JP2016180716A - Affinity bead - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、生理活性物質を固定化する機能を有する医療用粒子、生体分子の相互作用を分析するための分析用粒子、並びにそれらの製造方法に関する。 The present invention relates to medical particles having a function of immobilizing physiologically active substances, analytical particles for analyzing the interaction of biomolecules, and methods for producing them.
ポリマーでさまざまな粒子を被覆したポリマー被覆粒子は、工業分野で広く用いられてきただけでなく、近年においては基礎的な生物学や医療の分野においてその重要性が高まっている。例えばアフィニティークロマトグラフィーの担体への応用、医療における診断や薬物送達システム（ドラックデリバリーシステム、ＤＤＳ）、創薬用途などへの応用に対する関心が高まっている。創薬用途への応用例としては、例えば様々な粒子（担体）に固定されたリガンドと呼ばれる生理活性物質を介して特定のタンパク質などの生体分子を捕捉し、これを分離精製するものがある。 Polymer-coated particles obtained by coating various particles with a polymer have not only been widely used in the industrial field, but in recent years, their importance is increasing in the fields of basic biology and medicine. For example, there is an increasing interest in applications to affinity chromatography carriers, medical diagnosis, drug delivery systems (Drug Delivery Systems, DDS), and drug discovery applications. As an application example for drug discovery, for example, a biomolecule such as a specific protein is captured via a physiologically active substance called a ligand immobilized on various particles (carriers), and this is separated and purified.
粒子を担体として用いる際に求められる条件は、主には（１）穏和な条件下でリガンド、又はスペーサーを固定化できる官能基を有すること、またその固定化量が大きいこと、（２）粒子自体がタンパク質などの生体物質一般に対して非特異的吸着をしないこと、（３）目的・用途に応じた機械的強度を有すること、である。しかし、これらの条件を満たす粒子は未だ開発されていない。 The conditions required when using particles as a carrier are mainly (1) having a functional group capable of immobilizing a ligand or spacer under mild conditions, and having a large amount of immobilization, (2) particles They do not adsorb nonspecifically to biological substances such as proteins in general, and (3) have mechanical strength in accordance with the purpose and application. However, particles that satisfy these conditions have not been developed yet.
特に、リガンドの固定化量は担体の性能を左右する大きな要因であり、できるだけ大きな固定化量が要求される。リガンドの固定化量が大きくなれば、それに伴い捕捉するタンパク質の総量が増加するからである。特に、目的とするタンパク質がリガンドに捕捉されるタンパク質の中でもマイナーな成分である場合、固定化量が少ないとそれを発見できなくなる恐れもあるため、なおさらリガンド固定化量の大きな粒子が求められている。 In particular, the amount of ligand immobilization is a major factor that affects the performance of the carrier, and as much immobilization amount as possible is required. This is because as the amount of immobilized ligand increases, the total amount of protein to be captured increases accordingly. In particular, if the target protein is a minor component of the protein captured by the ligand, there is a risk that it may not be detected if the immobilization amount is small. Yes.
一方、捕捉したいタンパク質以外の成分の非特異的吸着を抑制することも極めて重要である。従来の粒子のうち、無機系のシリカゲル粒子は物理的強度の強い粒子で、多孔質であることから分離には良いとされているが、非特異的吸着の度合が高いという欠点があるため実際に使用されている例は極めて少ない。また、合成高分子系では、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物などでなる粒子が開発されているが、これらの高分子も生体関連物質の非特異的吸着が起こり易いという欠点がある。 On the other hand, it is also extremely important to suppress nonspecific adsorption of components other than the protein to be captured. Among the conventional particles, inorganic silica gel particles are particles with strong physical strength and are considered good for separation because they are porous, but they actually have the disadvantage of high degree of non-specific adsorption. Very few examples have been used. In the synthetic polymer system, particles made of polyacrylamide gel (trade name: Bio-GelP, Bio-Rad), polystyrene, ethylene-maleic anhydride copolymer, etc. have been developed. There is a drawback that non-specific adsorption of biological substances is likely to occur.
上記のように、粒子を医療用担体又は分析用担体として用いる場合には、非特異的吸着も問題になることが多い。そのため、それを回避するために様々な手法が検討されている。例えば、表面に目的の生理活性物質をつけたあと、残りの粒子表面をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の害の少ないタンパクを先に吸着させておくブロッキングの手法などがあるが、効果は十分ではない。また、表面がエポキシ基からなる粒子に特定のタンパク質と特異的に結合するＤＮＡを結合させ、タンパク質の精製用途に用いる例もある（例えば特許文献１）。この方法では、タンパク質の非特異吸着性が少ないという理由から、粒子表面へのエポキシ基導入にグリシジルメタクリレートなどを用いている。しかし、エポキシ基にＤＮＡ等生理活性物質を直接結合させる方法は、アルカリ条件下や高温条件下で反応させる必要があるなど相当厳しい反応条件を必要とする。このため、固定化させる生理活性物質がアルカリや高温で不安定な場合、固定化プロセスで生理活性物質が変質してしまう恐れがあるので不適当である。 As described above, when the particles are used as a medical carrier or an analytical carrier, nonspecific adsorption is often a problem. For this reason, various techniques are being studied to avoid this. For example, there is a blocking method in which a target physiologically active substance is attached to the surface, and then the remaining particle surface is first adsorbed with a less harmful protein such as bovine serum albumin (BSA). Absent. In addition, there is an example in which DNA that specifically binds to a specific protein is bound to particles having an epoxy group on the surface and used for protein purification (for example, Patent Document 1). In this method, glycidyl methacrylate or the like is used to introduce an epoxy group to the particle surface because of the low nonspecific adsorption property of the protein. However, the method of directly binding a physiologically active substance such as DNA to an epoxy group requires considerably severe reaction conditions such as a reaction under an alkaline condition or a high temperature condition. For this reason, when the physiologically active substance to be immobilized is unstable at an alkali or high temperature, the physiologically active substance may be altered during the immobilization process, which is inappropriate.
その他、粒子の非特異吸着低減方法としては、非特異吸着の少ないポリマー粒子を乳化重合法などで合成する例がある。例えば、特許文献２には、生理活性物質と反応可能な反応基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、ポリオキシアルキレン側鎖を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び疎水性を付与するエチレン系不飽和重合性ビニル芳香族モノマーを乳化重合法、又は懸濁重合法にて共重合し、粒子を得る方法が記載されている。しかし、このような方法では、得られる粒子径の制御が困難である。一般に、乳化重合法では、比較的均一な粒径を有する粒子が得られるものの、粒子径がサブミクロン程度のものしかできない。一方、懸濁重合法で得られる粒子は、粒子径分布が広く、例えばカラム用充填剤として用いるためには粒子を分級する必要があるが、特別な装置のない場合にはポリマー粒子を高度に分級することが難しい。しかも、得られる粒子のサイズが数十ミクロンから数百ミクロンであり、それよりも小さい径の粒子を合成することが難しい。さらに、重合で得られる粒子は、高分子であるがために担体としての強度に自ずと限界がある。粒子強度が求められる用途に使用する場合には、高分子中のエチレン系不飽和重合性ビニル芳香族モノマーの比率を上げるなど強度を上げるための処方を余儀なくされ、そのことは逆に非特異的吸着に不利であった。 In addition, as a method for reducing non-specific adsorption of particles, there is an example in which polymer particles with little non-specific adsorption are synthesized by an emulsion polymerization method or the like. For example, Patent Document 2 discloses an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a reactive group capable of reacting with a physiologically active substance, an ethylenically unsaturated polymerizable monomer having a polyoxyalkylene side chain, and an ethylenically unsaturated monomer imparting hydrophobicity. A method is described in which a saturated polymerizable vinyl aromatic monomer is copolymerized by an emulsion polymerization method or a suspension polymerization method to obtain particles. However, in such a method, it is difficult to control the particle size obtained. In general, the emulsion polymerization method can obtain particles having a relatively uniform particle diameter, but can only have a particle diameter of about submicron. On the other hand, particles obtained by the suspension polymerization method have a wide particle size distribution. For example, it is necessary to classify the particles for use as a packing material for a column. Difficult to classify. In addition, the size of the obtained particles is several tens to several hundreds of microns, and it is difficult to synthesize particles having a smaller diameter. Furthermore, since the particles obtained by polymerization are polymers, the strength as a carrier is naturally limited. When used in applications where particle strength is required, prescriptions are required to increase the strength, such as increasing the proportion of ethylenically unsaturated polymerizable vinyl aromatic monomer in the polymer, which is nonspecific. It was disadvantageous for adsorption.
粒子強度を確保しつつ、非特異吸着の少ない医療用粒子を得るには、物理的強度の強いシリカゲル粒子など、核となる粒子に高分子化合物を含む層を形成することで非特異吸着を抑制し、さらにはその高分子化合物で標的分子を捕捉する生理活性物質を固定化することが有効であると考えられる。そこで、本発明の第一の課題は、生理活性物質の固定化能力に優れ、非特異吸着の少ない医療用粒子を提供することである。また、本発明の第二の課題は、目的とする生体分子の捕捉能力に優れ、非特異的吸着の少ない分析用粒子を提供することである。
In order to obtain medical particles with low non-specific adsorption while ensuring particle strength, non-specific adsorption is suppressed by forming a layer containing a polymer compound on the core particles such as silica gel particles with strong physical strength. Furthermore, it is considered effective to immobilize a physiologically active substance that captures the target molecule with the polymer compound. Accordingly, a first object of the present invention is to provide medical particles that are excellent in the ability to immobilize physiologically active substances and have little nonspecific adsorption. A second object of the present invention is to provide particles for analysis that are excellent in the ability to capture target biomolecules and have less nonspecific adsorption.
