JP2008005848A - 標的核酸の遺伝子型、および変異の判定方法、不溶性支持体に核酸断片を固定化する方法、所望の核酸を精製し、かつ増幅するための方法、並びに遺伝子型アッセイキット - Google Patents
標的核酸の遺伝子型、および変異の判定方法、不溶性支持体に核酸断片を固定化する方法、所望の核酸を精製し、かつ増幅するための方法、並びに遺伝子型アッセイキット Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】標的核酸の遺伝子型または変異を判定するための方法、また、不溶性支持体に核酸断片を固定化するための方法であって、前記核酸断片を溶解する被覆用溶液の塩濃度が、1M〜5Mであることを特徴とする方法。前記不溶性支持体が、所望の核酸の精製から増幅までを1容器内で行うためのマイクロタイタープレートまたはPCRチューブの何れかであることを特徴とする方法。
【選択図】図2
Description
1.前記遺伝子型、または変異に特徴的な配列を選び出す工程と、
2.前記配列を含む核酸を増幅する工程と、
3.前記増幅された核酸を、前記遺伝子型、または変異に特異的なプローブにハイブリダイゼーションさせる工程と、
4.前記プローブにハイブリダイズした核酸を検出して、ハイブリダイズパターンを解析する工程と、
を含む方法を提供する。
1.所望のウイルスゲノムに対応するプローブを不溶性支持体からなる反応容器の内面に固定化する工程と、
2.前記反応容器に、前記所望のウイルスを含むサンプル液を添加して前記ウイルスゲノムをハイブリダイズさせる工程と、
3.前記サンプル液を除去する工程と、
4.前記反応容器にPCR反応液を添加して、PCR反応により前記核酸を増幅する工程と、
を含む方法を提供する。
前記核酸に相補的な配列を有するプローブを固相化するための被覆用溶液が添加されている不溶性支持体からなる反応容器と、
前記核酸が含まれているサンプルを稀釈するための稀釈液と、
前記核酸を増幅するためのPCR反応液と、
が含まれることを特徴とするキットを提供する。
前記B型肝炎ウイルスゲノムの各遺伝子型、および変異株について、1762番および1764番目の塩基を含む領域に相補的な配列を有するプローブが、それぞれ固定化された不溶性支持体と、
前記B型肝炎ウイルスゲノムをPCRで増幅させるためのプライマーを含むPCR反応液と、
を含むアッセイキットである。
(b)希釈液 (1%SDS, 1% 2-メルカプトエタノール等)
(c)Hybri. Sol (6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 0.5% SDS, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNA, 50%ホルムアミド等)
(d)洗浄液 (Tween-20を含む2xSSC等)
(e)PCR反応液(PCR pre-mixture) (Taq polymerase, PCR buffer, dNTPs,等通常のPCRに必要な試薬を含む。適切なプライマーを予め加えておき、特定の核酸を増幅するためのキットとすることもできる)。
HBVB型肝炎患者のうち肝炎を発症した症例のもつウイルスから高率に検出される変異株(T1762A1764)の検出法
1.患者検体の採取法
測定すべき患者から末梢血を採血し、ゼリー管等の採血管に採取した。十分に凝固させたのち3000rpm, 10分間程度の遠心を行い、血球成分を除いて血清を得た。血清は数本の保存用試験管に分注したのち-20℃以下の冷凍庫内に保存した。
ウイルスゲノムの抽出には、1検体あたり血清25μlを用いて行った。抽出は、スマイテストEX-R&D(ゲノムサイエンス研究所製)キットを用いて、付属の説明書にしたがって行った。
PCRは、ウイルス量が少ないサンプルでも十分な感度で検出できるようにnested PCRによって行った。1st PCRは、ビオチン標識なしのプライマー対(primer #eP1-1:5’-gcatggagaccaccgtgaac-3’配列番号18、primer #eP1-2:5’-ggaaagaagtcagaaggcaa-3’配列番号19)を使用して行った。反応条件は、94℃で4分間処理した後、94℃で1分、55℃で1.5分、72度で2分を1サイクルとする反応を35回繰り返し、最後に72℃で7分の処理を行った。2nd PCRは、ビオチンで標識したプライマ−対を用いて(#eP2-1:5’-cataagaggactcttggact-3’配列番号20、primer #eP2-2:5’-ggcaaaaaagagagtaactc-3’配列番号21)、反応条件は、94℃で4分間処理した後、94℃で1分、55℃で1分、72度で1.5分を1サイクルとする反応を30回繰り返し、最後に72℃で7分の処理を行った。
