JP2008001794A - Polymer compound for medical material and medical material using the same polymer compound - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生理活性物質を固定化する機能を有する医療材料用高分子化合物、該高分子材料を含む表面コーティング材料、該高分子化合物を用いた医療用基材、および該基材に生理活性物質を固定化した医療材料に関する。 The present invention relates to a polymer compound for medical materials having a function of immobilizing a physiologically active substance, a surface coating material containing the polymer material, a medical substrate using the polymer compound, and a physiological activity in the substrate. The present invention relates to a medical material on which a substance is immobilized.
遺伝子活性の評価や疾患プロセス、薬物効果の生物学的プロセスを含む生物学的プロセスを解読するための試みは、伝統的に、ゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、タンパク質レベルでの発現を検出し、定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、タンパク質の翻訳後修飾、タンパク質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。 Attempts to decipher biological processes, including assessment of gene activity, disease processes, and biological processes of drug effects, have traditionally focused on genomics, but proteomics Provide more detailed information about functional functions. Proteomics involves qualitative and quantitative measurement of gene activity by detecting and quantifying expression at the protein level rather than at the gene level. It also includes studies of non-gene-encoded events such as post-translational modification of proteins and protein-protein interactions.
膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとしてＤＮＡチップが実用化されてきた。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高いタンパク質の検出に関しては、プロテインチップが提唱され、最近研究が進められている。プロテインチップとは、タンパク質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化したものを総称する。 Now that a large amount of genome information is available, proteomics research is required to be faster and more efficient (high throughput). A DNA chip has been put into practical use as a molecular array for this purpose. On the other hand, regarding the detection of the most complex and highly diverse protein in biological functions, a protein chip has been proposed and recently researched. The protein chip is a generic term for a protein or a molecule in which a molecule for capturing the protein is immobilized on the chip surface.
現状のプロテインチップは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされている為、ガラス基板や粒子においてタンパク質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば、特許文献１参照）。たとえば、タンパク質の物理的吸着による固定化などが行われている。 Since current protein chips are generally developed on the extended line of DNA chips, studies are being made to immobilize proteins or molecules that capture them on glass substrates and particles on the chip surface (for example, Patent Document 1). For example, immobilization by physical adsorption of proteins is performed.
また、プロテインチップのシグナル検出において、信号対雑音比を低下させる原因として検出対象物質の基板への非特異的な吸着（たとえば、非特許文献１参照）が挙げられる。 Moreover, in the signal detection of a protein chip, non-specific adsorption (for example, refer nonpatent literature 1) of the detection target substance to the board | substrate is mentioned as a cause which reduces a signal-to-noise ratio.
前述のタンパク質の物理的吸着による固定化では、タンパク質を固定化した後に２次抗体の非特異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われているが、これらの非特異的吸着防止能は十分でない。また１次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため、固定化したタンパク質がコーティングされてしまい、２次抗体と反応できないという問題があった。このため、１次抗体の固定化後、吸着防止剤をコーティングすることなく、生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオチップが求められている。 In the above-mentioned protein immobilization by physical adsorption, after the protein is immobilized, a non-specific adsorption of the secondary antibody is carried out to prevent the non-specific adsorption of the secondary antibody. Noh is not enough. In addition, since the adsorption inhibitor is coated after immobilizing the primary antibody, there is a problem that the immobilized protein is coated and cannot react with the secondary antibody. For this reason, there is a need for a biochip with a small amount of nonspecific adsorption of a physiologically active substance without coating an adsorption inhibitor after the primary antibody is immobilized.
バイオチップに対する生理活性物質の非特異的吸着量を低減させるには、バイオチップの親水性を向上させるのが有効であるが、このようなバイオチップを用いた場合、親水性が高いためにタンパク質を捕捉させた後の洗浄工程において基板に固定化したタンパク質またはそれを捕捉する分子が流出し、信号が低下するという問題があった。この問題に対する１つのアプローチとして、官能基、スペーサー基、および結合基を含む活性成分、架橋用成分、マトリックス形成成分を支持体上に被覆し、硬化させることで、支持体上に強固に結合した機能性表面を形成できることが開示されている（たとえば、特許文献２）。しかしながら、この開示された方法では支持体上で低分子成分の硬化が進行するため、支持体がプラスチック基板の場合には反りや変形が起きる恐れがあった。また、網の目状に絡み合ったマトリックスが形成されることから、生理活性物質を固定化するための官能基の反応が抑制されたり、固定化した生理活性物質の機能発現の再現性が悪いなどの問題があった。また、洗浄を行ってもマトリックス内部に入り込んだタンパク質を除去しきれないために非特異吸着を十分に抑制できないといった問題もあった。 Improving the hydrophilicity of biochips is effective in reducing the amount of nonspecifically adsorbed bioactive substances to biochips. However, when such biochips are used, protein is highly hydrophilic. In the washing step after capturing the protein, there is a problem that the protein immobilized on the substrate or the molecule that captures it flows out and the signal decreases. One approach to this problem is to bond the active component containing a functional group, a spacer group, and a linking group, a cross-linking component, and a matrix-forming component onto the support and cure to bond firmly to the support. It is disclosed that a functional surface can be formed (for example, Patent Document 2). However, in this disclosed method, since curing of low molecular components proceeds on the support, there is a risk of warping or deformation when the support is a plastic substrate. In addition, since a matrix intertwined in a mesh shape is formed, the reaction of the functional group for immobilizing the physiologically active substance is suppressed, or the function expression of the immobilized physiologically active substance is poorly reproducible. There was a problem. In addition, there is a problem that nonspecific adsorption cannot be sufficiently suppressed because the protein that has entered the matrix cannot be removed even after washing.
一方、基礎的な生物学や医療の分野においてタンパク質等特定の生体物質を捕捉する粒子の重要性が高まっている。例えばアフィニティークロマトグラフィーの担体への応用、医療における診断や薬物送達システム（ドラックデリバリーシステム、ＤＤＳ）、創薬用途などへの応用に対する関心が高まっている。創薬用途への応用例としては、たとえば様々な粒子（担体）に固定されたリガンドと呼ばれる生理活性物質を介して特定のタンパク質などの生体分子を捕捉し、これを分離精製するものがある。 On the other hand, in the fields of basic biology and medicine, the importance of particles that capture specific biological substances such as proteins is increasing. For example, there is an increasing interest in applications to affinity chromatography carriers, medical diagnosis, drug delivery systems (Drug Delivery Systems, DDS), and drug discovery applications. As an application example for drug discovery, for example, a biomolecule such as a specific protein is captured and separated and purified through a physiologically active substance called a ligand immobilized on various particles (carriers).
粒子を担体として用いる際に求められる条件は、主には（１）担体自体がタンパク質などの生体物質一般に対して非特異吸着をしないこと、（２）穏和な条件下でリガンドまたはスペーサーを固定化できる官能基を有すること、またその固定化容量が大きいこと、（３）目的・用途に応じた機械的強度を有すること、である。しかし、これらの条件を満たす担体は未だ開発されていない。 The conditions required when using particles as a carrier are mainly (1) the carrier itself does not non-specifically adsorb to biological substances such as proteins, and (2) immobilization of ligands or spacers under mild conditions. It has a functional group that can be used, has a large immobilization capacity, and (3) has mechanical strength in accordance with the purpose and application. However, a carrier that satisfies these conditions has not yet been developed.
例えば、従来の担体のうち、無機系のシリカゲル粒子は物理的強度の強い担体で、多孔質であることから分離には良いとされているが、非特異吸着の度合が高いという欠点があるため実際に使用されている例は極めて少ない。一方、合成高分子系では、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物などでなる粒子が開発されているが、これらの高分子も生体関連物質の非特異的吸着が起こり易いという欠点がある。 For example, among conventional carriers, inorganic silica gel particles are carriers with strong physical strength and are considered to be good for separation because they are porous, but they have the disadvantage of high degree of non-specific adsorption. There are very few examples that are actually used. On the other hand, in synthetic polymer systems, particles made of polyacrylamide gel (trade name: Bio-GelP, Bio-Rad), polystyrene, ethylene-maleic anhydride copolymer, etc. have been developed. There is a drawback that non-specific adsorption of biological substances is likely to occur.
