JP2007535961A - バイオリアクター - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は微生物および真核細胞などの細胞を培養する分野に関する。さらに特に本発明は微生物および/または真核細胞などの細胞を培養するためのバイオリアクター装置ならびに本明細書に記載のバイオリアクター装置を用いて微生物および/または真核細胞などの細胞を培養する方法に関する。
微生物、酵母、哺乳動物または植物細胞培養からのバイオ医薬品に対する需要は増加している。これらの産物には遺伝子組換えおよび非遺伝子組換えペプチドおよびタンパク質、遺伝子ワクチン接種または遺伝子治療に応用する遺伝子組換えプラスミドDNAが含まれうる。
本発明は、真核細胞、植物および酵母または微生物などの細胞を培養するための安価かつ多用途のバイオリアクター装置を提供する。本発明のバイオリアクターは細胞および微生物を安全に増殖できるようにする。本発明の目的は、ガス交換を、ペプチド、タンパク質、プラスミドDNA、ウイルスおよびファージなどの生物学的に関連する治療薬の生産に用いる細胞株を一層効果的に培養できるレベルまで改良することである。本発明は、入口ガスをプランジング液ジェットのコア中に混合させるバイオリアクター装置を提供する。かかる改良されたバイオリアクターはジェット中でおよび液の表面でガス混合が起こり、微生物バイオリアクターまたは集中的な哺乳動物細胞培養の増殖を支えるのに必要なより効率的なガス移動をもたらす。
JL-AD=液入口点と液ジェット排出点の間の距離
TTL=ガス入口点と液入口点の間の距離
ベンチュリ比=TTL/(JL-AD)。
本発明のさらなる実施形態は、以上述べた特性を有する単一用途バイオリアクター装置を提供する。かからバイオリアクターの利点としては、限定されるものでないが、製品切替時間の短縮、最小限の設備の清掃停止時間ならびに所要のサイクルタイムおよび分析資源の低減が挙げられる。さらなる利点には装置実証時間の短縮が含まれる。
図1を参照すると、本発明のシステムが示されている。本システムはフレキシブルプラスチック円筒状または矩形状バッグ(1)(すなわち、「培養コンテナ」)を有し、該バッグは側面を全て剛性のコンテナ(描かれてない)により支えられている。培養液(2)をバッグ底部から1以上の再循環ループ(3)を用いて排出し、1以上のジェットノズル(4)を経由してバイオリアクター装置頂部に再投入する。ジェット(4)は図3に示した通りであって、培地中への効率的な酸素移動を行うように設計している。培養液流をバイオリアクター装置中に高速度にてジェットを通って注入し、酸素含有ガスを培養液流(5)の中心に導入し、液中への酸素ガス移動を行わせかつ液からの二酸化炭素ガス移動を誘導する。標準液流条件のもとで、ガスをベンチュリ効果によって液流中に引き込む。ガスをまた、液流中に流量を制御してスパージし、ジェット流中により激しい乱流を誘導することもできる。液ジェットはバイオリアクター頂部空間(6)を通って培養液表面に突っ込むので、液相中へのおよび液相からの酸素と二酸化炭素ガスの交換も起こる。ジェット中のガスオリフィスを2以上の孔を有するように改変して、液ジェットと接触するガス泡(界面の)面積を増加することができる。液ジェットはバイオリアクターバッグ内の循環を誘導するのに十分な速度でジェットノズルを出る。ジェットのチップは培養液中の横方向混合を増加する角度をつけてこれによってバイオリアクター内の混合を改良することができる。入口ガスは入口ガス滅菌フィルター(7)を経由してジェット中に導入され、そして出口ガス滅菌フィルター(7)を経由して排出される。
スケールダウンモデルのベンチュリプランジングジェット・バイオリアクターにおける設計パラメーターの確認