ELISA-PLATE, MICROLON, 96W, FLAT-BOTT, MEDIUM BINDING(グライナー社製)に、プローブを0.4μMになるように3M炭酸カリウム溶液で調整した被覆液を分注し、4℃で一晩保温した。プローブは、野生型プローブ(5’-taggttaaaggtctttgta-3’配列番号22と変異型プローブ(5’-taggttaatgatctttgta-3’配列番号23)の2種類を固定化した。
次に、ツイーン20を含むTBS緩衝液にてウェルを洗浄し、6xSSC、0.01M EDTA(pH8.0)、5x Denhardt’s solution, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNAからなる溶液を各ウェルに100μlずつ分注し、1時間程度室温にて軽く振とうしながらインキュベートすることによってブロッキングを行った。その後ツイーン20を含むTBS緩衝液にてウェルを洗い、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 0.5% SDS, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNAからなるハイブリダイゼーション溶液を50μlずつ分注して、今回のハイブリダイゼーションの温度である50℃に加温しておいた。ターゲットとなるPCR産物を98℃で2分間処理し、ただちに氷中に移して1本鎖の状態を維持させておき、ハイブリダイゼーション溶液を分注して加温してあるウェルに添加した。50℃で2時間程度軽く振とうしながらインキュベートすることによってハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後は、ツイーン20を含む2xSSC緩衝液にてウェルを洗浄した。
次に、25%FCSを含むTBS緩衝液中に、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を最終濃度7.5mUになるように溶解したもの(50μl)でウェルを被覆し、振とうしながら室温で1時間程度インキュベートした。さらにツイーン20を含む2xSSC緩衝液にてウェルを洗浄し、TMB(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)-ELIZA液(ライフテックオリエンタル社製)を50μlずつ添加した。十分に発色するまで暗所に静置したのち、反応停止液(2N硝酸ナトリウム)を50μlずつ添加して、492nmにおける吸光度を測定した。吸光度の測定はマルチスキャン バイクロマティック(ラボシステムズ ジャパン社製)を用いて行った。
結果を図3に示した。図3は、ダイレクトシークエンス法により予め明らかであった配列に応じて、各サンプルを野生型、変異型、その中間型にわけて表記してある。HBe抗原陽性時から、Hbe抗体陽性時を経て、慢性肝炎患者へと病態が進むにつれて変異型の割合が増加していることがわかる。また、ダイレクトシークエンスの結果と本発明の結果が一致していることがわかる。
C型肝炎ウイルスの遺伝子型判定法
1.患者検体の採取法
測定すべき患者から末梢血を採血し、ゼリー管等の採血管に採取した。十分に凝固させたのち3000rpm, 10分間程度の遠心を行い、血球成分を除いて血清を得た。血清は数本の保存用試験管に分注したのち-20℃以下の冷凍庫内に保存した。
ウイルスゲノムの抽出には、1検体あたり血清100μlを用いて行った。抽出にはSepa-Gene-RV-R(三光純薬 社製)キットを用いた。これにより必要なHCV RNAを含む分画がペレットとして得られた。そのペレットを1unit/μlの濃度で含む1mM DTT溶液9μlにて溶解し、逆転写反応に供するHCV RNAサンプルとした。
逆転写反応は、Hexa-deoxyribonucleotide mixture(TAKARA社製)を用いて、M-MLVReverse Transcriptase(LIFE TECHNOLOGIES社製)にて、先ほどのHCV RNAサンプル9μlを加えて総量20μlとして、42℃で30分間インキュベートすることによって行った。