本発明は以下の通りである。
（１）核となる粒子と、該粒子の表面に高分子化合物を含む層とを有する医療用粒子であって、下記式〔１〕を満たす、医療用粒子。
式〔１〕 Ａ／Ｂ≧０．８ｍｇ／平方メートル
Ａ：ＴＧ測定で求められる、核となる粒子１ｇ当たりの粒子の表面に高分子化合物を含む層の重量（ｍｇ）
Ｂ：核となる粒子１ｇあたりの表面積（平方メートル）
（２） 前記核となる粒子が無機材料を含む、（１）に記載の医療用粒子。
（３） 前記無機材料が酸化ケイ素である（１）または（２）に記載の医療用粒子。
（４） 前記高分子化合物が、シランカップリング剤を介して核となる粒子に結合している（１）ないし（３）に記載の医療用粒子。
（５）前記高分子化合物が、側鎖に非特異吸着抑制構造を有する第１ユニットと、側鎖の末端に生理活性物質を固定化しうる捕捉部を有する第２ユニットとを有する、（１）ないし（４）に記載の医療用粒子。
（６） 前記第１ユニットが、アルキレングリコール残基および／またはベタイン構造を含む（５）に記載の医療用粒子。
（７）前記第１ユニットが下記（化１）で表される、（５）または（６）に記載の医療用粒子。
（ 式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２はベタイン構造を有する官能基、水素原子、または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基またはその繰り返し構造を示す。 ただし、第１ユニット中にアルキレングリコール残基および／またはベタイン構造を含むものとする。）
（８） 前記第１ユニットが、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンいずれかに由来する、（５）ないし（７）のいずれかに記載の医療用粒子。
（９） 前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート及び／又はエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である（８）に記載の医療用粒子。
（１０） 前記第２ユニットが下記の（化２）で表される、（５）ないし（９）のいずれかに記載の医療用粒子。
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基を示す。ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。 Ｗは生理活性物質を固定化しうる基を示す。
（１１） 前記生理活性物質を固定化しうる基が、カルボキシル基、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、アミノオキシ基、ヒドラジド基及びビオチニル基から選ばれる少なくとも一つの官能基を有する（５）ないし（１０）に記載の医療用粒子。
（１２） 前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである、（１１）に記載の医療用粒子。
（１３）（１）（１２）いずれかに記載の医療用粒子の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを酸性溶液中で加水分解する工程、次いで前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランの酸性溶液中で核となる粒子を撹拌下、加熱する工程、及び乾燥後、更に加熱する工程、を含む医療用粒子の製造方法。
（１４） 更に、重合性官能基、または連鎖移動基を導入した核となる粒子と重合性モノマーを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程、及び乾燥する工程を含む（１３）に記載の医療用粒子の製造方法。
（１５） 前記重合反応がラジカル重合反応であることを特徴とする（１４）に記載の医療用粒子の製造方法。
（１６） （２）ないし（１２）に記載の医療用粒子に、その生理活性物質を固定化する官能基を介して生理活性物質を固定化したことを特徴とする分析用粒子。
（１７） 前記生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、プロテインＡ，プロテインＧ、リガンド、ペプチド、グルタチオン、低分子化合物、ビオチン、糖鎖、レクチン、糖脂質、及び糖タンパクよりなる群から選ばれる少なくとも一つである（１６）に記載の分析用粒子。
（１８）（１６）または（１７）に記載の分析用粒子の製造方法であって、（２）ないし（１２）に記載の医療用粒子に、生理活性物質をリン酸塩水溶液に溶解した溶液を接触させる工程を含む分析用粒子の製造方法。
（１９） 前記リン酸塩水溶液のリン酸塩濃度が０．１Ｍ以上５Ｍ以下である（１８）に記載の分析用粒子の製造方法。
（２０）（１６）または（１７）に記載の分析用粒子を、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより標的生体物質を回収することを特徴とする分析用粒子の使用方法。
The present invention is as follows.
(1) A medical particle having a particle serving as a nucleus and a layer containing a polymer compound on the surface of the particle, the medical particle satisfying the following formula [1].
Formula [1] A / B ≧ 0.8 mg / square meter A: Weight of the layer containing the polymer compound on the surface of the particle per 1 g of the core particle obtained by TG measurement (mg)
B: Surface area per gram of core particles (square meter)
(2) The medical particle according to (1), wherein the core particle includes an inorganic material.
(3) The medical particle according to (1) or (2), wherein the inorganic material is silicon oxide.
(4) The medical particle according to (1) to (3), wherein the polymer compound is bonded to a particle serving as a nucleus via a silane coupling agent.
(5) The polymer compound has a first unit having a nonspecific adsorption-inhibiting structure in a side chain, and a second unit having a capturing part capable of immobilizing a physiologically active substance at the end of the side chain. Thru | or medical particle | grains as described in (4).
(6) The medical particle according to (5), wherein the first unit includes an alkylene glycol residue and / or a betaine structure.
(7) The medical particle according to (5) or (6), wherein the first unit is represented by the following (Chemical Formula 1).
(Wherein R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group, R 2 represents a functional group having a betaine structure, a hydrogen atom, or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms. X represents —O—, —S—, —NH—. , -CO-, -CONH- represents a hydrocarbon chain having 0 to 20 carbon atoms, an alkylene glycol residue, or a repeating structure thereof, which may be interrupted by an alkylene glycol residue and / or a first unit. (Including betaine structure)
(8) The first unit is derived from any one of methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, ethoxypolyethylene glycol (meth) acrylate, and 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine, according to any one of (5) to (7). Medical particles.
(9) The medical particles according to (8), wherein an average number of ethylene glycol residues in the methoxypolyethylene glycol (meth) acrylate and / or ethoxypolyethylene glycol (meth) acrylate is 3 to 100.
(10) The medical particle according to any one of (5) to (9), wherein the second unit is represented by the following (Chemical Formula 2).
(Wherein R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, Y represents a hydrocarbon chain having 0 to 20 carbon atoms which may be interrupted by -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH-, Represents an alkylene glycol residue, q represents an integer of 1 to 100. When q is an integer of 2 to 100, the repeated Ys may be the same or different from each other. A group capable of immobilizing a physiologically active substance is shown.
(11) The group capable of immobilizing the physiologically active substance has at least one functional group selected from a carboxyl group, an aldehyde group, an active ester group, an epoxy group, a vinyl sulfone group, an aminooxy group, a hydrazide group, and a biotinyl group. (5) thru | or the medical particle as described in (10).
(12) The medical particle according to (11), wherein the active ester group is p-nitrophenyl ester or N-hydroxysuccinimide ester.
(13) The method for producing medical particles according to any one of (1) and (12), wherein the alkoxysilane having a polymerizable functional group or a chain transfer group is hydrolyzed in an acidic solution, and then the polymerization A method for producing medical particles, comprising a step of heating a particle as a nucleus in an acidic solution of an alkoxysilane having a functional functional group or a chain transfer group with stirring, and a step of further heating after drying.
(14) The method further includes a step of allowing the polymerization reaction to proceed by mixing the polymerizable functional group or the core particle into which the chain transfer group has been introduced and the polymerizable monomer in a solvent, and a step of drying. The manufacturing method of the medical particle as described.
(15) The method for producing medical particles according to (14), wherein the polymerization reaction is a radical polymerization reaction.
(16) A particle for analysis, wherein the bioactive substance is immobilized on the medical particle according to (2) to (12) via a functional group for immobilizing the bioactive substance.
(17) The group in which the physiologically active substance is a nucleic acid, aptamer, protein, antibody, antigen, protein A, protein G, ligand, peptide, glutathione, low molecular weight compound, biotin, sugar chain, lectin, glycolipid, and glycoprotein The analytical particle according to (16), which is at least one selected from:
(18) The method for producing analytical particles according to (16) or (17), wherein the bioactive substance is dissolved in a phosphate aqueous solution in the medical particles according to (2) to (12). The manufacturing method of the particle | grains for analysis including the process made to contact.
(19) The method for producing analytical particles according to (18), wherein the phosphate concentration of the aqueous phosphate solution is 0.1 M or more and 5 M or less.
(20) The analysis particle according to (16) or (17), wherein the analysis bioparticle is at least one solution selected from a target biomolecule solution, blood, plasma, serum, cell disruption solution, cell culture solution, and tissue disruption solution. A method of using particles for analysis, which comprises recovering a target biological material by bringing it into contact with water.
前記のとおり、核となる粒子の単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量を前記量に規定することにより、生理活性物質を効率的に固定化することができ、且つ非特異吸着を抑制した粒子を簡便に作製し、提供することが可能となった。 As described above, by prescribing the weight of the polymer compound contained per unit surface area of the core particle to the above amount, the physiologically active substance can be efficiently immobilized and non-specific adsorption is suppressed. The particles can be easily produced and provided.
以下、本発明の医療用粒子、分析用粒子、およびそれらの製造方法および使用方法について説明する。 Hereinafter, the medical particles and analytical particles of the present invention, and methods for producing and using them will be described.
本発明の医療用粒子は、生理活性物質の固定化能力に優れ、非特異吸着の少ない医療用粒子であって、核となる粒子に高分子化合物を含む層を形成がされている。ここで、筆者らは、核となる粒子の単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量を一定の値以上にすることで、効果的に非特異吸着を抑制し、Ｓ／Ｎ比を高めることができ、さらにはその高分子化合物で生理活性物質を固定化することができることを見出した。 The medical particles of the present invention are medical particles that are excellent in the ability to immobilize physiologically active substances and have little nonspecific adsorption, and a layer containing a polymer compound is formed on the core particles. Here, the authors effectively suppress non-specific adsorption and increase the S / N ratio by making the weight of the polymer compound contained per unit surface area of the core particles more than a certain value. It was also found that a physiologically active substance can be immobilized with the polymer compound.
