JP2008022851A - ワクチン生成に適した吸血生物および寄生生物の生成のための装置および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 吸血昆虫ベクターおよび寄生生物の無菌的な生成、より詳細には、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ種の蚊およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のスポロゾイトの生成のためのシステムおよび方法を提供すること。
【解決手段】 無菌的な昆虫段階の寄生生物の生成のための装置であって：壁で囲まれたチャンバ；表面を滅菌した昆虫卵からの成体昆虫の成長を補助するためのチャンバ内レザバ；および成体昆虫が寄生生物に感染した血液を消費することを可能にするチャンバ内血液供給ステーション、を備える、装置。
【選択図】 なし

Description

（優先権の主張）
本願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ １１９（ｅ）に基づき、２００２年４月５日に出願された米国仮出願番号６０／３７０，５８１の優先権を主張する。

（発明の分野）
本発明は、概して、吸血昆虫において寄生生物を生成するための装置および方法、詳細には、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ種の蚊においてＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトを生成するための装置および方法に関する。本発明はさらに、所望の特性（例えば、低アレルギー性または超感染性）を有する昆虫系統（例えば、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊）の生成のための装置および方法に関する。本発明はまた、凍結温度付近での凍結保存に耐性の寄生生物系統を生成する方法に関する。本発明はさらに、弱毒化された寄生生物ワクチンの注射のための装置および方法に関する。本発明により、望ましくない生物学的因子（例えば、細菌および他の微生物）が混入していない寄生生物および吸血昆虫の生成が可能となる。本発明の装置は、寄生生物または昆虫ベクター宿主のいずれかへの、望ましくない生物学的因子の混入を回避するための、複雑な寄生生物の生活サイクルの無菌的な再構築を提供する。本発明はまた、比較的浅い凍結保存温度で安定な弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトワクチンの生成のための方法を提供する。本発明はさらに、微量ボーラス量のワクチンの送達のための装置を提供する。

（発明の背景の説明）
マラリアは、最も打撃を与える寄生生物疾患であり、従って、最も重要な世界規模の公衆衛生問題の一つである。この分野の熟練者によると、マラリアは、三億人に感染し、毎年三百万人を殺傷する。マラリアに対するワクチンは、この危険な疾患の影響を大きく減少させると考えられる。

マラリアにおける原因因子は、種々の種の真核生物のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅを含む）である。これらの寄生生物は、脊椎動物宿主および無脊椎動物宿主の両方に関与する非常に複雑な生活サイクルを有する。この寄生生物の脊椎動物感染形態（スポロゾイト）は、蚊（代表的には、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ属）の唾液腺に存在し、スポロゾイトは、その蚊の食事中にヒトに伝染する。ヒト宿主において、スポロゾイトはまず、肝臓の細胞に感染し、最終的には、赤血球細胞に感染する。この感染は、感染者に潜在的に致命傷となる疾患を引き起こす。

現在のマラリアに対する予防アプローチとしては、クロロキン、メフロキン、およびアトバクオン／プロクアニルを含む薬物の使用が挙げられる。しかし、近年、複数の薬物耐性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ系統が観察されている。さらに、薬物耐性マラリア系統の発生は、これらの予防的抗マラリア薬の使用により促進されると考えられる。従って、マラリアに対するワクチンを開発するために、多大な努力がなされている。

科学文献には、マラリアに対するワクチンが有効であり得るとの指標がある程度示されている。代謝活性非複製（弱毒化）全スポロゾイトワクチンにおいて、非特許文献１は、照射によりマウスを免疫することにより、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉスポロゾイトを弱毒化したことを報告している。これらのげっ歯類の研究は、人体研究に対する推進力を提供し、そして、１９７０年代に、Ｃｙｌｄｅ，Ｒｉｅｃｋｍａｎｎら（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）は、限定的な研究を実施し、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトを唾液腺内に有する照射した蚊を噛みつかせて免疫したヒトボランティアが、完全に感染性のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトによるチャレンジに対して保護され得ることを確立した。ＨｏｆｆｍａｎおよびＬｕｋｅ（非特許文献５）は、生きた蚊による免疫およびチャレンジによる１０年にわたる臨床試験の結果を報告することにより、このアプローチの十分な能力を確立し、それらの結果を、ヒトを照射したＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトで免疫する全ての公開された臨床報告と合わせた。

以下の三点に、最も重要な発見を要約する：１）１０００以上の感染、照射された蚊の噛みつきにより免疫された１４人のボランティアの内１３人が、最後の一次免疫から１０週以内にチャレンジした場合、発達血液段階のＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染に対して保護された；２）上記１）において、最後の一次または二次免疫後２３〜４２週（２３、３６、３９、４１、および４２週）にチャレンジした場合、１４人のボランティアの内の５／６が、実験的チャレンジから保護された；および３）４人において、７回の異種チャレンジ（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの一つの系統での免疫およびＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの別の系統でのチャレンジ）のうち７回が、完全な保護を伴った。

このことから、少なくとも１０ヶ月の間、９０％以上の免疫研究で保護が達成されることを実証し、そして交雑系統（異種）保護を実証した。この実験的ワクチンアプローチの真の効果は、初めて実証された。この研究は、弱毒化マラリアワクチンの可能性を実証したが、多くの理由から、照射した感染蚊の噛みつきにより多くの感受性の個体を免疫することは実施不可能であると考えられた。

臨床適合するワクチンの開発に対する一つの技術的ハードルは、望ましくない生物学的因子の混入のない無菌的なスポロゾイトの生成である。現在、インビトロプロセスを用いて、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトを生成することは不可能である。従って、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトは、感染した雌のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊の組織から取得しなければならない。しかし、野生型で昆虫により育った蚊は、望ましくない生物学的因子（細菌、カビ、および真菌を含む）の混入であることが周知である。この交雑は、規制免許制度の下で適切な臨床的関連ワクチンにおいて蚊由来の寄生生物を使用することを大いに妨げている。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍスポロゾイトのインビボ生成のために無菌的なＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊を生成するための装置および方法は、臨床的な観点からも規制の観点からも許容できる弱毒化スポロゾイトワクチンの開発の重要な工程である。

蚊と、望ましくない生物学的因子との交雑は、蚊の生活サイクルにおけるいくつかの供給源から生じ得る。蚊の卵の表面は、雌の蚊の生殖管および産卵管からの産卵の間に汚染され得る。幼虫は、さなぎおよび成体の蚊への幼虫の変態の間、それらの胃腸管および栄養囲膜において微生物を保有し得る。さらに、複数の環境因子（幼虫の水中生息、成体の蚊の外部環境、および蚊が吸いついた動物の汚染した皮膚を含む）が、蚊（従って、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物）の汚染に寄与し得る。

数十年にわたり、非無菌的なスポロゾイトが、研究目的で、労力のいる技術を用いて感染Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊から慣用的に得られている。この標準的なアプローチには複数の欠点がある。その全プロセスは、非無菌的条件下で実施されるので、スポロゾイト調製物は、通常、微生物汚染している。スポロゾイトは種々の技術により部分的に精製されるが、得られる生成物の汚染は、ヒトへの使用のためのワクチンを開発する上で使用するのに不適切なものにする。微生物汚染したワクチンは、ヒトおよび動物の両方において、重篤な医原性感染を引き起こし得る。さらに、非無菌的な蚊を産み出すための先行技術のプロセスは、労力のかかる技術であり、そしてそれらの生活サイクルの間に複数の直接的な蚊の操作を必要とする。

従って、マラリアに対するワクチンを生成する上での制限の一つは、多量の無菌的なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のスポロゾイトを得る能力である。上述のように、標準的な技術を用いてＡｎｏｐｈｅｌｅｓ種から得られるスポロゾイトは、弱毒化スポロゾイトワクチンの開発に有用でないスポロゾイトである。無菌的なスポロゾイトは、安全かつ効果的な保護的免疫応答を生成するためのワクチンとして使用され得る。さらに、このような無菌的スポロゾイトの生成は、マラリアワクチンの商業製品についての規制要件である。

