JP2007536919A - Ｆａｄ依存性モノオキシゲナーゼの直接的な電気化学的再生による酵素的酸素添加方法 - Google Patents

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Abstract

FAD依存性モノオキシゲナーゼおよびFAD依存性モノオキシゲナーゼの直接的な電気化学的再生によって触媒される酵素的酸素添加のための方法。

Description

非反応性炭化水素の選択的オキシ官能化は未だに、合成有機化学の最も挑戦的な最先端課題の１つである。特に反応物の活性化とその反応の選択性の微妙なバランスを扱わなければならない。「古典的な」化学酸素供与体、例えばペルオキシド、次亜塩素酸塩、ヨードソベンゼンまたはジオキシランなど［１］は、選択性を欠いており、かかる選択性は、より複雑な基質のオキシ官能化に必要とされる。
さらに、多くの触媒化学アプローチは、未だにさほど開発されておらず、そのため触媒の立体区別のみならずターンオーバー数および回数が低い傾向にある［２，３］。一方、性質は、前記の規準を完全に満たす触媒の多才なツールボックスを発展させた。
モノオキシゲナーゼは一般に、高度に多方面化した酸素添加反応を、極めて位置選択的および立体選択的様式で、1分間あたり数百のターンオーバー数に達する触媒能力にて触媒する［４］。反応性酸素添加種は、モノオキシゲナーゼの活性部位にて分子状酸素からその場(in situ)で生じ、それによって望ましくない副反応を最小化する。このように、モノオキシゲナーゼは合成有機化学に用いることが期待できる触媒である［５-８］。しかし、モノオキシゲナーゼは補因子依存性酵素であり、この酵素はO２活性化のための還元性等価物と共に供給されなければならない。一般にこれら還元性等価物は、高価でかつ不安定なニコチンアミド補因子(NAD(P)H)から誘導される［９-１１］。さらに、モノオキシゲナーゼはしばしば、複雑な多重酵素系から成り、かかる系はNAD(P)Hから末端オキシゲナーゼへの電子伝達を達成する。洗練された分子構造およびNAD(P)H依存性のために、モノオキシゲナーゼの物質生産的用途は、少しの例外を除いて［８,１２―１６］、代謝的に活発な微生物を用いた全細胞アプローチに大きく制限されている［５,８,１７―１９］。
天然のモノオキシゲナーゼサイクルを模倣することが複雑であれば、酸素添加サイクルに還元力を直接的に導入することによって、徹底的に単純化した生体触媒のオキシ官能化反応の可能性が付与される。電気化学的還元は、選択のひとつのアプローチであるが、その理由は、適用された還元力を制御でき、そしてカソードは無試薬の電子供給源としての役割を果たすことができるためである。この点で、ヘム依存性モノオキシゲナーゼの種類が、これまで好ましい研究対象であった。モノオキシゲナーゼのヘム鉄中心とカソードとの間の電気的連絡が、直接的な接触［２０,２１］によって、および電子伝達を仲介した人工的な［２２］または生物学的な酸化還元リレー［２２,２５］によって確立された。
P450モノオキシゲナーゼに関する様々な研究活動に反して、フラビン依存性モノオキシゲナーゼの種類に関する同様のアプローチは未だに報告されていない。これは驚くべきことである。なぜならば、この酵素の種類は、目的のオキシ官能化反応（例えば、ヒドロキシル化［１２,２６,２７］、バイヤー-ビリガー酸化［２８,２９］およびエポキシ化［３０］など）を合成的に触媒するためである。
Pseudomonas sp. VLB120のスチレンモノオキシゲナーゼ (StyAB)は、幅広い範囲のスチレン誘導体の特異的な(S)-エポキシ化を触媒する［３１,３２］。この酵素は、エポキシ化反応を触媒するFAD依存性モノオキシゲナーゼ成分(StyA)と、NADHからStyAへFADH2を介して還元性等価物を送達するNADH依存性還元酵素成分(StyB)とから成る［３３］。
先に本発明者らは、StyBが直接的にエポキシ化反応に関与しないことを示したが、その理由は、立体化学的経路および反応速度を損なうことなく、化学還元剤によって置換されうるためである［３４］。FADH2のin situ再生を、移動水素化触媒として有機金属錯体 [Cp*Rh(bpy)(H2O)]2+と還元性等価物の化学量論的供給源としてのギ酸とを合わせて用いて達成した。
発明の説明