上記のように、粒子を医療用担体として用いる場合には、非特異吸着が問題になることが多い。一方で、それを回避するために様々な手法も検討されている。たとえば、表面に目的の生理活性物質をつけたあと、残りの粒子表面をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の害の少ないタンパクを先に吸着させておくブロッキングの手法などがあるが、効果は十分ではない。また、表面がエポキシ基からなる粒子に特定のタンパク質と特異的に結合するＤＮＡを結合させ、タンパク質の精製用途に用いる例もある（例えば特許文献３）。この方法では、タンパク質の非特異吸着性が少ないという理由から、粒子表面へのエポキシ基導入にグリシジルメタクリレートなどを用いている。しかし、エポキシ基にＤＮＡ等生理活性物質を直接結合させる方法は、相当厳しい条件を必要とする。このため、固定化させる生理活性物質がアルカリや高温で不安定な場合、固定化プロセスで生理活性物質が変質してしまう恐れがあるので不適当である。 As described above, nonspecific adsorption often becomes a problem when particles are used as a medical carrier. On the other hand, various techniques are being studied to avoid this. For example, there is a blocking method in which a desired physiologically active substance is attached to the surface, and then the remaining particle surface is first adsorbed with a less harmful protein such as bovine serum albumin (BSA). Absent. There is also an example in which DNA that specifically binds to a specific protein is bound to particles having an epoxy group on the surface and used for protein purification (for example, Patent Document 3). In this method, glycidyl methacrylate or the like is used to introduce an epoxy group to the particle surface because of the low nonspecific adsorption property of the protein. However, the method of directly binding a physiologically active substance such as DNA to an epoxy group requires considerably severe conditions. For this reason, when the physiologically active substance to be immobilized is unstable at an alkali or high temperature, the physiologically active substance may be altered during the immobilization process, which is inappropriate.
その他、粒子の非特異吸着低減方法としては、非特異吸着の少ないポリマー粒子を乳化重合法などで合成する例がある。たとえば、特許文献４には、生理活性物質と反応可能な反応基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、ポリオキシアルキレン側鎖を有するエチレン系不飽和重合性モノマーおよび疎水性を付与するエチレン系不飽和重合性ビニル芳香族モノマーを乳化重合法または懸濁重合法にて共重合し、粒子を得る方法が記載されている。しかし、このような方法では、得られる粒子径の制御が困難である。一般に、乳化重合法では、比較的均一な粒径を有する粒子が得られるものの、粒子径がサブミクロン程度のものしかできない。一方、懸濁重合法で得られる粒子は、粒子径分布が広く、たとえばカラム用充填剤として用いるためには粒子を分級する必要があるが、特別な装置のない場合にはポリマー粒子を高度に分級することが難しい。しかも、得られる粒子のサイズが数十ミクロンから数百ミクロンであり、小さい径の粒子を合成することができない。さらに、重合で得られる粒子は、高分子であるがために担体としての強度に自ずと限界がある。粒子強度が求められる用途に使用する場合には、高分子中のエチレン系不飽和重合性ビニル芳香族モノマーの比率を上げるなど強度を上げるための処方を余儀なくされ、そのことは逆に非特異吸着に不利であった。 In addition, as a method for reducing non-specific adsorption of particles, there is an example in which polymer particles with little non-specific adsorption are synthesized by an emulsion polymerization method. For example, Patent Document 4 discloses an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a reactive group capable of reacting with a physiologically active substance, an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a polyoxyalkylene side chain, and an ethylenically unsaturated monomer imparting hydrophobicity. A method is described in which particles are obtained by copolymerizing a saturated polymerizable vinyl aromatic monomer by emulsion polymerization or suspension polymerization. However, in such a method, it is difficult to control the particle size obtained. In general, the emulsion polymerization method can obtain particles having a relatively uniform particle diameter, but can only have a particle diameter of about submicron. On the other hand, the particles obtained by the suspension polymerization method have a wide particle size distribution. For example, the particles need to be classified for use as a column packing material. Difficult to classify. In addition, the size of the obtained particles is several tens of microns to several hundreds of microns, and particles having a small diameter cannot be synthesized. Furthermore, since the particles obtained by polymerization are polymers, the strength as a carrier is naturally limited. When used in applications where particle strength is required, prescriptions are required to increase the strength, such as increasing the proportion of ethylenically unsaturated polymerizable vinyl aromatic monomer in the polymer. Was disadvantageous.
現在最も汎用されている担体は、多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）およびデキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）に各種官能基を導入したものである。アガロースゲルは、排除できる不純物の限界分子量がデキストランやアクリルアミドよりも大きいため、高分子量の生物学的物質を扱う場合に適していると言われている。しかし、これらの担体は、物理的強度が小さいため耐圧性に欠けるとともに、担体の網目構造中に夾雑物の吸着や滞留が起こるために、夾雑物の混入が避けられないなど、問題点も多い。 Currently, the most widely used carrier is a porous agarose particle (trade name: Sepharose) and dextran particles (trade name: Sephadex) into which various functional groups are introduced. Agarose gel is said to be suitable for handling high molecular weight biological substances because the limiting molecular weight of impurities that can be eliminated is larger than that of dextran or acrylamide. However, these carriers have a lot of problems such as lack of pressure resistance due to their low physical strength, and contamination and adsorption of impurities in the network structure of the carrier. .
本発明の課題は、生理活性物質の固定化能力に優れ、タンパク質に対して非特異吸着が少なく、洗浄工程における溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有する医療材料用高分子化合物を提供すること、該高分子化合物を用いて非特異的吸着が少なく、かつ、生理活性物質の固定化が可能な医療用基材を提供すること、さらには該医療用基材に生理活性物質を固定化した医療材料を提供することである。
なお、本願において、「基体」とは、粒子、スライド形状基板、プレート、容器、マイクロフルイディスク基板等を総称するもので、高分子化合物を塗布する前の状態のものを示し、「基材」とは医療用基材のように、基体に高分子化合物を塗布した状態のものを示す。また、「医療材料」とは「基材」に生理活性物質を固定化した状態のものを示す。
An object of the present invention is to provide a polymer compound for medical materials having excellent chemical and physical stability, which has excellent ability to immobilize physiologically active substances, has less nonspecific adsorption to proteins, and has little dissolution and deterioration in the washing process. Providing a medical base material with less non-specific adsorption and immobilization of a physiologically active substance using the polymer compound, and further providing a physiologically active substance on the medical base material It is to provide an immobilized medical material.
In the present application, the “substrate” is a general term for particles, slide-shaped substrates, plates, containers, microfluidic substrates, etc., and indicates a state before applying a polymer compound. Means a state in which a polymer compound is applied to a substrate, such as a medical substrate. The “medical material” refers to a material in which a physiologically active substance is immobilized on a “base material”.
本発明者らは、生理活性物質の固定化能力に優れ、タンパク質に対して非特異吸着が少ない医療材料用高分子化合物の開発を目指して鋭意検討を行った。その結果、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）及び生理活性物質を固定化する官能基がアルキレングリコール残基を介して結合しているエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を含む重合体であって、前記エチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）のアルキレングリコール残基の鎖長がエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）のアルキレングリコール残基の鎖長より長いこと、および前記共重合体の少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有することを特徴とする医療材料用高分子化合物が、生理活性物質の固定化能力に優れ、タンパク質に対して非特異吸着が少なく、洗浄工程における溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。 The present inventors diligently studied with the aim of developing a polymer compound for medical materials that has excellent ability to immobilize physiologically active substances and has little nonspecific adsorption to proteins. As a result, an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having an alkylene glycol residue and an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) in which a functional group for immobilizing a physiologically active substance is bonded via the alkylene glycol residue. ), The chain length of the alkylene glycol residue of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) is the alkylene glycol residue of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a). The polymer compound for medical materials, which is longer than the chain length of the copolymer and has a reactive functional group at least on one end of the copolymer, has an excellent ability to immobilize physiologically active substances and On the other hand, it has been found that it has low nonspecific adsorption and has chemical and physical stability with little dissolution and deterioration in the washing process, and the present invention is completed. Led was.