従って、マラリアに対するワクチン開発に使用するための無菌的なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトおよび無菌的なＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊の生成が、医療分野で長い間望まれている。Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物を無菌的に産み出すための装置および方法はまた、他の臨床的に必要とされているヒトおよび動物の寄生生物疾患に対するワクチンのための、他の吸血昆虫種および寄生生物の無菌的生成についても使用され得る。

特定の所望の特性（例えば、超感染性または低アレルギー性）を有する昆虫系統を開発するために、個々の昆虫の噛みつき挙動および特性を選択的に評価する実験を可能にするデバイスを用いることが有用である。この装置はまた、所望の特性を有する昆虫の選択においても有用である。

マラリアに対する弱毒化ワクチンの効果的かつ経済的な開発についてのさらなるハードルは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物が蚊宿主において有する有害な効果である。Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊は、吸いついた宿主動物にＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを伝染することができる。Ａｎｏｐｈｅｌｅｓの雌蚊のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染は、実験環境および自然環境の両方において蚊の生存に有害であることが研究により示されている。従って、多量の蚊相の寄生生物を雌の蚊から抽出する能力は、蚊が重度のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物負荷に耐えられないことから現在は制限されている。

Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｕ寄生生物による多量の感染に耐性である特有のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊系統からは、より効果的に蚊からのスポロゾイトの生成および抽出を行える。従って、この特有のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊系統からの弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトワクチンの開発は、より効果的でありかつより経済的である。

蚊組織から抽出された、生きた、弱毒化された、または死滅した病原ワクチンを生成する上でのさらなる潜在的な困難性は、蚊抗原が、接種したヒトまたは動物において超感染性反応、アルツス反応、または遅延型超感染性反応を引き起こす可能性である。いくつかの種の蚊において、多くの超感染性唾液抗原が同定されている。これらの唾液抗原はおそらく、多くの理由で、野生型の蚊に生存上の利益を与える。

しかし、研究室で維持された蚊の集団において、このような抗原は、それらの野生の先祖の痕跡であり、おそらく、選択的な生存上の利益をもはや必要としない。低アレルギー性の蚊を生成する技術を開発することによって、広範な蚊誘導感染に特異的ないくつかの低アレルギー性種の蚊（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ、Ａｃｅｄｅｓ、Ｃｕｌｅｘなど）を生成することが可能である。これらの低アレルギー系統の蚊は、安全かつ有効な弱毒化された寄生生物ワクチンの生成において大きな有用性を有する。

一旦、弱毒化ワクチンが開発されると、このワクチンは、それを必要とする個々に効率的に送達されるべきである。しかし、ワクチンが送達される標準的な様式（注射器を介した注入）は、弱毒化マラリアワクチンの場合効果的でない。種々のゲージの針が取り付けられ得る産業標準的なロッキングポートを有する種々のサイズのワクチン注射器が市販されている。通常、このシステムは、必要とされる量が５００〜１０００マイクロリットルの範囲であるため、代表的なワクチンには十分である。代表的なワクチンの免疫原性に対して、免疫間の少量の差は効果を有さない。

しかし、弱毒化されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトワクチンのようないくつかのワクチンにおいて、接種材料は、マイクロリットルまたはそれ以下のオーダーであるべきであり得る（探索目的の蚊の注射のように）。多量であると、ワクチンの保有する液体が、組織の完全性を破壊し、そしてその液体が組織面に流れ込み得る。マウスにおいては、実質的に全てのスポロゾイトチャレンジ研究および弱毒化スポロゾイト免疫研究が、スポロゾイトの静脈内注入により達成される。なぜならば、皮膚、皮下組織、および筋肉におけるスポロゾイトの非静脈内投与は、ずっと低い感染効率および保護率を伴うからである。皮膚への注射の場合、スポロゾイトは、宿主の細胞構造を通じて毛細管に移動する機会がなければ、スポロゾイトが懸濁された液体により形成される組織面の間の空間内で失活する可能性がある。

従って、現在のワクチンについての標準的な手順は、超少量ワクチンについては不適切である。この制限を克服するために、使い捨て微小針および注射器アセンブリが設計され得る。このアプローチは有効であるかもしれないが、数百万のワクチンを、極めて貧しい国に与えなければならないので非現実的でもある。好ましくは、マラリアワクチン送達システムは、超少量のボーラスを送達しかつ費用を抑える目的で標準の注射器アセンブリを用い得る。

世界規模での個人への凍結した弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍワクチンの送達についてのハードルもまた存在する。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトは、種々の保存溶液中で、凍結温度で生存する能力を有する。再加温し、運動性のスポロゾイトの割合および実験動物への注射後に患者の血液段階感染を引き起こす能力を概算した後に測定された最良の結果は、極めて低い温度（摂氏−１９６〜−７０度）が数年間スポロゾイトを保存し得ることを実証している。しかし、保存温度が摂氏０度に達すれば、時間の関数として、生存スポロゾイトの割合が、温度依存的な様式で大きく下降する。この生存度の低下は、保存および輸送の間に高い程度の能力を保持しなければならない弱毒化スポロゾイト由来のマラリアワクチンの有用性を制限する。

世界規模の低温保存および輸送インフラは強固であり、ほとんど全ての国々が比較的多量のマラリアを摂氏０℃に達する温度で保存する能力を有する。摂氏０度付近で、既存の設備およびインフラは、地球の最も離れた位置へさえも弱毒化ウイルスワクチンを送達するよう適合され得る。摂氏−７０度の範囲の温度を必要とする保存および輸送インフラは、技術的に実現可能であるが、より技術的に発展した国々においてのみ慣用的に可能である可能性がある。しかし、このような極めて低い温度は、特別な装置、取り扱いが必要であり、おそらく、弱毒化スポロゾイトワクチンを送達する物流管理を適合するのに多額の資金投資を伴う。

スポロゾイトの凍結保存研究は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｍｕスポロゾイトの凍結耐性系統を開発する以外の目的で開発されたＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ系統およびクローンを使用している。全ての生物は、ある程度、重要酵素、タンパク質の変性を防止するかまたは氷結晶形成により引き起こされる細胞物質への損傷を制限する安定化タンパク質、熱ショックタンパク質、糖質、および炭水化物を使用することにより、温度変移に対して生存する能力を有する。マラリア寄生生物（その生活サイクルは、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊を通る経路を含む）は、自然な温度変移（しばしば、極端な側での）に抗する能力を有するはずである（なぜならば、多くの温和／熱帯気候は、昼夜サイクルにおいて華氏３０〜５０度変化し得るからである）。自然界のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ生物間の遺伝的変異は、温度危機に抗するスポロゾイトの能力における広範な変異を導いている。

高温の凍結保存条件においてより良好に生存することができるＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種を開発するための鍵は、その能力を有することが示されたスポロゾイトを選択的に飼育することである。長期間にわたり、天然の生活サイクルを完了する能力を有しつつ次第に高くなる凍結保存温度で生存するスポロゾイトを選択することにより、世界規模で使用するための弱毒化寄生生物ワクチンにおいてずっと有用性の高いＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ系統を開発することが可能である。
Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９６７）２１６：１６０〜１６２ Ｃｌｙｄｅら；Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９７３）２６６：１６９−１７７ Ｃｌｙｄｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．（１９７３）２６６：３９８−４０１ Ｒｉｅｃｋｍａｎｎら，Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．（１９７４）６８：２５８−２５９ Ｈｏｆｆｍａｎら；Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２００２）１８５：１１５５−１１６４

（発明の要旨）
本発明に従って、概して言うと、吸血昆虫ベクターおよび寄生生物の無菌的な生成、より詳細には、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ種の蚊およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のスポロゾイトの生成のためのシステムおよび方法を提供する。

本発明は、好ましくは、全ての段階の寄生生物−昆虫生活サイクルを補助し得る滅菌環境の使用を通じて、寄生生物の無菌的な生成を可能にする。昆虫は、好ましくは、表面が滅菌された卵から成長し、成長した昆虫には、卵から成体への変態の間、濾過した空気、滅菌水、および滅菌発達段階に適切な栄養を与えられる。十分に成長した後、昆虫には、生成される寄生生物の感染形態を含む滅菌された感染血液ミールが提供される。