使い捨てリアクターを設計するためのガイドとして、通常の非使い捨てリアクターを攪拌槽と使い捨て方式の両方で運転できる構造に改造して2つの培養システムの直接比較ができるにした。全体積7Lの水ジャケット付きApplikonバイオリアクターを全ての設計研究に使用した。天板に2つのベンチュリジェットおよび外部循環ループを取り付けた。バイオリアクター内容物を容器からQuattroダイアフラムポンプを用いて広孔採集管を経由して抜き出し、図1に示したのと類似の方法でベンチュリジェットに戻して循環した。ベンチュリジェット(図3に図解)の次元は上記の通りである。ジェット流量は5〜9リットル/分(2.95〜5.3m/sと同等)であった。バイオリアクターにはまた、邪魔板、pHプローブ(Ingold)およびポーラログラフDOTプローブ(Mettler Toledo)ならびに温度ポケットに挿入したPT100温度プローブも取り付けた。試験バイオリアクター(図2に図解)の次元を次に掲げる。
全体積7リットルのApplikon系ベンチトップ・バイオリアクターシステムを本研究に使用した(図2を参照)。試験バイオリアクターの物理的特性を図2に示す(次元は上記参照)。バイオリアクターにはまた、3つの邪魔板、温度計ポケット、pHプローブ、DOTプローブ、サンプリングチューブ、多点ガススパージラインおよび採集ラインを取り付けた。2つのベンチュリジェット(図3を参照)を天板の反対側に取り付け、外側循環ループと接続した。バイオリアクター内容物を、採集ラインから外側循環ループのQuattroダイアフラムポンプ(Pall corporation)を経由してベンチュリプランジングジェット中へ再循環した。2つのRuston型インペラーを備えた攪拌機を容器の中心に配置して通常攪拌槽とベンチュリプランジングジェットシステムの結果を比較できるようにした。ガス混合測定は、バイオリアクターの循環水ジャケットにより37℃に維持した容器に入った4Lの逆浸透(RO)水を用いて実施した。
バイオリアクター中の溶存O2分圧(DOT)は容器内に配置したin situポーラログラフDOTプローブを用いて測定した。このプローブを、DOT値をアナログ出力1に出力するように設定したApplikon 1035バイオコントローラーに接続した。該プローブをDOTシミュレーターを用いて0%に、そしてバイオリアクターに15分間800rpmの攪拌速度で圧縮空気を用いて5L/minスパージした後に100%に、それぞれキャリブレーションした。DOT=0.0%および100%はそれぞれ4.0mAおよび20mAの読みをアナログ出力に与えた。ピコロガーADC16アナログデジタル変換器(Pico Technologies)を用いて500秒毎に読取値を採取し、読取値をRS232リンクを通してPCにリアルタイムで送った。Applicon 1035からの4〜20mAシグナルを、好適なシグナル変換カードを用いてADC16に好適な0〜2Vシグナルに変換した。
StatEase Design Expert 6.0ソフトウエアを全ての設計セットアップと解析に用いた。Box-Behnken応答表面設計を用いてそれぞれのパラメーターの相対的効果を研究した。次の4つのファクターを設計に考慮した:ガス流量、液流量、ベンチュリ比およびジェット高さ。設計は日々の変化を考慮に入れて3ブロックに分離した。表2は応答表面設計セットアップの概要である。通常方式で運転したバイオリアクターのガス混合効率も毎日決定してブロック毎の一貫性を確実なものにした。通常の運転は37℃、4L作業体積、圧縮空気4L/minおよび攪拌速度700rpmにて実施した。
通常方式で運転したバイオリアクターのガス混合効率を研究してジェット混合結果との比較を行った。通常の微生物運転において、ガス流量と攪拌は2L/minおよび500rpmにセットする。正常な運転条件のもとで攪拌速度は500〜900rpmにそしてガス流量は2L/min〜8L/minに自動的に制御する。圧縮空気流量2L/minおよび攪拌速度500、700および900rpmに対して、KLaはそれぞれ0.019、0.033および0.046sec-1であった。KLaの外部コントロール測定もそれぞれの実験ブロックで行った。これらの外部コントロールは4L/min、700rpmにて行った。