すなわち本発明は、
（１）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）及び生理活性物質を固定化する官能基がアルキレングリコール残基を介して結合しているエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を含む重合体であって、前記エチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）のアルキレングリコール残基の鎖長がエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）のアルキレングリコール残基の鎖長より長く、かつ前記共重合体の少なくとも片側の末端に反応性官能基を有することを特徴とする医療材料用高分子化合物、
（２）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）及び生理活性物質を固定化する官能基がアルキレングリコール残基を介して結合しているエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）及び疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）から誘導される繰り返し単位を含む重合体であって、前記エチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）のアルキレングリコール残基の鎖長がエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）のアルキレングリコール残基の鎖長より長く、かつ前記共重合体の少なくとも片側の末端に反応性官能基を有することを特徴とする医療材料用高分子化合物、
（３）前記末端の反応性官能基が反応性シリル基である（１）または（２）記載の医療材料用高分子化合物、
（４）前記反応性シリル基がアルコキシシリル基である（３）記載の医療材料用高分子化合物、
（５）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）が下記の一般式［１］で表されるモノマーである（１）〜（４）いずれか記載の医療材料用高分子化合物、
（６）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）のアルキレングリコール残基がエチレングリコール残基である（５）記載の医療材料用高分子化合物、
（７）アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）がメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシエチルアクリレートである（５）記載の医療材料用高分子化合物、
（８）生理活性物質を固定化する官能基がアルキレングリコール残基を介して結合しているエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の官能基がアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチンから選ばれる少なくとも一つの官能基である（１）〜（７）いずれか記載の医療材料用高分子化合物、
（９）生理活性物質を固定化する官能基がアルキレングリコール残基を介して結合しているエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）が、下記の一般式［２］で表される活性エステル基を有するモノマーである（１）〜（７）いずれか記載の医療材料用高分子化合物、
（１０）前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである（９）記載の医療材料用高分子化合物、
（１１）疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）の疎水性ユニットがアルキル基である（２）〜（１０）いずれか記載の医療材料用高分子化合物、
（１２）疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）の疎水性ユニットが炭素数３〜２０のアルキル基である（２）〜（１１）いずれか記載の医療材料用高分子化合物、
（１３）疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）がｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、及びシクロヘキシルメタクリレートから選ばれる少なくとも一つのモノマーである（１２）記載の医療材料用高分子化合物、
（１４）反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）の存在下、少なくともアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）および生理活性物質を固定化する官能基がアルキレングリコール残基を介して結合しているエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）をラジカル共重合することにより、末端に前記反応性官能基を導入した高分子化合物を得ることを特徴とする請求項（１）〜（１３）いずれか記載の医療材料用高分子化合物の製造方法、
（１５）反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）が下記の一般式［３］で表されるメルカプトシラン化合物である（１４）記載の医療材料用高分子化合物の製造方法、
（１６）前記一般式［３］で表されるメルカプトシラン化合物の反応性部位がアルコキシル基である（１５）記載の医療材料用高分子化合物の製造方法、
（１７）（１）〜（１３）いずれか記載の医療材料用高分子化合物または（１４）〜（１６）いずれか記載の製造方法で得られる医療材料用高分子化合物を含む医療材料用表面コーティング材料、
（１８）（１７）記載の医療材料用表面コーティング材料を含む層を基体表面に形成した医療材料用基材、
（１９）前記基体が無機材料またはプラスチックからなることを特徴とする（１８）記載の医療材料用基材、
（２０）前記無機材料が無機酸化物からなる（１９）記載の医療材料用基材、
（２１）前記無機酸化物が酸化ケイ素または酸化チタンである（２０）記載の医療材料用基材、
（２２）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンである（１９）記載の医療材料用基材、
（２３）前記基体の形状が粒子、スライド形状基板、プレート、容器、マイクロフルイディスク基板である（１８）〜（２２）いずれか記載の医療材料用基材、
（２４）（１８）〜（２３）いずれか記載の医療材料用基材に生理活性物質を固定化した医療材料、
（２５）前記生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、ビオチン、アビジン及び糖タンパク質から選ばれる少なくとも一つの生理活性物質である（２４）記載の医療材料、
（２６）（１８）〜（２３）いずれか記載の医療材料用基材の製造方法であって、前記高分子化合物を溶媒に溶解させた溶液を調製する工程、前記溶液を基体表面に塗布する工程、及び乾燥させる工程、を含む医療材料用基材の製造方法、
（２７）更に加熱処理する工程を含む（２６）記載の医療材料用基材の製造方法、
（２８）（２４）または（２５）記載の医療材料の製造方法であって、（２６）または（２７）記載の製造方法で得られた医療材料用基材に対し生理活性物質を固定化する工程を含む医療材料の製造方法、
である。
That is, the present invention
(1) An ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue (a) and an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group for immobilizing a physiologically active substance bonded via an alkylene glycol residue (b) ), The chain length of the alkylene glycol residue of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) is the alkylene glycol residue of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a). A polymer compound for medical materials, which is longer than the chain length of the copolymer and has a reactive functional group at least on one end of the copolymer;
(2) An ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue (a) and an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a functional group for immobilizing a physiologically active substance bonded via an alkylene glycol residue (b) ) And a repeating unit derived from an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having a hydrophobic unit, the chain length of the alkylene glycol residue of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) Is longer than the chain length of the alkylene glycol residue of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) and has a reactive functional group at least on one end of the copolymer, ,
(3) The polymer compound for medical material according to (1) or (2), wherein the reactive functional group at the terminal is a reactive silyl group,
(4) The polymer compound for medical materials according to (3), wherein the reactive silyl group is an alkoxysilyl group,
(5) The polymer for medical materials according to any one of (1) to (4), wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having an alkylene glycol residue is a monomer represented by the following general formula [1] Compound,
(6) The polymer compound for medical materials according to (5), wherein the alkylene glycol residue of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having an alkylene glycol residue is an ethylene glycol residue,
(7) The ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having an alkylene glycol residue is methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, ethoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, or methoxyethyl acrylate. Molecular compounds,
(8) The functional group of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) in which the functional group for immobilizing the physiologically active substance is bonded via an alkylene glycol residue is an aldehyde group, active ester group, epoxy group, vinyl sulfone A polymer compound for medical materials according to any one of (1) to (7), which is at least one functional group selected from a group and biotin;
(9) An active ester group represented by the following general formula [2], wherein the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) to which a functional group for immobilizing a physiologically active substance is bonded via an alkylene glycol residue A polymer compound for medical materials according to any one of (1) to (7),
(10) The polymer compound for medical materials according to (9), wherein the active ester group is p-nitrophenyl ester or N-hydroxysuccinimide ester,
(11) The polymer compound for medical material according to any one of (2) to (10), wherein the hydrophobic unit of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having a hydrophobic unit is an alkyl group,
(12) The polymer compound for medical material according to any one of (2) to (11), wherein the hydrophobic unit of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having a hydrophobic unit is an alkyl group having 3 to 20 carbon atoms. ,
(13) The ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having a hydrophobic unit is at least one monomer selected from n-butyl methacrylate, n-dodecyl methacrylate, n-octyl methacrylate, and cyclohexyl methacrylate. Polymer compounds for medical materials,
(14) An ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having at least an alkylene glycol residue and a functional group for immobilizing a physiologically active substance in the presence of a mercapto compound (d) having a reactive functional group are alkylene glycol residues A polymer compound in which the reactive functional group is introduced at a terminal is obtained by radical copolymerization of an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) bonded via a hydrogen atom (1). To (13) A method for producing a polymer compound for medical material according to any one of
(15) The method for producing a polymer compound for medical material according to (14), wherein the mercapto compound (d) having a reactive functional group is a mercaptosilane compound represented by the following general formula [3]:
(16) The method for producing a polymer compound for medical material according to (15), wherein the reactive site of the mercaptosilane compound represented by the general formula [3] is an alkoxyl group,
(17) Surface coating for medical material comprising the polymer compound for medical material according to any one of (1) to (13) or the polymer compound for medical material obtained by the production method according to any one of (14) to (16) material,
(18) A substrate for medical material, wherein a layer containing the surface coating material for medical material according to (17) is formed on the surface of the substrate,
(19) The medical material substrate according to (18), wherein the substrate is made of an inorganic material or plastic.
(20) The medical material substrate according to (19), wherein the inorganic material comprises an inorganic oxide;
(21) The medical material substrate according to (20), wherein the inorganic oxide is silicon oxide or titanium oxide,
(22) The medical material substrate according to (19), wherein the plastic is saturated cyclic polyolefin or polystyrene,
(23) The substrate for medical material according to any one of (18) to (22), wherein the shape of the substrate is a particle, a slide-shaped substrate, a plate, a container, or a microfluidic substrate.