本発明はまた、感染昆虫を気絶させて、安全な様式で、不動の感染昆虫の効率的な収集を行う（ついで、これらは、寄生生物の収集のために処理され得る）ために提供される。

本発明は、吸血昆虫において、絶対的な繁殖、循環式の発達または循環式の繁殖生活サイクル相の広範な種々の無菌的な寄生生物を生成するのに使用され得る。適切な寄生生物および吸血昆虫と寄生生物の組み合わせの例としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ−Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ−Ｔｒｉａｔｏｍａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ、およびＡｅｄｅｓ ｑｕａｄｒｉｍａｃｕｌａｔｕｓ−Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉが挙げられる。

従って、本発明の目的は、研究目的で、無菌的に、安全に、かつ経済的に脊椎動物の無菌的な寄生生物を生成することである。本発明の装置および方法によって生成される無菌的な寄生生物は、好ましくは、ヒトおよび動物のワクチンに適している。

本発明は、概して言うと、吸血昆虫において寄生生物を生成するため、詳細には、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ種の蚊においてＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のスポロゾイトを生成するための装置および方法に関する。本発明はさらに、所望の特性（例えば、低アレルギー性または超感染性）を有する昆虫系統（例えば、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊）の生成のための装置および方法に関する。本発明はまた、凍結温度付近の温度に耐え得る寄生生物系統を生成する方法に関する。本発明はさらに、弱毒化された寄生生物ワクチンの注射のための装置および方法に関する。本発明は、望ましくない生物学的因子（例えば、細菌および他の微生物）による汚染のない寄生生物および吸血昆虫の生成を可能にする。本発明の装置は、寄生生物または昆虫宿主のいずれかが望ましくない生物学的因子で汚染されるのを回避するため、無菌的に複雑な寄生生物の生活サイクルを再構成するために提供される。本発明はまた、比較的浅い凍結保存温度で安定な弱毒化Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトワクチンを生成するための方法を提供する。本発明はさらに、微小ボーラス量のワクチンの送達のための装置を提供する。
本発明はさらに、以下を提供する：
・（項目１）
無菌的な昆虫段階の寄生生物の生成のための装置であって：
壁で囲まれたチャンバ；
表面を滅菌した昆虫卵からの成体昆虫の成長を補助するためのチャンバ内レザバ；および
成体昆虫が寄生生物に感染した血液を消費することを可能にするチャンバ内血液供給ステーション、
を備える、装置。
・（項目２）
上記チャンバへの流体の導入のために、上記チャンバ壁を通過することを目的として延びる複数の管をさらに備える、項目１に記載の装置。
・（項目３）
上記管のうちの一つが、上記レザバ中に滅菌幼虫飼育ブロスを導入するよう適合されている、項目２に記載の装置。
・（項目４）
上記表面を滅菌した昆虫卵を支持するための潜水性浮遊物を上記レザバ中にさらに備える、項目３に記載の装置。
・（項目５）
上記成体昆虫に供給するための糖質供給レザバを上記チャンバ中に有する、項目１に記載の装置。
・（項目６）
上記糖質供給レザバが、芯ベースまたは溝ベースである、項目５に記載の装置。
・（項目７）
上記管のうちの一つが、血液を温めるための手段を有する、項目２に記載の装置。
・（項目８）
上記チャンバが、第一サブチャンバおよび第二サブチャンバを有し、上記第一サブチャンバが、操作可能なドアにより、上記第二サブチャンバと隔てられている、項目１に記載の装置。
・（項目９）
無菌的な昆虫段階の寄生生物の生成方法であって：
囲まれたチャンバの内部を滅菌する工程；
上記囲まれたチャンバ中のレザバに、無菌幼虫飼育ブロスを導入する工程；
表面を滅菌した昆虫卵を上記無菌幼虫飼育ブロスに入れる工程；
上記囲まれたチャンバ内で、上記表面を滅菌した昆虫卵を成体昆虫に成長させる工程；および
上記寄生生物に感染した無菌血液ミールを上記成体昆虫に提供する工程、
を包含する、方法。
・（項目１０）
上記提供する工程がさらに、上記無菌血液ミールを温める工程を包含する、項目９に記載の方法。
・（項目１１）
上記血液ミールが、生殖母細胞段階寄生生物を含む、項目１０に記載の方法。
・（項目１２）
上記提供する工程の後に、上記成体昆虫を気絶させる工程をさらに包含する、項目１１に記載の方法。
・（項目１３）
上記成体昆虫がＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊である、項目１２に記載の方法。
・（項目１４）
上記寄生生物が、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅからなる群より選択される、項目１３に記載の方法。
・（項目１５）
昆虫の噛みつき挙動を評価するための装置であって：
矩形区画のアレイであって、上記矩形区画が一匹の昆虫を収容し得る、アレイ；
上記矩形区画の上部分にある複数のハッチであって、上記ハッチが、上記矩形区画の内部へのアクセスを可能にするよう適合されている、ハッチ；および
上記矩形区画のアレイの底部分にある金属メッシュであって、上記メッシュは、昆虫が、上記金属メッシュの反対側の表面を噛みつくことを可能にするよう適合されている、メッシュ、
を備える、装置。
・（項目１６）
低アレルギー性の吸血昆虫の養殖方法であって：
吸血昆虫を皮膚断片に曝す工程；
上記吸血昆虫により上記皮膚断片上に噛み傷を負わせる工程；
上記噛み傷に対して皮膚断片のアレルギー応答のセットを割り当てる工程；および
上記アレルギー応答のセットに基づき、良性のアレルギー応答のセットを生じる昆虫のセットを選択する工程、
を包含する、方法。
・（項目１７）
上記選択する工程の後に、上記良性のアレルギー応答のセットを生じる昆虫のセットを交雑繁殖する工程をさらに包含する、項目１６に記載の方法。
・（項目１８）
上記吸血昆虫が蚊である、項目１７に記載の方法。
・（項目１９）
昆虫段階の感染性寄生生物を形成する増強された能力を有する吸血昆虫系統を養殖する方法であって：
吸血昆虫群に血液ミールを提供する工程であって、上記血液ミールが感染性寄生生物を含む、工程；
上記吸血昆虫群に卵を産ませる工程；
上記吸血昆虫群を屠殺する工程；
上記吸血昆虫群の各メンバーにより支持された感染性寄生生物の数を測定する工程；
上記測定する工程に基づき、より多くの感染性寄生生物を支持し得る吸血昆虫群の部分集団を選択する工程；および
上記より多くの感染性寄生生物を支持し得る吸血昆虫群の部分集団を交雑繁殖させる工程、
を包含する、方法。
・（項目２０）
上記吸血昆虫が蚊である、項目１９に記載の方法。
・（項目２１）
上記感染性寄生生物が、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅからなる群より選択される、項目２０に記載の方法。
・（項目２２）
凍結保存耐性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトを生成する方法であって：
Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊に血液ミールを供給する工程であって、上記血液ミールは、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生殖母細胞に感染されている、工程；
上記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生殖母細胞をスポロゾイトに成長させる工程；
上記Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊から上記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトを抽出する工程；
上記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトを凍結する工程；
上記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトを解凍する工程；および
生存に成功した上記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｕ種スポロゾイトを飼育する工程、
を包含する、方法。
・（項目２３）
上記凍結する工程がさらに、上記Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトを、摂氏０度付近の温度で維持する工程を包含する、項目２２に記載の方法。
・（項目２４）
上記摂氏０度付近の温度が、約摂氏−５〜０℃である、項目２３に記載の方法。
・（項目２５）
超低容量ワクチンの注射のための装置であって：
複数の微小針；
上記複数の微小針に操作可能に接続された、ワクチン溶液を保持し得るレザバ；
上記レザバを覆う、弾性プレート；および
プラスチックキャップであって、上記プラスチックキャップは上記弾性プレートの上から上記レザバに取り付けられ、さらに、上記プラスチックキャップは、通常の注射器に取り付け可能な雌型ドッキングポートを備える、キャップ、
を備える、装置。
・（項目２６）
上記微小針が、低容量ワクチンを送達するよう適合された複数の微小孔を備える、項目２５に記載の装置。