以下の発明は、FAD依存性モノオキシゲナーゼによって触媒される生成物Pへの遊離体(educt)Eの酵素的酸素添加のための方法に関し、FAD依存性モノオキシゲナーゼが、直接的な電気化学的還元によって再生されることを特徴とする。
遊離体Eの化学的性質は、モノオキシゲナーゼ、特にFAD依存性モノオキシゲナーゼが酸素添加の基質として遊離体Eを受け入れることができる限り、幅広い範囲で変化しうる。。遊離体Eとして好ましいものは、置換されたスチレンおよびスチレン誘導体の化合物であり、特に表1に記載された基質が好ましい。
本発明によるモノオキシゲナーゼとしては、Pseudomonas sp由来のスチレンモノオキシゲナーゼ (Sty AB )が好ましい［３１,３２］。他の好ましい酵素を図9に列挙する。
電気酵素的（electroenzymatic）エポキシ化の最初の実験を、トランス-β-メチルスチレンを基質として用いて行った。電気分解を、-550 mV vs. Ag/AgClsat.のカソード電位を印加し、定電位的(potentiostatically)に行った。反応培地からStyAまたはFADのいずれかを排除した場合、生成物の形成を検出できなかった。一方、全ての反応成分存在下における電気分解によって、加水分解可能な、より極性の高い生成物の形成を生じた。この生成物が、実際に純粋なエナンチマー(enantiopure)の(1S,2S)-1-フェニルプロピレンオキシドであることを確認した［３６］。同様に、広範な種類の様々な置換ビニル芳香族化合物を、98%を越える光学的に純粋な対応する(S)エポキシドに変換できた(表１)。
Figure 2007536919
しかし、電気酵素的酸素添加反応の立体区別（stereodiscrimination ）が全細胞［３１,３２］および無細胞反応［３４,３５］を用いて得られた値を満たすが、エポキシ化の速度は同等に劣っていた。初速度研究において、2.1 U mg-1以下のStyA比活性を測定した［３３］。したがって、表１に示した速度は、StyAの触媒能の割合（2％未満）だけを示す。示した電気酵素的エポキシ化反応の律速因子を決定するために、本発明者らはさらに、様々な反応パラメータを変えることによる、電気酵素的エポキシ化反応の速度への影響を調べた。
図10に示すように、電気酵素的エポキシ化反応の速度は、用いた生体触媒の濃度に相関した。35.5 ± 2.1 U g-1のStyA比活性が、生体触媒の濃度と無関係に観察された。この比活性は温度依存性であり、反応温度を例えば25℃から37℃に高めることによって、他は同一の条件下でエポキシ化活性が2.5倍増加した［３６］。このように一見したところStyAは、電気酵素的反応の律速であるように思われた。しかし、最大値と比べて乏しいStyAの触媒能力は、電気酵素的エポキシ化反応の速度を著しく制限するさらに別の因子であることを示していた。
カソード電位を−550から−650 mV vs. Ag/AgClsatに下げても、反応過程に顕著な影響はなかった［３６］。このことは、カソードからFADへの電子移動が、FADH2再生の律速ではなかったことを示している。しかし不均一反応の場合、FADH2の再生が、カソード表面への大量輸送によって制限されうる。実際本発明者らは、最高少なくとも500μMにFAD濃度を増加させることによって、エポキシ化速度が増加したことを観察した［３６］。これらの結果は、これまでの知見に反しており、その知見では10〜20μMの所定の最適なFAD濃度がFADH2の均一な再生を用いて観察された［３３,３４］。FADH2の自己触媒的酸化［３７］が、20μMよりも高いFAD濃度におけるエポキシ化速度減少の原因となった。この場合この効果は、カソード表面におけるFADの増大した利用能による、増大したFADH2発生速度によって覆されうる。後者の仮説が正しく、カソードのFADH2再生が拡散制限の影響を受けるのであれば、カソード表面もまた再生速度に影響するはずである。従って、カソード表面対反応容積の比の影響を調べた。図11に示すように、StyA比活性（ここではターンオーバーの回数として示す［1分間あたりの触媒サイクル数］）は、カソード面積と反応容積の比と直接的に関連した。
概してこれらの観察は、電気酵素的エポキシ化反応におけるStyA活性が、エポキシ化反応に関するFADH2の利用能によって制限されることを示した。還元型フラビンは、分子状酸素の存在下において不安定であるために［３７］、本発明者らは、電気酵素的エポキシ化反応の速度に対するエアレーションの影響を調べた(図12)。