(24) A medical material in which a physiologically active substance is immobilized on the medical material substrate according to any one of (18) to (23),
(25) The medical material according to (24), wherein the physiologically active substance is at least one physiologically active substance selected from nucleic acids, aptamers, proteins, oligopeptides, sugar chains, biotin, avidin, and glycoproteins,
(26) The method for producing a substrate for medical material according to any one of (18) to (23), wherein a step of preparing a solution in which the polymer compound is dissolved in a solvent is applied, and the solution is applied to a substrate surface A method for producing a substrate for medical material, comprising: a step of drying;
(27) The method for producing a medical material substrate according to (26), further comprising a heat treatment step,
(28) The method for producing a medical material according to (24) or (25), wherein a physiologically active substance is immobilized on the medical material substrate obtained by the production method according to (26) or (27). A method for producing a medical material including a process,
It is.
本発明によれば、生理活性物質の固定化能力に優れ、タンパク質に対して非特異吸着が少なく、洗浄工程における溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有する医療材料用高分子化合物を提供でき、更に該高分子化合物を用いて非特異的吸着が少なく、かつ、生理活性物質の固定化が可能な医療用基材を提供することができる。さらには、該医療用基材に生理活性物質を固定化することにより、目的のタンパク質等を選択的に捕捉することのできる医療材料を提供することができる。 According to the present invention, there is provided a polymer compound for medical materials having excellent chemical and physical stability with excellent ability to immobilize physiologically active substances, low non-specific adsorption to proteins, and low dissolution and deterioration in the washing process. Furthermore, it is possible to provide a medical base material that can be provided and can be immobilized with a physiologically active substance with less non-specific adsorption using the polymer compound. Furthermore, by immobilizing a physiologically active substance on the medical base material, it is possible to provide a medical material capable of selectively capturing a target protein or the like.
本発明の高分子化合物は、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）及び生理活性物質を固定化する官能基がアルキレングリコール残基を介して結合しているエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される繰り返し単位を含む重合体であって、前記エチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）のアルキレングリコール残基の鎖長がエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）のアルキレングリコール残基の鎖長より長いこと、および前記共重合体の少なくとも片側の末端に反応性官能基を有することを特徴とする。この高分子化合物は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、特定の生理活性物質を固定化する性質を併せ持つポリマーで、アルキレングリコール残基が生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、生理活性物質を固定化する官能基が特定の生理活性物質を固定化する役割を果たす。しかも、生理活性物質を固定化する官能基がアルキレングリコール残基を介して結合しており、そのアルキレングリコール残基の鎖長がエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）のアルキレングリコール残基の鎖長以上であることから、該高分子化合物に生理活性物質を固定化する際、主鎖やエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）の側鎖によって反応を邪魔されることが少ない。このことにより、生理活性物質に対する反応性が高まる。また、少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有することから、基体と共有結合を形成することができ、これにより基体の表面該高分子化合物をグラフトさせることができる。このようにして得られたグラフト化基体は、洗浄工程により該高分子化合物が流出してしまうことがない。 The polymer compound of the present invention includes an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having an alkylene glycol residue and an ethylenically unsaturated group in which a functional group for immobilizing a physiologically active substance is bonded via the alkylene glycol residue. A polymer comprising a repeating unit derived from a polymerizable monomer (b), wherein the chain length of the alkylene glycol residue of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) is an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) It is longer than the chain length of the alkylene glycol residue, and has a reactive functional group at the terminal on at least one side of the copolymer. This polymer compound is a polymer that has both the property of suppressing non-specific adsorption of a physiologically active substance and the property of immobilizing a specific physiologically active substance, and an alkylene glycol residue suppresses nonspecific adsorption of the physiologically active substance. A functional group that plays a role and immobilizes a physiologically active substance plays a role of immobilizing a specific physiologically active substance. Moreover, the functional group for immobilizing the physiologically active substance is bonded via an alkylene glycol residue, and the chain length of the alkylene glycol residue is the chain of the alkylene glycol residue of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a). Since it is longer or longer, the reaction is hardly hindered by the main chain or the side chain of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) when the physiologically active substance is immobilized on the polymer compound. This increases the reactivity to the physiologically active substance. In addition, since it has a reactive functional group at least on one end, it can form a covalent bond with the substrate, whereby the polymer compound can be grafted on the surface of the substrate. In the grafted substrate thus obtained, the polymer compound does not flow out by the washing step.
本発明に使用するアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）は、特に構造を限定しないが、一般式［１］で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｘの連鎖からなる化合物であることが好ましい。 The ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having an alkylene glycol residue used in the present invention is not particularly limited in structure, but has a (meth) acryl group represented by the general formula [1] and 1 to 10 carbon atoms. It is preferable that it is a compound which consists of the chain | strand of the alkylene glycol residue X.
式中のアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｘの繰り返し数ｐは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは１〜９０の整数であり、さらに好ましくは１〜８０の整数であり、最も好ましくは１〜５０の整数である。各種ｐの混合物である場合には、高分子化合物全体としては、ｐは平均値として特定される。繰り返し数２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Ｘの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。 The number of carbon atoms of the alkylene glycol residue X in the formula is 1 to 10, preferably 1 to 6, more preferably 2 to 4, still more preferably 2 to 3, and most preferably 2. . The repeating number p of the alkylene glycol residue X is not particularly limited, but is preferably an integer of 1 to 100, more preferably an integer of 1 to 90, and still more preferably an integer of 1 to 80. Yes, most preferably an integer of 1-50. In the case of a mixture of various types of p, p is specified as an average value for the entire polymer compound. When the number of repeats is 2 or more and 100 or less, the carbon number of the alkylene glycol residue X to be repeated may be the same or different.
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）としては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、エトキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、生理活性物質の非特異的吸着の少なさ及び入手性からメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、メトキシエチルアクリレートが好ましい。メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートを用いた（共）重合体を基体表面に塗布した場合、水和性の高いポリエチレングリコール鎖が水中で広がり、立体排斥効果でタンパク質などの生体成分の非特異的吸着を抑制していると考えられる。一方、メトキシエチルアクリレートを用いた（共）重合体を基体表面に塗布した場合、側鎖による立体排斥効果はほとんど期待できないが、その表面には中間水と呼ばれる弱く束縛された水の層が存在することが示唆されている。この層の存在がタンパク質などの生体成分の非特異的吸着を抑制していると考えられている。なお、本発明において（メタ）アクリルはアクリル及び／またはメタクリルを示し、（メタ）アクリレートはアクリレート及び／またはメタクリレートを示す。
本発明の高分子化合物において、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）から誘導される部分の割合は、特に制限されるものではないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、１〜９５ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは３０〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは５０〜９０ｍｏｌ％である。
Examples of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having an alkylene glycol residue include methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, ethoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, methoxyethyl (meth) acrylate, ethoxyethyl (meth) acrylate, 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, 2-hydroxypropyl (meth) acrylate and mono-substituted ester thereof, 2-hydroxybutyl (meth) acrylate and mono-substituted ester thereof, glycerol mono (meth) acrylate, polypropylene glycol (Meth) acrylate, 2-ethoxyethyl (meth) acrylate, methoxydiethylene glycol (meth) acrylate, ethoxydiethylene glycol (Meth) acrylate, ethoxypolyethyleneglycol (meth) acrylate, etc. are mentioned, but methoxypolyethyleneglycol (meth) acrylate, ethoxypolyethyleneglycol (meth) acrylate, methoxy because of the low nonspecific adsorption of bioactive substances and availability Ethyl acrylate is preferred. When a (co) polymer using methoxypolyethyleneglycol (meth) acrylate or ethoxypolyethyleneglycol (meth) acrylate is applied to the substrate surface, highly hydratable polyethylene glycol chains spread in water, resulting in steric exclusion effects such as protein It is considered that non-specific adsorption of the biological components of is suppressed. On the other hand, when a (co) polymer using methoxyethyl acrylate is applied to the substrate surface, the steric exclusion effect by side chains can hardly be expected, but there is a weakly bound layer of water called intermediate water on the surface. It has been suggested that The presence of this layer is thought to suppress nonspecific adsorption of biological components such as proteins. In the present invention, (meth) acryl represents acryl and / or methacryl, and (meth) acrylate represents acrylate and / or methacrylate.