（発明の詳細な説明）
本発明の図面および説明は、本発明の明確な理解のために、関連する要素を簡素化して説明していることが理解される。その詳細な説明は、添付の図面を参照して本明細書中以下に提供される。

概して、本発明は、吸血昆虫における寄生生物の生成のための装置および方法を提供する。本発明は、好ましくは、多段階での生成（所望の特性を有する昆虫および寄生生物の種の選択から、弱毒化ワクチンの開発において使用するための無菌的な寄生生物の成長まで、弱毒化ワクチンの注射のための送達系まで）を補助する。本発明の種々の局面および実施形態は、弱毒化ワクチンの生成および送達において一緒にまたは別々の要素として利用され得る。本発明の種々の局面および実施形態は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｕ種スポロゾイトの生成に関して詳細に記載されているが、本明細書中の教示は、他の昆虫段階の感染性寄生生物に適用可能であることが当業者に理解される。さらに、本明細書中に見出される記載は、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊に対して詳述しているが、当業者は、本明細書中に見出される教示は、他の吸血昆虫に適用可能であることを理解する。

本発明の一つの局面は、インビボでの無菌状態下で生成されると吸血昆虫において脊椎動物の昆虫段階寄生生物を生成するための装置および方法を提供する。これらの無菌的な寄生生物および吸血昆虫は、防御ワクチンの生成および実験研究において有用であると考えられる。多くの寄生生物−吸血昆虫の組み合わせの無菌的生成は、本発明の範囲内であることが意図されるが、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種の寄生生物およびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊が、代表的な例として使用される。

本発明は、好ましくは、吸血昆虫および寄生生物が成長する内部環境の微生物汚染を防止するよう設計された寄生生物生成チャンバを提供する。このことは、寄生生物生成チャンバが、昆虫および寄生生物の成長の間、非無菌的な外部環境（例えば、日中照らされた加温室）に配置されることを可能にする。操作者は、保護服、マスク、グローブ、またはシューズカバーを装着する必要がなく、これにより、快適性、効率、および操作費用が大きく改善される。さらに、本発明の寄生生物生成チャンバは、好ましくは、操作者から感染性のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊を物理的に隔離し、潜在的なマラリア感染を引き起こし得る事故的な噛み付きを防止する。

本発明の好ましい実施形態は、昆虫および寄生生物を成長させる滅菌環境の構築を通じて、吸血昆虫および寄生生物の無菌的な生成を提供する。この環境の滅菌性は、好ましくは、昆虫−寄生生物の組み合わせの生活サイクルの間維持される。本発明のチャンバおよび寄生生物生成チャンバの内部要素は、好ましくは、成長過程の最初に滅菌的である。表面が滅菌された昆虫の卵は、好ましくは、昆虫コロニーを最初に成長させる際に使用する。さらに、成体の吸血昆虫が吸いつき、好ましくは、その昆虫に寄生生物を提供する血液もまた、微生物汚染していない。さらに、水、幼虫飼育ブロス、供給溶液、および本発明の寄生生物生成チャンバにおいて使用される全ての他の溶液および材料もまた、滅菌されていることが好ましい。任意の標準的な滅菌手段が用いられ得る。例えば、オートクレーブ、化学的滅菌、放射線照射、および微量濾過が挙げられるがこれらに限定されない。さらなる滅菌技術は、当業者に周知である。

本発明の好ましい実施形態において、寄生生物生成チャンバは、高温耐性材料（例えば、金属、ガラス、またはプラスチック化合物）である。一般的な形状は、異なる寸法の矩形または立方体であり得る。本発明の好ましい寄生生物生成チャンバの内部は、寄生生物の宿主段階の生活サイクルの要求を補助し、生成される寄生生物−昆虫宿主の組み合わせにより決定される区画に物理的に分割され得る種々の要素を収容する。

本発明の寄生生物生成チャンバの種々の入口管および出口管、機械ポート、およびレザバは、本発明の方法および装置の操作の説明に従って記載される。

本発明の好ましい実施形態１００の全面図を図１に示す。三方の壁１０４は、気密シールを有するガラスまたは透明プラスチックビューポート１０８のための設備を有する。最後の壁１１２は、好ましくは、ハッチを備え、洗浄および寄生生物生成調製のためのチャンバの内部へのアクセスを可能にする。ハッチの内部リムは、好ましくは、連続するゴムのガスケットを有し、この装置の側壁に対する気密シールを提供する。ハッチの縁に配置された圧縮ラッチ１１６は、ゴムのガスケットが側壁に対して強く圧迫するのを可能にする。不揮発性、非毒性の潤滑剤（例えば、グリセロール）が、ゴムガスケット上にコーティングされ得、上述のハッチが契合した場合のハッチの気密シールを改善する。寄生生物生成チャンバ１２０の上部は、好ましくは、その内側で金属格子により補強され得る透明な材料（例えば、ガラスまたはプレキシガラス）である。透明な上部は、チャンバ内部を見れるようにし、日中の光の変化（多くの昆虫が成長するのに必要）のために光が浸透するのを可能にする。

複数の金属管１２４、１２８は、寄生生物生成チャンバの内部から外部へ延びている。この管が寄生生物生成チャンバの壁を貫通する場合、金属またはエポキシ溶接により管を固定し、気密シールを作成する。この管は、この装置の内外への気体および液体の滅菌的な移動を可能にする。液体は、本明細書中以下に記載されるようなレザバまたは供給装置のいずれかへ導入され得る。各管は、生成される寄生生物種および昆虫種に依存して異なる目的を有する。さらに、各管は、好ましくは、寄生生物生成チャンバの内部の汚染を防止するためにその外部に装着された微孔フィルタ１３２を有する。本発明の寄生生物生成チャンバはまた、好ましくは、寄生生物生成チャンバの内部への物理的なアクセスを可能にする操作可能なアクセスポート１３６を備える。

図２は、本発明の好ましい実施形態の断面図であり、特に、この寄生生物生成チャンバの内部へと延びる管を示している。この寄生生物生成チャンバの内部は、壁２０５により２つの部分に分割され得、壁は、２つの部分の間に閉鎖可能なドア２０６を好ましくは含む。寄生生物生成チャンバの２つの部分は、昆虫飼育部分２００および血液ミール部分２０２として想定され得る。空気入口管２０４は、寄生生物生成チャンバへと加湿空気を進めてこのシステムへの酸素を提供し、そしてこのシステムが微生物で汚染されるのを防止する内部環境から外部環境への正の圧力勾配を生成する。空気入口管２０４はまた、システムに無酸素ガスを送達し得、簡単な回収のために寄生生物に感染した昆虫を殺す（本明細書中以下で議論する）。空気出口管２０８は、推し進めた空気を、寄生生物生成チャンバの内部から排出することを可能にする。空気出口管２０４および空気出口管２０８は、好ましくは、寄生生物生成チャンバの外部環境から内部環境への空気伝播微生物汚を防止するようそれらの外部端に装着された微孔フィルタ２０５、２０９を有する。

図２に示される、本発明の好ましい実施形態はさらに、寄生生物生成チャンバの昆虫飼育部分２００への幼虫飼育ブロスの導入に有用な管２１６を開示する。このブロス導入管２１６はまた、ブロスの濾過のための微孔フィルタ２１７を含み得る。本発明の関係で使用される幼虫飼育ブロスは、成長する特定の昆虫により示されるように、合成ブロスまたは半合成ブロスであり得る。ブロス導入管２１６により、幼虫飼育ブロスが、本明細書中以下に記載されるような幼虫飼育ブロスへ導入される。

図２はさらに、本明細書中以下に記載されるような卵飼育レザバへの水の導入のための水導入管２２０を示す。この水導入管２２０は、好ましくは、微孔フィルタ２２１を含み、水が、卵飼育レザバへの導入の前に滅菌濾過されることを可能にする。