具体的には、核となる粒子の単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量は、下記式〔１〕を満たすとよい。
式〔１〕 Ａ／Ｂ≧０．８ｍｇ／平方メートル
Ａ：ＴＧ測定で求められる、核となる粒子１ｇ当たりの粒子の表面に高分子化合物を含む層の重量（ｍｇ）
Ｂ：核となる粒子１ｇあたりの表面積（平方メートル）
ここでいうＴＧ測定とは、物質および基準物質の温度を調節されたプログラムに従って変化させながら、その物質の質量を温度の関数として測定する技法である。温度のプログラムは、典型的には室温から５００℃まで１０℃／ｍｉｎで上昇させた後、５００℃で１時間維持することなどが挙げられる。測定は空気を２００／ｍｉｎで供給しながら行われるのが好ましい。核となる粒子１ｇ当たりの粒子の表面に高分子化合物を含む層の重量は、前記ＴＧ測定において、初期重量と測定終了時の重量の差を、粒子表面に存在する高分子化合物を含む層の重量とみなすことで算出できる。
Specifically, the weight of the polymer compound contained per unit surface area of the core particles may satisfy the following formula [1].
Formula [1] A / B ≧ 0.8 mg / square meter A: Weight of the layer containing the polymer compound on the surface of the particle per 1 g of the core particle obtained by TG measurement (mg)
B: Surface area per gram of core particles (square meter)
The TG measurement here is a technique for measuring the mass of a substance and a reference substance as a function of temperature while changing the temperature of the substance and a reference substance according to a controlled program. The temperature program typically includes increasing the temperature from room temperature to 500 ° C. at 10 ° C./min, and then maintaining the temperature at 500 ° C. for 1 hour. The measurement is preferably performed while supplying air at 200 / min. The weight of the layer containing the polymer compound on the surface of the particle per 1 g of the core particle is the difference between the initial weight and the weight at the end of the measurement in the TG measurement. It can be calculated by considering it as weight.
一方、核となる粒子１ｇあたりの表面積は、粉体粒子の表面に吸着占有面積のわかったガス分子を吸着させ、その量から試料の比表面積を求めるＢＥＴ法で求めることができる。吸着占有面積のわかったガス分子とは典型的には窒素である。 On the other hand, the surface area per 1 g of core particles can be determined by the BET method in which gas molecules whose adsorption occupation area is known are adsorbed on the surface of the powder particles and the specific surface area of the sample is determined from the amount. The gas molecule whose adsorption occupation area is known is typically nitrogen.
核となる粒子の単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量が前記式〔１〕を満たすことにより、効果的に非特異吸着を抑制し、さらにはその高分子化合物で生理活性物質を固定化することが可能となる。これを実現する方法としては、核となる粒子にあらかじめ合成した高分子化合物を吸着させる方法、核となる粒子にあらかじめ合成した高分子化合物を化学的に結合させる方法などが挙げられるが、中でも、高分子化合物を生成するための官能基を、核となる粒子に導入し、この官能基を利用して粒子表面に高分子化合物を生成する方法が好ましい。高分子化合物を生成するための官能基としては、重合性官能基や連鎖移動基が挙げられ、ラジカル反応性の面から、ビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、メルカプト基であることがより好ましい。核となる粒子にこれらの官能基を導入する方法は特に限定されるものではないが、たとえばシリカ粒子に、これらの官能基を導入する場合、これらの官能基を有するシランカップリング剤をシリカ粒子表面に反応させることで達成できる。
なお、高分子化合物の吸着量は、Ａ／Ｂ≦５．０ｍｇ／平方メートルであることがさらに好ましい。５．０ｍｇ／平方メートルを超えても、十分な非特異吸着抑制能を担保できない。
When the weight of the polymer compound contained per unit surface area of the core particle satisfies the above formula [1], non-specific adsorption is effectively suppressed, and the physiologically active substance is immobilized with the polymer compound. It becomes possible to do. Examples of methods for realizing this include a method of adsorbing a pre-synthesized polymer compound to core particles, a method of chemically binding a pre-synthesized polymer compound to core particles, and the like. A method is preferred in which a functional group for producing a polymer compound is introduced into the core particle and the polymer compound is produced on the particle surface using this functional group. Examples of the functional group for producing the polymer compound include a polymerizable functional group and a chain transfer group. From the viewpoint of radical reactivity, the functional group may be a vinyl group, an allyl group, an acrylic group, a methacryl group, or a mercapto group. More preferred. The method for introducing these functional groups into the core particles is not particularly limited. For example, when these functional groups are introduced into silica particles, a silane coupling agent having these functional groups is added to the silica particles. This can be achieved by reacting with the surface.
In addition, the adsorption amount of the polymer compound is more preferably A / B ≦ 5.0 mg / square meter. Even if it exceeds 5.0 mg / square meter, sufficient nonspecific adsorption suppression ability cannot be secured.
前記高分子化合物は、生理活性物質が捕捉する標的生体物質以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制しうる第１ユニットと、官能基として側鎖の末端に生理活性物質を固定化する機能を有する第２ユニットと、を有することが好ましい。 The polymer compound has a first unit capable of suppressing non-specific adsorption of proteins other than the target biological substance captured by the physiologically active substance, and a function of immobilizing the physiologically active substance at the end of the side chain as a functional group And a second unit.
第１ユニットが、後述の生理活性物質によって捕捉可能な標的生体物質以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制する役割を果たす。 The first unit plays a role of suppressing non-specific adsorption of proteins other than the target biological substance that can be captured by the physiologically active substance described later.
また、第２ユニットが、側鎖の末端に生理活性物質を固定化する機能を有することにより、さまざまな生理活性物質を効率良く、かつ簡易に担体に結合することを可能とする。これにより、該標的生体物質を特異的に捕捉できるようになる。 Further, since the second unit has a function of immobilizing the physiologically active substance at the end of the side chain, various physiologically active substances can be efficiently and easily bound to the carrier. As a result, the target biological substance can be specifically captured.
生理活性物質によって捕捉可能な物質以外のタンパク質等の非特異吸着を抑制しうる第１ユニットとしては、例えば、側鎖にアルキレングリコール残基、水酸基、ベタイン構造などを有するユニットが挙げられ、特に非特異吸着性が高いという観点からアルキレングリコール残基および／またはベタイン構造を有するものが好ましい。 Examples of the first unit capable of suppressing non-specific adsorption of proteins other than substances that can be captured by a physiologically active substance include units having an alkylene glycol residue, hydroxyl group, betaine structure, etc. in the side chain. From the viewpoint of high specific adsorption, those having an alkylene glycol residue and / or a betaine structure are preferred.
第１ユニットは、さらには、（化１）で表わされる構造のものが好ましい。
（ 式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２はベタイン構造を有する官能基、水素原子、または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基またはその繰り返し構造を示す。 ただし、第１ユニット中にアルキレングリコール残基および／またはベタイン構造を含むものとする。）
Further, the first unit preferably has a structure represented by (Chemical Formula 1).
(Wherein R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group, R 2 represents a functional group having a betaine structure, a hydrogen atom, or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms. X represents —O—, —S—, —NH—. , -CO-, -CONH- represents a hydrocarbon chain having 0 to 20 carbon atoms, an alkylene glycol residue, or a repeating structure thereof, which may be interrupted by an alkylene glycol residue and / or a first unit. (Including betaine structure)
アルキレングルコール残基を有する第１ユニットを構成するための、由来元のモノマーとしては、例えば、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコールメタクリレート；２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基の一置換エステルの（メタ）アクリレート類；グリセロールモノ（メタ）アクリレート；ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート；２−メトキシエチル（メタ）アクリレート；２−エトキシエチル（メタ）アクリレート；メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート；エトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、アッセイ時の非特異的吸着の少なさ及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレート又はエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。 Examples of the origin monomer for constituting the first unit having an alkylene glycol residue include methoxy polyethylene glycol (meth) acrylate, ethoxy polyethylene glycol methacrylate; 2-hydroxyethyl (meth) acrylate, 2-hydroxy (Meth) acrylates of mono-substituted hydroxyl groups such as propyl (meth) acrylate and 2-hydroxybutyl (meth) acrylate; glycerol mono (meth) acrylate; (meth) acrylate having polypropylene glycol as a side chain; 2-methoxy Examples include ethyl (meth) acrylate; 2-ethoxyethyl (meth) acrylate; methoxydiethylene glycol (meth) acrylate; ethoxydiethylene glycol (meth) acrylate, and the like. Methoxy polyethylene glycol methacrylate or ethoxy polyethylene glycol methacrylate from lack and availability of non-specific adsorption of at Say are preferred.
前記メトキシポリエチレングリコールメタクリレート又はエトキシポリエチレングリコールメタクリレートの、エチレングリコール残基の平均繰り返し数は、モノマーの入手性と反応性の観点から、３〜１００が好ましい。 The average number of ethylene glycol residue repeats in the methoxypolyethylene glycol methacrylate or ethoxypolyethylene glycol methacrylate is preferably 3 to 100 from the viewpoint of monomer availability and reactivity.
ベタイン構造を有する第１ユニットを構成するための、由来元のモノマーとしては、例えばカルボキシベタイン系モノマー、スルホベタイン系モノマー、ホスホベタイン系モノマー、ホスホリルコリン系モノマーなどが挙げられる。 Examples of the origin monomer for constituting the first unit having a betaine structure include a carboxybetaine monomer, a sulfobetaine monomer, a phosphobetaine monomer, and a phosphorylcholine monomer.
カルボキシベタイン系モノマーの具体例としては、例えばジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−カルボキシラトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−カルボキシラトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（４−カルボキシラトブチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（４−カルボキシラトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（カルボキシラトメチル）アミニウム等が挙げられる。 Specific examples of the carboxybetaine monomer include, for example, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-carboxylatoethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (2-carboxylatoethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyl). Oxyethyl) (3-carboxylatopropyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (3-carboxylatopropyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (4-carboxylatobutyl) aminium, dimethyl (2- Acryloyloxyethyl) (4-carboxylatobutyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (carboxylatomethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (cal Kishiratomechiru) aminium, and the like.