興味深いことに本発明者らは、エアレーション速度を増加させることによって、エポキシドの形成速度が著しく加速されることを見出した。活発に吸気しない場合、30 U g-1の範囲のStyA比活性が、確定した反応であった(図12)。さらに、およそ50μMのエポキシドのみが、全体として形成された。このことは80％以上の溶解酸素が、酵素的エポキシ化以外の反応によって消費されることを示している。一方、エアレーションの高い速度によって、StyAの最大活性のおよそ10％に相当する215 U g-1までStyA比活性が増加した。これは興味深い。なぜなら、P450モノオキシゲナーゼの直接的な還元再生における研究によって、酵素的酸素添加反応からの電気化学的再生反応の酸化的脱カップリングが全体の制限となることが同定されたためである［２２,２４,３８］。例えば、Vilkerおよび共同研究者らは、P450camによって駆動される樟脳のヒドロキシル化の著しい増加を見出したが、それはカソード電位の印加及びアノードにおけるO2のin situ再生の前に、電気分解緩衝液をArでパージした場合であった。この明白な不一致は、スキーム１に概要を示したように、FADH2酸化のメカニズムを考慮することによって説明できる［３７］。
Figure 2007536919
従って、可逆的な共均衡化（reversible synproportionation）によるセミキノンラジカルアニオンの形成は、還元型フラビンの非酵素支援(non-enzyme-supported)酸化の全体的な速度を制限する。このように本発明者らの実験において、c(O2)は非酵素支援のFADH2の再酸化の速度に影響しなかった。一方分子状酸素は、触媒的に活性な4α-ペルオキソフラビンの形成に直接的に関与する。このことがStyAによって触媒されるエポキシ化反応の全体的な律速ステップである場合、エポキシ化速度がエアレーション速度に依存することを十分に説明することができる。後者の仮説は、FAD依存性p-ヒドロキシフェニル酢酸-3-ヒドロキシラーゼを用いた同様の知見によって支持される。ここでは、4α-ペルオキソフラビンの形成が、律速であり、かつO2依存性であることを見出した［３９］。今後の実験では、電気酵素的反応に対するO2のin situ濃度の影響をより慎重に調べるつもりである。
これまでの新しい電気酵素的エポキシ化反応の物質生産(preparative)用途に関する一つの特定の挑戦は、長期的安定性が比較的低いことである。一般に、この反応は1〜1.5時間後に停止した。これまでに得られた結果から、いくつかの質的な結論を導き出すことができた。第一に、用いられた総タンパク質含有量と全体的な反応時間の相関関係を検出することができ（図10とも比較する）、第二に、反応時間を吸気速度によって減少させる(図12)。両観察は、反応条件下における生体触媒の低い安定性を示す。StyAのこの低い安定性は、カソード表面へのStyAの吸収に部分的に起因しうるが、かかるカソード表面は、O2のカソード還元から生じる局所的に高濃度の部分的に還元された酸素に曝されると考えられる［４０］。さらに、O2の不均一な取り込みによって、生体触媒の三次元構造を不安定化する気-液界面にずり応力および表面張力の発生をもたらす。これまでの研究は、追加的な「犠牲的」タンパク質、例えばウシ血清アルブミン(BSA)［３５］の有利な影響、さらにまた例えばEupergit Cへの固定化を介するStyAのヘテロゲンゼーション(heterogenzation)が実施可能であることを示唆した。上記条件下にて増加した生体触媒安定性を目的とするさらなる研究が、進行中である。
結論として、本発明者らの研究は、フラビン依存性モノオキシゲナーゼの直接的な電気化学的再生を初めて実証したものである。電力のみによって駆動すると、光学的に純粋なエポキシドが、対応するビニル芳香族化合物から合成された。このように、3種のポリペプチド(StyA、StyB、およびNADH再生酵素)と2種の補因子(NADHおよびFAD)から成る、どちらかと言えば複雑な天然電子伝達系は、最高に単純な生体触媒のエポキシ化反応のエポキシ化に絶対的に必要な成分にまで減らすことができた。本明細書中、このような複雑な酵素系を単純化するための電気酵素的アプローチの有用性を示すが、これは他の酵素的酸素添加反応［４１］にまで及びうる。かかる他の酵素的酸素添加反応とは、合成的に興味深い反応、例えば酸化的脱硫［４２］、芳香族環の特異的なヒドロキシル化［４３−４５］、エナンチオ選択性バイヤー-ビリガー反応［４６］、選択的ハロゲン化反応［４７］、などをなし、電気化学電解槽中で、単離されたモノオキシゲナーゼおよびFADのみを用いて実施できる。