図２はまた、血液加温管２２４を開示する。血液加温管２２４の両端は、好ましくは、寄生生物生成チャンバの外部から延び、両端は、外部環境の方に開いている。血液加温管２２４は、寄生生物生成チャンバの血液ミール部分２０２へと成体の雌の蚊を誘導し、本明細書中以下で議論されるように感染血液ミールを温めるための温水加熱コイルとして作用する。図２はさらに、感染血液を、昆虫による消費のために装置の血液ミール部分２０２に移動するコンジットとして作用する血液導入管２２８を開示する。血液導入管２２８の外部端は、好ましくは、気密ラテックスまたはゴム栓２３２で閉鎖されている。血液導入管の外部端のラテックスまたはゴム栓２３２は、感染性血液ミールが、注射器に装着された針により栓２３２を通じて無菌的に注射されるのを可能にする。

本発明の好ましい寄生生物生成チャンバの外部壁は、図３に示されるような、一連のポートおよび物理的アクセスポイントを備える。各ポートは、好ましくは、緊密に適合するハッチ、ガスケット、およびラッチにより閉鎖され、寄生生物生成チャンバの内部に対して気密シールを提供する。他の好ましい実施形態において、ポートは、上記のような緊密に適合するゴムまたはラテックスプラグと共に設計され得る。気密シールを改善するため、不揮発性かつ非毒性潤滑剤（例えば、グリセロール）が、ガスケット上にコーティングされ得る。各ポートは、寄生生物生成における特定の目的を果たすよう設計および配置され、従って、その直径は、成長させる昆虫の要求によって変化し得る。卵移動ポート３０４は、好ましくは、寄生生物生成チャンバの昆虫飼育部分３０２の方に開いている。卵移動ポート３０４は、好ましくは、表面が滅菌された卵が、本明細書中以下に記載されるように、滅菌ピペットによって、幼虫飼育レザバ中の半潜水性の浮遊物へと無菌的に移動されるのを可能にする。昆虫除去ポート３０８は、好ましくは、寄生生物生成チャンバの血液ミール部分３００へと開口している。昆虫除去ポート３０８は、好ましくは、感染昆虫が、生成工程の最後に屠殺したのちに回収されるのを可能にする。

内部では、本発明の寄生生物生成チャンバは、好ましくは、パーティション３１２（頑丈な壁またはメッシュスクリーンであり得る）によって、昆虫飼育部分３０２および血液ミール部分３００に内部分割されている。パーティション３１２は、好ましくは、昆虫飼育部分３０２と血液ミール部分３００との間のドア３１６を有する。ドア３１６は、機械的連結ロッド３２０を介して開口または閉鎖され得る。このデバイスはまた、ねじ回しまたはドア３１６を開口および閉鎖するために使用される他の機械デバイスであり得る。機械的連結ロッド３２０は、好ましくは、寄生生物生成チャンバの外部表面上のレバー３２４を操作することにより操作される。機械的連結ロッド３２０は、好ましくは、不揮発性、非毒性の潤滑剤（例えば、グリセロール）で潤滑化された緊密に適合されたゴムまたは金属グロメット３２８に取り囲まれ、ここで、機械的連結ロッド３２０はこの装置の内部へと外部壁を通じて通過する。このグロメット３２８は、寄生生物生成チャンバ内部の滅菌性を維持するのを補助する。

図４に示されるように、寄生生物生成チャンバの昆虫飼育部分４０２は、昆虫の卵、幼虫、さなぎ、および成体の無菌的な水生生活段階を補助し得る、複数の特化した要素を含む。幼虫飼育レザバ４０６は、この装置の底部に位置し、そして本明細書中上記されたブロス導入管４１０により送達された滅菌幼虫飼育ブロスを保持するよう設計される。半潜水性浮遊物４１４は、好ましくは、幼虫飼育レザバ４０６の底部に位置する。幼虫飼育ブロスが、幼虫飼育レザバ４０６を部分的に充填する場合、半潜水性浮遊物４１４は、液体表面の直下に位置する。Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊の表面が滅菌された卵は、幼虫飼育ブロス中に深く沈みすぎた場合、もはや浮遊せず、死滅する。半潜水性浮遊物４１４は、好ましくは、生存性を保証する液体の表面の直下にある表面が滅菌された卵を支持する。浮遊物４１４が半潜水性であるので、Ｌ１幼虫は、幼虫飼育レザバ４０６内の他の位置への遊泳を妨げられない。この装置の昆虫飼育部分４０２はまた、糖質供給レザバ４１８を含む。この糖質供給レザバ４１８は、好ましくは、さなぎから孵化した後に栄養物質を成体昆虫に提供するメッシュスクリーンのランディングパッドを通る小さい糖である。あるいは、糖質供給レザバは、本明細書中以下に記載されるように、芯ベース（ｗｉｃｋ−ｂａｓｅｄ）の糖質供給システムであり得る。糖質は高度に親水性であり、高湿度および高温度の条件下で部分的に溶解されるので、ランディングパッドは、成体昆虫が着地し、棒状にならないようにメッシュを通った糖質を得ることを可能にする。

寄生生物生成チャンバの血液ミール部分５０２を、図５に示す。血液ミール部分５０２の中で、専門化された要素は、無菌的な寄生生物および昆虫宿主（成体の雌の蚊内のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトを含む）の生成を補助する。血液供給ステーション５０６は、以下により詳細に記載されるように、薄膜または精巧なメッシュスクリーンにより覆われた血液レザバ５１０で構成される。血液レザバ５１０は、Ｒｕｔｌｅｄｇｅ型給餌器または任意の他の型の血液ミールデバイスであり得る。血液レザバ５１０は、寄生生物生成チャンバの外部に延びる血液導入管５１４に接続される。上記のように、血液加熱管５２２は、温水を装置の内外に循環させる加熱コイルである。血液加熱管５２２のコイルは、好ましくは、血液レザバ５１０を取り囲んでいるかまたは血液を加熱するためにＲｔｌｅｄｇｅ型給餌器内で温水を循環させる。本発明が、ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトおよびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊を生成するために用いられる場合、血液レザバ５１０の操作は、雌の雄の蚊と雌の蚊を隔離するよう機能し得、また、無菌的なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種寄生生物の循環繁殖のために雌の蚊に感染性血液ミールを提供する。

図５はさらに、寄生生物生成チャンバの昆虫飼育部分に見出される糖質供給レザバと類似の糖質供給レザバ５２６を開示する。本発明のこの局面は例として糖質を用いて記載されるが、任意の栄養源が使用され得る。この糖質供給レザバ５２６は、好ましくは、成体昆虫に栄養物質を提供するメッシュスクリーンのランディングパッドを通った小さい糖である。糖質供給レザバ５２６は、本明細書中以下に記載されるように、芯ベースの供給システムで置換され得る。

血液ミールによって、雌のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊は、約４８時間以内に卵からかえる。これらの卵を産卵させるために、卵産卵レザバ５３０が、寄生生物生成チャンバの血液ミール部分の底部に位置する。卵産卵レザバ５３０は、水導入管５３４により送達される場合、滅菌水で部分的に充填されるよう設計される。

図６は、血液供給ステーションの２つの好ましい実施形態を示す。図６Ａは、血液加温管６０２を示し、温水が、感染性血液ミールの加温のために寄生生物生成チャンバの外部から内部へと移動するのを可能にする。次いで、温水は、別の管６０１によって、寄生生物生成チャンバの外部に戻される。血液加温管６０２は、血液供給チャンバ６０６を取り囲むチャンバ６０３へと延びる。血液導入管６１０は、この装置の外部に延びる。血液導入管６１０の外部端は、ラテックスまたはゴム栓６１４を含む。血液供給ステーションの操作中、感染性血液は、栓６１４を通して血液導入管６１０に注射される。血液は血液導入管６１０を通って血液供給チャンバ６０６に移動し、血液供給チャンバ６０６の底部に並ぶ膜６２２を超えて広がる。膜は、成体の雌の蚊の口先により貫通でき、それによって蚊に感染性血液ミールを提供することができるようなものである。血液の加熱の間、血液供給チャンバ６０６中の気体の容量が膨張する。血液供給チャンバ６０６の加熱滅菌の間、血液供給チャンバ６０６内の気体の容量が膨張する。血液導入管６１０のすぐれた局面において、膜６２２または栓６１４のいずれかに損傷を与えないために、排出口６１８が備えられ、発生するいかなる圧力の軽減をも可能にする。