スルホベタイン系モノマーの具体例としては、例えばジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−スルホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−スルホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（４−スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（４−スルホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（スルホナトメチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（スルホナトメチル）アミニウム等が挙げられる。 Specific examples of the sulfobetaine monomer include dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-sulfonatoethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (2-sulfonatoethyl) aminium, and dimethyl (2-methacryloyl). Oxyethyl) (3-sulfonatopropyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (3-sulfonatopropyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (4-sulfonatobutyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxy) Ethyl) (4-sulfonatobutyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (sulfonatomethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (sulfonatomethyl) aminium, etc. It is.
ホスホベタイン系モノマーの具体例としては、例えばジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（２−ホスホナトエチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（３−ホスホナトプロピル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（４−ホスホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（４−ホスホナトブチル）アミニウム、ジメチル（２−メタクリロイルオキシエチル）（ホスホナトメチル）アミニウム、ジメチル（２−アクリロイルオキシエチル）（ホスホナトメチル）アミニウム等が挙げられる。 Specific examples of the phosphobetaine monomer include, for example, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (2-phosphonatoethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (2-phosphonatoethyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) ( 3-phosphonatopropyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (3-phosphonatopropyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (4-phosphonatobutyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (4 -Phosphonatobutyl) aminium, dimethyl (2-methacryloyloxyethyl) (phosphonatomethyl) aminium, dimethyl (2-acryloyloxyethyl) (phosphonatomethyl) aminium, etc. It is.
また、ホスホリルコリン系モノマーの具体例としては、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン等が挙げられる。 Specific examples of the phosphorylcholine monomer include, for example, 2- (meth) acryloyloxyethyl phosphorylcholine, 2- (meth) acryloyloxyethoxyethyl phosphorylcholine, 6- (meth) acryloyloxyhexyl phosphorylcholine, 10- (meth) acryloyloxy. Examples thereof include ethoxynonyl phosphorylcholine, 2- (meth) acryloyloxypropyl phosphorylcholine, 2- (meth) acryloyloxybutyl phosphorylcholine and the like.
これらの中でも、アッセイ時の非特異的吸着の少なさ及び入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。 Among these, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine is preferred because of its low non-specific adsorption during assay and availability.
側鎖の末端に生理活性物質を固定化しうる捕捉部を有する第２ユニットとしては、例えば、下記（化２）で示されるように、生理活性物質を固定化しうる捕捉部が−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基を介して結合した化合物であることが挙げられる。
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基を示す。ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。 Ｗは生理活性物質を固定化しうる基を示す。
As a 2nd unit which has a capture part which can fix a physiologically active substance to the terminal of a side chain, as shown by the following (chemical formula 2), the capture part which can fix a physiologically active substance is -O-,- Examples thereof include a compound bonded via a hydrocarbon chain having 0 to 20 carbon atoms and an alkylene glycol residue, which may be interrupted by S-, -NH-, -CO-, -CONH-.
(Wherein R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, Y represents a hydrocarbon chain having 0 to 20 carbon atoms which may be interrupted by -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH-, Represents an alkylene glycol residue, q represents an integer of 1 to 100. When q is an integer of 2 to 100, the repeated Ys may be the same or different from each other. A group capable of immobilizing a physiologically active substance is shown.
前記（化２）中のＹがアルキレン基である場合、ｑは１〜１００の整数であり、好ましくは１〜２０であり、より好ましくは１〜１０であり、最も好ましくは１〜６である。ｑの値が前記範囲内であることにより、タンパク質等の非特異吸着抑制に優れる。 When Y in the above (Chemical Formula 2) is an alkylene group, q is an integer of 1 to 100, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and most preferably 1 to 6. . When the value of q is within the above range, it is excellent in suppressing nonspecific adsorption of proteins and the like.
前記（化２）中のＹがアルキレングリコール残基である場合、アルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。炭素数が前記範囲内であると、特にタンパク質等の非特異吸着抑制に優れる。
また、アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、好ましくは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは４〜９０の整数である。前記繰り返し数ｑが前記範囲内であると、特にタンパク質等の非特異吸着抑制に優れる。
When Y in the above (Chemical Formula 2) is an alkylene glycol residue, the alkylene glycol residue Y has 1 to 10 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms, more preferably 2 to 4 carbon atoms, Preferably it is 2-3, and most preferably. When the carbon number is within the above range, it is particularly excellent in suppressing nonspecific adsorption of proteins and the like.
Further, the repeating number q of the alkylene glycol residue Y is not particularly limited, but is preferably an integer of 1 to 100, more preferably an integer of 2 to 100, still more preferably 2 to 95. It is an integer, most preferably an integer of 4 to 90. When the repeat number q is within the above range, it is particularly excellent in suppressing nonspecific adsorption of proteins and the like.
前記（化２）中の生理活性物質を固定化しうる基Ｗは、カルボキシル基、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、アミノオキシ基、ヒドラジド基及びビオチニル基から選ばれる少なくとも一つの官能基が好ましい。なお、これらの基は保護基で保護されていてもよく、生理活性物質を固定化する際に脱保護して使用しても構わない。 The group W capable of immobilizing the physiologically active substance in (Chemical Formula 2) is at least one selected from a carboxyl group, an aldehyde group, an active ester group, an epoxy group, a vinyl sulfone group, an aminooxy group, a hydrazide group, and a biotinyl group. Functional groups are preferred. These groups may be protected by a protecting group, and may be used after deprotection when immobilizing a physiologically active substance.
本発明の使用する「活性エステル」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステルとして知られている。 The “active ester” used in the present invention is an ester group having a highly acidic electron-attracting group at one substituent of the ester group and activated for a nucleophilic reaction, that is, a high reaction activity. As an ester group, it is commonly used in various chemical synthesis fields such as polymer chemistry and peptide synthesis. Actually, phenol esters, thiophenol esters, N-hydroxyamine esters, esters of heterocyclic hydroxy compounds, and the like are known as active esters having much higher activity than alkyl esters and the like.
このような活性エステルとしては、たとえばｐ−ニトロフェニル活性エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル、コハク酸イミド活性エステル、フタル酸イミド活性エステル、5−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル等が挙げられるが、保存安定性と反応性のバランスからｐ−ニトロフェニル活性エステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルが好ましい。 Examples of such an active ester include p-nitrophenyl active ester, N-hydroxysuccinimide active ester, succinimide active ester, phthalimide active ester, 5-norbornene-2, 3-dicarboximide active ester, and the like. Although mentioned, p-nitrophenyl active ester or N-hydroxysuccinimide active ester is preferable from the balance of storage stability and reactivity.
これら活性エステルは、活性エステルを有するモノマーを重合することで高分子化合物に組み込んでもよいし、あるいは、活性エステルを導入しうる官能基を有する高分子化合物をあらかじめ合成しておき、後から活性エステルを導入してもよい。 These active esters may be incorporated into a polymer compound by polymerizing a monomer having an active ester, or a polymer compound having a functional group capable of introducing an active ester is synthesized in advance, and the active ester is later May be introduced.
前記高分子化合物の第１ユニットと、第２ユニットとの共重合比（第１ユニット／第２ユニット）は、特に限定されないが、例えば９７／３〜５／９５であることが挙げられ、特に９０／１０〜１０／９０であることが好ましい。共重合比が前記範囲内であると、特に非特異吸着を効果的に抑制するとともに、生理活性物質を固定化する効果に優れる。 The copolymerization ratio (first unit / second unit) between the first unit and the second unit of the polymer compound is not particularly limited, and is, for example, 97/3 to 5/95. It is preferable that it is 90/10-10/90. When the copolymerization ratio is within the above range, non-specific adsorption is particularly effectively suppressed and the effect of immobilizing a physiologically active substance is excellent.
また、前記高分子化合物は第１ユニットと、第２ユニットの他に、核となる粒子に該高分子化合物を吸着させやすくする部分を有するユニットや化学的に結合させるための官能基を有するユニットと含んでいてもよい。これらは、核となる粒子の組成や表面に存在する官能基に応じて適宜選択することができる。 In addition to the first unit and the second unit, the polymer compound includes a unit having a part that facilitates adsorption of the polymer compound to particles serving as a nucleus, and a unit having a functional group for chemically bonding. May be included. These can be appropriately selected according to the composition of the core particles and the functional groups present on the surface.
前記共重合比は、例えばＸ線光電子分光分析（ＸＰＳ）で元素組成を評価することで算出できる。 The copolymerization ratio can be calculated, for example, by evaluating the elemental composition by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS).
本発明の高分子化合物の化学構造は、その結合方式がランダム、ブロック、グラフトなどの形態であることが挙げられ、なかでも、第１繰り返しユニットと第２繰り返しユニットを含むランダム共重合体であることが好ましい。これにより、第２繰り返しユニットの側鎖の末端に存在する活性エステルが分散するために、有効に作用することができる。 The chemical structure of the polymer compound of the present invention is such that the bonding system is in the form of random, block, graft or the like, and is a random copolymer including a first repeating unit and a second repeating unit. It is preferable. Thereby, since the active ester which exists in the terminal of the side chain of a 2nd repeating unit disperse | distributes, it can act effectively.
前記高分子化合物の重量平均分子量は、特に限定されないが、例えば５０００〜１００００００であることが挙げられ、特に１００００〜１０００００であることが好ましい。重量平均分子量が前記範囲内であると、合成時のハンドリングがよく、また、タンパク質等の非特異吸着を効果的に抑制することができる。 Although the weight average molecular weight of the said high molecular compound is not specifically limited, For example, it is 5000-1 million, for example, It is especially preferable that it is 10000-100,000. When the weight average molecular weight is within the above range, handling during synthesis is good, and nonspecific adsorption of proteins and the like can be effectively suppressed.