In the polymer compound of the present invention, the proportion of the moiety derived from the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) having an alkylene glycol residue is not particularly limited, but the repeating unit of all monomers in the polymer Is preferably 1 to 95 mol%, more preferably 30 to 90 mol%, and most preferably 50 to 90 mol%.
本発明に用いる生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）の官能基としては、化学的に活性な基、受容体基、リガンド基などがあるが、これらに限定されない。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチン、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基、アビジン、ストレプトアビジン、金属キレートなどがあるがこれらに限定されない。これらの中でも生理活性物質に多く含まれるアミノ基との反応性の点からアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましく、また生理活性物質と結合定数が高いビオチンが好ましい。なかでもモノマーの保存安定性の点から活性エステル基が最も好ましい。 Examples of the functional group of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) having a functional group for immobilizing a physiologically active substance used in the present invention include a chemically active group, a receptor group, and a ligand group. It is not limited to. Specific examples include aldehyde groups, active ester groups, epoxy groups, vinyl sulfone groups, biotin, thiol groups, amino groups, isocyanate groups, isothiocyanate groups, hydroxyl groups, acrylate groups, maleimide groups, hydrazide groups, and azide groups. Amide group, sulfonate group, avidin, streptavidin, metal chelate, and the like. Among these, an aldehyde group, an active ester group, an epoxy group, and a vinyl sulfone group are preferable from the viewpoint of reactivity with an amino group contained in a large amount in the physiologically active substance, and biotin having a high binding constant with the physiologically active substance is preferable. Of these, an active ester group is most preferable from the viewpoint of storage stability of the monomer.
本発明に使用する生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）は、特に構造を限定しないが、下記の一般式［２］で表される（メタ）アクリル基と活性エステル基が炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖またはアルキル基を介して結合した化合物であることが好ましい。 The ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) having a functional group for immobilizing the physiologically active substance used in the present invention is not particularly limited in structure, but (meth) acrylic represented by the following general formula [2] A group in which a group and an active ester group are bonded via a chain of an alkylene glycol residue having 1 to 10 carbon atoms or an alkyl group is preferable.
式［２］で、アルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは１〜１００の整数であり、より好ましくは１〜９０の整数であり、最も好ましくは１〜８０の整数である。各種ｑの混合物である場合には、高分子化合物全体としては、ｑは平均値として特定される。繰り返し数２以上１００以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。ここで、アルキレングリコールの鎖長、すなわち(Ｙ)ｑの長さは式［１］中の (Ｘ)ｐの長さよりも長いことが望ましい。鎖長の差が明らかでない場合は、それぞれの原子数で近似してもよい。なお、(Ｘ)ｐおよび(Ｙ)ｑの長さに分布がある場合には、平均値で比較するとよい。(Ｙ)ｑが(Ｘ)ｐよりも長いことにより、生理活性物質を固定化する官能基の周辺は、高分子化合物の主鎖やエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）の側鎖が存在する確率が少なくなり、比較的「空いた」状態になりやすい。このことから該高分子化合物に生理活性物質を固定化する際、生理活性物質を固定化する官能基と生理活性物質とが出会う確率が上昇し、生理活性物質に対する反応性が高まる。 In the formula [2], the alkylene glycol residue Y has 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 6, more preferably 2 to 4, still more preferably 2 to 3, most preferably. 2. The repeating number q of the alkylene glycol residue Y is an integer of 1 to 100, more preferably an integer of 1 to 90, and most preferably an integer of 1 to 80. In the case of a mixture of various qs, q is specified as an average value as the whole polymer compound. When the number of repeats is 2 or more and 100 or less, the carbon number of the alkylene glycol residue to be repeated may be the same or different. Here, the chain length of the alkylene glycol, that is, the length of (Y) q is preferably longer than the length of (X) p in the formula [1]. If the difference in chain length is not clear, the number of atoms may be approximated. In addition, when there is a distribution in the lengths of (X) p and (Y) q, the average values may be compared. Since (Y) q is longer than (X) p, the main chain of the polymer compound and the side chain of the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (a) are present around the functional group for immobilizing the physiologically active substance. The probability of doing so decreases, and it tends to be relatively “vacant”. For this reason, when a physiologically active substance is immobilized on the polymer compound, the probability that the functional group that immobilizes the physiologically active substance and the physiologically active substance will increase, and the reactivity to the physiologically active substance will increase.
本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。 The “active ester group” used in the present invention is an ester group having a highly acidic electron-withdrawing group in one of the substituents of the ester group and activated for nucleophilic reaction, ie, the reaction activity. As meaning a high ester group, it is commonly used in the fields of various chemical syntheses such as polymer chemistry and peptide synthesis. In practice, phenol esters, thiophenol esters, N-hydroxyamine esters, esters of heterocyclic hydroxy compounds, etc. are known as active ester groups having much higher activity than alkyl esters and the like. .
このような活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でもｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。 Examples of such active ester groups include p-nitrophenyl active ester groups, N-hydroxysuccinimide active ester groups, phthalic acid imide active ester groups, 5-norbornene-2, 3-dicarboximide active ester groups, and the like. Among them, a p-nitrophenyl active ester group or an N-hydroxysuccinimide active ester group is preferable, and a p-nitrophenyl active ester group is most preferable.
本発明の高分子化合物において、生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）から誘導される部分の割合は特に制限されるものではないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、１〜５０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜３５ｍｏｌ％である。 In the polymer compound of the present invention, the proportion of the portion derived from the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (b) having a functional group for immobilizing a physiologically active substance is not particularly limited, 1-50 mol% is preferable with respect to the total number of repeating units of the monomer, and more preferably 1-35 mol%.
本発明に使用する高分子化合物は、少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有していれば、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの他に疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）を共重合して得られる高分子化合物であってもよい。疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）は、特に構造を限定しないが、（メタ）アクリル基に疎水性ユニットが結合したモノマーが好ましく、脂肪族（メタ）アクリレート類や芳香族（メタ）アクリレート類が挙げられる。より好ましくは、前記脂肪族がアルキル基である（メタ）アクリレート類である。さらに好ましくは、前記アルキル基が炭素数３〜２０のアルキル基である（メタ）アクリレート類である。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。 The polymer compound used in the present invention has a functional group for immobilizing an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having an alkylene glycol residue and a physiologically active substance as long as it has a reactive functional group at least on one end. It may be a polymer compound obtained by copolymerizing an ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having a hydrophobic unit in addition to the ethylenically unsaturated polymerizable monomer having. The ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having a hydrophobic unit is not particularly limited in structure, but a monomer having a hydrophobic unit bonded to a (meth) acryl group is preferred, and aliphatic (meth) acrylates and aromatics are preferred. (Meth) acrylates may be mentioned. More preferably, they are (meth) acrylates in which the aliphatic is an alkyl group. More preferably, (meth) acrylates in which the alkyl group is an alkyl group having 3 to 20 carbon atoms. The structure of the alkyl group is not particularly limited, and may be linear, branched, or cyclic.
具体的なモノマーの例としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、iso−ブチル（メタ）アクリレート、sec−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、sec−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、iso−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、iso−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、iso−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、iso−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、iso−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、iso−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、iso−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、iso−オクタデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで最も好ましいのが、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレート、及びシクロヘキシルメタクリレートである。 Specific examples of the monomer include n-butyl (meth) acrylate, iso-butyl (meth) acrylate, sec-butyl (meth) acrylate, t-butyl (meth) acrylate, n-neopentyl (meth) acrylate, iso -Neopentyl (meth) acrylate, sec-neopentyl (meth) acrylate, neopentyl (meth) acrylate, n-hexyl (meth) acrylate, iso-hexyl (meth) acrylate, heptyl (meth) acrylate, n-octyl (meth) acrylate , Iso-octyl (meth) acrylate, 2-ethylhexyl (meth) acrylate, n-nonyl (meth) acrylate, iso-nonyl (meth) acrylate, n-decyl (meth) acrylate, iso-decyl (meth) acrylate, n -Dodecyl (meth) acrylate , Iso-dodecyl (meth) acrylate, n-tridecyl (meth) acrylate, iso-tridecyl (meth) acrylate, n-tetradecyl (meth) acrylate, iso-tetradecyl (meth) acrylate, n-pentadecyl (meth) acrylate , Iso-pentadecyl (meth) acrylate, n-hexadecyl (meth) acrylate, iso-hexadecyl (meth) acrylate, n-octadecyl (meth) acrylate, iso-octadecyl (meth) acrylate, cyclohexyl (meth) acrylate, isobonyl (meth) ) Acrylate and the like. Most preferred among these are n-butyl methacrylate, n-dodecyl methacrylate, n-octyl methacrylate, and cyclohexyl methacrylate.