実験の部
化学物質を、Fluka (Buchs, Switzerland)から入手可能な最高の純度で購入し、さらなる精製を行うことなく用いた。
StyAを、これまでに記載されたように組換え大腸菌（Escherichia coli） JM101を用いて冨化した［３５］。凍結乾燥した生体触媒の純度は、（SDSゲル電気泳動によって測定した場合）およそ70％であった。
電気分解を、温度制御され、撹拌されたタンク反応器内で実施した。円柱状の炭素フェルトを、カソード（作用電極）として使用し、電位を飽和Ag/AgClsat.基準電極に対して調整した。作用電極の大きさは、（平均27.1 ± 2.1 mg cm-2に相当する）顕微鏡的な極微小の面積を提供する。分離槽(divided cell)又は非分離槽(undivided cell)のいずれかの条件を選択した。分離槽については、Pt線カウンター電極を透析膜内に配置し、それ以外は、Ptフォイル(直径1cm)を使用した。示した反応成分を反応器に添加した後、−550 mV vs. Ag/AgClsat.のカソード電位を印加した。分離槽の場合、O2を空気の不均一取り込みによって供給した（吸気速度をHewlett Packardソープフィルム流量計を用いて測定した）；非分離槽の条件下では、O2がカウンター電極にて発生した。
反応速度（およびその算出した酵素能力）を、これまでに報告されているプロトコル［３４,３５］を用いてHPLCによって測定されるように、生成物形成に基づいて測定した。
以下に本明細書に記載された参考文献を列記する。
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過塩素酸を用いた処理前および処理後の電気酵素的エポキシ化のクロマトグラム。 トランス−β−メチルスチレンの電気酵素的エポキシ化生成物の光学純度の測定結果。 電気酵素的エポキシ化速度へのカソード電位の影響。 トランス−β−メチルスチレンの電気酵素的エポキシ化速度への温度の影響。 典型的な電気酵素的エポキシ化の電流効率の測定結果。 電気酵素学的反応の間のスチレンモノオキシゲナーゼの安定化。 有機相および水相でのエマルション反応の間のスチレンオキシド濃度。 電気化学的な分離槽および非分離槽のセットアップ。 補因子として拡散性還元型フラビンを用いる酵素の選択。 トランス−β−メチルスチレンの電気酵素的エポキシ化速度へのStyA濃度の影響。 StyAによって触媒されるエポキシ化反応効率へのカソード面積対反応容積の比率の影響。 電気酵素的エポキシ化速度へのエアレーションの影響。

Claims (10)

  1. FAD依存性モノオキシゲナーゼによって触媒される生成物Pへの遊離体Eの酵素的酸素添加のための方法であって、該FAD依存性モノオキシゲナーゼが、直接的な電気化学的還元によって再生されることを特徴とする、上記方法。
  2. 前記酸素添加反応がエポキシ化である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記酸素添加反応が酸化的脱硫である、請求項１に記載の方法。
  4. 前記酸素添加反応がエナンチオ選択性バイヤー-ビリガー反応である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記酸素添加反応が芳香族分子のヒドロキシル化である、請求項１に記載の方法。
  6. 前記FAD依存性モノオキシゲナーゼが4-ヒドロキシフェニル酢酸-モノオキシゲナーゼである、請求項１に記載の方法。
  7. 前記FAD依存性モノオキシゲナーゼがピロール-2-カルボン酸-モノオキシゲナーゼである、請求項１に記載の方法。
  8. 前記FAD依存性モノオキシゲナーゼがクロロフェノール-4-ヒドロキシラーゼである、請求項１に記載の方法。
  9. 前記遊離体Eが置換または非置換のスチレンである、請求項１に記載の方法。
  10. 前記FAD依存性モノオキシゲナーゼがシュードモナスのスチレンモノオキシゲナーゼ(Sty AB)である、請求項１に記載の方法。
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