前記粒子の基材は、特に限定されるものではなく、有機材料、無機材料を問わず用いることができる。有機材料としては、例えばアフィニティークロマトグラフィーの担体として用いられる多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の他に、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチル、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、アクリル系樹脂等の各種樹脂材料等が挙げられる。また、無機材料としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、アルミニウムおよびこれらの合金や無機酸化物等が挙げられる。
これらの中でも無機材料が粒子自体の強度が高い点で好ましく、さらに酸化ケイ素が取り扱いやすく最も好ましい。また、酸化ケイ素を担体として用いると、Si-O結合が疎水性低分子化合物の吸着を抑制することが知られており好ましい（文献 特開2008-107310参照）。
The base material of the particles is not particularly limited, and any organic material or inorganic material can be used. As the organic material, for example, in addition to porous agarose particles (trade name: Sepharose) and dextran particles (trade name: Sephadex) used as carriers for affinity chromatography, polyacrylamide gel (trade name: Bio-Gel P, Biorad), polystyrene, ethylene-maleic anhydride copolymer, polymethyl methacrylate, polyolefin, polystyrene, polyethylene, polycarbonate, polyamide, acrylic resin, and various resin materials. Examples of the inorganic material include gold, silver, platinum, palladium, iridium, rhodium, osmium, iron, copper, cobalt, aluminum, and alloys and inorganic oxides thereof.
Among these, inorganic materials are preferable in view of high strength of the particles themselves, and silicon oxide is most preferable because it is easy to handle. Further, when silicon oxide is used as a carrier, it is known that a Si—O bond suppresses adsorption of a hydrophobic low molecular compound (refer to Japanese Patent Laid-Open No. 2008-107310).
本発明の医療用粒子の平均粒径は、目的および用途に応じて適宜選択される。特に、無機物の場合、粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で有機物の粒子を製造する方法に比較して、粒径の制御が容易である。 The average particle diameter of the medical particles of the present invention is appropriately selected according to the purpose and application. In particular, in the case of an inorganic substance, the particle diameter can be easily controlled as compared with a method of producing organic particles by emulsion polymerization or suspension polymerization in which it is difficult to control the particle diameter.
具体的に、本発明の分析用担体に用いる粒子の粒径としては、用途によっても異なるが、一般的に平均粒径が数ｎｍ〜１００μｍ程度のものが挙げられ、１００ｎｍ〜５０μｍが好ましく、１μｍ〜４０μｍがさらに好ましい。前記担体の平均粒径が前記範囲内であると、特に生理活性物質の固定化量とハンドリングの良さとのバランスに優れる。このような平均粒径は、例えば粒度分布計で測定することができる。また、形状が多孔質になると、比表面積が大きくなり、表面に含まれる高分子化合物の量を増加させることが出来る。この孔径の大きさは、１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましく、５ｎｍ以上１００ｎｍ以下であることがさらに好ましい。この範囲にあることで、 、十分な比表面積を担保し、かつ標的生体分子を効果的に捕捉することが可能となる。 Specifically, the particle size of the particles used in the analytical carrier of the present invention varies depending on the application, but generally includes particles having an average particle size of about several nm to 100 μm, preferably 100 nm to 50 μm, preferably 1 μm. More preferably, it is ˜40 μm. When the average particle size of the carrier is within the above range, the balance between the amount of the physiologically active substance immobilized and the good handling is excellent. Such an average particle diameter can be measured with a particle size distribution meter, for example. Moreover, when the shape is porous, the specific surface area is increased, and the amount of the polymer compound contained on the surface can be increased. The pore size is preferably 1 nm to 200 nm, more preferably 5 nm to 100 nm. By being in this range, it becomes possible to ensure a sufficient specific surface area and effectively capture the target biomolecule.
前にも述べたように、核となる粒子の単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量が前記式〔１〕を満たすようにするには、核となる粒子にあらかじめ合成した高分子化合物を吸着させる方法、核となる粒子にあらかじめ合成した高分子化合物を化学的に結合させる方法などが挙げられる。このような高分子化合物は、核となる粒子に吸着しやすい成分や、核となる粒子表面に存在する反応性官能基と反応しうる官能基を有する成分を、合成する際に共重合体として組み込むことで得られる。核となる粒子表面に存在する反応性官能基と反応しうる官能基としては、シランカップリング剤を加水分解して得られるシラノール基が、反応性が高く好ましい。 As described above, in order for the weight of the polymer compound contained per unit surface area of the core particles to satisfy the formula [1], a polymer compound synthesized in advance on the core particles is used. Examples include a method of adsorbing, a method of chemically bonding a polymer compound synthesized in advance to particles serving as a nucleus, and the like. Such a polymer compound is used as a copolymer when synthesizing a component that easily adsorbs to the core particle and a component having a functional group that can react with the reactive functional group present on the surface of the core particle. It is obtained by incorporating. As the functional group capable of reacting with the reactive functional group present on the particle surface serving as a nucleus, a silanol group obtained by hydrolyzing a silane coupling agent is preferable because of high reactivity.
前記高分子化合物を粒子表面に塗布することで、高分子化合物が粒子表面に吸着または化学的に結合させることができる。塗布方法としては、高分子化合物の溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法が挙げられる。塗布後、室温下ないしは加温下にて乾燥させるのが好ましい。化学結合を行う場合は、さらにそれぞれに応じた反応条件で実施するとよい。 By applying the polymer compound to the particle surface, the polymer compound can be adsorbed or chemically bonded to the particle surface. Examples of the coating method include known methods such as preparing a solution of a polymer compound and dipping or spraying. After application, it is preferable to dry at room temperature or under heating. When chemical bonding is performed, it is better to carry out the reaction conditions corresponding to each.
前述の高分子化合物の溶液濃度は特に制限されるものではないが、一例として０．０５重量％以上であることが挙げられ、好ましくは０．１〜３０重量％、より好ましくは０．１〜２０重量％、さらに好ましくは０．３〜１０重量％であることが挙げられる。 The solution concentration of the above-described polymer compound is not particularly limited, but an example is 0.05% by weight or more, preferably 0.1 to 30% by weight, more preferably 0.1 to 0.1% by weight. It is mentioned that it is 20 weight%, More preferably, it is 0.3-10 weight%.
また、高分子化合物を生成するための官能基を、核となる粒子に導入し、この官能基を利用して粒子表面に高分子化合物を生成する方法によっても前記式〔１〕を満たすようにすることができる。高分子化合物を生成するための官能基としては、重合性官能基または連鎖移動基がよく、例えばビニル基、アリル基、アクリル基、メタクリル基、メルカプト基が挙げられる。これらは単独で用いてもよいし、または２種以上組合せてもよい。これらの基を担体に導入するには、これらの基を有するシランカップリング剤と粒子を結合させる方法が挙げられる。 In addition, a method for introducing a functional group for producing a polymer compound into a core particle and producing a polymer compound on the particle surface using this functional group also satisfies the above formula [1]. can do. The functional group for producing the polymer compound is preferably a polymerizable functional group or a chain transfer group, and examples thereof include a vinyl group, an allyl group, an acrylic group, a methacryl group, and a mercapto group. These may be used alone or in combination of two or more. In order to introduce these groups into the carrier, a method of binding particles with a silane coupling agent having these groups can be mentioned.
前記シランカップリング剤としては、例えばメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリエトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジエトキシシラン、３−メルカプトプロピルジメチルメトキシシラン、３−メルカプトプロピルジメチルエトキシシラン、メルカプトエチルトリエトキシシラン、ＡＬＬＹＬＴＲＩＭＥＴＨＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＡＣＥＴＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＡＣＥＴＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＡＣＥＴＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＡＣＥＴＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＡＣＥＴＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＳ（2-ＭＥＴＨＯＸＹＥＴＨＯＸＹ）ＳＩＬＡＮＥ、ＶＩＮＹＬＴＲＩＳ（ＭＥＴＨＹＬＥＴＨＹＬＫＥＴＯＸＩＭＩＮＯ） ＳＩＬＡＮＥ、ＡＬＬＹＬＯＸＹＵＮＤＥＣＹＬＴＲＩＭＥＴＨＯＸＹＳＩＬＡＮＥ、ＡＬＬＹＬＴＲＩＥＴＨＯＸＹＳＩＬＡＮＥ 3-（ＴＲＩＥＴＨＯＸＹＳＩＬＹＬ）-1-ＰＲＯＰＥＮＥなどが挙げられる。 Examples of the silane coupling agent include methacryloxypropyldimethylmethoxysilane, methacryloxypropyldimethylethoxysilane, methacryloxypropylmethyldimethoxysilane, methacryloxypropylmethyldiethoxysilane, methacryloxypropyltrimethoxysilane, and methacryloxypropyltriethoxy. Silane, acryloxypropyldimethylmethoxysilane, acryloxypropyldimethylethoxysilane, acryloxypropylmethyldimethoxysilane, acryloxypropylmethyldiethoxysilane, acryloxypropyltrimethoxysilane, acryloxypropyltriethoxysilane, 3-mercaptopropyltri Methoxysilane, 3-mercaptopropyltriethoxysilane, 3-mercaptopro Rumethyldimethoxysilane, 3-mercaptopropylmethyldiethoxysilane, 3-mercaptopropyldimethylmethoxysilane, 3-mercaptopropyldimethylethoxysilane, mercaptoethyltriethoxysilane, ALLYLTRIMETHOXYYSINETE, VINYLTRIACETIXYNETY, X 2-METHOXYETHOXY) SILANE, VINYLTRIS (METHYLETHYLKETOXIMINO) SILANE, ALLYLOXYUNDECYLTRIMETHOXYSILA E, ALLYLTRIETHOXYSILANE 3- (TRIETHOXYSILYL) such -1-propene and the like.
高分子化合物を生成するための官能基を、核となる粒子に導入し、この官能基を利用して粒子表面に高分子化合物を生成した粒子の製造方法としては、例えば、
（１）重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを酸性溶液中で加水分解する工程、
（２）前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランの酸性溶液中で核となる粒子を撹拌下、加熱する工程、及び乾燥後、更に加熱する工程、
（３）重合性官能基、または連鎖移動基を導入した核となる粒子と重合性モノマーを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程
を含むことが挙げられる。
As a method for producing a particle in which a functional group for producing a polymer compound is introduced into a core particle and a polymer compound is produced on the particle surface using this functional group, for example,
(1) a step of hydrolyzing an alkoxysilane having a polymerizable functional group or a chain transfer group in an acidic solution;
(2) a step of heating the core particles in the acidic solution of alkoxysilane having a polymerizable functional group or a chain transfer group under stirring, and a step of further heating after drying;
(3) It includes a step of proceeding the polymerization reaction by mixing the polymerizable functional group or the core particle introduced with the chain transfer group and the polymerizable monomer in a solvent.