図4は最初の応答表面設計から得たKLaおよびプランジ深さの結果の概要を示す。運転範囲と外部コントロールも示した。設計からのKLa値は外部コントロールの8%〜35%の範囲にある。解析の概要を表3に示す。液流量およびベンチュリ比はKLaに影響を及ぼす主なパラメーターである一方、ガス流および液流は小さい非線形の効果に寄与する。多数の報文は、ジェット高さをジェット混合に寄与する重要なファクターとして確認している(Bin,1993, Chem. Eng. Sci, 48: 3585-3630に総括されている)。使用したモデルはジェット高さがこの規模では有意な影響を与えないことを示したが、容器サイズとジェット高さが増加するとガス混合性能が改善しうることが期待される。ベンチュリ比は明らかな主な効果ではないであろう、何故なら色々なベンチュリ比におけるガス接触時間の差は大きくないと考えられるからである。
ジェット角度
横方向(lateral)混合の改良はジェットが液表面をヒットする角度を変えることにより達成できる。Tojoら(Tojo, NarukoおよびMiyanami, 1982, Chem. Eng. J., 25:107-109)は、15〜20°の角度がガス混合に有意な効果を有することを確認した。図7はジェット出口で15°角度の設定のKLaに対する効果を示す。実験は4つの設計点において行った。低いガス流量および液流量(ラン2およびラン6)で有意な効果は観察されなかったが、高いガス流量および液流量(ラン10)においてKLaが無角度のジェットを4倍越える増加を示した。
ベンチュリに存在する液ジェットとガスジェットの間の界面領域は、ガス出口をクリンプすることにより増加することができる。クリンプしたベンチュリガス入口の効果は低いガスおよび液流量では有意でない(図8:ラン2および6)。高いガスおよび液流量の組み合わせで若干の増加が観察された(図8:ラン8および9)。
スケールダウンモデルのベンチュリプランジングジェット・バイオリアクターにおける設計パラメーターの最適化
実施例1はベンチュリ比、ジェット角度および、より限られた程度で、ジェットクリンプがベンチュリプランジングジェット系バイオリアクターの性能に影響を与える重要な設計パラメーターであることを確認した。ジェット高さは重要なパラメーターとして確認されなかったが、ジェットを最高の可能な位置(すなわち、ジェットの培養液中への角度付き入口を確実にしうる最高の可能な位置)にセットした。Bin(Bin, A.K., 1993, Chem. Eng. Sci.48 (21): 3585- 3630)はジェット高さをプランジングジェットの重要な設計パラメーターであることを確認した。単一用途バッグ設計において、これは包装および輸送中にバッグの完全な状態が損われることを防止しうる。本実施例において、応答表面設計手法を用いて、ジェット高さを高くセットした場合のガス流量、液流量およびベンチュリ比に応答するベンチュリジェットの性能を特徴付けた。ジェットを15°角度およびクリンプしたガス管を取り付けて、40%酸素を入口ガスとして用いた。
試験バイオリアクターは図1に用いたのと同じセットアップであった。ジェット流量は2〜9リットル/分であり、1.18〜5.3m/sのジェット速度と等価であった。例えば、実施例1と2のガス流量は1〜9リットル/分であった。
実施例1に用いたのと同じキャリブレーション手順を用いて溶存酸素分圧(DOT)をセットアップした。この実施例において、1035 Applikonバイオコントローラーは出力を0% DOTに対して4mAおよび150% DOTに対して20mAにセットした。ピコロガー、アナログデジタル変換器の設定は実施例1に記載したのと同じである。
図9は実施例2応答表面設計から得たKLaおよびプランジ深さの結果の概要を示す。表5は応答表面解析の概要を示し、実施例1のように、ガス流量と液流量が重要なパラメーターであることを確認する。ガス流量および液流量とベンチュリ比との間の相互作用も重要であることを確認した。
小規模モデルベンチュリプランジングジェット運転と50L作業体積単一用途バイオリアクターのベンチュリプランジングジェットとの比較