血液供給ステーションの別の実施形態を、図６Ｂに開示する。血液加温管６２６は、寄生生物生成チャンバの外部から内部へと延びている。この実施形態において、血液加温管６２６は、血液レザバ６３４と接触しており、温水が血液加温管６２６を通してポンプ出しされる際に血液レザバ６３４中の血液を加熱する。この加熱を達成するには複数の方法が存在し、それらとしては、血液加熱管６２６で血液レザバ６３４を取り囲む方法、血液加熱管６２６を血液レザバ６３４の底部で接触させる方法、および血液加熱管６２６を血液レザバ６３４と並列させて加熱レザバ６３０を形成させる方法が挙げられる。当業者は、多くのこのような血液ミールを加熱する方法を認識する。血液は、その上部に膜またはメッシュ６３８を有し、成体昆虫（例えば、成体雌のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊）が感染性血液ミールを取る際の補助を提供する。感染性血液は、血液導入管６４２の外部端に位置するゴムまたはラテックス栓６４６を通して、血液導入管６４２に注入され得る。血液導入管６４２はまた、オートクレーブ滅菌の間に生じ得る圧力を開放するのに使用され得る排出口６５０を含み得る。

図７Ａは、本発明の装置において使用される、好ましい芯ベースの糖質給餌器７００を開示する。糖質給餌器は、好ましくは、本発明の装置７０４の上部に位置する。糖質給餌器７００の底部分は、気密シールを有する本発明の装置の内部に延びている。糖質給餌器７００の上部分は、好ましくは、ゴムまたはラテックス栓７０８を含み、それを通して糖溶液７１６が糖質給餌器７００のレザバ７１２に注入される。糖溶液７１６は、装置の内部へと延びる芯７２０へと、レザバ７１２の底部に流れ込む。次いで、昆虫は、芯７２０に着地し、そして芯７２０を飽和する糖溶液７１６を消費する。

図７Ｂは、本発明の装置において使用する、好ましい溝ベースの糖質給餌器７２４を開示する。糖質７２８は、好ましくは、メッシュ膜７３６（その上部は、ランディングパッドとして機能する）を有する溝７３２の基部に配置される。糖質７２８は、高度に親水性であり、高湿度および高温度の条件下で部分的に溶解されるので、メッシュ膜７３６は、成体昆虫が着地し、棒状にならないようにメッシュを通った糖質を得ることを可能にする。

詳細には記載されていないが、さらなる管、レザバ、ポート、および小区画が、本発明の寄生生物生成チャンバを種々の寄生生物／昆虫の対の生成に適合させるために追加され得る。所望の場合、レザバは、レザバの機能が完了した後にさらなる管によって引き抜かれ得る。

ＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトおよびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊の無菌的生成のための上記寄生生物生成チャンバの操作をここで記載する。最初に、寄生生物生成チャンバ全体が、照射、化学的処理、オートクレーブ、または当該分野で公知の他の滅菌プロセスによって滅菌され、滅菌性がその後維持される。種々の糖質供給レザバが、糖質で充填される。寄生生物生成チャンバの昆虫飼育部分と寄生生物生成チャンバの血液ミール部分との間のドアは、未熟な蚊の初期の移動を制限するため閉じられる。

幼虫飼育レザバは、幼虫ブロス導入管を通して滅菌幼虫飼育ブロスで部分的に充填され、そして半潜水性浮遊物が、ブロス表面の直下に位置するようになる。次いで、表面が滅菌されたＡｎｏｐｈｅｌｅｓの卵が、卵アクセスポートを通じて半潜水性浮遊物上に配置される。寄生生物生成チャンバの内部の温度および湿度は、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓの卵の成長を促進する条件で維持される。卵から幼虫に成長したら、幼虫は、浮遊物を離れて遊泳し、そして幼虫飼育レザバ中で周りを遊泳する。

さなぎへの幼虫の成長の後、成体が、さなぎから孵化し、そして糖質供給レザバに配置された糖質を供給する装置の昆虫飼育部分の内部を自由に飛び回れるようになる。蚊が成体まで成長した後、雌の蚊に、寄生生物生成チャンバの血液ミール部分において感染性顆粒球血液ミールが供給される準備がなされる。

血液ミール供給手順を開始するために、温水が、血液供給レザバの周囲またはそれを通してコイル状となった血液加温管の入口を通して推し進められる。寄生生物生成チャンバの昆虫飼育部分および血液ミール部分を分離するパーティション上のドアは、レバーにより開けられる。雌のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊は、加温源に選択的に引き付けられてハッチを通って飛行し、従って、雌の蚊と雄の蚊とを効果的に分離する。一定期間の後、ハッチが閉められる。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物の顆粒球を含む感染性血液が、血液導入管の外部ラテックスまたはゴムポートを通じて注入される。血液は、血液導入管を通り、そして、使用される血液供給システムに依存して、膜上またはメッシュスクリーン下に分散する。次いで、雌のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊は、感染性顆粒球血液を得る。

スポロゾイトが成長するのに十分な時間の後、無酸素の滅菌濾過された気体が、空気入口管から装置に吹き込まれる。これにより蚊を気絶させ、それらを装置の底部に落とす。昆虫除去ポートを開放し、そして滅菌真空管を挿入して、雌の蚊を、寄生生物生成チャンバの血液ミール部分から無菌的に除去する。次いで、これらの雌の蚊は、無菌的なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトの供給源となる。

本発明の寄生生物生成チャンバの操作は、以下の実施例の説明によってより理解され得る。

糖質供給レザバを、少量のスクロースで充填する。Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ幼虫による摂取に適した精巧な粒子溶液の濁った懸濁液数ミリリットルを３００ミリリットルの水と混合し、このシステムの幼虫飼育レザバに入れる。昆虫飼育部分と血液ミール部分との間のドアを閉じ、容器を３０分間、摂氏１２０度、３０ｐｓｉでオートクレーブする。このデバイスをゆっくりと室温まで冷ます。次いで、半合成幼虫飼育ブロスを幼虫飼育レザバへと滅菌濾過し、任意の加熱に不安定な栄養素を置換するかまたは再充填する。

７０％エタノール、１％塩化ベンズアルコニウム中で１０分間撹拌することにより表面を滅菌し洗浄した約１００個のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉの卵を、卵移動ポートを通じて、滅菌技術を用いてピペットによりこのシステムに移す。この表面を滅菌した卵（もはや、浮揚性でない）を、半潜水性浮遊物に陸揚げする。この装置を、摂氏２８度の温度および明：暗１４／１０の日中光相の部屋に移す。少量の空気をこの装置へと滅菌濾過し、システムの内側での正の圧力勾配を維持する。

幼虫飼育レザバにおいて卵が孵化し、幼虫さなぎを形成する。約９日で成体の蚊が現れる。成体の蚊は、栄養を、デバイス内の滅菌糖供給源から得る。

次いで、この装置の昆虫飼育部分と血液ミール部分の間のドアは、さなぎから現れた約３日後に開放する。この装置の血液ミール部分において温められた供給ステーションは、成体の雌の蚊が、必須の血液ミールを探すために開放されたドアを通って飛行することによって雄から自主的に隔離するよう誘導する。雄は、加熱源に引き付けられず、血液ミールを探さない。雄と雌の分離に十分な時間の後、ハッチが閉められる。

感染性のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｇａｍｅｔｏｃｙｔｅｓ血液ミールを与えた後、感染、妊娠した雌の蚊に、卵の産卵のための滅菌水を提供し、栄養を滅菌糖質供給源から得る。感染性血液ミールの約１４日後、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトを、雌のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊において十分に成長させる。この時、微細濾過した無酸素ガスをこの装置に充填し、蚊を気絶させる。次いで、気絶した雌の蚊を、昆虫除去ポートを通じて除去し、そして無菌的なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｕスポロゾイトを得るために処理する。このスポロゾイトを、弱毒化したスポロゾイト全ワクチンの開発および免疫原において使用し得る。