本発明の医療用粒子の作製方法は、製造の容易さから、例えば粒子表面に、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を化学結合させ、タンパク質等の非特異吸着を抑制しうるモノマーと、生理活性物質を固定化しうる捕捉部を有する重合性モノマーおよび該粒子を含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中で重合することが挙げられる。こうすることで粒子表面にシランカップリング剤を介して結合した高分子化合物を生成することができる。 The method for producing medical particles of the present invention suppresses nonspecific adsorption of proteins and the like by chemically bonding a silane coupling agent having a polymerizable functional group or chain transfer group to the particle surface, for example, for ease of production. And a monomer containing a monomer capable of immobilizing a physiologically active substance and a mixture containing the particles and a mixture containing the particles in a solvent in the presence of a polymerization initiator. By doing so, a polymer compound bonded to the particle surface via a silane coupling agent can be generated.
重合性官能基または連鎖移動基を有するシランカップリング剤としては、前述のシランカップリング剤を好適に用いることができる。 As the silane coupling agent having a polymerizable functional group or a chain transfer group, the aforementioned silane coupling agent can be preferably used.
重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を、粒子表面に化学結合させる際のシランカップリング剤濃度については、例えば０．０１〜２０wt%であることが挙げられ、０．１〜１０wt%が好ましく、３〜１０wt%であることがより好ましい。また、シランカップリング剤の使用量は、細孔内を含めた粒子の表面積を被覆できる量以上を用いることが好ましい。この値は、細孔内を含めた粒子の表面積とシランカップリング剤の最小被覆面積から算出するとよい。 The concentration of the silane coupling agent when the silane coupling agent having a polymerizable functional group or a chain transfer group is chemically bonded to the particle surface is, for example, 0.01 to 20 wt%. -10 wt% is preferable, and 3-10 wt% is more preferable. Moreover, it is preferable to use the usage-amount of a silane coupling agent more than the quantity which can coat | cover the surface area of particle | grains including the inside of a pore. This value may be calculated from the surface area of the particles including the inside of the pores and the minimum coating area of the silane coupling agent.
溶媒は、シランカップリング剤が溶解すればよいが、例えば、ｐ Ｈ ２ 〜 ５ の酸性水溶液または、これと有機溶媒との混合物が、シランカップリング剤が加水分解しやすく、また、加水分解により生成したシラノール基が安定して存在できるようになるので好ましい。この処理に用いられる酸としては各種公知の無機酸及び／又は有機酸を用いることができる。無機酸としては、硫酸、硝酸、塩酸、フッ酸等が挙げられ、また有機酸としては蟻酸、酢酸、安息香酸等が挙げられるが、なかでも取り扱いが比較的容易な酢酸がより好適である。有機溶媒としては２−ブタノン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブタノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトン、アセトニトリルなどが好ましい。 The solvent only needs to dissolve the silane coupling agent. For example, an acidic aqueous solution of pH 2 to 5 or a mixture of this with an organic solvent can be easily hydrolyzed by the silane coupling agent. This is preferable because the generated silanol group can be stably present. As the acid used in this treatment, various known inorganic acids and / or organic acids can be used. Examples of the inorganic acid include sulfuric acid, nitric acid, hydrochloric acid, and hydrofluoric acid. Examples of the organic acid include formic acid, acetic acid, benzoic acid, and the like. Among these, acetic acid that is relatively easy to handle is more preferable. As the organic solvent, 2-butanone, methanol, ethanol, t-butyl alcohol, isopropyl alcohol, n-butanol, tetrahydrofuran, dioxane, acetone, acetonitrile and the like are preferable.
シランカップリング剤がアルコキシシランの場合、加水分解により生成されたシラノール基が、粒子表面の水酸基、アミノ基、カルボニル基、シラノール基等と脱水縮合して共有結合を形成する。シラノール基の脱水縮合により形成される共有結合は加水分解されにくい性質があるので、これを介して粒子表面に固定化された重合体は容易に溶解したり、核となる粒子から脱離してしまうことはない。シラノール基の脱水縮合は加熱処理により促進される。例えば、６０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。 When the silane coupling agent is alkoxysilane, silanol groups generated by hydrolysis are dehydrated and condensed with hydroxyl groups, amino groups, carbonyl groups, silanol groups and the like on the particle surface to form covalent bonds. The covalent bond formed by the dehydration condensation of the silanol group is difficult to hydrolyze, so the polymer immobilized on the particle surface can be easily dissolved or detached from the core particle through this. There is nothing. The dehydration condensation of silanol groups is promoted by heat treatment. For example, it is preferable to heat-process at 60-120 degreeC for 5 minutes-24 hours.
その後、さらに粒子を乾燥させ、加熱することでよりシランカップリング剤と粒子との結合が促進される。例えば、８０〜１２０℃で５分間〜２４時間加熱処理するのが好ましい。 Thereafter, the particles are further dried and heated to further promote the bonding between the silane coupling agent and the particles. For example, it is preferable to heat-process at 80-120 degreeC for 5 minutes-24 hours.
前記のようにして得られた重合性官能基、または連鎖移動基を導入した核となる粒子は、重合性モノマーと溶媒中で混合し、重合反応を進行させる工程をおこなうことで、その表面に高分子化合物を含む層を形成できる。重合性モノマーとしては、側鎖に非特異吸着抑制構造を有する第１ユニットの由来元となるモノマーと、側鎖の末端に生理活性物質を固定化しうる捕捉部を有する第２ユニットの由来元となるモノマーが好ましく、必要に応じて、他の重合性モノマーや重合開始剤を加えてもよい。また、撹拌しながら重合を行うと粒子表面にムラなく高分子化合物を形成できるので好ましい。 The particles serving as nuclei introduced with the polymerizable functional group or chain transfer group obtained as described above are mixed with a polymerizable monomer in a solvent and subjected to a step of proceeding the polymerization reaction. A layer containing a polymer compound can be formed. As the polymerizable monomer, a monomer that is the origin of the first unit having a non-specific adsorption-suppressing structure in the side chain, and a source of the second unit that has a capture unit that can immobilize the physiologically active substance at the end of the side chain The monomer which becomes is preferable, and you may add another polymeric monomer and a polymerization initiator as needed. Further, it is preferable to carry out the polymerization while stirring, because a polymer compound can be formed on the particle surface without unevenness.
重合する際の条件としては、例えば温度が４０℃〜１００℃、重合時間は１時間〜４８時間であることが挙げられる。 Examples of the polymerization conditions include a temperature of 40 ° C. to 100 ° C. and a polymerization time of 1 hour to 48 hours.
また、溶媒としてはそれぞれのモノマーが溶解するものであればよく、例えば、２−ブタノン、メタノール、エタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ‐ジメチルホルムアミドなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。 Further, the solvent may be any solvent as long as each monomer can be dissolved. For example, 2-butanone, methanol, ethanol, t-butyl alcohol, benzene, toluene, tetrahydrofuran, dioxane, dichloromethane, chloroform, dimethyl sulfoxide, N, N -Dimethylformamide and the like. These solvents are used alone or in combination of two or more.
重合終了後は、粒子に吸着した高分子化合物などを洗浄により除去し、乾燥するとよい。乾燥する方法は特に限定されない。加熱することで溶媒を揮発させてもよいし、真空乾燥してもよいし、それらを組み合わせてもよい。 After the polymerization, the polymer compound adsorbed on the particles may be removed by washing and dried. The method for drying is not particularly limited. The solvent may be volatilized by heating, may be vacuum-dried, or a combination thereof.
前記重合反応は、ラジカル重合が簡便で好ましい。重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルなどの有機過酸化物などを挙げることができる。 The polymerization reaction is preferably radical polymerization because it is simple. The polymerization initiator may be any ordinary radical initiator, for example, azo compounds such as 2,2′-azobisisobutyronitrile, 1,1′-azobis (cyclohexane-1-carbonitrile), peroxide Examples thereof include organic peroxides such as benzoyl and lauryl peroxide.
また、本発明の医療用粒子の作製方法は、担体表面に重合開始基を共有結合させ、前記側鎖に非特異吸着抑制構造を有する第１ユニットの由来元となるモノマーと、側鎖の末端に生理活性物質を固定化しうる捕捉部を有する第２ユニットの由来元となるモノマーおよび該粒子を含む混合物を、溶媒中でリビングラジカル重合してもよい。 In addition, the method for producing medical particles of the present invention includes a monomer that is a source of the first unit having a non-specific adsorption-suppressing structure in the side chain, wherein a polymerization initiating group is covalently bonded to the surface of the carrier, A mixture containing the monomer that is the origin of the second unit having a trapping part capable of immobilizing a physiologically active substance and the particles may be subjected to living radical polymerization in a solvent.
リビングラジカル重合には様々な方法があるが、特に制限を受けるものではなく、原子移動ラジカル重合、可逆的付加-開裂連鎖移動重合、ニトロキシドを介したラジカル重合などを好適に用いることができる。 Although there are various methods for living radical polymerization, it is not particularly limited, and atom transfer radical polymerization, reversible addition-cleavage chain transfer polymerization, radical polymerization via nitroxide, and the like can be suitably used.
前記のようにして得られた医療用粒子は、官能基を介して生理活性物質を固定化することにより、免疫沈降法やプルダウンアッセイ等に用いる分析用粒子として利用できる。該医療用粒子を、生理活性物質を溶解した液体と接触させ、粒子上の捕捉部と生理活性物質とを反応させることで、生理活性物質を粒子に固定化することができる。 The medical particles obtained as described above can be used as analytical particles for use in immunoprecipitation methods, pull-down assays, etc., by immobilizing physiologically active substances via functional groups. The medical particles can be immobilized on the particles by bringing the medical particles into contact with a liquid in which the physiologically active substance is dissolved and reacting the capturing part on the particles with the physiologically active substance.