PCRは、ウイルス量が少ないサンプルでも十分な感度で検出できるようにnested PCRにて行った。一度目のPCRはビオチン標識なしのプライマー対を用いて行い、二度目のPCRは、内側のプライマーを使用して、片方のプライマーには、ビオチン標識して行った。反応条件は、94℃で4分間処理した後、94℃で30秒、55℃で30秒、72度で1分を1サイクルとする反応を1度目のPCRでは25回、2度目のPCRでは30回繰り返し、それぞれ最後に72℃で7分の処理を行った。PCRは、GeneTaq(和光純薬社製)を使用して行った。一度目、二度目共に総量50μlとして行った。
ELISA-PLATE, MICROLON, 96W, FLAT-BOTT, MEDIUM BINDING(グライナー社製)に、プローブを0.4μMになるように3M炭酸カリウム溶液で調整した被覆液を分注し、4℃で一晩保温した。プローブは、1検体につきC型肝炎ウイルスの遺伝子型を調べる目的で10種類(配列番号1〜10)を使用した。
その後、ツイーン20を含むTBS緩衝液にてウェルを洗い、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 0.5% SDS, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNAからなるハイブリダイゼーション溶液を50μlずつ分注して、今回のハイブリダイゼーションの温度である50℃に加温しておいた。ターゲットとなるPCR産物を98℃で2分間処理し、ただちに氷中に移して1本鎖の状態を維持させておき、ハイブリダイゼーション溶液を分注して加温してあるウェルに添加した。50℃で2時間程度軽く振とうしながらインキュベートすることによってハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後は、ツイーン20を含む2xSSC緩衝液にてウェルを洗浄した。
次に、25%FCSを含むTBS緩衝液中に、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)を最終濃度7.5mUになるように溶解したもの50μlでウェルを被覆し、振とうしながら室温で1時間程度インキュベートした。さらにツイーン20を含む2xSSC緩衝液にてウェルを洗い、TMB(3,3’,5, 5’-tetramethylbenzidine)-ELIZA液(ライフテックオリエンタル社製)を50μlずつ添加した。十分に発色するまで暗所に静置したのち反応停止液(2N硫酸)を50μlずつ添加して、492nmにおける吸光度を測定した。吸光度の測定はマルチスキャン バイクロマティック(ラボシステムズ ジャパン社製)を使用して行った。
結果は図4に示した通りである。12検体はそれぞれ1〜4までが1b型、5〜8までが2a型、9〜12までが2b型である。それぞれのグラフは、ターゲットの遺伝子型別に示した。マイクロプレートに分注して固相したプローブを、増幅した各サンプル由来の産物をグラフの横軸に示した。ビオチンが多く検出されたウェルに固相してあったプローブから型判定を行った結果、それぞれの遺伝子型において、各サンプルとも予想されたプローブにハイブリダイゼーションした。
核酸固定化のための最適条件の検討
不溶性支持体(マイクロタイタープレート)にプローブを固相化するための最適な条件を検討した。数種類の塩溶液を数段階の濃度に溶解して、この被覆用溶液中に、20塩基からなるプローブを0.4μMの濃度に溶解し、マイクロタイタープレートに分注して4℃で一晩放置し、ツイーン20を含むTBS(トリス・バッファード・セリン)緩衝液にてウェルを洗い、プローブ固相化の操作とした。
従来の抽出法を使用しないでHBVの増幅を行う方法
1.患者検体の採取法
測定すべき患者から末梢血を採血し、ゼリー管等の採血管に採取した。十分に凝固させたのち3000rpm, 10分間程度の遠心を行い、血球成分を除いて血清を得た。血清は数本の保存用試験管に分注したのち-20℃以下の冷凍庫内に保存した。
従来法の例では、ウイルスゲノムの抽出に、1検体あたり血清25μlを用いて行った。抽出には、スマイテストEX-R&D(ゲノムサイエンス研究所製)キットを使用した。
プローブとして使用するために、PCRチューブには、10μMのHBV S領域に特異的なプライマ−HS1-1(5’-tcgtgttacaggcggggttt-3’配列番号14)とHS1-2(5’-cgaaccactgaacaaatggc-3’配列番号15)を0.4μMになるように2M炭酸カリウム溶液で調整した被覆溶液を50μlずつ分注し、4℃で一晩保温した。プライマー(プローブ)を固定化した後、ツイーン20を含むTBS緩衝液にてウェルを洗浄し、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNAからなる溶液を各ウェルに100μlずつ分注し、1時間程度室温にて軽く振とうしながらインキュベートすることによってブロッキングを行った。
