともホスホセリルｔＲＮＡの合成能を有する古細菌由来のシステインｔＲＮＡにおいて、当該システインｔＲＮＡのアンチコドンが、ＡＧＣＡ、ＣＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＵＧＣＡ、ＧＣＡＧ、ＧＣＡＵ、ＧＣＡＣ及びＧＣＡＡから選択されるいずれか一つの塩基配列からなる４塩基アンチコドンに置換された改変ｔＲＮＡ、及びホスホセリルｔＲＮＡ合成酵素を含むことを特徴とするキット。
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-
2006
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