本発明のさらなる局面は、吸血昆虫噛みつきチャンバアレイ（図８Ａ、図８Ｂ）を含む。この装置は、個々の吸血昆虫の噛みつき挙動および反応性／アレルギー性の研究に有用である。これらの研究は、吸血昆虫集団の選択的な飼育および遺伝的操作において有用である。

この吸血昆虫噛みつきチャンバアレイは、好ましくは、長方形の２つの大きな並行な表面を有する三次元長方形構造である。この吸血昆虫噛みつきチャンバアレイ８００の内部は、好ましくは、同様の寸法の複数の部分チャンバ８０４に分割される。各部分チャンバは、アレイの高さを拡大し、個々の昆虫を収容することができる。

このアレイの一方の側において、表面は、金属メッシュ８０８であり、研究中の昆虫種の逃亡を防止する。昆虫が不注意に操作者に噛みつくのを防止するためにメッシュ８０８が覆われ得るように、または広いドラフトを有することで部分チャンバ８０４の内部環境を変更するように、プラスチックカバーが配置される。従って、吸血昆虫噛みつきチャンバアレイ８００が皮膚のパッチと並列させた場合、メッシュ８０８は、昆虫が、ヒトまたは動物の皮膚を探索し、噛みつき、または吸うことを可能にする。メッシュ８０８は、好ましくは、吸血昆虫噛みつきチャンバアレイの堅い外側縁部により装着および支持される。

メッシュ８０８側と反対のアレイの側面にて、個々のハッチ８１２は、各部分チャンバ８０４に個々にアクセス可能なように各部分チャンバ８０４の外側縁部に装着される。従って、部分チャンバ８０４は、個々の昆虫が別々に収容されるのを可能にする。このような構成において、各昆虫は、他の昆虫による妨害にさらされず、環境の変化（例えば、露光量、環境色、化学環境など）は、各昆虫について独立して操作され得る。

吸血昆虫噛みつきチャンバアレイ８００を操作するために、個々の昆虫を、部分チャンバ８００に入れ、ハッチ８１２を締める。メッシュ８０８上のプラスチックカバーを除去し、アレイのメッシュ８０８側をヒトまたは他の動物の皮膚と接触させる。試験される各昆虫種について個別に設計され得るプロトコルを用いて、異なる時間、昆虫に探索および給餌させる。吸血昆虫噛みつきチャンバアレイ８００の構造は、同じ皮膚パッチを同じ昆虫に複数回さらすのを可能にする構造である。

本発明のさらなる局面は、ヒトまたは他の動物に対して低アレルギー性である昆虫系統（例えば、蚊）である。

低アレルギー性昆虫の生成は、以下の手順により達成され得る。吸血性の、一般的に異なる集団の特定の蚊種を、囲まれた昆虫飼育室で自由に飼育する。血液ミールが卵の成長を完了するのに必要である場合、妊娠した雌を、その生活サイクルの適切な時点で隔離する。

次いで、多くのこのような雌の蚊を、好ましくは、部分分割した長方形の容器に入れる。容器は、ヒトまたは他の動物への蚊のアクセスを可能にしつつ、同時にチャンバから逃げないようにするよう適合されている。この装置の一つの例は、本明細書中上記の吸血昆虫噛みつきチャンバアレイである。好ましくは、単一の雌の蚊が、吸血昆虫噛みつきチャンバアレイの各チャンバを占めている。

吸血昆虫噛みつきチャンバアレイは、好ましくは、温度、湿度、および周辺光の変化が限定的である厳密な環境制御下で維持される。

次いで、雌の蚊を入れた吸血昆虫噛みつきチャンバアレイを、予め調製した動物またはヒトの皮膚表面に配置する。好ましくは、各々の雌の蚊を、単一の、特定の皮膚区画にアクセス可能とする。皮膚の調製は、試験位置の皮膚から毛髪を剃り落とし、皮膚表面を石けん、クリーム、または他の人工物質に曝すのを約２４〜４８時間制限することを含む。好ましくは、どの雌の蚊が皮膚の各区画に噛みつくかを実験者が識別し得るように、皮膚表面にマークを付ける。

試験被験体および動物は、好ましくは、蚊の噛みつきに対して通常の反応をする個体および蚊の噛みつきに対して過敏症である経歴を有する個体を含む。

吸血昆虫噛みつきチャンバアレイは、好ましくは、短い期間、皮膚上に置き、蚊に、血液ミールを得るため努力して皮膚を探索させる。次いで、吸血昆虫噛みつきチャンバアレイを、皮膚から２〜３回持ち上げ、次いで、同じ皮膚上のスポットに戻す。これは、好ましくは、蚊がさらなる探索を行い、それによって同じ皮膚パッチからより多くの抗原を注入する。探索せず満腹でもない雌の蚊を同定し排除する。各吸血昆虫噛みつきチャンバアレイチャレンジを、約２回の連続する供給期間（３分間、１分間の休憩をはさむ）続け得る。

吸血昆虫噛みつきチャンバアレイチャレンジを完了した後、試験ヒトまたは動物の皮膚反応を、１５分、３０分、１時間、２時間、２４時間、および４日で評価する。このような期間は、過敏反応、アルツス反応、および遅延型過敏反応の評価のためである。この評価は、その時点での各蚊についての紅斑、硬結、および病巣サイズの注意深い対象の評価を含む。対象の測定はまた、好ましくは、噛みつき部位での痒みについてなす。

皮膚を探索し、血液ミールを食べることが示された、吸血昆虫噛みつきチャンバアレイチャレンジ集団中の各雌の蚊は、試験被験体における過敏反応、アルツス反応、および遅延型過敏反応の発達について評価される。最少の反応性を有する雌を、飼育チャンバに戻し、産卵させる。高い反応性を示す蚊を廃棄する。

低反応性の雌の蚊からの卵を孵化および成長させる。これらの子孫の一部を戻し交配するかまたは無作為な他の低反応性の雌の子孫と共に飼育する。特定の卵または幼虫を後に使用するために凍結保存する。

実験者によって決定される時点で、低反応性を有する雌およびその子孫を、好ましくは、昆虫により誘導される病原体（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅを含むがこれらに限定されない）で感染させ、それらが目的の病原体を繁殖させる能力を保持することを確認する。

上記手順を、好ましくは、複数回反復する。この手順の結果は、動物およびヒトで低反応性を有するかまたは反応性を有さないが、目的の病原体を繁殖する能力を保持することが示される蚊の低アレルギー系統の開発である。この蚊系統は、好ましくは、その系統の蚊の体全体または唾液から抽出した病原体由来のワクチンの開発において有用である。

本発明のこの局面は、蚊の例を用いて記載されているが、同じ技術が、他の種の低アレルギー性吸血昆虫（ブヨ、噛みつきハエ、ノミ、シラミ、およびダニを含むがこれらに限定されない）を生成するのにも使用され得る。

本発明のさらなる局面は、感染段階の寄生生物を補助する能力の向上した昆虫系統を飼育する方法を含む。本発明のこの局面は、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ種の蚊およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種のスポロゾイトの例を参照して記載するが、同じアプローチが、感染段階の寄生生物のレベルの上昇を補助し得る任意の昆虫系統を生成するのに有用であることが理解されるはずである。

Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍスポロゾイトのより高い積載量を補助し得るＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊の系統の生成は、以下の手順により達成され得る。異種系統または同種系統のＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊を、単一の雌および複数の雄のコホートに分割する。各コホートは、好ましくは、環境条件が制御されモニタリングされる囲まれた容器中に置く。好ましくは、容器の間の条件は一致している。

次いで、蚊を飼育する。その生活サイクルの適切な時点で、生殖母細胞または処理した血液含有オーキネートを含むＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染血液のプールからの血液ミールを雌に与える。供給期間および他の変数を制御し、血液ミールプロセスの間の環境の一貫性を確保する。感染血液を食べることが観察されない雌の蚊を、好ましくは、廃棄する。

蚊の生活サイクルの適切な時点で、栄養水ブロスを、各容器の底部に添加する。雌の蚊を卵の産卵についてモニタリングする。卵の産卵が観察されない雌を、好ましくは、廃棄する。