前記生理活性物質は、核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、プロテインＡ，プロテインＧ、リガンド、ペプチド、グルタチオン、低分子化合物、ビオチン、糖鎖、レクチン、糖脂質、及び糖タンパクよりなる群から選ばれる少なくとも一つであることが好ましい。 The physiologically active substance is selected from the group consisting of nucleic acid, aptamer, protein, antibody, antigen, protein A, protein G, ligand, peptide, glutathione, low molecular weight compound, biotin, sugar chain, lectin, glycolipid, and glycoprotein. It is preferable that it is at least one.
医療用粒子に活性エステル基が存在する場合、生理活性物質を溶解した液体のｐＨは７．０〜１２．０であることが好ましく、ｐＨ７．５〜１１がより好ましい。ｐＨが上記範囲であることにより、固定化を効率よく行うことができるとともに、生理活性物質の変性・分解を抑制することが可能となる。このような液体としては、リン酸塩水溶液が好ましい。あるいは、生理活性物質を溶解した液体はトリエチルアミンなど触媒を含有する有機溶媒でもよいし、これとリン酸塩水溶液との混合物でもよい。 When an active ester group is present in the medical particles, the pH of the liquid in which the physiologically active substance is dissolved is preferably 7.0 to 12.0, and more preferably pH 7.5 to 11. When the pH is in the above range, immobilization can be performed efficiently and denaturation / decomposition of the physiologically active substance can be suppressed. As such a liquid, an aqueous phosphate solution is preferable. Alternatively, the liquid in which the physiologically active substance is dissolved may be an organic solvent containing a catalyst such as triethylamine, or a mixture of this and a phosphate aqueous solution.
前記リン酸塩は特に限定されるものではないが、リン酸２水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２カリウム、又はリン酸水素２ナトリウムが生理活性物質への影響が少なく、特に好ましい。 The phosphate is not particularly limited, but potassium dihydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, or disodium hydrogen phosphate is particularly preferable because it has little influence on the physiologically active substance. .
前記リン酸塩水溶液のリン酸塩濃度は０．１Ｍ以上５Ｍ以下であることが好ましい。この範囲にあることで、効率的に生理活性物質を粒子に固定化することができる。 The phosphate concentration of the aqueous phosphate solution is preferably 0.1M or more and 5M or less. By being in this range, the physiologically active substance can be efficiently immobilized on the particles.
生理活性物質付着後は、２−アミノエタノール等のアミノ基を有する低分子物質で担体を処理し未反応の活性エステル基を失活させてしまうことが好ましい。 After attaching the physiologically active substance, it is preferable to deactivate the unreacted active ester group by treating the carrier with a low molecular substance having an amino group such as 2-aminoethanol.
前記のように作製した分析用担体は、免疫沈降法やプルダウンアッセイ等に用いる分析用粒子として利用できる。例えば、該分析用担体に、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより、標的生体物質の捕捉が可能となる。 The analytical carrier produced as described above can be used as analytical particles for use in immunoprecipitation methods, pull-down assays, and the like. For example, by bringing the analytical carrier into contact with at least one solution selected from a target biomolecule lysate, blood, plasma, serum, cell disruption fluid, cell culture fluid, and tissue disruption fluid, Capturing is possible.
以下、本発明を実施例および比較例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail based on an Example and a comparative example, this invention is not limited to this.
＜実施例１＞ <Example 1>
（ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の重合）
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（Ｂｌｅｎｍｅｒ ＰＥ−２００（ｎ＝４）、日本油脂（株）製）を２０ｍＬのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬（株）製）及びクロロホルム２０ｍＬの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１ｈ反応させた後、さらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）を得た。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が平均４．５単位含まれていることを確認した。
(Polymerization of p-nitrophenyloxycarbonyl-polyethylene glycol methacrylate (MEONP))
0.01 mol of polyethylene glycol monomethacrylate (Blenmer PE-200 (n = 4), manufactured by NOF Corporation) was dissolved in 20 mL of chloroform and then cooled to −30 ° C. While maintaining the temperature at −30 ° C., 0.01 mol of p-nitrophenyl chloroformate (manufactured by Aldrich), 0.01 mol of triethylamine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 20 mL of chloroform were added to this solution. The homogeneous solution was slowly added dropwise. After reacting at −30 ° C. for 1 h, the solution was further stirred for 2 hours. Thereafter, salts were removed from the reaction solution by filtration, and the solvent was distilled off to obtain p-nitrophenyloxycarbonyl-polyethylene glycol methacrylate (MEONP). The obtained monomer was measured by 1H-NMR in deuterated chloroform solvent, and it was confirmed that an average of 4.5 units of ethylene glycol residue was contained.
（粒子表面へのシランカップリング剤の導入）
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製ＳＩＭ６４８６．５）１３ｇをｐＨ３．０の酢酸水溶液１００ｍＬとエタノール１００ｍＬとの混合液に添加し、シランカップリング剤を加水分解した後に、シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）１０ｇを投入し７０℃で２時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、１００℃で１時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
(Introduction of silane coupling agent to particle surface)
After adding 13 g of methacryloxypropyldimethylmethoxysilane (SIM 6486.5 manufactured by Gelest) to a mixed solution of 100 mL of acetic acid aqueous solution of pH 3.0 and 100 mL of ethanol, hydrolyzing the silane coupling agent, silica beads (average particle size) 10 μg of 5 μm, 70 μm pore size, SMB70-5 manufactured by Fuji Silysia Chemical Ltd. was added and stirred at 70 ° C. for 2 hours, and then silica beads were collected from the reaction solution by suction filtration and heated at 100 ° C. for 1 hour. Then, after dispersing with ethanol and shaking well, the supernatant was removed by centrifugation and dried.
（粒子表面への、高分子化合物を含む層の形成）
メトキシポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、数平均分子量Ｍｎ＝４６８、エチレングリコール残基数は平均９単位、新中村化学株式会社製）と先に重合したＭＥＯＮＰを、エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を１５０ｍL作製した。総モノマー濃度は０．４ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に８０：２０である。そこにＡＩＢＮを０．００８ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ１０ｇを投入し、アルゴンガス雰囲気下、７０℃で６時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、ジメチルスルホキシドに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、真空乾燥させた。これを４ロット繰り返し合成した。
(Formation of layer containing polymer compound on particle surface)
Methoxypolyethylene glycol methacrylate (PEGMA, number average molecular weight Mn = 468, average number of ethylene glycol residues is 9 units, Shin-Nakamura Chemical Co., Ltd.) and previously polymerized MEONP are dissolved in ethanol to prepare a monomer mixture solution of 150 mL. did. The total monomer concentration is 0.4 mol / L, and the respective molar ratios are 80:20 in the order of PEGMA and MEONP. AIBN was added there so that it might become 0.008 mol / L, and it stirred until it became uniform. Thereafter, 10 g of silica beads treated with the above methacryloxypropyldimethylmethoxysilane were added and reacted at 70 ° C. for 6 hours in an argon gas atmosphere. Next, silica beads were collected from the reaction solution by centrifugation, dispersed in dimethyl sulfoxide, shaken well, and then collected by suction filtration and vacuum dried. This was repeated for 4 lots.
＜実施例２＞
実施例１の粒子表面への、高分子化合物を含む層の形成において、総モノマー濃度を０．２ｍｏｌ／Ｌにしたものを実施例２とした。
<Example 2>
In the formation of the layer containing the polymer compound on the particle surface of Example 1, the total monomer concentration was set to 0.2 mol / L.
＜比較例＞
実施例２の担体表面へのシランカップリング剤の導入において、メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランの処方量を５．０ｇにしたものを比較例とした。
<Comparative example>
In the introduction of the silane coupling agent onto the surface of the carrier in Example 2, 5.0 g of methacryloxypropyldimethylmethoxysilane was used as a comparative example.
（粒子の表面に導入された、高分子化合物を含む層の重量の測定）
粒子の表面に導入された、高分子化合物を含む層の重量は、ＴＧＡ装置（セイコーインスツルメント社製ＴＧ／ＤＴＡ６２００）を用いて、空気雰囲気中、室温から５００℃へ１０℃／分で昇温し、さらに５００℃を１時間維持した後の重量減少率を測定した。この値と、別途ＢＥＴ法で求めた単位重量当たりの粒子の表面積から、粒子の表面に導入された、高分子化合物を含む層の重量を算出した。
(Measurement of weight of layer containing polymer compound introduced on particle surface)
The weight of the layer containing the polymer compound introduced on the surface of the particles was increased from room temperature to 500 ° C. at 10 ° C./min in an air atmosphere using a TGA apparatus (TG / DTA 6200 manufactured by Seiko Instruments Inc.). The weight reduction rate after heating and maintaining at 500 ° C. for 1 hour was measured. From this value and the surface area of the particles per unit weight determined separately by the BET method, the weight of the layer containing the polymer compound introduced on the surface of the particles was calculated.
（粒子に対する非特異吸着量の測定）
・ 粒子の不活性化
実施例および比較例の粒子それぞれ２０ｍｇをエッペンチューブに採取し、０．１Ｍ２−エタノールアミンのｔｒｉｓ-ＨＣｌバッファ溶液（ｐＨ９．５）１ｍＬを投入、１時間転倒混和することで、ＭＥＯＮＰのｐ−ニトロフェニル基を不活性化した。その後ｔｒｉｓ-ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）で洗浄した。
(Measurement of non-specific adsorption to particles)
-Inactivation of particles 20 mg each of the particles of Examples and Comparative Examples were collected in an Eppendorf tube, and 1 mL of a 0.1 M 2-ethanolamine tris-HCl buffer solution (pH 9.5) was added and mixed by inverting for 1 hour. The p-nitrophenyl group of MEONP was inactivated. Thereafter, it was washed with tris-HCl buffer (pH 7.4).