本実施例においては、小規模ベンチュリプランジングジェットを作業体積50Lをもつパイロット規模使い捨てバイオリアクターの次元までスケールアップした。パイロット規模を排出する液ジェット速度は実施例1および実施例2に用いた液速度と同じ範囲に保った。スケールアップしたジェットの次元は図3に示した。
スケールダウンしたベンチュリプランジングジェット・バイオリアクターにおける遺伝子組換え大腸菌DH1の増殖比較
実施例1に記載した構造のバイオリアクターを用いて、通常の攪拌槽リアクター(STR)とベンチュリプランジングジェット・リアクター(VPJ)方式において増殖した遺伝子組換え大腸菌(E.coli)の増殖特性を比較した。大腸菌(E.coli)はDNAに基づく治療ワクチンとして用いるpUC系プラスミド、pXYにより形質転換しておいたものである。
バイオマス濃度測定法
光学密度(OP)測定
光学密度は600nmにセットしたPharmacia NovaSpec分光光度計を用いて測定した。サンプルを無菌培地に希釈して0.2〜0.7の読みを得た。培養のODは読みに希釈ファクターを乗じて計算した。
培養サンプルのアリコート(1mL)を予め二重秤量した2.2mLのマイクロ遠心チューブ中に移した。チューブを室温にて10分間14000gにてEppendorf 5471マイクロ遠心分離器で遠心分離した。培養上清を注ぎ出して残留液を綿棒を用いて取り除いた。次いでチューブを再秤量した。チューブの重量差を用いて湿細胞重量濃度を計算した。
本研究に用いた種子および拡大フラスコ増殖培地は単一強度のTerrific Brothであった。二重強度のTerrific Brothをバイオリアクター増殖研究に用いた。
PXYプラスミド治療ワクチンを用いて形質転換した大腸菌(E.coli)DH1の凍結ストック培養を-70℃にて貯蔵した15%(v/v)グリセロールストック中に維持した。これらのグリセロールストックを100mLの種子培地(50mg/Lカナマイシン入り)を含有する500mL邪魔板付き振盪フラスコ中に入れて復活させた。復活フラスコを37℃にて8時間230rpmにてインキュベートした。8時間後、その培養を、種子培地およびカナマイシンを含有する500mL邪魔板付き振盪フラスコ中に移して拡大した。拡大フラスコを接種して光学密度(600nmにて)=0.02とし、そして37℃、230rpmにて16時間インキュベートした。3つの振盪フラスコの内容物をプールして接種前に光学密度を読み取った。バイオリアクターに移す種菌の体積を、最初の出発OD=0.4となるようにセットした。
温度は温度制御した容器の水ジャケットを用いて37℃に制御した。アルカリ(2M水酸化ナトリウム)および酸(2M硫酸)の自動添加を利用してpHを7.0に維持した。STRとVPJ方式の両方の運転に当たって、STR方式で運転し、攪拌機を700rpmにセットし、そして圧縮空気をスパージラインを通して2vvmで15分間スパージすることにより、DOTプローブを100%飽和にキャリブレーションした。STR方式においてはSTR中の溶存酸素分圧(DOT)を攪拌機速度とガス流量の自動カスケード制御によりほぼ30%以上に維持した。制御装置がDOT>30%を維持できなくなれば、内部ガス供給を手動で窒素中に40%O2を含有する酸素濃縮空気に切り替えた。
温度とpHはSTR運転に記載の通り維持した。DOTは手動で液流量とガス流量を変えることにより制御した。両方のVPJ運転はベンチュリ比0.8およびジェット高さセット5cmで行った。ジェットは20°の角度とし、クリンプしたガス出口を取り付けた。初期液およびガス流量はそれぞれ4L/minおよび2L/minであった。DOT制御無しのVPJに対しては、液流量とガス流量を2時間毎にDOTが30%以上を維持するように変えた。DOT制御有りのVPJに対しては、液流量とガス流量を0.5時間毎にDOTが30%以上を維持するように変えた。