いくつかの卵または成長している幼虫を分割し、それらの母の物理的および／または生理学的プロフィールが有益であると判断される場合に後で使用するために凍結保存する。凍結保存において子孫の比率を保存することによって、遺伝的なローバスト性および能力が維持される。

各容器中の卵および幼虫の全てまたは一部を、好ましくは、成長させる。卵または幼虫の一部に異常が観察された場合、その雌およびその子孫を、好ましくは、廃棄する。

スポロゾイトの生活サイクルにおける適切な時点（約１４〜１６日）に、蚊の唾液腺を、蚊の頭から切り出す。唾液腺を、穏やかに粉砕し、混合して懸濁物とする。正確な量の懸濁物を正確な量の溶液に添加する。希釈懸濁液を、ガラススライドに移し、顕微鏡下で試験する。感染レベルを、標準的な方法を用いて、１級、２級、３級、または４級として最初に等級付ける。好ましくは、蚊の集団を徐々に選択することで、スポロゾイトの数を計数する。

形態および遺伝に関連する他の因子を評価し、特定の属性を有するスポロゾイト収率と関連付ける。これらの因子としては、唾液腺の大きさ、中腸の長さおよびサイズ、特定のタンパク質マーカーおよび遺伝子マーカーが挙げられるがこれらに限定されない。このような因子は、蚊系統の成長の進行において使用される。

複合スコアリングシステムは、好ましくは、漸進的な蚊および寄生生物の生活サイクルを維持するのに必要な作用を十分に備えつつ高レベルのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染を保持する全体的な能力について各々の雌の蚊をランク付けするのに使用される。高い複合スコアを有する雌は、このプロセスのさらなるサイクルについて保持される子孫を有する。選択される子孫は、高いスポロゾイト感染耐性について容易に選択するため、内部交配および交差交配する。

連続的なサイクルを通して、極めて高レベルのＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ感染およびスポロゾイト生成が可能な、高度に精製された、全体的に異なるＡｎｏｐｈｅｌｅｓ系統を作製する。このようなＡｎｏｐｈｅｌｅｓ系統は、好ましくは、弱毒化した生存（または死亡した）寄生生物ワクチンにおいて使用するための生存性の全細胞スポロゾイトのより効率的な生成を可能にする。

本発明は、特定の実施形態の観点で記載されているが、当業者は、本明細書中に記載される技術に照らせば、特許請求の範囲に記載の発明の範囲から逸脱することなく、またはその範囲を超えることなく、さらなる実施形態および改良が作成し得る。従って、本明細書中の図面および説明は、本発明の解釈を容易にするためにのみ提供され、本発明の範囲を限定するよう解釈するべきでないことが理解される。

本発明のさらなる局面は、標準の注射器に装着するのに適した超低容量のワクチンを注入するための装置を含む。

本発明の一つの局面は、微量ボーラスワクチンアセンブリに関して参照される装置である（図９Ａ、９Ｂ）。微量ボーラスワクチンアセンブリは、好ましくは、複数の微小孔９０８を有する微小針９０４を使用する。微小孔９０８は、ワクチン総量を数百または数千の小ボーラスに送達する。針９０４を、スポロゾイトワクチンの正確な量を保持するプラスチックレザバ９１２に装着する。必要なワクチン量は、小ボーラスの所望量と内部微小針の量を足したものと、針９０４の数をかけることによって算出する。針９０４の反対側のレザバ９１２のカバーには、レザバ９１２を完全に密封する弾性プラスチック９１６を用いる。次いで、ワクチンレザバ９１２と同じ外部寸法を有するプラスチック構造体９２０を装着する。このプラスチック構造体９２０は、一般的な注射器９２８の工業規格ロッキングポートに装着する標準の雌型ドッキングポート９２４を有する。

微量ボーラスワクチンアセンブリ９００は、以下の様式で操作する。１〜２ミリリットルの大気ガスを注射器９３２に引き入れ、そして微量ボーラスワクチンアセンブリ９００を注射器９３２に装着する。針９０４を患者の皮膚に持っていき、注射器のプランジャー９３６を力を込めて押し込む。注射器９３２の内部の気体を圧縮し、微量ボーラスワクチンアセンブリ９００に移動させる。次いで、この気体で弾性膜９１６を変形させる。膜９１６は、微量ボーラスワクチンアセンブリレザバ９１２中のワクチン溶液を押す。ワクチンは、微小孔９０８を通って、皮膚組織に押し出される。弾性膜９１６は、注射器９３２中の気体が微量ボーラスワクチンアセンブリ９００のワクチンレザバ９１２への移動を防止する。

本発明のさらなる局面は、凍結保存／凍結耐性Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種スポロゾイトの開発方法である。

高温凍結保存可能なＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｕ種は、以下の手順を用いることにより開発し得る。Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種生殖母体／オーキネートの異種系統または同種系統を、血液培養物中で混合し、そしてＡｎｏｐｈｅｌｅｓ蚊に給餌する。オーキネートは無作為に分類し、雌の蚊の中腸内で接合子核を形成する。

次いで、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｕ寄生生物を、スポロゾイトに成長させる。蚊からスポロゾイトを抽出する７２時間前に、蚊を、４〜６時間間隔でゆっくり温度を低下させ（それらの生存耐性レベルより上でプラトーに達する）、次いで、規定温度まで再上昇させる。これにより、スポロゾイトを凍結保存に抗するように誘導する安定化タンパク質、酵素、および糖複合体を生成する細胞機構を活性化させる。

次いで、好ましくは、スポロゾイトを抽出し、当業者に周知の技術に従って、全蚊抽出物または唾液腺から精製する。

次いで、好ましくは、スポロゾイトを摂氏−７０度〜０度の温度で凍結保存する（ヒトにおいて直接免疫するために適した選択された培地において１０〜２０度ずつ増加させる）。これらのスポロゾイトの一部をインビトロで解凍し、運動性および生存性の他のマーカーについて評価する。

次いで、好ましくは、スポロゾイトを解凍し、そしてヒトまたは動物に注射する。一旦、ヒト／動物が寄生中血症になったら、血液サンプルを抽出し、血液培養物中に入れる。培養、感染、および凍結のサイクルを数回反復する。

凍結保存において生存することに成功し、蚊およびヒトまたは動物の両方の宿主において完全な生活サイクルを完了する能力を実証したスポロゾイトを、連続的に、選択および同系繁殖し、そして他の成功系統に戻し交配して、高感性性、高凍結保存温度耐性のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生生物系統を最終的に生成する。

本発明を明確に理解し、容易に実施するため、本発明は、以下の図面と共に記載される。図面において、同様の参照記号は、同じまたは同様の要素を示す。どの図面も本明細書に組込まれ、その一部をなす。

図１は、寄生生物生成チャンバの好ましい実施形態の外観図である。 図２は、寄生生物生成チャンバの好ましい実施形態の内部の上面図である。入口管および出口管が示されている。 図３は、寄生生物生成チャンバの好ましい実施形態の内部の上面図である。機械的アクセスのポートおよびポイントが示されている。 図４は、寄生生物生成チャンバの好ましい実施形態の昆虫飼育部分の内部の上面図である。 図５は、寄生生物チャンバの好ましい実施形態の血液ミール部分の内部の上面図である。 図６Ａは、本発明の好ましい血液供給ステーションの図である。 図６Ｂは、本発明の好ましい血液供給ステーションの図である。 図７Ａは、本発明の好ましい芯ベースの糖質給餌器の図である。 図７Ｂは、本発明の好ましい溝ベースの糖質給餌器の図である。 図８Ａは、本発明の好ましい吸血昆虫噛みつきチャンバアレイの図である。 図８Ｂは、本発明の好ましい吸血昆虫噛みつきチャンバアレイの図である。 図９Ａは、本発明の好ましい微量ボーラスワクチンアセンブリの図である。 図９Ｂは、本発明の好ましい微量ボーラスワクチンアセンブリの図である。

Claims (1)

1. 出願時の図面および明細書の実施例に従う、無菌的昆虫の産生のための装置。

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