本発明の高分子化合物において、疎水性ユニットを有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｃ）から誘導される部分の割合は、特に制限されるものではないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して０〜９０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは０〜７０ｍｏｌ％である。割合が上限値を越えると生理活性物質の非特異的吸着が多くなる恐れがある。 In the polymer compound of the present invention, the proportion of the portion derived from the ethylenically unsaturated polymerizable monomer (c) having a hydrophobic unit is not particularly limited, but the repeating unit of all monomers in the polymer is not limited. 0 to 90 mol% is preferable with respect to the total number, more preferably 0 to 80 mol%, and most preferably 0 to 70 mol%. If the ratio exceeds the upper limit, non-specific adsorption of the physiologically active substance may increase.
末端に反応性官能基を導入する方法は特に限定されるものではないが、反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）の存在下、少なくともアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ａ）および生理活性物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー（ｂ）を溶媒中でラジカル共重合する方法が簡便で好ましい。反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）が連鎖移動剤として働くため、末端に反応性官能基を有する高分子化合物が得られる。反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）は特に限定されるものではないが、下記の一般式［３］で表されるメルカプトシラン化合物が好ましい。
式［３］でアルキル基Ｒ4の炭素数は１〜２０であり、より好ましくは１〜５であり、最も好ましくは１〜３である。Ａ１、Ａ２、Ａ３の内、少なくとも１個は反応性部位であり、その他はアルキル基を示す。反応性部位としては、アルコキシル基、ハロゲン基、アミノ基、イソシアネート基、フェノキシ基、水酸基などが挙げられるが、中でもシラノール基を生成しやすい点からアルコキシル基が最も好ましい。また、ポリマーの長期保存が必要な場合に、保存性が良い点からは、反応性官能基内の反応性部位は１つであることが好ましい。 In the formula [3], the alkyl group R 4 has 1 to 20 carbon atoms, more preferably 1 to 5 carbon atoms, and most preferably 1 to 3 carbon atoms. At least one of A 1 , A 2 , and A 3 is a reactive site, and the other represents an alkyl group. Examples of the reactive site include an alkoxyl group, a halogen group, an amino group, an isocyanate group, a phenoxy group, and a hydroxyl group. Among them, an alkoxyl group is most preferable because it easily generates a silanol group. When long-term storage of the polymer is required, it is preferable that the number of reactive sites in the reactive functional group is one from the viewpoint of good storage stability.
アルコキシル基を有するメルカプトシラン化合物としては、たとえば（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）トリエトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジエトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシラン、（メルカプトメチル）トリメトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジメトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルメトキシシラン、（メルカプトメチル）トリエトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジエトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルエトキシシランなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。入手性から（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシランや（３-メルカプトプロピル）トリエトキシシランが好ましい。中でも、ポリマーの長期保存が必要な場合に、保存性が良い点から、（３−メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシラン、（３−メルカプトプロピル）ジメチルメトキシシランがより好ましい。これらのメルカプトシラン化合物は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。 Examples of mercaptosilane compounds having an alkoxyl group include (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane, (3-mercaptopropyl) methyldimethoxysilane, (3-mercaptopropyl) dimethylmethoxysilane, and (3-mercaptopropyl) triethoxysilane. , (3-mercaptopropyl) methyldiethoxysilane, (3-mercaptopropyl) dimethylethoxysilane, (mercaptomethyl) trimethoxysilane, (mercaptomethyl) methyldimethoxysilane, (mercaptomethyl) dimethylmethoxysilane, (mercaptomethyl) Examples include, but are not limited to, triethoxysilane, (mercaptomethyl) methyldiethoxysilane, (mercaptomethyl) dimethylethoxysilane, and the like. From the availability, (3-mercaptopropyl) trimethoxysilane and (3-mercaptopropyl) triethoxysilane are preferred. Among these, (3-mercaptopropyl) dimethylethoxysilane and (3-mercaptopropyl) dimethylmethoxysilane are more preferable from the viewpoint of good storage stability when long-term storage of the polymer is required. These mercaptosilane compounds are used alone or in combination of two or more.
重合時の溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーおよび反応性官能基を有するメルカプト化合物（ｄ）が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジメチルホルムアミド等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。プラスチック基体に該高分子化合物を塗布する場合は、エタノール、メタノールが基体を変性させないため好ましい。 As the solvent during polymerization, any solvent capable of dissolving each ethylenically unsaturated polymerizable monomer and the mercapto compound (d) having a reactive functional group may be used. For example, methanol, ethanol, t-butyl alcohol, benzene, toluene , Tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, chloroform, dimethylformamide and the like. These solvents are used alone or in combination of two or more. When the polymer compound is applied to a plastic substrate, ethanol and methanol are preferable because they do not denature the substrate.
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，
２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１−カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
The polymerization initiator may be any ordinary radical initiator, for example, 2,
Examples include azo compounds such as 2′-azobisisobutylnitrile (hereinafter referred to as “AIBN”), 1,1′-azobis (cyclohexane-1-carbonitrile), organic peroxides such as benzoyl peroxide and lauryl peroxide. be able to.
本発明の高分子化合物の化学構造は、少なくともアルキレングリコール残基および生理活性物質を固定化する官能基を有する各エチレン系不飽和重合性モノマーからなる共重合体であって、少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有するものであれば、その結合方式はランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。 The chemical structure of the polymer compound of the present invention is a copolymer composed of each ethylenically unsaturated polymerizable monomer having at least an alkylene glycol residue and a functional group for immobilizing a physiologically active substance, at least at one end. As long as it has a reactive functional group, the bonding method may be random, block, graft or the like.
本発明の高分子化合物の分子量は、基体に均一に塗布しやすくなり、かつ高分子化合物と未反応のエチレン系不飽和重合性モノマーとの分離精製が容易になることから、数平均分子量は３，０００以上1，０００，０００以下が好ましく、５，０００以上５００，０００以下がより好ましい。なお、ここで、数平均分子量はＮＭＲ測定の解析により求めた組成を基に、全ての高分子の片側の末端に反応性官能基が導入されていると仮定して算出したものである。 The molecular weight of the polymer compound of the present invention is such that the number average molecular weight is 3 because it is easy to apply uniformly to a substrate and the polymer compound and unreacted ethylenically unsaturated polymerizable monomer are easily separated and purified. 1,000 to 1,000,000 is preferable, and 5,000 to 500,000 is more preferable. Here, the number average molecular weight is calculated on the basis of the composition obtained by analysis of NMR measurement, assuming that a reactive functional group is introduced at one end of all polymers.
本発明の高分子化合物は、基体表面を該高分子化合物で被覆することにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、特定の生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。さらに、末端の反応性基が基体と結合しうることから、該高分子化合物を化学的にグラフトすることができるため、基体洗浄による信号低下のおそれがない。 The polymer compound of the present invention easily imparts the property of suppressing nonspecific adsorption of a physiologically active substance and the property of immobilizing a specific physiologically active substance by coating the substrate surface with the polymer compound. Is possible. Furthermore, since the reactive group at the end can be bonded to the substrate, the polymer compound can be chemically grafted, so there is no risk of signal degradation due to substrate washing.
基体表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５重量％以上の濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基体表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。なお、高分子化合物が液体の場合は高分子単体を基体表面に塗布しても良い。有機溶剤としてはエタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、酢酸メチル等の単独溶媒またはこれらの混合溶剤が使用される。中でも、基体がプラスチックの場合、エタノール、メタノールが基体を変性させないため好ましい。酸化ケイ素や金属および／または金属酸化物が基体の場合、基体の変性の恐れはほとんどなく、高分子化合物の溶解性と乾燥させやすさから選択してよい。 For coating the substrate surface with a polymer compound, for example, a polymer solution in which a polymer compound is dissolved in an organic solvent so as to have a concentration of 0.05% by weight or more is prepared, and a known method such as immersion or spraying is used. After coating on the surface of the substrate, drying is performed at room temperature or under heating. When the polymer compound is liquid, the polymer alone may be applied to the substrate surface. As the organic solvent, a single solvent such as ethanol, methanol, t-butyl alcohol, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, chloroform, acetone, methyl ethyl ketone, ethyl acetate, methyl acetate, or a mixed solvent thereof is used. In particular, when the substrate is plastic, ethanol and methanol are preferable because they do not denature the substrate. When silicon oxide or metal and / or metal oxide is a substrate, there is almost no possibility of modification of the substrate, and it may be selected from the solubility of the polymer compound and the ease of drying.