（２）粒子へのタンパク質吸着および回収
不活性化した粒子２ｍｇ分を新たなエッペンチューブに移し、遠心分離後、上清を除去した。そこに０．３ｍｇ／ｍＬに調整したＨｅＬa細胞ライセート１ｍＬを添加し、４℃で２時間転倒混和し、粒子にタンパク質を吸着させた。その後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ｔｒｉｓ-ＨＣｌバッファ（ｐＨ７．４）で粒子を洗浄した。遠心分離後、上清を除去し、グリシン‐ＨＣｌバッファを３０μＬ加え、ボルテックスミクサーで混合、再度遠心分離し、粒子に吸着したタンパク質が溶解した上清を回収した。
(2) Adsorption and recovery of protein on particles 2 mg of inactivated particles were transferred to a new Eppendorf tube, and after centrifugation, the supernatant was removed. Thereto was added 1 mL of HeLa cell lysate adjusted to 0.3 mg / mL, and the mixture was mixed by inverting at 4 ° C. for 2 hours to adsorb the protein to the particles. Thereafter, the particles were washed with a tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.05% Tween20. After centrifugation, the supernatant was removed, 30 μL of glycine-HCl buffer was added, mixed with a vortex mixer, and centrifuged again to recover the supernatant in which the protein adsorbed on the particles was dissolved.
・ ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色
（２）で得た上清および既知量のＢＳＡを用いてＳＤＳ-ＰＡＧＥを行い、さらに銀染色を実施した。
SDS-PAGE and silver staining SDS-PAGE was performed using the supernatant obtained in (2) and a known amount of BSA, and silver staining was further performed.
・ 非特異吸着量の測定
染色後のゲルをスキャナで読み取り、画像処理を行いバンドの濃さを数値化した。数値化においてはフリーソフトＩｍａｇｅＪを利用した。ＢＳＡのバンドの濃さから検量線を作成し、これに基づき、単位重量あたりに非特異吸着していたタンパク質の量を算出した。
-Measurement of non-specific adsorption amount The dyed gel was read with a scanner, image processing was performed, and the intensity of the band was digitized. For the digitization, free software ImageJ was used. A calibration curve was created from the density of the BSA band, and based on this, the amount of non-specifically adsorbed protein per unit weight was calculated.
（抗体を固定した粒子の抗原捕捉能）
・ １次抗体固定化
実施例および比較例で得られた粒子各２０ｍｇに対し、５０μｇ／ｍＬに調製したＣＲＰ抗体（Ａｂｎｏｖａ製）の１．２Ｍりん酸水素二カリウム溶液１ｍＬを加え、室温にて１晩転倒混和した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。さらに０．１Ｍ２−エタノールアミンのｔｒｉｓ-ＨＣｌバッファ溶液（ｐＨ９．５）で室温下、１時間処理し、粒子に残存しているＭＥＯＮＰのｐ−ニトロフェニル基の不活性化を行った。
(Antigen-capturing ability of antibody-immobilized particles)
・ To 20 mg of particles obtained in Examples and Comparative Examples for primary antibody immobilization, 1 mL of 1.2 M dipotassium hydrogen phosphate solution of CRP antibody (manufactured by Abnova) prepared at 50 μg / mL was added at room temperature. Inverted overnight. Washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween20. Further, it was treated with a 0.1 M 2-ethanolamine tris-HCl buffer solution (pH 9.5) at room temperature for 1 hour to inactivate the p-nitrophenyl group of MEONP remaining in the particles.
・ ＣＲＰとの反応
ＣＲＰ抗体を固定化した粒子５ｍｇに３μｇ／ｍＬに調製したＣＲＰのＰＢＳ溶液１ｍＬを加え、室温にて１時間転倒混和した。遠心分離で粒子を回収後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。
-Reaction with CRP 1 mL of CRP in PBS prepared to 3 μg / mL was added to 5 mg of particles with immobilized CRP antibody, and mixed by inverting at room temperature for 1 hour. The particles were collected by centrifugation and washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween20.
・ ２次抗体との反応
ＣＲＰを反応させた粒子に、１μｇ／ｍＬに調製したＨＲＰ標識化ＣＲＰ抗体（Ａｂｎｏｖａ製）溶液を１ｍＬ加え、室温にて１時間転倒混和した。遠心分離で粒子を回収後０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄した。
-Reaction with secondary antibody 1 mL of HRP-labeled CRP antibody (manufactured by Abnova) prepared to 1 μg / mL was added to the particles reacted with CRP, and mixed by inverting at room temperature for 1 hour. The particles were collected by centrifugation and washed 3 times with PBS containing 0.05% Tween20.
・ ＣＲＰ捕捉量の定量
ＨＲＰ標識化ＣＲＰ抗体を反応させた粒子を、住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットを用いて発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することによりＣＲＰの捕捉量を見積もった。
-Quantification of CRP Capture Amount The particles reacted with the HRP-labeled CRP antibody were colored using a peroxidase coloring kit manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., and the CRP capture amount was estimated by measuring the absorbance at 450 nm.
また、実施例および比較例の粒子にＣＲＰ抗体を固定化せずに不活化のみを行ったものに対して、上記と同様にＣＲＰとの反応、２次抗体との反応を実施し、ＣＲＰの非特異吸着量の定量を行った。 In addition, for the particles of Examples and Comparative Examples in which the CRP antibody was not immobilized but only inactivated, the reaction with CRP was performed in the same manner as described above, and the reaction with the secondary antibody was performed. Non-specific adsorption amount was quantified.
単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量、タンパク質の非特異吸着量、ＣＲＰ抗体を固定した粒子の抗原捕捉能をまとめて表１に示す。 Table 1 summarizes the weight of the polymer compound contained per unit surface area, the nonspecific adsorption amount of the protein, and the antigen capturing ability of the particles having the CRP antibody immobilized thereon.
単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量の増加に伴い、タンパク質の非特異吸着量が減少する傾向が認められる。タンパク質の非特異吸着量は約５０ｎｇ／ｍｇ以下でなければ、Ｓ／Ｎの低下など実用上問題が発生することから、単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量は０．８ｍｇ／ｍ２以上が望ましいといえる。また、単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量が多いほど、抗体固定化粒子が標的である抗原を多く捕捉する傾向が認められ、０．８ｍｇ／ｍ２以上では十分にシグナルを検出できていることが分かる。以上より、単位表面積あたりに含まれる高分子化合物の重量が０．８ｍｇ／ｍ２以上になると、分析用粒子としての性能が十分に発揮できることがわかる。 As the weight of the polymer compound contained per unit surface area increases, the nonspecific adsorption amount of the protein tends to decrease. If the amount of nonspecific adsorption of protein is not about 50 ng / mg or less, practical problems such as a decrease in S / N will occur, so the weight of the polymer compound contained per unit surface area is 0.8 mg / m 2 or more. Is desirable. In addition, the higher the weight of the polymer compound contained per unit surface area, the more the antibody-immobilized particles tend to capture the target antigen, and the signal can be sufficiently detected at 0.8 mg / m 2 or more. I understand that. From the above, it can be seen that when the weight of the polymer compound contained per unit surface area is 0.8 mg / m 2 or more, the performance as analytical particles can be sufficiently exhibited.
本発明により、生理活性物質を効率的に固定化することができ、且つ非特異吸着を抑制した粒子を提供することが可能となった。さらには、生理活性物質を固定化した粒子で目的とする生体分子を効率的に捕捉できるようになった。
According to the present invention, it is possible to provide particles capable of efficiently immobilizing a physiologically active substance and suppressing nonspecific adsorption. Furthermore, the target biomolecule can be efficiently captured by the particles on which the physiologically active substance is immobilized.
Claims (20)
式（１） Ａ／Ｂ≧０．８ｍｇ／平方メートル
Ａ：ＴＧ測定で求められる、核となる粒子１ｇ当たりの粒子の表面に高分子化合物を含む層の重量（ｍｇ）
Ｂ：核となる粒子１ｇあたりの表面積（平方メートル）
A medical particle having a core particle and a layer containing a polymer compound on the surface of the particle, the medical particle satisfying the following formula (1).
Formula (1) A / B ≧ 0.8 mg / square meter
A: Weight of the layer containing the polymer compound on the surface of the particle per 1 g of the core particle obtained by TG measurement (mg)
B: Surface area per gram of core particles (square meter)
（ 式中Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ２はベタイン構造を有する官能基、水素原子、または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｘは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基またはその繰り返し構造を示す。 ただし、第１ユニット中にアルキレングリコール残基および／またはベタイン構造を含むものとする。） The medical particle according to claim 5 or 6, wherein the first unit is represented by the following (Chemical Formula 1).
(Wherein R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group, R 2 represents a functional group having a betaine structure, a hydrogen atom, or an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms. X represents —O—, —S—, —NH—. , -CO-, -CONH- represents a hydrocarbon chain having 0 to 20 carbon atoms, an alkylene glycol residue, or a repeating structure thereof, which may be interrupted by an alkylene glycol residue and / or a first unit. (Including betaine structure)
（式中Ｒ３は水素原子またはメチル基を示し、Ｙは−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されてもよい炭素数０〜２０の炭化水素鎖、アルキレングルコール残基を示す。ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。 Ｗは生理活性物質を固定化しうる基を示す。） The medical particle according to claim 5, wherein the second unit is represented by the following (Chemical Formula 2).
(Wherein R3 represents a hydrogen atom or a methyl group, Y represents a hydrocarbon chain having 0 to 20 carbon atoms which may be interrupted by -O-, -S-, -NH-, -CO-, -CONH-, Represents an alkylene glycol residue, q represents an integer of 1 to 100. When q is an integer of 2 to 100, the repeated Ys may be the same or different from each other. Indicates a group capable of immobilizing a physiologically active substance.)
The analytical particles according to claim 16 or 17 are brought into contact with at least one solution selected from a target biomolecule lysate, blood, plasma, serum, cell lysate, cell culture fluid, and tissue lysate. A method of using particles for analysis, which comprises recovering a target biological material.
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