湿細胞重量増加の時間経過を図13に示した。二重の攪拌槽バイオリアクターからの結果を平均化し、全結果を攪拌槽バイオリアクターの最大平均湿細胞重量取得と比較してプロットした。DOT制御無しのVPJバイオリアクターの増殖(白四角)はSTRの増殖と初期は類似しているが3時間後に酸素制限によって遅くなる。DOT制御無しのVPJで達成した最終湿細胞重量は対照攪拌槽バイオリアクターで達成した値の70%であった。DOT制御有りのVPJの増殖は初期4時間についてはDOT制御無しのVPJと類似のパターンであった。DOT制御有りのVPJの最終湿細胞濃度は8時間後にSTRバイオリアクターで達成した湿細胞重量と有意差がなかった。表6は攪拌槽バイオリアクターの色々な増殖期に達成した平均増殖速度と比較した増殖速度を示す。初期増殖速度は最初の4時間にわたって計算する一方、最終増殖速度は培養が増殖した残りの期間について計算した。全増殖速度は増殖の全期間にわたって計算した。
Claims (43)
- 培養液中で微生物または細胞を培養するバイオリアクター装置であって、培養液用のコンテナ、ならびに培養液をコンテナから排出しかつコンテナへ送り戻して循環する循環システムを含んでなり、前記循環システムが培養液の中空液流を形成させかつ酸素含有ガス流を培養液の液流の中空部中に導入するのに役立つように適合された機構を有する上記装置。
- 循環システムが培養液の中空コアを有する環状液流を形成させかつ酸素含有ガス流を培養液の環状液流の中空コア中に導入するのに役立つように適合されている機構を有する、請求項1に記載の装置。
- 機構が少なくとも1対の内と外とに配置された管を含むものであり、少なくとも1対の内管は酸素含有ガスの供給部と連結されかつその外管はコンテナと連結されていて、該培養液が内管を覆って外管内を流れて中空液流を形成し、その中空部中へ内管を経由して酸素含有ガスを導入することができる、請求項1または2に記載の装置。
- 内管と外管は同心に配置した、請求項3に記載の装置。
- 循環システムが、培養液を培養コンテナ中に送り戻すための、コンテナ中に方向付けた出口を備えた少なくとも1つの流出ノズルを有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の装置。
- 内と外とに配置された管の少なくとも1対の末端の構造が流出ノズルの構造であり、角度付き先端部分を有するか、または有しない、請求項2〜5のいずれか1項に記載の装置。
- 外管および内管がそれぞれ出口を有しかつ内管出口は外管の内部に配置されている、請求項2〜6のいずれか1項に記載の装置。
- 請求項6に記載の装置において、外管の出口が外管の角度付き先端部分である、請求項7に記載の装置。
- 角度付き先端部分が、内管の出口と同じレベルまたはその下流にある外管のある点から下流方向に出口へ拡がる上流末端を有する、請求項8に記載の装置。
- 外管の出口が流出ノズルの出口である、請求項6〜9のいずれか1項に記載の装置。
- コンテナが底壁、および底壁から直立する側壁構造を有し、少なくとも1つの流出ノズルの出口が底壁の上に位置しかつ底壁の方向に向いている、請求項5〜10のいずれか1項に記載の装置。
- 少なくとも1つの流出ノズルの出口が側壁の方向に向いている、請求項11に記載の装置。
- 2以上の流出ノズルが存在し、該2以上の流出ノズルの出口がコンテナの上下軸の周りで全て同じ回転方向に向いている、請求項12に記載の装置。
- 機構が酸素含有ガスを培養液流の中空部中に混入するように適合されている、請求項1〜13のいずれか1項に記載の装置。
- 外管および内管がベンチュリ効果により酸素含有ガスを外管内の液流の中空部中に引き込むように配置された、請求項3〜14のいずれか1項に記載の装置。
- 1以上の部分を単一用途用に設計した、請求項1〜14のいずれか1項に記載の装置。
- 培養液用のコンテナを耐水性セミフレキシブルまたはフレキシブル材料で作った、請求項1〜16のいずれか1項に記載の装置。
- 培養液用のコンテナをポリ塩化ビニル、またはPVCまたはPTFEシートの1以上の層で作った、請求項17に記載の装置。
- 循環系を耐水性セミフレキシブルまたはフレキシブル材料で作った、請求項1〜18のいずれか1項に記載の装置。
- 循環系をシリコンエラストマーまたは白金処理シリコンエラストマーで作った、請求項19に記載の装置。