血清は、前処理をしない場合(5μlの血清に生理食塩水を加えて95℃にて10分間処理したもの)と、前処理あり(5μlの血清に対して、1% SDS, 2% 2-mercaptoethanol, 2%ツイーン20、プロテアーゼ K(PK)等を様々に加えた溶液を添加し、それぞれ95℃にて10分間処理)の場合をテストした。
プライマ−(プローブ)を固定化してブロッキングを行ったPCRチューブを、ツイーン20を含むTBS緩衝液にて洗い、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 0.5% SDS, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNA、50%ホルムアミドからなる基本ハイブリダイゼーションバッファー、もしくはULTRA hyb(Ambion社製)を50μlずつ分注して、今回のハイブリダイゼーションの温度である42℃に加温しておいた。4.の工程の前処理後のサンプルをターゲットとして、または2.の工程の抽出サンプルをコントロールとして使用し、95℃で処理した後、ただちに氷中に移して1本鎖の状態を維持させておき、ハイブリダイゼーション溶液を分注して加温してあるPCRチューブに添加した。42℃で2時間程度軽く振とうしながらインキュベートすることによってハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後は、ツイーン20を含む生理食塩水にてPCRチューブ内を1回洗浄した。
PCRのプライマ−には、PCRチューブに固定化した2種のプライマ−より内側に位置するプライマ−HS2-1(5’-caaggtatgttgcccgtttg-3’配列番号16)、HS2-2(5’-ggcactagtaaactgagcca-3’配列番号17)を使用した。PCR反応に必要な酵素、プライマ−、dNTPs、バッファー等は、予め調整しておき、ハイブリダイゼーション後に1回洗浄したPCRチューブに50μlずつ添加して、そのままPCR反応を開始した
7.検出
2%アガロースゲルにて電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色を行って、紫外線下で写真撮影をおこなった。
結果を図5に示した。(1)は、抽出HBV DNAと血清サンプルに1%SDS,2% 2−メルカプトエタノール処理した場合の比較で、a,b2種類の陽性サンプルについて検出を行った結果である。ハイブリダイゼーションバッファーとして、6xSSC, 0.01M EDTA(pH8.0), 5x Denhardt’s solution, 0.5% SDS, 100μg/ml Sheared, denatured salmon sperm DNA、50%ホルムアミドからなる溶液(基本的ハイブリダイゼーションバッファーとする)とULTRA hybを比較した。その結果、ハイブリダイゼーションに用いるバッファーとして、ULTRAhybより基本ハイブリダイゼーションバッファーの方がよかった。ULTRAhybを用いた場合は、今回のハイブリダイゼーション条件では検出できなかったが、基本的ハイブリダイゼーションバッファーではうまく検出できた。また、既成の抽出キットを用いたサンプルと、PCRチューブ内で簡単な前処理をしたのみのサンプルとではほぼ同程度の増幅をしめした。抽出したHBV-DNAと同様に、チューブ内で1% SDS, 2% 2-mercaptoethanolで熱処理しただけのサンプルでも、同様に目的の産物が増幅された。
a-12 ctc aat gcc tgg aga ttt ggg(配列番号1)
a-20 tct atg ccc ggc cat ttg gg(配列番号2)
a-32 ctc tat gtc cgg tca ttt ggg(配列番号3)
b領域
b-11 agt agt gtt ggg tcg cga a(配列番号4)
b-21 agt agc gtt ggg ttg cga a(配列番号5)
c領域
c-11 gag cgg tcg caa cct cgt g(配列番号6)
c-21 gag cgg tcc cag cca cgt(配列番号7)
c-31 agc gat ccc agc cgc gtg(配列番号8)
e領域
e-21 cga ggt tcc cgt ccc tct t(配列番号9)
e-31 cgc ggg tct cgt cct act t(配列番号10)
PCR primers for HCV genotyping (semi nested PCR)