本発明の高分子化合物は末端の反応性官能基を用いて基体と共有結合させることができる。結合させる条件は官能基に応じて任意に選択することができる。例えば、末端にアルコキシシランを有する高分子化合物の場合、加水分解により生成されたシラノール基が、基体表面の水酸基、アミノ基、カルボニル基、シラノール基等と脱水縮合して共有結合を形成する。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、基体表面にグラフトされた高分子化合物は容易に溶解したり、基体から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。高分子化合物が熱により変成されない温度範囲内、例えば、６０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。 The polymer compound of the present invention can be covalently bonded to the substrate using a terminal reactive functional group. The bonding conditions can be arbitrarily selected according to the functional group. For example, in the case of a polymer compound having an alkoxysilane at the terminal, a silanol group produced by hydrolysis is dehydrated and condensed with a hydroxyl group, amino group, carbonyl group, silanol group, etc. on the surface of the substrate to form a covalent bond. Since the covalent bond formed by the dehydration condensation of the silanol group has the property of being hardly hydrolyzed, the polymer compound grafted on the surface of the substrate is not easily dissolved or detached from the substrate. The dehydration condensation of silanol groups is promoted by heat treatment. Heat treatment is preferably performed within a temperature range where the polymer compound is not denatured by heat, for example, at 60 to 120 ° C. for 5 minutes to 24 hours.
エタノールやメタノールなど極性の高い有機溶剤を用いる場合や、高分子化合物自体の親水性が高い場合は、溶剤に含まれる水分や塗布後空気中の水分により、高分子末端のアルコキシシリル基の加水分解が生じるため、特別な加水分解工程を施さなくとも、基体を加熱するだけでグラフト化することができることが多い。加水分解が不足する場合は、有機溶剤中に水を含有させた混合溶液を用いてもよい。理論上加水分解によりシラノール基を生成するのに必要な水が供給されれば十分であるが、溶液の調製の容易さを考えると、含水量を１５重量％以下にするのが好ましい。含水量が多くなると高分子化合物が溶媒に不溶となる恐れがある。 When a highly polar organic solvent such as ethanol or methanol is used, or when the polymer compound itself is highly hydrophilic, hydrolysis of the alkoxysilyl group at the polymer end is caused by moisture contained in the solvent or moisture in the air after coating. Therefore, it is often possible to perform grafting only by heating the substrate without performing a special hydrolysis step. When the hydrolysis is insufficient, a mixed solution containing water in an organic solvent may be used. Theoretically, it is sufficient if water necessary for generating silanol groups by hydrolysis is supplied, but considering the ease of preparing the solution, the water content is preferably 15% by weight or less. When the water content increases, the polymer compound may become insoluble in the solvent.
本発明に使用する基体の素材は、酸化ケイ素、プラスチック、金属及び／または金属酸化物その他を用いることができるが、板や容器の形状で用いる場合には、表面処理の容易性、量産性の観点から、プラスチックが好ましく、中でも熱可塑性樹脂がより好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものが好ましく、たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。一方、粒子形状で用いる場合には、酸化ケイ素や金属及び／または金属酸化物が操作性の良さの点から好ましい。 The base material used in the present invention may be silicon oxide, plastic, metal and / or metal oxide, etc., but when used in the form of a plate or container, the surface treatment is easy and mass-productive. From the viewpoint, a plastic is preferable, and a thermoplastic resin is more preferable. As the thermoplastic resin, those having a small amount of fluorescence generation are preferable, for example, linear polyolefins such as polyethylene and polypropylene, cyclic polyolefins, fluorine-containing resins, etc. are preferably used, heat resistance, chemical resistance, low fluorescence, It is more preferable to use a saturated cyclic polyolefin that is particularly excellent in moldability. Here, the saturated cyclic polyolefin refers to a saturated polymer obtained by hydrogenating a polymer having a cyclic olefin structure or a copolymer of a cyclic olefin and an α-olefin. On the other hand, when used in the form of particles, silicon oxide and metal and / or metal oxide are preferred from the viewpoint of good operability.
該高分子化合物を基体にグラフトさせるには、基体表面に高分子化合物と反応しうる官能基があればそのまま使用できるが、それがない場合もしくは乏しい場合は、基体表面を活性化することが好ましい。活性化する方法は特に限定されるものではないが、表面処理剤としてアルコキシシランを用いる方法や酸・アルカリにより処理する方法、酸素雰囲気下、アルゴン雰囲気下、窒素雰囲気下、空気雰囲気下などの条件下でプラズマ処理する方法、ＡｒＦ、ＫｒＦなどのエキシマレーザーで処理する方法等が挙げられる。基体が粒子である場合、表面全体を均一に活性化できることから、表面処理剤としてアルコキシシランを用いる方法及び／又は酸・アルカリにより処理する方法が好ましい。 In order to graft the polymer compound onto the substrate, it can be used as it is if there is a functional group capable of reacting with the polymer compound on the substrate surface. However, if there is no functional group, it is preferable to activate the substrate surface. . The activation method is not particularly limited, but a method using an alkoxysilane as a surface treatment agent, a method using an acid / alkali, a condition such as an oxygen atmosphere, an argon atmosphere, a nitrogen atmosphere, or an air atmosphere. Examples thereof include a plasma treatment method below, and a treatment method using an excimer laser such as ArF or KrF. When the substrate is particles, the entire surface can be activated uniformly. Therefore, a method using alkoxysilane as a surface treatment agent and / or a method using an acid / alkali is preferable.
本発明の高分子化合物を基体に塗布することで容易に基体に生理活性物質の非特異的吸着を抑制された医療材料用基材を作製できる。また、該高分子化合物は化学結合により基体に結合させることができるので、洗浄工程での流出がない。これらのことより、該高分子化合物を塗布した基体は医療材料用基材に好適に用いることができる。 By applying the polymer compound of the present invention to a substrate, a substrate for medical material in which nonspecific adsorption of a physiologically active substance on the substrate can be easily produced. Further, since the polymer compound can be bonded to the substrate by chemical bonding, there is no outflow in the washing step. Based on these facts, the substrate coated with the polymer compound can be suitably used as a medical material substrate.
さらに、前記基体には各種の生理活性物質を固定化することができる。固定化する生理活性物質は核酸、アプタマー、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質、ビオチンなどがある。例えば核酸を固定化する場合は、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入することが好ましい。アミノ基の導入位置は分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端にアミノ基が導入されていることが好ましい。固定化方法は点着、液中での反応など、基体・生理活性物質・それを固定化する官能基に応じて任意に選択することができる。 Furthermore, various physiologically active substances can be immobilized on the substrate. Examples of the physiologically active substance to be immobilized include nucleic acids, aptamers, proteins, oligopeptides, sugar chains, glycoproteins, and biotin. For example, when immobilizing a nucleic acid, it is preferable to introduce an amino group in order to increase the reactivity with the active ester group. The amino group may be introduced at the end of the molecular chain or at the side chain, but the amino group is preferably introduced at the end of the molecular chain. The immobilization method can be arbitrarily selected according to the substrate, the physiologically active substance, and the functional group for immobilizing it, such as spotting or reaction in a liquid.
このように生理活性物質を固定化することによって得られた医療材料は、生理活性物質を利用した様々なバイオアッセイ用途、例えば免疫診断、遺伝子マイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、マイクロフルイディスクデバイスを含めた多くの分析システムやアフィニティクロマトグラフィ用担体、創薬用単体などにおいて使用することができる。 The medical material obtained by immobilizing the physiologically active substance in this way is used in various bioassay applications using the physiologically active substance, such as immunodiagnosis, gene microarray, protein microarray, and microfluidic device. It can be used in analysis systems, carriers for affinity chromatography, drug discovery alone, and the like.
（ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成）
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂株式会社製Ｂｌｅｎｍｅｒ ＰＥ−２００）を２０ｍLのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬工業株式会社製）及びクロロホルム２０ｍLの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１時間反応させた後、室温でさらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を得た。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が４．５単位含まれていることを確認した。
(Synthesis of p-nitrophenyloxycarbonyl-polyethylene glycol methacrylate (MEONP))
0.01 mol of polyethylene glycol monomethacrylate (Blenmer PE-200 manufactured by NOF Corporation) was dissolved in 20 mL of chloroform, and then cooled to -30 ° C. While maintaining at −30 ° C., 0.01 mol of p-nitrophenyl chloroformate (manufactured by Aldrich), 0.01 mol of triethylamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 20 mL of chloroform were added to this solution. The homogeneous solution of was slowly added dropwise. After reacting at −30 ° C. for 1 hour, the solution was further stirred at room temperature for 2 hours. Thereafter, salts were removed from the reaction solution by filtration, and the solvent was distilled off to obtain p-nitrophenyloxycarbonyl-polyethylene glycol methacrylate (MEONP). The obtained monomer was measured by 1H-NMR in deuterated chloroform solvent, and it was confirmed that 4.5 units of ethylene glycol residue was contained.
（高分子化合物の合成例）
メトキシエチルアクリレート（以下ＭＥＡと記載、和光純薬工業株式会社製）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下ＭＥＯＮＰと記載）をジメチルホルムアミドに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は１．５ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＭＥＡ、ＭＥＯＮＰの順に９７：３である。そこにさらに（３-メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシラン（以下ＭＰＤＥＳと記載）および２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下ＡＩＢＮと記載、和光純薬工業株式会社製）をそれぞれ０．０１０ｍｏｌ／Ｌ、０．００５ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、７５℃で２４時間反応させた後、反応溶液をエタノール中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物を重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、ＭＥＡの末端メトキシ基に帰属されるピーク、ＭＥＯＮＰのベンゼン環に帰属されるピーク、ＭＰＤＥＳのＳｉに結合したメチレンに帰属されるピーク、それぞれの積分値より、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
(Synthesis example of polymer compound)
Methoxyethyl acrylate (hereinafter referred to as MEA, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and p-nitrophenyloxycarbonyl-polyethylene glycol methacrylate (hereinafter referred to as MEONP) were dissolved in dimethylformamide to prepare a monomer mixed solution. The total monomer concentration is 1.5 mol / L, and the respective molar ratios are 97: 3 in the order of MEA and MEONP. Further, (3-mercaptopropyl) dimethylethoxysilane (hereinafter referred to as MPDES) and 2,2-azobisisobutyronitrile (hereinafter referred to as AIBN, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were each 0.010 mol / L. , 0.005 mol / L, and stirred until uniform. Then, after making it react at 75 degreeC under argon gas atmosphere for 24 hours, the reaction solution was dripped in ethanol and precipitation was collected. The obtained polymer compound was measured by 1H-NMR in a deuterated chloroform solvent. The peak attributed to the terminal methoxy group of MEA, the peak attributed to the benzene ring of MEONP, and the methylene bonded to Si of MPDES The composition ratio of the polymer compound was calculated from the peak and each integrated value. Table 1 shows the results.
《実施例》
平均粒径４０μｍのシリカビーズを合成例で得られた高分子化合物の５０ｗｔ％酢酸エチル溶液に浸漬し、ボルテックスミキサーでよく攪拌した。吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた後、１５０℃で２時間加熱処理を施した。
"Example"
Silica beads having an average particle diameter of 40 μm were immersed in a 50 wt% ethyl acetate solution of the polymer compound obtained in the synthesis example, and stirred well with a vortex mixer. The beads were collected by suction filtration and dried well, and then heat-treated at 150 ° C. for 2 hours.
（非特異吸着量評価）
前記高分子化合物塗布シリカビーズ２０ｍｇを１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ジメチルスルホキシド）で４０℃にて１晩処理し、ＭＥＯＮＰの不活性化を行った。よく乾燥させた後、３０ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液を１ｍＬ加え、４℃にて１時間処理した。その後、遠心分離を行い、上澄みの除去を行った。これにＰＢＳを加え、ボルテックスミキサーでよくリンスし、上澄みを除去する作業を３回繰り返した。そこにドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）１ｗｔ％のＰＢＳ溶液を２ｍＬ加え、１時間静置し、粒子表面に吸着したＢＳＡを剥がしとった。上澄みを回収してMｉｃｒｏ−ＢＣＡ法の測定試料とした。Mｉｃｒｏ−ＢＣＡ法はＰＩＥＲＣＥ社製Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡＴＭ Ｐｒｉｔｅｉｎ ＡｓｓａｙＫｉｔを用いて行った。この試薬は、希薄溶液中のタンパク質濃度（０．５〜２０μｇ／ｍＬ）を測定する試薬であり、タンパク質の存在下で第一銅イオンに着色錯体を形成させるためのキレート試薬として、ビシンコニン酸を利用している。この測定法の標準的なプロトコールに従ってサンプルを調整し、５６２ｎｍの吸光度により非特異吸着のＢＳＡ量を定量した。
(Non-specific adsorption amount evaluation)
20 mg of the polymer compound-coated silica beads were treated with 1 mol / L of 2-aminoethanol (solvent: dimethyl sulfoxide) at 40 ° C. overnight to inactivate MEONP. After drying well, 1 mL of 30 mg / mL bovine serum albumin (BSA) in PBS was added and treated at 4 ° C. for 1 hour. Then, centrifugation was performed and the supernatant was removed. PBS was added to this, and it rinsed well with the vortex mixer, and the operation | work which removes a supernatant was repeated 3 times. 2 mL of 1 wt% sodium dodecyl sulfonate (SDS) in PBS was added thereto and allowed to stand for 1 hour to remove the BSA adsorbed on the particle surface. The supernatant was collected and used as a measurement sample for the Micro-BCA method. The Micro-BCA method was performed using a Micro BCA ™ Pritin Assay Kit manufactured by PIERCE. This reagent is a reagent for measuring the protein concentration (0.5 to 20 μg / mL) in a dilute solution. Bicinchoninic acid is used as a chelating reagent for forming a colored complex with cuprous ions in the presence of protein. We are using. Samples were prepared according to the standard protocol of this measurement method, and the amount of non-specifically adsorbed BSA was quantified by absorbance at 562 nm.
（活性エステル当量の評価）
前項で得られたビーズを２０ｍｇ採取し、それぞれ２ｍＬの０．０１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に投入した。ボルテックスミキサーでよく撹拌後、室温にて１時間静置した。これらの操作によりＭＥＯＮＰのニトロフェノールを遊離させた。上澄み液を採取し、４００ｎｍの吸光度から活性エステル当量を算出した。
(Evaluation of active ester equivalent)
20 mg of the beads obtained in the previous section were collected and put into 2 mL of 0.01N aqueous sodium hydroxide solution. After thoroughly stirring with a vortex mixer, it was allowed to stand at room temperature for 1 hour. By these operations, nitrophenol of MEONP was released. The supernatant was collected, and the active ester equivalent was calculated from the absorbance at 400 nm.
《比較例》
実施例に用いたシリカビーズを、高分子化合物を塗布せずにそのまま用い、実施例と同様、非特異吸着量評価および活性エステル当量評価を行った。
《Comparative example》
The silica beads used in the examples were used as they were without applying the polymer compound, and the nonspecific adsorption amount evaluation and the active ester equivalent evaluation were performed in the same manner as in the examples.
表２に実施例および比較例のMｉｃｒｏ−ＢＣＡ法によるＢＳＡ吸着量を示した。表より明らかなように、本発明の粒子はシリカビーズに比較してＢＳＡ吸着量が格段に低下しており、タンパク質の非特異吸着が抑制されていることがわかる。 Table 2 shows the amount of BSA adsorbed by the Micro-BCA method of Examples and Comparative Examples. As is apparent from the table, the amount of BSA adsorbed in the particles of the present invention is significantly lower than that of silica beads, indicating that non-specific protein adsorption is suppressed.
表３に実施例および比較例の活性エステル当量を示した。表より明らかなように実施例の粒子には活性エステルが導入されており、生理活性物質を固定化することが可能であることがわかった。 Table 3 shows active ester equivalents of Examples and Comparative Examples. As is clear from the table, it was found that active particles were introduced into the particles of the examples, and it was possible to immobilize physiologically active substances.
Claims (28)
26. A method for producing a medical material according to claim 24 or 25, comprising the step of immobilizing a physiologically active substance on the medical material substrate obtained by the production method according to claim 26 or 27. Method.
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