- 循環系が培養液をコンテナから排出しかつコンテナへ送り戻すポンプを有する、請求項1〜21のいずれか1項に記載の装置。
- ポンプヘッドが直接培養液と接触しないぜん動ポンプを用いる、請求項21に記載の装置。
- 使い捨てポンプヘッドを用いる、請求項21に記載の装置。
- 温度および/またはpHおよび/または溶存酸素分圧の制御を最適化するためのセンサーをさらに含んでなる、請求項1〜23のいずれか1項に記載の装置。
- センサーを循環系内に配置した、請求項24に記載の装置。
- センサーをコンテナ内に配置した、請求項24に記載の装置。
- 培養液中の微生物または細胞を培養する方法であって、培養液を培養液の受器から排出しかつ受器へ送り戻して循環させ、前記循環工程中に培養液の中空液流を形成させかつ酸素含有ガスが液流の中空部中に導入される上記方法。
- 培養液を連続循環する、請求項27に記載の方法。
- 培養液を微生物または細胞と一緒に循環する、請求項27または28に記載の方法。
- 培養液を受器中にジェットとして送り戻す、請求項27〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 培養液を受器表面上方から受器中にジェットとして送り戻す、請求項30に記載の方法。
- 受器の表面を通過する仮想軸の周りに受器の回転を生じるように、培養液を受器中にジェットとして送り戻す、請求項30または31に記載の方法。
- 培養液中で微生物または細胞を培養する方法であって、培養液を培養液の受器から取出しかつ受器の表面を通過する仮想軸の周りに受器の回転を生じるように受器表面中にジェットとして送り戻す上記方法。
- 培養液中で微生物または哺乳動物、酵母または植物細胞などの細胞を培養するためのバイオリアクター装置であって、前記装置は培養液中で前記微生物または細胞を培養するための培養コンテナを含んでなり、前記装置は培養液を前記培養コンテナから排出しかつ該コンテナへ送り戻して循環する循環系を含んでなり、前記循環系は少なくとも2対の同心に配置した外管および内管を含んでなり、前記少なくとも2対の内管は酸素含有ガスの供給と連結しかつ外管は培養コンテナと連結し、該培養液は外管内を流れて内管を覆って中空液流を形成し、その中空部中に内管を経由して酸素含有ガスを導入することができ、前記少なくとも2対は流出ノズルを含んでなり、その流出ノズルから前記酸素含有中空液流が流出して前記培養コンテナ中に流入するものである、上記バイオリアクター装置。
- 少なくとも2対の少なくとも1つが培養液より上に位置する、請求項34に記載の装置。
- 少なくとも1つの流出ノズルが培養液より上に位置して酸素を含有する中空液流を培養コンテナ中に流入するように方向付けており、好ましくは、前記液流を前記培養液中に方向づけている、請求項34または35に記載の装置。
- 流出ノズルが酸素含有中空液流のジェットを形成する構造である、請求項36に記載の装置。
- 装置が2、3または4対の同心に配置した外管および内管を含んでなる、請求項34または37に記載の装置。
- 液流が培養液の平面に対してほぼ70〜75°の傾斜角で前記培養液中に流入するように流出ノズルを方向付けた、請求項36または38に記載の装置。
- 少なくとも2対の少なくとも1つの酸素含有中空液流がノズルを取付けた外管の経線軸から15°〜20°の角度で前記ノズルから流出する、請求項34に記載の装置。
- 少なくとも2対の2つまたは全ての酸素含有中空液流が、ノズルを取付けた外管の経線軸から15°〜20°の角度で前記ノズルから流出する、請求項40に記載の装置。
- ベンチュリ比が0.2〜0.8、好ましくは0.5以上、例えば0.6、0.7または0.8である、請求項1〜41のいずれか1項に記載の装置。
- 目的のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質を生産する方法であって、請求項1〜42のいずれか1項に記載の装置の培養液中で微生物および/または細胞を培養することを含んでなる上記方法。
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