1st PCR
nt2 ccc tgt gag gaa cta ctg tc(配列番号11)
core1 gga atg tac ccc atg agg tc(配列番号12)
2nd PCR
nc4 tct gcg gaa ccg gtg agt ac(配列番号13)
core 1 1stと同じ
PCR primers for HBV
HS1-1 5’-tcgtgttacaggcggggttt-3’(配列番号14)
HS1-2 5’-cgaaccactgaacaaatggc-3’(配列番号15)
HS2-1 5’-caaggtatgttgcccgtttg-3’(配列番号16)
HS2-2 5’-ggcactagtaaactgagcca-3’(配列番号17)
PCR primers for HBV
eP1-1:5’-gcatggagaccaccgtgaac-3’(配列番号18)
eP1-2:5’-ggaaagaagtcagaaggcaa-3’(配列番号19)
eP2-1:5’-cataagaggactcttggact-3’(配列番号20)
eP2-2:5’-ggcaaaaaagagagtaactc-3’(配列番号21)
proves for HBV
wildtype 5’-taggttaaaggtctttgta-3’(配列番号22)
mutant 5’-taggttaatgatctttgta-3’(配列番号23)
Claims (10)
- 標的核酸の遺伝子型、または変異の判定方法であって、
1.前記遺伝子型、または変異に特徴的な配列を選び出す工程と、
2.前記配列を含む核酸を増幅する工程と、
3.前記増幅された核酸を、前記遺伝子型、または変異に特異的なプローブにハイブリダイゼーションさせる工程と、
4.前記プローブにハイブリダイズした核酸を検出して、ハイブリダイズパターンを解析する工程と、
を含む方法。 - 請求項1に記載の方法であって、前記遺伝子型、または変異は、C型肝炎ウイルスの遺伝子型であり、前記C型肝炎ウイルスの遺伝子型に特徴的な配列は、a〜e領域の配列であり、かつ前記遺伝子型特異的なプローブは、各遺伝子型のa〜e領域の配列に相補的な配列を有するプローブである方法。
- 不溶性支持体に核酸断片を固相化するための方法であって、前記核酸断片を溶解する被覆用溶液の塩濃度は、1M〜5Mであることを特徴とする方法。
- 請求項3に記載の方法であって、前記被覆用溶液に使用する塩は、K2CO3、Rb2CO3、Cs2CO3、Na2CO3、KCl、NaClの群から選択される塩であることを特徴とする方法。
- 請求項4に記載の方法であって、前記被覆用溶液に使用する塩は、K2CO3、Rb2CO3、Cs2CO3、Na2CO3の群から選択される炭酸塩であることを特徴とする方法。
- 所望の核酸を精製し、かつ増幅するための方法であって、 1.前記所望の核酸に相補的な配列を有するプローブを不溶性支持体からなる反応容器の内面に固定化する工程と、
2.前記反応容器に、前記核酸を含むサンプル液を添加して前記核酸を前記プローブにハイブリダイズさせる工程と、
3.前記サンプル液を除去する工程と、
4.前記反応容器にPCR反応液を添加して、PCR反応により前記核酸を増幅する工程と、
を含む方法。 - 請求項6に記載の所望の核酸を精製し、かつ増幅するための方法であって、前記核酸は、ウイルスゲノムである方法。
- 請求項6に記載の所望の核酸を精製し、かつ増幅するための方法であって、前記核酸は、B型肝炎ウイルスゲノムであり、前記プローブは、前記B型肝炎ウイルスゲノムに相補的な配列を有するプローブであり、かつ前記PCR反応に使用するプライマーは、前記B型肝炎ウイルスゲノムを増幅させるためのプライマーである方法。
- 所望の核酸を精製し、かつ増幅するためのキットであって、 前記核酸に相補的な配列を有するプローブを固相化するための被覆用溶液が添加されている不溶性支持体からなる反応容器と、
前記核酸が含まれているサンプルを稀釈するための稀釈液と、
前記核酸を増幅するためのPCR反応液と、
が含まれることを特徴とするキット。 - B型肝炎ウイルスの遺伝子型および変異株を判別するためのアッセイキットであって、
前記B型肝炎ウイルスゲノムの各遺伝子型について、1762番および1764番目の塩基を含む領域に相補的な配列を有するプローブが、それぞれ固定化された不溶性支持体からなる反応容器と、
前記B型肝炎ウイルスゲノムをPCRで増幅させるためのプライマーを含むPCR反応液と、
を含むアッセイキット。
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